活性天然产物b用于制备抗真菌抗肿瘤产品的用途的制作方法

专利名称：：活性天然产物b用于制备抗真菌抗肿瘤产品的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药和食品
技术领域：
，具体地说是涉及一种中药提取物——活性天然产物用于制备抗真菌、抗肿瘤及抗血管性老年痴呆产品的用途，更具体地说是涉及一种海洋真菌提取物——活性天然产物B，即4，6-Dihydroxy-3—methylene-10-propenyl-2-oxa-spiro[4,5]dec-8-ene-l,7-dione，用于制备抗真菌、抗肿瘤及抗血管性老年痴呆产品的用途。
背景技术：
：(一)海洋真菌的研究概况1、概述海洋微生物以其生存于特殊的生物环境中而具有产生新型生物活性物质的巨大潜力。几十多年來，从海洋真菌中分离鉴定近600个结构新颖的次级代谢产物，许多化合物显示了良好的抗肿瘤、抗菌和抗病毒活性；另有一些化合物显示出了独特的生理活性，如抗老年痴呆。因此，海洋微生物是近年来的一个研究热点。越來越多的研究表明，海洋微生物——尤其是那些跟海洋动物或海洋植物存在共生或寄生等关系的微生物一一能产生结构独特并具强烈生理活性的代谢产物。而且海洋微生物繁殖快，可利用现代微生物技术，大规模工业发酵，有广阔的应用前景。科学家们预计，开发新的海洋药物将寄希望于海洋微生物这一新的领域。2、海洋真菌'海洋真菌(Mar/加是生活在海洋中的能形成孢子且有真核结构的微生物，是一个既能在海水中繁殖和完放生活史、又能在海水培养基上良好生长的真菌类群，又称海水真菌。g卩具有真核结构、能形成孢子、营腐生或寄生生活的海洋生物(①J.KohlmeyerandE.Kohlmeyer,她"'恥Afy(油gy,AcademicPress,NewYork,1979;②T.W.Johnson,F.K.Sparrow,FungiinOceansandEstuaries,丄Cramer,Weinheim,1961)。海洋真菌通常为菌丝状和多细胞，只有酵母菌在发育阶段中有单细胞出现。营养方式除粘菌为摄食式外，多为吸收式。一些來源于海洋并能在海洋生境中生长与繁殖者，称为专性海洋真菌；另一些来源于陆地或淡水，但能在海洋生境中生长与繁殖者，称为兼性海洋真菌。它们适应海水的酸碱度，耐高渗透压能力较强，大多数栖于某种基物而生活，例如寄生于海藻和海生动物，或者腐生于浸沉在海水中的木材上；少数自由生活，例如可生长在含盐的湿地和栲树沼泽中。因此，真菌在海洋中的分布主要取决于寄主的分布。研究简史1869年法国M.C.de迪尔约等从海草中首先发现海洋真菌。1934年，F.K.斯帕罗研究了丹麦海域的藻状菌类。1944年，E.S.巴洪和D.H.林德发表研究海洋木生真菌的论文。1961年，T.W.约翰森和F.K.斯帕罗的《海洋与河口真菌》论述了海洋真菌的分类与生物学特性。1978年￡卫.0.琼斯主编的《水生真菌学进展》论述了海洋真菌形态、生理和生态方面的研究进展。1979年J.科尔迈尔等的《海洋真菌学-高等真菌》，系统阐述了高等海洋真菌的研究成果。分类.目前，多数学者认为真菌应独立成界(King-dommycota)。但对所属门、纲等的划分，至今还没有一个较为公认的方案。据现有记载，海洋真菌尚不足500种，仅相当于陆地真菌种数(约5万种)的1%。包括丝状高等海洋真菌209种，海洋酵母菌类177种，低等海洋真菌藻状菌类(Phycomycetes)约70种。在高等海洋真菌中，有子囊菌类(Ascomycetes)149禾中、担子菌类(Basidiomycetes)4禾中禾口半矢口菌类(Deuteromycetes)56种。海洋真菌可分为海藻寄生菌、木材腐生海水菌和匙孢囊目3类①海藻上的寄生种类有根肿菌属、破囊壶菌属、链壶菌属、水霉属、冠孢壳属、隔孢球壳属、球座菌属、近枝链孢属和变孢霉属等；②常见的木材腐生海水菌有冠孢壳属、海生壳属、木生壳属、挠孢壳属、白冬孢酵母属、拟珊瑚孢属、腐质霉属和无梗孢属等；③匙孢囊目寄生在红藻上，分解卤素的能力较强。匙孢囊属提供了菌类起源于红藻的证据，有人认为它是海水中木材着生子囊菌的直接祖先。分布海洋真菌分布广泛，从潮间带高潮线或河口到深海，从浅海沙滩到深海沉积物中，均有其成员。海洋酵母菌和低等真菌附生于浮游生物和动物体上，因而在大洋中也有分布；高等海洋真菌的生长要求适宜的基物作为栖生场所，因此多集中分布在沿岸海域。由于海洋真菌营腐生或寄生生活，所以其地理分布的特点是取决于寄主的地理分布范围。但海水中溶解氧的浓度和海水水温，也是影响海洋真菌存在与发展的重要因子。几乎所有真菌都可在小于海水中氧化钠浓度的条件下生长，因此耐盐性不能作为区分海洋真菌与陆地真菌的标志。來源于水深超过500米海洋环境中的真菌，明显地具有适应高压、低温而生长的能力。现知的深海真菌只有5种，采集样品的最大水深为5315米。生态习性大多数海洋真菌依赖栖住某种基物而生活，只有少数真菌不依赖基物而5自由生活。依其栖生的习性，海洋真菌可分成5种基本的生态类型①木生真菌。在海洋水体中数量最多和分布最广的高等真菌，营腐生生活，善分解纤维素。在热带海域和浅海环境中分布更加广泛。已知有子囊菌类76种，半知菌类29种，担子菌类2种。一类数量最多、分布最广的高等海洋真菌。能强烈地分解木材和其他纤维物质。它们在热带海域的分布较温带和极地广泛，在浅海环境的分布较深海广泛。在己知的107种海洋木生真菌中，子囊菌类占76种，半知菌类占29种，担子菌类只有2种。②寄生藻体真菌。约占海洋真菌种数的1/3，其中以子囊菌类居多。有腐生、寄生和共生等类型。在海洋真菌中，约有1/3的种与藻类有联系，其中以子囊菌类居多。有腐生、寄生和共生等类型。不同海藻的分布可直接影响该类真菌的分布，如在北大西洋的马尾藻海中,真菌的种类和数量都很少，也极少发现被真菌侵染的海藻,这是由于马尾藻(Saras-sumspp)具有抗菌作用的单宁酸物质。一般说，腐烂海藻上酵母菌的数量要高于活藻体上和海水中的数量；附在红藻和绿藻上的酵母菌数量，要高于褐藻上的。因为褐藻分泌的酚类物质能抑制海洋真菌的生长。一些海洋真菌与特定海藻结合形成专性共生的结合体，即为海洋地衣。③红树林真菌。多半是腐生菌，其中子囊菌类23种，半知菌类17种，担子菌类2种。红树是热带亚热带潮间带盐泽地的植物(见红树林生物群落)。栖生在红树林的海洋真菌多半是腐生菌，其中有子囊菌类23种，半知菌类17种，担子菌类2种。浸在海水中的红树枢干、枝条和根部的表皮被穿孔动物、风浪或人为损伤后，极易被真菌侵入而造成腐烂。但埋在泥中的根部，则不易受真菌侵害。海洋真菌能分解红树叶片，为海洋提供大量的有机物碎屑。④海草真菌。数量很少，多栖居于叶部。数量较少，其中栖居叶部的真菌较栖根者为多。海草根中含有单宁酸和其他抑制生物生长的物质，只有那些能抵抗这类物质的海洋真菌才能在海草根上适应生长。⑤寄生动物体真菌。只限寄生在外骨骼和壳部处。只局限于寄生在外骨骼、壳等处。海洋真菌在分解动物体中的纤维素、甲壳素、蛋白质和碳酸钙等过程中，起重要作用。低等海洋真菌是引起海洋鱼类和无脊椎动物病害的重要致病菌。海洋真菌常有如下特点①如果属于子囊菌亚门,则主要为有分解纤维素活力的核菌纲的成员，子囊壳黑色，子囊孢子常具有含酸性多糖的附属丝，有利于粘附在新基质上。通常无分生孢子世代。②如果是不完全菌，则孢子为顶壁孢子型，多为暗色。海洋真菌和海洋细菌都参加海洋有机物的分解和无机营养物的再生过程，不断为海洋植物提供有效营养；但海洋真菌是海洋动物的寄生菌和致病菌，有的能使海洋植物致病，甚至使港湾设施中的木质结构腐烂；某些海洋真菌能破坏聚氨基甲酸酯等高分子合成材料。意义海洋真菌与海洋细菌一样，参与海洋有机物质的分解和无机营养物的再生过程，为海洋植物不断提供有效营养，在海洋食物链中占有重要位置。特别是在海洋沉积物中的真菌菌丝体和酵母菌体，为海洋原生动物、底栖动物等提供了饵料的来源。某些海洋真菌能产生抗菌素和其他生理活性物质，是新药丌发的巨大宝库，在生态和应用方面也有重要意义，如降解海洋环境中的污染物，促进海洋自净等；利用海洋真菌加工麦麸、甘蔗渣、稻草等，制成廉价的微生物碎屑混合物，用作水产养殖中的饲料。海洋真菌是某些海洋动物的寄生菌和致病菌，如美国牡蛎生产区曾因真菌的侵害遭受严重损失。能引起某些海洋植物的病害，如北大西洋、太平洋沿岸和欧洲的海草曾被网粘菌属真菌严重侵染。海洋木生真菌能腐烂港口设施、防波堤及堰堤中的木质结构和其他纤维材料。某些海洋真菌能破坏海水中的人工合成材料，如聚氨基甲酸酯材料被它们穿透后会膨胀裂坏。3、活性天然产物B的化学结构与制备方法海洋真菌ikfoMan'wartw/cato的代谢产物B为首次从中国海海洋真菌中分离得到。真菌中活性产物B及甘露醇均有较高的含量，如果对其培养条件进行更深入的研究，可将Mow"n'朋似"/Mto丌发为一种资源菌，进一步加强在提高免疫功能、抗癌、抗衰老等作用方面的研究。海洋真菌弁K26的代谢产物中，胆碱硫酸酯为首次从南中国海海洋真菌中分离得到；3,4,5-三羟基苯甲酸是首次从海洋真菌中发现。真菌弁K26中胆碱硫酸酯及甘露醇均有较高的含量，如果对其培养条件进行更深入的研究，可将弁K26开发为一种资源菌。胆碱硫酸酯(简称COS)广泛存在于自然界中，它在土壤中硫的微生物转换方面扮演重要的角色。多种植物、土壤真菌以及细菌都能利用胆碱和PA(3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulphate)作为底物，在硫转换酶催化作用下合成COS，另一方面在胆碱硫酸酯水解酶的作用下COS可发生水解，成为生物体内胆碱和硫酸基团的来源之一。COS的另一个重要角色是作为抗渗透化合物。3,4,5-三羟基苯甲酸(即没食子酸)是一种多酚类化合物，由于分子中有一定量的ROH基，能形成有抗氧化作用的氢自由基(H0，有超氧阴离子(02—)和羟基自由基(OPf)等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害，以及提高免疫功能、抗7癌、抗衰老等作用。通过对海洋真菌Ma^an'"asp.,strainCNT-016的深入研究，目前已发现螺环内酯化合物6-epi-5'-hydroxy-mycosporulone(参见M.A.Abdel-Wahabetal./Phytochemistry68(2007)1212-1218)，但尚未进行深入的生物活性研究，本发明的研究涉及到的化合物与其有类似母核，并.进行了抗真菌抗肿瘤活性及抗血管性老年痴呆研究。(二)常规有效成分的提取分离方法1、溶剂提取法(1)原理溶剂提取法是根据被提取物原料例如中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到被提取物原料(例如中草药，需适当粉碎)中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如牝多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。被提取物原料成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为亲水性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大而疏于油；有的亲水性基团少，其极性小而疏于水。各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关。这样，发明人就可以通过对被提取物原料例如中草药成分结构分析，去估计它们的此类性质和选用的溶剂。总的说来，只要被提取物原料成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓"相似相溶"的规律。这是选择适当溶剂自被提取物原料中提取所需要成分的依据之一。(2)溶剂的选择运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；②溶剂不能与中药的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等。常见的提取溶剂可分为以下三类①水水是一种强的极性溶剂。被提取物原料中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及苷类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。②亲水性的有机溶剂也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇(又称酒精)、甲醇(又称木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对被提取物原料细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取比用水量较少，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低(64°C)，但有毒性，使用时应注意。'③亲脂性的有机溶剂也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取被提取物原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。(3)提取方法用溶剂提取被提取物原料成分，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。①浸渍提取法(简称浸渍法)浸渍法系将被提取物原料粉末或碎块装入适当的容器中，加入适宜的溶剂(如乙醇、稀醇或水)，浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，且如用水为溶剂，其提取液易发霉变质，须注意加入适当的防腐剂。②渗漉提取法(简称渗漉法)渗漉法是将被提取物原料粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法。当溶剂渗进药粉、溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀浸出液作为另一批新原料的溶剂之用。③煎煮提取法(简称煎煮法)煎煮法是中国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。④加热回流提取法应用有机溶剂加热提取，需釆用M流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量的20%60%，9溶剂浸过药材表面约12cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾3~6小时，放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。⑤连续回流提取法应用挥发性有机溶剂提取被提取物原料有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。2、分离和纯化方法上述提取法所得到的被提取物原料提取液或提取物仍然是混合物，需进一歩除去杂质，分离并进行精制。(1)溶剂分离法一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分歩进行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常为胶状物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌入适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，再以选用溶剂依次提取，使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。利用被提取物原料化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化，是最常用的方法。(2)溶剂萃取法①萃取法溶剂提取萃取法又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分在溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高；如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时，多用乙酸乙脂和水萃取。提取亲水性强的皂苷则多选用正丁醇、异戊醇和水作萃取。不过，一般有机溶剂亲水性越大，与水作萃取的效果就越不好，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一歩精制影响很大。②逆流连续萃取法是一种连续的溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加溶剂萃取时的接触面。如果一种被提取物原料的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取是否完全，可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查。③逆流分配法逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。—④液滴逆流分配法液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的溶剂萃取法。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好。(3)大孔吸附树脂法大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有良好的吸附性能，近十余年来逐渐被应用于被提取物原料化学成分的提取分离和中药新药的开发研制。大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。筛选原理是由于其本身多孔性结构所决定。由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经-定的溶剂洗脱而分开。这使得有机化合物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。大孔吸[f树脂的骨架由苯乙烯和二乙烯苯縮聚而生成，由于改性剂的加入，大孔吸附树脂的极性发生改变，按照树脂的表面性质，吸附树脂一般分为非极性、中极性和极性三类。非极性吸附树脂是由偶极矩很小的单体聚合物制得的不带任何功能基的吸附树脂。典型的例子是苯乙烯-二乙烯苯体系的吸附树脂，如D101、XAD-1、DiaionHP-lO大孔吸附树脂。中极性吸附树脂指含酯基的吸附树脂，如丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯与双甲基丙烯酸酯等交联的一类共聚物。它是在非极性大孔吸f付树脂的基础上，加入丙烯酸甲酯或丙烯腈縮聚而成，如中国中国经常使用的AB-8大孔吸附树脂。极性吸附树脂是指含酰胺基、腈基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂。此外，有时把含氮、氧、硫等配体基团的离子交换树脂称作强极性吸附树脂，强极性吸附树脂与离子交换树脂的界限很难区别。极性大孔吸附树脂可以由甲基丙烯酸甲酯、丙烯酰胺或亚砜类縮聚而成，如闩本三菱化工的DiaionHP2MG、美国Rohm-hass公司的XAD-IO，XAD-9大孔吸附树脂。与活性炭和其它吸附剂相比，大孔吸附树脂具有很多的优点，如对某种物质的吸附选择性较高；物理化学稳定性和机械强度较好；品种规格较多，可根据需要改变树脂物理或化学结构；吸附树脂一般为球状颗粒，流体阻力较小等等。因而被广泛应用于化工、医药等领域，近年來关于大孔吸附树脂在天然产物提取分离中的应用研究报道越来越多。大孔吸附树脂对被提取物原料化学成分如生物碱、黄酮、皂苷、香豆素及其他一些苷类成分都11有一定的吸附作用。对糖的吸附能力很差，对色素的吸附能力较强。(4)沉淀法是在被提取物原料提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。如铅盐沉淀法铅盐沉淀法为分离某些被提取物原料成分的经典方法之一。由于醋酸铅及碱式醋酸铅在水及醇溶液中，能与多种被提取物原料成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。然后将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中，通以硫化氢气体，使分解并转为不溶性硫化铅而沉淀。(5)盐析法盐析法是在被提取物原料的水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铰等。(6)透析法透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制。(7)结晶、重结晶和分步结晶法鉴定被提取物原料化学成分，研究其化学结构，必须首先将被提取物原料成分制备成单体纯品。在常温下，物质本身性质是液体的化合物，可分别用分馏法或层析法进行分离精制。一般地说，被提取物原料化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶体的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法來达到分离精制的目的。3、常用干燥方法(1)真空干燥是基于这样一基本原理水的饱和蒸气压与温度紧密相关，在真空状态下，水的沸点降低，即在真空下操作也就是在低温下操作，可避免在高温下营养成分如维生素等的破坏，同时提高了干燥速度。真空干燥在食品、制药、化工等行业有广泛的应用，中国也开发和引进了各种真空干燥设备，其结构形式多种多样。常用的形式主要有箱式真空干燥器、双锥式真空干燥器、带式真空干燥器等。这些传统的真空干燥装置主要采用热风，蒸汽或电等加热，利用热传导、对流或辐射原理将热量从外部传到物料内部。真空干燥具有干燥温度低，干燥室内相对缺氧，可避免脂肪氧化，色素褐变等一系列优点，适合于热敏感性食品物料的干燥，此外设备成本、干燥费用也相对较低。(2)喷雾干燥是流化技术用于液态物料干燥的一种方法。因是瞬间干燥，特别适用于热敏性物料，故所得产品质量好，保持原來的色香味，且易溶解。利用喷雾干燥来制备微囊的研究IH在进行，它是将心料混悬在衣料的溶液中，经离心喷雾器将其喷入热气流中，所得的产品是衣料包心料而成的微囊，这种微囊粉水可采用于直接压片，也可制备胶囊剂、糖浆剂或混悬剂。(3)冷冻干燥是将干燥液体物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用冰的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥的一种方法。由于物料在高度真空及低温条件下干燥，故对某些极不耐热物品的干燥很适合。王大林报道了一种喷雾通气冻干新技术，是利用冷的空气或氮气作为介质，迅速流经冻结物使水升华，喷雾冻干制得的产品微粒小、干燥快、时间短、均匀、流动性好，并具良好的速溶性。近年来，对膏状物料和粘稠物料干燥的研究取得了较大进展，流态化技术、喷射技术、惰性载体技术，则是在此研究基础上发展起来的。旋转闪蒸干燥机、热喷射气流干燥机、惰性载体干燥机均适合热敏性物料和膏状物料的干燥。这些新的研究成果用于中药制剂生产，将大大改善中药加工的技术水平，提高生产效率。(4)远红外加热干燥法是一项新的干燥技术，其干燥原理是将电能转变为远红外辐射，从而被药材的分子吸收，产生共振，引起分子和原子的振动和转动，导致物体变热，经过热扩散、蒸发和化学变化，最终达到干燥的目的。远红外干燥可节省电能20%50%，效果较好。(5)微波干燥法是一项20世纪60年代迅速发展起来的新技术，微波干燥实际上是通过感应加热和介质加热，使被干燥物中的水分和脂肪不同程度地吸收微波能量，并把它转变为热量从而达到干燥的目的。微波干燥可杀灭微生物和霉菌，并具有消毒作用。目前中国生产的微波加热成套设备有915mhz和2450mhz两个频率。(三)血管性痴呆的研究概况痴呆(Dementia)是山于脑功能障碍而产生的获得性和持续性智能障碍综合症，智能障碍包括不同程度的记忆、语S、视空间功能、人格异常及认知能力降低。痴呆的主要类型是包括血管性痴呆症(vasculardementia,或称血管性老年痴呆症，简称VD)、老年痴呆症中的老年性痴呆症(Alzheimer'sDisease,或称阿尔兹海默症，或称阿尔茨海默症，简称AD)等。老年痴呆症包括老年性痴呆症、多重梗塞型痴呆症(MultimfarctDementia)、酒精性痴呆症(AlcoholicDementia)及正常脑压水脑症(NormalPressureHychocephalus)，其中老年性痴呆症为老年痴呆症中的主要类型。由于AD好发病于60岁以上老年人，所以习惯被称为早老性痴呆症。血管性痴呆症是由脑血管性疾病引起的，主要由脑缺血缺氧导致。临床上常见多梗死性痴呆、大面积脑梗死性痴呆、丘脑性痴呆及出血性脑血管并发痴呆及混合性痴呆等类型。临床表现为抑郁、澹妄、失语等。病理改变为多发性腔隙性病变或大面积梗死灶及动脉粥样硬化病变(参见神经病学，第四版，人民卫生出版社)。临床治疗可使用胆碱能抑制剂，扩张血管、增加脑血流量，或者利用脑保护剂一抗氧化剂或自由基清除剂可以改善缺血、缺氧所引起的病理损伤减少脑细胞坏死和凋亡，保护脑组织。血管性痴呆者早期仅表现近记忆障碍，远记忆相对保持较好；随病程的增加，远记忆能力逐渐丧失，智能衰退呈渐进性加重。而老年性痴呆早期就表现出远近记忆障碍，智能衰退呈现出一种缓慢的进展过程(郭明英，韩国玲，等.老年性痴呆与血管性痴呆智能障碍的比较研究.青海医学院学报.2007,28(2):125-127.)。血管性危险因素在血管性痴呆和阿尔兹海默症的发病中均扮演着重要角色，所以有理论认为阿尔兹海默症与血管性痴呆可能并非两个独立疾患。阿尔兹海默症与血管性痴呆的共性研究已经在危险因素、发病机制、病理生理、影像学改变等各个方面广泛地开展。血管性痴呆症是由多次脑卒中或长期慢性脑缺血所致的大脑皮层获得性高级功能的进行性衰退性疾病。.在欧美调査表明，55岁以上的老人中痴呆发生率约1.1%，其中阿尔兹海默症占首要位置(发生率约7.7%。)，约为痴呆总人数的50%60%，而VD居次(发生率约1.5%。)，占10%20%，而随着年龄增长，VD所占比例显著增加(①OttA，BretelerMMB,HarskampF,StijnenT,HofmanA.Incidenceandriskofdementia:theRotterdamstudy.Am.J.Epidemiol"1998,147(6):574-580.;②DiCarloA，BaldereschiM，AmaducciL,etal.Incidenceofdementia,Alzheimer'sdisease,andvasculardementiainItaly.TheILSAStudy.J.Am.Geriatr.Soc.,2002;50:41-48.)。中国最近的研究也表明，65岁以上的老人中AD发生率约3.5%，VD发生率U%(ZhangZX,ZahnerGE,RomanGC,etal.DementiasubtypesinChina:prevalenceinBeijing,Xian,Shanghai,andChengdu.ArchNeurol.2005;62(3):447-453.)。由于目前还缺乏适用于诊断VD的认知损害模式，对于AD和VD的诊断的鉴别以及"混合型"痴呆(AD+脑血管病，简称AD+CVD)的诊断仍然具有一定的挑战性(①丁素菊，李云霞.血管性痴呆的临床诊断和治疗.国外医学脑血管疾病分册.2005,13(9):676-680;②ErkinjunttiT:Vasculardementia:challengeofclinicaldiagnosis.IntPsychogeriatr.1997;9:51-58.)，所以有人认为血管性痴呆可能是老年人中最为常见的痴呆类型，主要是因为很多"混合型"痴呆(AD+CVD)可能被诊断为AD(①RomdnGC.Vasculardementiamaybethemostcommonformofdementiaintheelderly.JNeurolSci.2002,203-204:7-10;②丁素菊.血管性痴呆.中国老年学杂志.2003;23(4):200-202.)。VD的发生率在男女无明显差异(AndersonK，LaunerLJ,DeweyME,etal.GenderdifferencesintheincidenceofADandvasculardementia:theEURODEMstudies.Neurology.1999;53:1992—1997.)，其最显著的危险因子是年龄[HebertR.,LindsayJ.，VerreaultR.,RockwoodK.,HillG"DuboisMF.Vasculardementia:incidenceandriskfactorsintheCanadianstudyofhealthandaging.Stroke,2000;31(7):1487-1493.]，根据流行病学调查，在大于60岁14的人群中，年龄每增加5岁VD的发病率就增加1倍。引起VD的两个主要原因是脑卒中和缺血性心脏病(ischemicheartdisease,简称-IHD)，而在老年人中这两者都是常见病。仅就脑卒中而言，现在每年全球新增加卒中患者1000万，其中中国就有200万(①FeiginVL,LawesCMM,BennettDA,etal.Strokeepidemiology:areviewofpopulation-basedstudiesofincidence,prevalence,andcase-fatalityinthelate20thcentury.LancetNeurol.,2003,2(1):43-53;②吴兆苏，姚崇华，赵冬.中国人群脑卒中发病率、死亡率的流行病学研究.中华流行病学杂志，2003;24(3):236-239.)，在老年人中发病率尤高，从而造成很多患者并发VD。中国全国性痴呆流行病学统计资料也显示随着人口的老龄化、饮食结构的改变，VD的发病呈递增趋势。随着人口老化，心脑血管病的发病率逐年升高，并发VD患者也逐渐增多。VD不仅严重损害患者健康，给患者带来长期痛苦，影响患者的生命质量，也给社会和家庭带来沉重的负担，引起了世界各国的普遍关注，它是老年医学领域中的一个重要课题。普遍认为年龄对VD的作用是通过多方面来影响的，例如脑的自身调节、细胞的新陈代谢、血脑屏障及自主功能方面的老化改变使脑血管易于受到损害，而脑损害的累计效应也是原因之痴呆的诊断必须符合三个条件①痴呆；②脑血管病；③以上二者密切相关。痴呆和卒中在时间上密切联系，通常卒中后3个月内发生痴呆。主要症状为①脑组织病理形态改变；②记忆力下降。关于VD的治疗，目前尚,无肯定的治疗方法可以改变整个病程，山于脑梗死后坏死的脑细胞不可能逆转，主要是对供血不足的脑细胞的治疗以缓解发作期症状、预防再损害等。常采用积极改善脑细胞供氧、改善微循环、预防新血栓与再梗死的方法等。改善脑循环治疗常用的有双氢麦角碱类、钙离子拮抗剂、烟酸类、其他扩血管药物及抗血小板聚集药物。胆碱酯酶抑制剂是近年发展较为迅速的痴呆治疗药物，如盐酸多奈哌齐和重酒石酸卡巴拉汀。临床上还经常应用脑保护治疗药物如钙离子拮抗剂(尼莫地平和西吡灵)；自由基、清除剂(维生素E、维生素C以及银杏叶制剂)等。但从上述药物目前临床的应用效果来看，疗效一般，并且大部分都仅仅是对症处理，并不能改善死亡率。目前一些中药制剂如银杏叶、灯盏花、刺五加等制剂大多存在活性成分不清、作用机制不明、质量不稳、毒副作用大等不足之处，难以满足临床需要。因此，目前世界各国对控制此病病程进展尚无有效方法和药物，VD的预防、治疗和预后的药物研究和丌发已成为各国非常重视的研究课题(①丁素菊.血管性痴呆.中国老年学杂志.2003;23(4):200-202;②陈春雷，邱智辉，苏世鑫，郑忠诚，陈培芬，叶志平.血管性痴呆的治疗进展.中国新医学论坛.2007,7(7):59-62.)。因此，研究出一种有效的治疗方法來阻止潜在的发病过程是很必要的，结合中国的传15统被提取物原料，从中发掘有效、低毒、价廉的治疗血管性痴呆和老年性痴呆的药物，用于预防、诊断、检测、保护和治疗VD等方面的产品特别是药物具有非常重要的意义，能够产生显著的社会效益和经济效益。(四)抗真菌药物的研究概况近年来真菌感染有逐渐增加的趋势，它包括浅部和深部真菌病，后者发病多系机体免疫功能受损，常病情严重，危及生命，需全身应用强效抗真菌药物治疗。.该类药物可分为外用和系统应用两类，外用药物仅用于浅部真菌感染。人类的真菌感染可累及表皮、皮下和全身；一般可分为浅部感染(即局限在角层、鳞状粘膜或角膜)和深部感染(皮下和全身)两大类。它们的治疗药物也有所不同，而有部分药物既可用于浅部感染，又可用于深部感染。浅部真菌感染包括皮肤真菌病，皮肤、指(趾)甲、毛发的感染，如体癣、股癣、手足癣、花斑癣、甲真菌病、皮肤黏膜念珠菌病和真菌性角膜炎等。据统计浅部真菌病约占全部皮肤病的1/4，特别是足部真菌感染，约占皮肤科就诊病人的46%，而其中甲真菌病就占了约16%;对于这些感染，主要采用局部用药治疗，由于其感染的特点，药物治疗效果往往不很满意，在某些情况，还需口服用药。局部使用环吡酮胺指甲涂剂涂在指甲表面是治疗甲真菌病的较好方法。深部真菌感染包括皮下组织和全身系统感染，包括念珠菌病、隐球菌病、曲霉病和毛霉菌病等。近年来由于广泛应用广谱抗生素、皮质激素、免疫抑制剂、放射治疗、化学治疗、器官移植、导管手术以及艾滋病的增多，使发生侵袭性真菌感染机会增加，而导致深部真菌感染F(益增多，据不完全统计，近十多年来，深部真菌感染的发病率增高了35倍。对于全身系统感染则需全身用药，有时尚需联合用药。由于药物的作用机制不同，特别需要注意它们的安全性和药物相互作用问题。在治疗应用方面，深部真菌感染主要选用两性酶素B、伊曲康啤、酮康唑、氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、卡泊芬净和氟胞嘧啶，其他药物则多用于浅部真菌感染，但多数具有较严重的毒副作用，如两性霉素有肾脏毒性。在长期药物应用的过程中病原菌也逐渐产生不同程度的耐药性，迫切需要我们开发新型疗效好且毒副作用更小的抗真菌药物。(五)抗肿瘤药物的研究概况恶性肿瘤严重危害人们的健康，据RST统计，在全世界五十多多亿人口中平均每年死于恶性肿瘤者达690万人，新发病例为870万例，且数字还在逐年增加。因此，各国政府、研究机构及制药公司长期以來一直对肿瘤研究和抗肿瘤药物予以高度重视，在抗肿瘤药物的研究上，目能已取得了重大进展。近年来，分子肿瘤学、分子药理学的发展使肿瘤本质lH在逐歩阐明；大规模快速筛选、组合化学、基因工程等先进技术的发明和应用加速了药物丌发进程；抗肿瘤药物的研究与丌发已进入一个崭新的时代。抗肿瘤药物iH从传统的细胞毒性药物，向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。因此，研究开发新型的抗肿瘤药物成为迫切的需要。药品销售的数据表明，全球制药企业50强在2007年的处方药销售额增长为2.8%，而其中抗肿瘤类药物增长最快，达14%。2006年数据同样表明，IO类药物中抗肿瘤药物的销售增长居首位，达20.5%。这反映了对抗肿瘤药物的持续、快速增长的市场需求。中国在制定中长期科学发展规划的基础上，提出设立一批重大专项。"重大新药创制"是从"十一五"到2020年间国家支持的重大项目之一。该项目将针对肿瘤、心血管病等多种严重危害人民的重大疾病，研制创新药物。很明显，抗肿瘤新药的研究与开发，既是防治严重危害人民疾病的需要，也是我国持续发展和建设创新型国家的重要任务。"重大新药创制"专项的设立，将对我国抗肿瘤新药研发的进程产生积极的影响。癌症治疗是医学与生物学的重大难题。研制可根治肿瘤的药物，仍然"任重道远"。与世界先进水平相比，中国在抗肿瘤新药研究方面仍有不小差距。抗肿瘤新药的研究与开发是一项艰巨的任务，是一个长期、复杂的过程，需要科技人员长期专心致志地工作与积累。因此，需要为研究者提供稳定的工作环境与条件；需要各方面专业人员和相关机构通力合作；需要有利于推动合作的政策保障措施和组织协调机制；需要有较大数量经费包括临床前研究与临床研究的经费的大力支持。当前，抗肿瘤新药研发正面临良好的机遇。生物医药科学的发展，为研制新型抗肿瘤药物提供了重要的理论基础和新的技术支撑。中国医疗卫生事业的发展，对包括癌症在内的重大疾病治疗药物提出了更高的要求，中国市场和世界市场的巨大需求能给研发单位带来可观的经济效益。中国设立"重大新药创制"重大专项，将促进中国新药包括抗肿瘤新药的研究与丌发。经文献检索等，到目前为止，尚未发现有活性天然产物B(polydatin，piceid)以及其组合物在直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、血管性痴呆和老年性痴呆及其直接相关疾病方面的报道。
发明内容本发明所需要解决的技术问题是公开了一种中药活性天然产物B抗真菌、抗肿瘤及抗血管性痴呆的新作用，即该提取物用于制备抗真菌产品、抗肿瘤产品及抗血管性痴呆产品，以克服现有技术存在的上述缺陷。也就是说，本发明通过细胞和动物实验等研究和理论探索，意在明确一种活性天然产物B在抗真菌、抗肿瘤及抗血管性痴呆应用方面的活性，即本发明涉及一种活性天然产物B的新用途。本发明的另一个目的是提供含有上述活性天然产物B的药物组合物作为制备抗真菌抗肿瘤产品及抗血管性痴呆产品的应用。在该组合物中，本发明的活性天然产物B占10%~90%(重量百分比)，优选占50%~90%(重量百分比)。(一)本发明所采用的定义本发明所述的抗真菌抗肿瘤产品是包括抗真菌产品和抗肿瘤产品；本发明所述的抗真菌产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究病原真菌及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的病原真菌是指白念球菌、新生隐球菌、红色毛癣菌和烟曲霉菌。本发明所述的抗肿瘤产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究肿瘤及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的肿瘤是指肝癌、乳腺癌和肺癌。本发明所述的抗血管性痴呆产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究血管性痴呆及其直接相关疾病的产品中的一种或多种。本发明所述的抗真菌抗肿瘤产品、抗血管性痴呆产品均是包括医药和食品等领域产品中的一种，是包括药物、试剂或食品等中的一种或多种，优选药物。本发明所述的活性天然产物B是指白藜芦醇-3-0-(3-D-葡萄糖苷(piceid，polydatin)。本发明所述的活性天然产物B所使用的药材原料是指海洋真菌或海洋真菌粗提物，优选海洋真菌她扁rf"af麵-cato或海洋真菌她簾n'朋f臓'cato粗提物。活性天然产物B是预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆的活性成分，其使用方式是包括单独使用或与其他化学物质联合使用等中的一种，优选单独使用，均能够用于制备抗真菌产品、抗肿瘤产品和抗血管性痴呆产品。供试样品均是采取常规的制备方法获得，所得到的活性天然产物B含量一般<60%,但是通过纯化，能够得到纯化后的活性天然产物B的纯度能够在95c/。以上，即本发明所定义的活性天然产物B。也就是说，采用活性天然产物B为原料，或者是直接采用含有活性天然产物B的海洋真菌为原料，或者直接采用含有活性天然产物B的海洋真菌粗提物为原料，都能够直接或间接用于制备抗真菌抗肿瘤产品和抗血管性痴呆产品。活性天然产物B优选以基本纯的形式使用即本发明所定义的活性天然产物B，如活性天然产物B的纯度>95%。(二)技术构思自主开发创新药物是中国目前的一项紧迫任务，中国中医药学具有悠久的历史，在预防和治疗疾病方面也积累了丰富的经验，因此从中药中寻找有效的活性成分或发现其新的用途均是有效的快捷途径，也是中国快捷创新药物研制的优势之所在。陆生微生物发酵产物一直是制药工业的重要资源之一，但近年来随着陆地资源的不断18开发，寻找新的微生物或筛选新的活性代谢产物的难度越来越大，且抗药性问题日益严重,使得新药的开发面临着严峻挑战。海洋微生物是近年来的一个研究热点。海洋约占地球表面积的71%,蕴藏着丰富的微生物资源.。越来越多的研究也表明，海洋微生物——尤其是那些跟海洋动物或海洋植物存在共生或寄生等关系的微生物——能产生结构独特并具强烈生理活性的代谢产物。而且海洋微生物繁殖快，可利用现代微生物技术，大规模工业发酵，有广阔的应用前景。科学家们预计，开发新的海洋药物将寄希望于海洋微生物这一新的领域。从海洋微生物次级代谢产物中寻找新的抗肿瘤活性代谢产物，为开发新型抗肿瘤药物提供先导化合物，通过对海洋真菌^fo^"n力"sp.，strainCNT-016的深入研究，目前已发现螺环内酉旨化合物6-epi-5'-hydroxy-mycosporulone(参见M.A.Abdel-Wahabetal./Phytochemistry68(2007)1212-1218)，但尚未进行生物活性研究，本发明研究涉及到的化合物与其有类似母核，并进行了抗真菌抗肿瘤活性研究，开展了细胞和动物实验研究。发明人通过对海洋真菌提取物进行系统的化学成分研究，筛选并证明该海洋真菌提取物活性天然产物B的活性和用途，发明人从而推测活性天然产物B在预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆等方面活性的临床药效，也应主要是通过活性部位该海洋真菌提取物特别是活性天然产物B的药效来发挥的，研究结果也证明和证实了该海洋真菌提取物特别是活性天然产物B具有显著的药理活性。发明人经过研究的最新发现是活性天然产物B能够抵抗e—淀粉样蛋白致脑细胞损伤的作用，能够抵抗过氧化氢致脑细胞损伤作用，提高东茛菪碱致痴呆小鼠模型的学习记忆功能，提高AP致痴呆小鼠模型学习记忆能力，抑制脑缺血再灌注小鼠模型脑组织脂质过氧化，增强脑缺血再灌注小鼠模型脑组织超氧化物歧化酶活性和减低脑缺血再灌注小鼠模型脑片细胞内钙离子浓度。痴呆特别是血管性痴呆和老年性痴呆严重影响中国人口的健康和生存质量，研制预防、诊断、检测、保护、治疗和研究血管性痴呆和老年性痴呆等方面的产品，特别是药物、诊断试剂和保健品等，具有显著的社会效益、经济效益。(三)活性天然产物B的结构与性质本发明的目的在于提供了一种具有潜在药用价值的新化合物，阐明了该化合物的结构，活性天然产物B结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>活性天然产物B的实验数据无色固体；熔点203—205°C，IR(KBr)3436,3402,2952,1815,1726,1679,1150,899cm-1;[M+H]+m/z251.07,[M-H]-m/z251.08,HRESITOFMS[M+H]+m/z251.0861(Cl3H1405),calcd.251.0874).NMR数据见表1。表l、活性天然产物B的NMR实验数据Position5H(JinHz)Sc(DEPT)蘭BCNOESY1171.5(C)3157.21(C)45,29t(2.2)69,13(CH)C-l,C-3,C-4,C-5,C-6,C-10,3-CH2H-661.58(C)64.31s71.88(CH)C-l，C-4，C-5,C-6,C-7,C-10H-4196.88(C)86.24dd(10.2,3.〗)125.95(CH)C-6,C-1096.68dd(10.5,2.3)149.69(CH)C-5,C-7,c-io，c-r103,9ldd(5.7，2.5)40.75(C)4.79t(2.7)88.13(CH2)C-l，C-43-CH2P4,60t(2.5)C-l1，5.74m132.71(CH)C-IO，C-2',C-3'H-9，H-102,5.49m126.25(CH)C-9，C-10,C-3'H-3'3，1,62dd(6.5'1.5)7.88(CH3)C-l'，C-2'H-l',H-2'(四)活性天然产物B的药理活性本发明对活性天然产物B在预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗血管性痴呆等方面的活性进行了多方面的试验。现有研究表明血管性痴呆的主要症状为①脑组织病理形态改变；②记忆力下降。发明人的研究表明活性天然产物B能明显改善血管性痴呆模型大鼠大脑的缺血性病理损伤、对痴呆大鼠的学习记忆功能具有较强的保护和促进作用。因此，活性天然产物B及其组合物能够用于制备抗真菌抗肿瘤产品。活性天然产物B在血管性痴呆的预防、诊断、检测、保护、治疗和研究活性方面的作用及其体外试验本发明通过如下实验，说明活性天然产物B具有防治血管性痴呆的作用。1、对血管性缺血损伤(多发性局部栓塞法造模)形成的痴呆大鼠的学习记忆保护作用(参见张均田主编《现代药理实验方法学》上册第1243页)学习记忆是大脑的高级功能，是构成人脑最高机能——智能的要素。学习记忆障碍是MID的早发症状之一。所以把学习记忆的改善作为评价智能提高的一个主要标准。(1)动物Sprague-Dawley大鼠，80只，雄性，体重250—300g，由中国科学院上海分院动物中心提供，动物合格证号SCXK(沪)2003—0003。(2)仪器与试剂Morris水迷宫视频分析系统(上海吉量软件科技有限公司和"DigBehv动物行为分析系统")，金纳多(德国Schwabe药厂)；羧甲基纤维素钠、水合氯酸为国产分析纯试剂。(3)配制方法本发明药物及金纳多在临用前用0.5%羧甲基纤维素钠碾磨均匀，配成所需浓度。(4)动物模型的制备和分组本法是取同种大鼠左心室采血，无菌37'C恒温干燥成血凝块，研碎后经200-300目筛孔过筛备用，应用时用6%右旋糖苷葡萄糖液每1ml加血凝块1mg制成混悬液，显微镜下测量直径为50100pm。然后将实验大鼠用水合氯醛腹腔麻醉(35mg/100g)，颈部正中切丌暴露分离右侧颈总动脉和颈外动脉。临时夹闭颈外动脉，从颈总动脉推注栓子右旋糖苷混悬液，在注入栓子的同时开放颈总动脉，利用颈总动脉的血流将栓子通过颈内动脉送入颅内至大脑各动脉，造成多灶性脑梗死。第二天将造模成功的动物分组，本发明药物组分为高剂量组(100mg/kg)、低剂量组(50mg/kg)，每组16只。用本发明药液分别灌胃给药，每鼠每天10ml/kg，阳性药对照组每鼠每天灌胃金纳多混悬液(2.5mg/ml)10ml/kg，模型对照组及假手术组每鼠每天给予0.5%羧甲基纤维素钠10ml/kg，均连续2周。(5)术后10天，Morris水迷宫实验①实验丌始甜一天，先让大鼠在不含有平台的水池中自由游泳2min，以熟悉环境。②定位航行实验连续训练4天，每天4次。每一次均随机顺序从不同等分水池的4个起点将大鼠投入水池中，放入时使大鼠面向池壁，记录大鼠从入水到找到并爬上平台的时间，这个时间称为逃避潜伏期。让其在平台上休息IO秒后再行下一次检测。如果在120秒内大鼠仍未找到平台，则将其引导到平台，潜伏期记为最高分120秒。每天4次潜伏期21的算术均数作为这一时间段的成绩，进行统计分析。③空间探索实验训练第5天，在定向游泳实验结束后，立即将平台撤掉，仍然随机选取4个入水点中的一个放入大鼠，计录大鼠在原平台所在象限中的停留时间。(6)实验结果(见表2及表3)。由表中可见Morris水迷宫游泳训练后，药物各剂量组的游泳潜伏期较模型组显著降低(PO.05);在空间探索实验中，药物组.动物在平台所在象限停留时间明显多于模型组(P<0.05)。上述结果表明，活性天然产物B对大鼠的学习记忆功能具有保护作用。表2、Morris水迷宫实验动物游泳潜伏期(秒)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>与模型组比较，*P<0.05;**P<0.01;***P<0.005;****P<0.001表3、空间探索实验(训练第5天)分组给药剂量平台象限停留时间(秒)穿越平台次数假手术组0mg/kg55.4±4.0**5.2±1.2**模型组0mg/kg28.3±2.51.4±0.6l氐齐'j量纟且50mg/kg48.9±7.2*3.0±0.7*高剂量组100mg/kg50.6±2.1**3.5±0,6**金纳多组25mg/kg_40.1±3.3_j.l±1.0*_~~与模型组比较，PO.05;**P<0.01;(7)形态学检査术后14天，将大鼠断头处死，迅速分离取出前脑皮层、海马，于中性福尔马林液中固定，切片做HE染色。除假手术组外，各组均见不同程度的皮质下各区域片状脑实质软化坏死灶，范围各组不等。①假手术组中枢神经系统各部均未见明显病变，大脑皮质神经细胞核未见明显异常，染色质分布均匀，血管内皮细胞无异常。海马区锥体细胞核未见明显异常，染色质分布均匀，血管内皮细胞无异常。②模型组大脑皮质实质区片状软化灶，部分已液化，并形成不整形囊腔，范围广，大量祌经元空泡样变，核膜变厚，染色体减少或消失，有的神经细胞肿胀变性，核膜不清。血管内皮肿胀现象。海马区多处神经细胞空泡样变，核膜变厚，染色体减少或消失，有的神经细胞肿胀变性，核膜不清。③活性天然产物B低剂量组大脑皮质神经细胞染色质分布不甚均匀，但轴突未见-明显异常，少量神经细胞空泡样变，血管内皮轻度肿胀。海马有范围较小的软化灶体液化。④活性天然产物B"高剂量组大脑皮质有片状软化灶，范围较大。海马周围有小灶性软化灶(伴有轻度钙化，属坏死后反应)。⑤金纳多组大脑皮质见有片状软化灶，但范围较小。海马锥体细胞染色质分布均匀，轴突明显，可见少数神经细胞核固縮，血管内皮细胞轻度肿胀。..两剂量给药组及阳性药金纳多组与模型组相比缺血性损伤的程度轻、范围小。以上试验结果说明活性天然产物B对血管性痴呆大鼠缺血性损伤有较强的保护作用，改善模型大鼠的学习记忆功能。因此，活性天然产物B可用于制备预防和治疗血管性痴呆疾病的药物。2、活性天然产物B对抗P-淀粉样蛋白致痴呆大鼠模型学习记忆能力(1)实验目的老年性痴呆一个特征病理改变是大脑皮层和海马出现由于(3-淀粉样蛋白(Beta-AmyloidProtein,简称A3)沉积而形成的老年斑，越来越多的证据表明在AD的发生、发展中起到主导的作用，Ae的神经毒性涉及到复杂的分子机制，主要包括破坏细胞内的钙离子稳态，促进自由基的形成，降低K离子通道的功能，增强致炎细胞因子引起的炎症反应等。本实验目的是观察活性天然产物B对AP致痴呆大鼠模型学习记忆能力的影响。(2)实验方法雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250—300g，麻醉后在颅顶部正中切开皮肤，暴露颅骨，参照《大鼠脑立体定位图谱》(包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.第1版，北京人民卫生出版社，1991,44-45.)，选择双侧海马CA1区为注射靶区，用牙科钻钻开颅骨，用微量进样器将聚集态的AeMO缓慢注入(共5jal，lpl/min)，留针10分钟以保证溶液充分扩散，然后缓慢撤针，缝合伤口。生理盐水组注入相同体积的生理盐水。第二天将造模成功的动物分组，本发明药物组分为高剂量组(100mg/kg)、低剂量组(50mg/kg)，每组16只。用活性天然产物B药液分别灌胃给药，每鼠每天10ml/kg，阳性药对照组每鼠每天灌胃金纳多混悬液(2.5mg/ml)10ml/kg，模型对照组及假手术组每鼠每天给予0.5%羧甲基纤维素钠10ml/kg，均连续2周。术后10天，Morris水迷宫实验'①实验丌始甜一天，先让大鼠在不含有平台的水池中自由游泳2min，以熟悉环境。②定位航行实验连续训练4天，每天4次。每一次均随机顺序从不同等分水池的4个起点将大鼠投入水池中，放入时使大鼠面向池壁，记录大鼠从入水到找到并爬上平台的23时间，这个时间称为逃避潜伏期。让其在平台上休息IO秒后再行下一次检测。如果在120秒内大鼠仍未找到平台，则将其引导到平台，潜伏期记为最高分120秒。每天4次潜伏期的算术均数作为这一时间段的成绩，进行统计分析。③空间探索实验训练第5天，在定向游泳实验结束后，立即将平台撤掉，仍然随机选取4个入水点中的一个放入大鼠，计录大鼠在原平台所在象限中的停留时间。(3)实验结果(见表4及表5)。由表中可见Morris水迷宫游泳训练后，药物各剂量组的游泳潜伏期较模型组显著降低(P<0.05);在空间探索实验中，药物组动物在平台所在象限停留时间明显多于模型组(P<0.05)。上述结果表明，活性天然产物B可以改善AP致痴呆大鼠模型的学习记忆能力。表4、Morris水迷宫实验动物游泳潜伏期(秒)分组给药剂量第l天第2天第3天第4天生理盐水组0mg/kg77.4±6.742.2±4.624.1±6.0**15.2±4.1"**模型组0mg/kg83.6±6.261.1±5.956.3±6.348.4±8.4低剂量组50mg/kg77.8±6.457.8±6.242.0±4.8*33.1±4.3**高剂量组100mg/kg78.9±7.555.3±8.139.5±6.2*30.5±7.6*金纳多组25mg/kg79.1±8.957.5±6.940.0±6.4*30.3±8.6*与模型组比较，*P<0.05;**P<0.01;***P<0.005;****P<0.001表5、空间探索实验(训练第5天)分组给药剂量平台象限停留时间(秒)穿越平台次数生理盐水组0mg/kg56.6±4.6**5.5±1.3**模型组0mg/kg34.5±5.81.5±0.7低剂量组50mg/kg49.8±7.7*2.9±0.6*高剂量组腦mg/kg46.9±3.〗**3.3±0.5**金纳多组25mg/kg46.1±3.9**3.3±0.9*与模型组比较，PO.05;**P<0.01;3、活性天然产物B抵抗过氧化氢致神经细胞损伤作用(1)实验目的在血管性痴呆和老年性痴呆的发展过程中，自由基与活性氧起着很大的促进作用。脑缺血可引起自由基及活性氧增高，自由基及活性氧进而攻击神经细胞，造成细胞死亡，引起一系列病变，引发长期损伤。这在动物实验和临床上可能影响认知功能，发展为痴呆。本实验的目的是观察活性天然产物B对活性氧过氧化氢(H202)致祌经细胞损伤具有抵抗作用。(2)实验方法使用人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系(形态与功能与神经元相似)，传代培养。活性24天然产物B与神经细胞预孵育12小时或24小时，换培养液，加H202与细胞孵育2小时。取上清液测定乳酸脱氢酶(简称LDH)活性，用MTT法测定细胞存活率。(3)实验结果，在11202致神经细胞损伤模型上，发现活性天然产物B可明显拮抗H202引起的细胞存活率下降及LDH漏出增多，减低11202的神经毒性，并且呈剂量依赖关系，提示活性天然产物B具有保护神经细胞作用，即对血管性痴呆具有防治作用(见表6，表7)。表6、活性天然产物B预孵育12小时对H202致SK-N-SH神经细胞损伤的影响组别NLDH漏出率(o/b)MTT(OD550nm)正常对照组62.50±0.42*0.5866±0.0209*H2O2模型组(500(iM)381.22±2.290.0413±0.0100金纳多组(50inM)349.91±6.01*0.2230±0.0269*活性天然产物B5pM+363.40±2.45*0.1096±0.0084*25|iM+H202362.31±2.61*0.1317±0.0321*50|iM+H202351.98±5.89*0.1439±0.0198*100|aM+H2O2352.01±6.21*0.2032±0.0261*200)iM+H202346.22±2.23*0.2486±0,0291*400拜+H202353.87士1，0.2165±0.0216*M±SD;*P<0.05,与&02模型组相比较。M±SD;*P<0.05，与H202模型组相比较。表7、活性天然产物B预孵育24小时对H202致SK-N-SH神经细胞损伤的影响组别NLDH漏出率CM))MTT(OD550nm)正常对照组63.22±0.49*0.8766±0.0463*H2O2模型组(500jaM)377.56±6,410,1455±0.0478金纳多组(50pM)38.91±5.23*0.5030+0.0256*活性天然产物B5nM+H202360.04±5.69*0.0711±0.0212*25|jM+H202333.53±0.79*0,1512士0.1742^50mM+h202318.72±4.32*0.2311±0.0208*lOO^M+H20238.56士2.0"0.5236±0.0211*200岸+H20236.16士1.10*0.6812±0.0440*400|_iM+H202361.90±5.02*0.2071±0週0*M土SD;*P<0.05，与H202模型组相比较。4、活性天然产物B提高东莨菪碱致痴呆小鼠模型学习记忆功能(1)实验目的老年性痴呆以基底前脑胆碱能神经元丢失最为严重，造成乙酰胆碱(acetylcholine,简称ACh)分泌不足。血管性痴呆和老年性痴呆有许多相似的病理学和症状特征，包括胆碱能神经递质ACh水平降低和与其相关的认知障碍。东莨菪碱是乙酰胆碱酯酶M受体阻25断剂，能够拮抗中枢神经的ACh，导致记忆力下降，可以模拟ACh分泌不足的结果，是比较有效的痴呆动物模型。(2)实验方法①Morris水迷宫试验雄性昆明小鼠50只，体重22-28克，动物随机分5组，分别为正常对照组、模型组、活性天然产物B低剂量组(50mg/kg)和高剂量组(100mg/kg)。实验前各组连续灌胃给药IO天后造模。试验当天给药1小时后，腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液lmg/kg，对照组注射等量的生理盐水。15分钟后进行Morris水迷宫试验，一天两次，连续三天。数据处理均由图像自动监视和处理系统完成。②避暗试验小鼠给药与注射东莨菪碱方法同上，东莨菪碱剂量为20mg/kg。注射15分钟后进行避暗试验。本方法为被动回避试验，小鼠有喜欢黑暗的习性，进入暗室则遭电击。第2、3、4天进入暗室的潜伏期越长、进入次数越少，表明学习记忆功能越好。3.实验结果试验发现活性天然产物B高剂量组组可以明显縮短小鼠游出时间和游泳距离(表8)，表明活性天然产物B可以改善改善东莨菪碱模型小鼠空间学习记忆能力。避暗试验发现活性天然产物B高剂量组可明显延长潜伏期，减少进入暗室的次数(表9)，表明活性天然产物B可以改善小鼠被动回避学习记忆功能，其机理与ACh能神经功能增强有关。表8、活性天然产物B对东莨菪碱致痴呆小鼠模型水迷宫游出时间及游泳距离的影响组别N游出时间(秒)游泳距离(cm)正常对照组1070.9±46.9*1151±840*模型组10100.2±39.21821±873活性天然产物B50mg/kg1084.5±46.01522±1012活性天然产物1077.1±45.8*1377±923*B100mg/kg_M±SD;*P<0.05，与模型组相比较。表9、活性天然产物B东莨菪碱致痴呆小鼠模型避暗试验潜伏期及错误次数的影响组别N潜伏期(秒)错误次数正常对照组10320±50.80.00±0.00*模型组10251.8±77.10.80±1.32活性天然产物B50mg/kg10279.2±56.0.25±1.13活性天然产物B100mg/kg10_300.6±45.6*_0.00±0.00*_M±SD;*P<0.05，与模艰幼相比较。5、活性天然产物B抑制脑缺血再灌注小鼠模型脑组织脂质过氧化(1)实验目的缺血后脑内自由基的产生、氧化应激导致的神经元损伤是老年性痴呆和血管性痴呆弓起认知损害的一个重要因素。脑缺血后产生大量自由基的产生而引起的脂质过氧和氧化应激，导致脂质过氧化。过氧化脂质是生物膜和细胞中磷质所含多元不饱和脂肪酸被自由基损伤、氧化而形成的过氧化产物，可引起膜损伤、酶抑制、溶酶体释放、蛋白交联、DNA和RNA结构破坏等反应，从而破坏细胞正常的生理功能，最终可导致细胞死亡。本实验旨在观察活性天然产物B对脑组织脂质过氧化代谢产物丙二醛(简称MDA)含量增高的影响。(2)实验方法昆明小鼠，雄性，体重22~28克，随机分组，实验前各组连续灌胃给药7天，对照组(假手术组)及缺血模型组分别给予自来水。手术当日空腹给药后lh，于小鼠麻醉后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉15分钟，再灌注15分钟后迅速断头取脑，去掉小脑。脑组织称重，1:10加入0.2M磷酸盐缓冲液匀浆，3000转/分离心IO分钟，取上清0.5ml，用硫代巴比妥酸(简称TAB)法测定脑组织中MDA含量。(3)实验结果活性天然产物B灌服可降低急性脑缺血再灌注小鼠脑组织MDA含量(见表IO)，表明该药可抑制脂质过氧化，其机理可能为减少自由基生成或增强自由基清除。活性天然产物B的抗脂质过氧化作用有利于防治血管性痴呆和老年性痴呆。表10、活性天然产物B对急性脑缺血再灌注小鼠脑组织MDA含量的影响组别NMDA(nmol/mg蛋白)对照组(假手术组)101扁±0,148*模型组(缺血再灌)10U86±0.192金纳多25mg/kg+缺血再灌101.091±0.116*活性天然产物B30mg/kg+缺血再灌101.169±0.156活性天然产物B100mg/kg+缺血再灌01.010±0.151**活性天然产物B300mg/kg+缺血再灌101.021±0.139**M土SD;*P<0.05，**P<0.01，与缺血模型组相比较。6、增强脑缺血再灌注小鼠模型脑组织超氧化物歧化酶活性(1)实验目的超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化与杭氧化平衡起着至关重要的作用。体内过多的超氧阴离子可引起脂质氧化，损害细胞，与多种疾病以及衰老等病理过程相关。此酶可催化超氧阴离子发生歧化反应，使之转化为过氧化氢和氧，保护细胞免受损伤。本实验旨在观察活性天然产物B对脑缺血再灌注小鼠模型脑组织SOD活性降低的影响，探讨活性天然产物B抑制脂质过氧化的机理。(2)实验方法昆明小鼠，雄性，体重2228克，随机分组，实验前各组连续灌胃给药7天，假手术27组及缺血模型组分别给予自来水。手术当日空腹给药后lh,于小鼠麻醉后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉15分钟，再灌注15分钟后迅速断头取脑，去掉小脑。脑组织称重，1:10加入0.2M磷酸盐缓冲液匀浆，3000转/分离心IO分钟，取上清0.1ml，用亚稍酸盐法测定脑组织中SOD活性。(3)实脸结果活性天然产物B灌胃口服可增高急性脑缺血再灌注小鼠脑组织SOD活性(见表11)，表明该药具有增强机体清除自由基的作用，这可能是其抑制脂质过氧化的机理。活性天然产物B促进内源性抗氧化酶活性的作用有利于防治血管性痴呆和老年性痴呆。表11、活性天然产物B对急性脑缺血再灌注小鼠脑组织SOD活性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>M±SD;*P<0.05,**P<0.01，与缺血模型组相比较。7、减低脑缺血再灌注小鼠模型脑片细胞内钙离子浓度(1)实验目的在血管性痴呆和老年性痴呆的发病机理中，神经细胞内钙离子浓度增高、钙超载起重要作用。脑缺血再灌注后发生一系列变化，包括钙离子尤其是神经细胞内钙浓度的异常增高、钙超载，在缺血性脑损伤起重要作用，最终可使得神经元细胞死亡。本实验旨在观察活性天然产物B对模型动物脑片细胞内钙离子浓度增高的影响。(2)实验方法雄性昆明小鼠，体重2228克，动物随机分组，实验前各组连续灌胃给药7天，假手术组及缺血模型组分别给予自来水。手术当日空腹给药后lh，在小鼠麻醉后，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉15分钟，再灌注15分钟后迅速断头并取出全脑，迅速浸入4°C通有95%的C02和5%02的人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluidsolution,简称ACSF，ACSF酉己方为(mmol/L):NaCl124，KC13.3,KH2P041.2，NaHC0326，CaCl22.5，MgS042.4，葡萄糖10)，在振动切片机上切出脑片，厚度400^n，放入C02培养箱中，37'C孵育30min，加入5uM的Fluo-3AM500ul，在C02培养箱中负载m后，ACSF冲洗数次，在激光扫描共聚焦显微镜上进行光学切片，观察荧光强度。激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicrosc叩e，简称LSCM)可用于对细胞结构(生物膜、细胞器、染色体等)及分子(核酸、蛋白质、脂类等)、离子(Ca2+，K+等)进行定位、定量、实时、动态的观测。光学切片是激光扫描共聚焦显微镜的特色之一，可以实现对离体活脑片进行连续无损切割，光切可以获得样品表面的和深层的信息，通过三维重建技术，能够获得三维图象和立体结构信息。钙荧光指示剂Fluo-3AM本身无荧光，但它具有能与活细胞内[C^+]特异性结合后发出荧光的特性，利用激光扫描共聚焦显微镜测定荧光强度，可以检测细胞内游离钙的水平。图象处理利用LaserSharp图象处理系统，测定左右海马区、皮层区的面积或体积和总的荣光强度，以单位面积或单位体积荧光强度及荧光强度分布中值(即Mean，系统给出)为指标，观察海马、皮层的细胞内游离钙的水平。统计方法实验数据均采用均值土标准差(x士s)表示，组间差异的显著性用Z检验。(3)实验结果活性天然产物B各剂量组灌胃口服皆可降低脑缺血再灌注小鼠模型大脑皮层和海马区神经细胞内钙离子浓度(见表12)，这对于保护神经细胞、防治血管性痴呆和老年性痴呆具有重要意义。表12、对脑缺血再灌注小鼠模型神经细胞内钙离子的影响组别N细胞内钙离子荧光值皮层(Pix/jum2)海马(Pix/pm2)对照组(假手术组)30.6041±0.6305*0.4727±0,4122*模郭.组(缺血再灌)31.0439±0.26400.8390±0.2861金纳多25mg/kg+缺血再灌0.3736±0.1382*0.4412±0.2068*活性天然产物B30mg/kg+缺血再灌30.4480±0.1101**0.4383±0.1023*活性大然产物B100mg/kg+缺血再灌30.4742±0.2663**0.6545±0.3181*活性天然产物B300mg/kg+缺血再灌30.5933±0.3150*0.6619±0.3956*M±SD;*P<0.05，**P<0.01，与缺血模荆组相比较。(五)活性天然产物B抗真菌活性本发明通过体外抗真菌抗肿瘤实验证明，活性天然产物B对四种常见临床病原真菌有一定抑制作用(见表13)，并能不同程度抑制肿瘤细胞株的生长，在以人正常细胞株(1^-02)、人肝癌细胞株(HepG-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺癌细胞株(A-549)为靶细胞的MTT还原法检测抗肿瘤活性试验中，活性天然产物B的MIC加如表14所示，表明活性天然产物B可用于制备抗肿瘤药物。1、菌株ATCC标准株白念珠菌(Candidaalbicans)ATCC76615、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)ATCC32609均山长征医院菌种保存中心赠送。临床株红色毛癣菌29(Trichophytonrubrum)0504656、烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)0504656,采自上海长海医院，并经形态学和生化学鉴定。2、菌液制备用接种圈从保存的SDA培养基上挑取新生隐球菌、白念珠菌和近平滑念珠菌等球状菌少量，接种至lmlYEPD培养液，于35。C，250rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至lmlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整菌液浓度至lxl(^5xl()S个/ml。将烟曲霉菌接种至SDA斜面，35'C培养一周；红色毛癣菌，28'C培养两周。各菌按本方法活化两次，加适量RPMI1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至Ixl035xl03+/ml。3、药敏板制备取无菌％孔板，于每排1号孔加RPMI1640100pi作空白对照；312号孔各加新鲜配制的菌液1202号孔分别加菌液160pi和受试化合物溶液1.6pl。211号孔10级4倍稀释，使各孔中的药物终浓度分别为64、16、4、1、0,25和0.0625、0.0156、0.0039、0.00097、0.00024mg七-1，各孔中DMSO含量均低于1%;12号孔不含药物，作阳性对照，各药敏板于35'C培养。4、MIQo值判定念珠菌、新生隐球菌及丝状菌分别于35。C培养24h、72h和一周后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC肌(真菌生长80%被抑制时的药物浓度)。表13、活性天然产物B对4种真菌的抗菌活性(MIQ。.吗/ml)药名白念球菌新生隐球菌红色毛藓菌烟曲霉菌ATCC76615ATCC3260905046560504656活性产物B0.580.250.25灰黄霉素8422酮康唑80.250.06250.0156当药物的MIQo值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计MIC8o值高于最高浓度64mg'L"时，计为"〉64mg'L"";MICso值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为"50.00024mg'L—"'。上述实验均平行操作2到3次，当MIC8Q值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC8o值，当MICso值相差两个浓度以上时，则30需重新实验，直到符合要求。有四个化合物有不同程度的抗真菌活性(表13)。(六)活性天然产物B的抗肿瘤活性本发明通过体外抗真菌抗肿瘤实验证明，活性天然产物B对四种常见临床病原真菌有一定抑制作用(见表13),并能不同程度抑制肿瘤细胞株的生长，在以人正常细胞株(1^02)、人肝癌细胞株(H印G-2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肺癌细胞株(A-549)为靶细胞的MTT还原法检测抗肿瘤活性试验中，活性天然产物B的MIC8Q如表14所示，表明活性天然产物B可用于制备抗肿瘤药物。MTT还原法检测活性天然产物B抗肿瘤活性试验如下1.材料1.1四脞盐(MTT):用O.Olmol/L的磷酸盐缓冲液(简称PBS)溶解MTT(3-(4,5-dimethythiazol-z-yl)2,5-diphenytetrazoliumbromide,简称SIGMA)终浓度5mg/ml，过滤除菌，分装后4'C避光保存。1.2MTT裂解液的配制80g的十二垸基磺酸钠(简称SDS,华美生物工程公司)溶解在200ml的N-N-二甲基甲酸胺(国药)中，水浴加热助溶，加入200ml蒸馏水，用80%乙酸与IN盐酸(1:1)混合调pH至4.7。1.3细胞株选用人正常细胞株(L-02)，人肝癌细胞株(hepg-2)，人乳腺癌细胞(mlf-7)和人肺癌细胞株(a-549)。2.操作步骤a.单细胞悬液接种于96孔板(用RPMI-1640基础培养基将细胞稀释至3X104/1111，每孔加入20Ul稀释好的细胞)，37°C，5%C02，饱和湿度下培养24小时每组四个平行样；b.去除培养基，取新配制培养基按系列浓度制备抗癌药物(活性天然产物B)溶液，每孔200iU，培养48小时；c.每孔加入2mg/ml的MTT20ul，孵育4小时；d.吸出孔内培养液(尽量完全)，加入DMSO液(150ul/孔)，振荡10分钟，使结晶物充分溶解；e.酶标仪检测各孔OD值(A=570nm);f.绘制细胞活力曲线图，求出IC50值。表14、活性天然产物B的细胞毒试验结果(ixg/ml)药名人正常细胞株人肝癌细胞株人乳腺癌细胞人肺癌细胞株(L-02)(hepg-2)(mlf-7)(a-549)活性天然产物B16.7156.9383.1854.062两性霉素15,24910.2238.08211.42831试验结果如表14所示。试验结果说明，活性天然产物B具有较强的细胞毒，其毒性对正常细胞和癌细胞具有一定的选择性；对于不同肿瘤细胞表现出不同细胞毒性。活性天然产物B有用做制备抗肿瘤药物的潜力。(七)活性天然产物B的提取方法PDB培养基搅拌均匀后分装到250ml的锥形瓶中(100ml/瓶)，封口后经高压灭菌，冷却备用。要培养的菌株转移到PDA平板上，28'C培养一周，在超净台中用打孔器(d二3mm)将长有菌丝的琼脂块定量接种至250ml锥形瓶中(5块/瓶)，每一菌株接种三瓶以验证其重复性，三瓶空白PDA培养基作为对照。然后将接种好的摇瓶置于恒温摇床中28"C震荡培养一周(180转/分)。1、有机溶剂萃取培养得到的发酵液，减压过滤后，用等体积的乙酸乙酯萃取三次；收集有机相(乙酸乙酯层)在旋蒸仪中减压旋干得浸膏。2、硅胶柱梯度洗脱配置氯仿/甲醇(100:l，50:1,30:1，20:1，10:1,8:1)—系列梯度的展开剂。在硅胶装柱完成后，用样品溶液点在硅胶板上，在各比例展开剂中逐一实验。选择能使目标点Ri值在0.2附近的展开剂洗脱目标点，首先极性最小的物质被洗脱下来，按极性大小逐一洗脱分离。3、葡聚糖凝胶LH-20纯化化合物流动相采用甲醇，甲醇/氯仿(1:1)两种流动相，上样后自动接收仪自动收集，流速12滴/分钟。所得各试管溶液通过TLC检测，按检测结果进行处理。由于不损失样品，可以多次反复上柱，并调换流动相，以达到好的分离效果。4、TLC制备硅胶版若化合物样品很少且硅胶柱和葡聚糖凝胶柱都不能很好的分离纯化，则考虑用薄层制备硅胶版分离，用TLC检测板探讨最适展开条件。样品在TLC检测板上用各不同极性展开剂(氯仿/甲醇不同配比展开剂)展开；选择能使目标点与杂质点显著分开的展开剂为制备板展开剂，Rf值0.5左右为宜。在具体实施时，需要根据现有的资金、技术和有关的要求，采用其中合适的方法，并选取合适的条件等必要的措施以达到预期的目标。而这些方法也均是本领域的公知技术，在需要进一歩确证的时候，都是很容易从有关的教材和相关的技术文献等査阅到包括技术细节在内的所有技术资料。(八)活性天然产物B的用途1、概述32一种用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品，包括药物、试剂、食品等中的一种或多种，优选药物。通过药理活性筛选证明，活性天然产物B为其预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的活性部位。经实验研究表明，活性天然产物B体外能够显著延缓相关疾病的发展。已完成的急性毒性实验证明，小鼠灌胃给药对该活性部位的最大耐受量超过1.0g/kg，相当于临床推荐用药剂量的200倍以上，表明该有效部位安全可靠，解决了中药复方中成分复杂、有效成分含量低且含有有毒成分的问题。综上所述，发明人对活性天然产物B进行了理论探索，经过大量的实验研究特别是长期的药理学试验，发现所述及的活性天然产物B有显著的预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的活性。因此，活性天然产物B及其组合物可用于制备抗真菌产品、抗肿瘤产品和抗血管性痴呆产品，优选以本发明活性天然产物B为原料制备而成的药物。2、活性天然产物B及其组合物的使用方法与要求本发明活性天然产物B可以单独或与其它活性组分联合使用，包括用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品，包括药物、试剂或食品等，尤其是药物。在具体使用方面，本发明所述的活性天然产物B能够单独使用，例如以活性部位、其衍生物或药用盐的形式应用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解活性天然产物B的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种或多种；进一歩优选医药学上可接受的载体。本文使用的"医药学上可接受的载体"包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，'糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了该活性天然产物B的有效期或效力。从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，33包括润滑剂，如滑石粉、聚乙二醇或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如淀粉、糊精或乳糖等中的一种或多种；粘合剂，如预胶化淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或多种；渗透压调节剂，如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；pH调节剂，如盐酸、氢氧化钠等酸或碱中的一种或多种；溶剂，如水、缓冲液、乙醇或丙二醇等中的一种或多种等；抗氧剂和络合剂，如亚硫酸钠、EDTA等中的一种或多种；表面活性剂，如季铵化合物、十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；高分子骨架剂，如环糊精、聚乙二醇、泊洛沙姆等中的一种或多种；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂、防腐剂或甜味剂等中的一种或多种。例如，将活性组分活性天然产物B溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有增溶剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚维酮、环糊精、泊洛沙姆、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9-甘露糖、D-山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如稳定剂(例如，人血清白蛋白等)、止痛剂(例如，盐酸普鲁卡因或利多卡因等中的一种或多种)等。本发明所述及的活性天然产物,B还可以以组合物的形式联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、猴、猪、兔或犬等中的一种或多种，进一步优选人、大鼠或猴等中的一种或多种。例如，.可以将本发明活性天然产物B加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明活性天然产物B和药学上可接受的载体。活性天然产物B的组合物特别是药物组合物可以有各种形式，包括例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的活性天然产物B为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。本发明所述的活性天然产物B或其药物组合物能够可以采用本领域公知的常规生产方法制成任何一种适合于实验、研究或临床上应用的剂型，包括固体制剂如胶囊、片剂、颗粒制剂等，液体制剂如口服液或者注射剂等。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，釆取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗真菌、'抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。药物组合物优选含有重量比为0.5%~99%的活性成分活性天然产物B，进一步优选含有重量比为1%~95%的活性成分活性天然产物B，最优选含有重量比为5%~90%的活性成分活性天然产物B。活性天然产物B的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该活性天然产物B与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该活性天然产物B加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。.例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。该组合物中可包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐或明胶，以达到注射组合物的延长吸收；可包括高分子聚合物载体，如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯，以达到口服组合物的延长释放。用于患者时，本发明所述的活性天然产物B剂量为5~20mg/kg*d，可以分一次或多次使用，该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。本发明活性天然产物B及其药用组合物可以包括"治疗有效量"或"预防有效量"的本发明活性天然产物B。"治疗有效量"是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。活性天然产物B的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该活性天然产物B在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该活性天然产物B的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。"预防有效量"是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂暈用于患病甜或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明活性天然产物B的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是520mg/kg，更优选为5~10mg/kg。应注意，剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的活性天然产物B剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况來决定。另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，35并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。也就是说，需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明活性天然产物B的每次和/或每円的剂量或用量。例如，经静脉给予哺乳动物.，尤其是成年人(如体重60kg)，所述活性天然产物B的单剂量约为501200mg，优选约100mg，优选每闩给药13次。可以调整剂量单位，以提拱最佳所需反应(例如，治疗或预防应答)。例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式，指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物活性天然产物B。本发明的剂量单位形式的规格，由以下确定并直接取决于以下(a)该活性天然产物B的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性活性天然产物B的技术中的内在限制。3、活性天然产物B及其组合物的药物剂型和给药途径本发明所述的活性天然产物B及其组合物制备的用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品，其中按照饮料、食品
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的要求制备的产品能够用于预防、保护和治疗抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病；按照医药
技术领域：
的要求制备的产品能够用于患者的治疗或保健，既能够单独直接用于制备治疗或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗或保健的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用食品级或药用级的物料。本发明所述的活性天然产物B及其组合物，可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是喷雾剂或口服给药。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如空释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚iH酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J.R.Robinson编辑，MarcelDekker,Inc.,纽约，1978)。本发明所述的活性天然产物B或其药物组合物中，可以含有本领域公知的医药学上可接受的载体和其它任选成分。载体包括羧甲基淀粉、淀粉、纤维素、明胶、碳酸氢钠、丙36二醇或吐温80等。任选成分例如是着色剂、甜味剂、抗氧剂等。本发明所述的活性天然产物B及其组合物，通常通过口服、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。本发明所述的活性天然产物B、其衍生物或药用盐、组合物特别是药物组合物可以制成任何一种适合于临床上应用的剂型，包括固体制剂，如胶囊、片剂、颗粒制剂等，半固体制剂如软膏等，液体制剂如口服液、混悬剂、乳剂等，或者注射剂。采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行血管性痴呆和老年性痴呆及其直接相关疾病的预防、诊断、检测、保护、治疗或科学研究。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时，本发明活性天然产物B可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该活性天然产物B(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述活性天然产物B与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。为了以非肠道给药之外给予本发明活性天然产物B，可能需要用防止其失活的材料对该活性天然产物B包衣或与该活性天然产物B—同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明活性天然产物B与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆、釘剂或酏剂等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。以上药物或药物组合物能够使用各种途径，在所述的使用形式中，优选的形式是口服制剂(如片剂、包衣片剂、胶囊、溶液或混悬液等中的一种或多种)、非肠道给予剂型(如注射剂、软膏或贴剂等中的一种或多种)等中的一种或多种，进一歩优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，特别优选片剂或注射剂中的一种。此外，活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等在某些情况下也能够单独直接用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品，也能够与许多化学物质进行混合或组合，以组合物的形式直接或间接用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品。这単所述的化学物质与本节上文中所述的相同。例如，活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末用于制备用于抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症预防、诊断、保护和治疗产品特别是药物的各种剂型，或者是活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末与有关的辅料用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和5开究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品尤其是药物的各种剂型，或者是活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末与有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品如药物一起用于制备用于预防诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品如药物的各种剂型，或者是活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末与有关的辅助药物一起用于制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品如药物的各种剂型，如片剂、胶囊剂或混悬剂等中的一种或多种，优选胶囊剂。所述的方法之一是将活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末灌装为胶囊剂，方法之二是将活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉水与有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品如药物一起灌装为胶囊剂，方法之三是将活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末与有关的辅助药物一起灌装为胶囊剂；方法之四是将活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末与有关的辅料一起按常规方法直接压为片剂，方法之五是将活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末、有关的制备用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品如药物一起与有关的辅料按常规方法直接压为片剂，方法之六是将活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的粉末、有关的辅助药物一起与有关的辅料按常规方法直接压为片剂等。除上述的六种基本方法外，还能够选择活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的其他形式或对活性天然产物B所使用的药材原料进行本领域公知的方法处理后，制备各种剂型的含有活性天然产物B所使用的药材原料的产品如药物。但是，需要注意的是，在上述直接使用活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的时候，应先根据所使用的活性天然产物B的剂量要求，换算得到所需要使用的活性天然产物B所使用的药材原料包括海洋真菌或海洋真菌粗提物等的用量。综上所述，本发明活性天然产物B及其组合物可用于预防、诊断、检测、保护、治疗38和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品，优选药物和食品，进一步优选药物。(九)技术特长本发明对四五螺环内酯类活性天然产物B拓展了新的医药用途，也为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病提供了一种新的药物来源。本发明的活性天然产物B安全低毒，药理作用较强，其原料来源丰富、价廉，制备工艺简单，得率高，可用于制备预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的产品。本发明有针对性地研究活性天然产物B，活性天然产物B药理作用较强，其使用安全，一物多用，最大限度地发挥了作用；活性天然产物B性质稳定，使用制备的制剂质量稳定，更适于抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症产品的工业化生产；预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病的效果明显，且使用范围特别广，因此容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发新的抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症产品提供了新的来源，对开发利用中国的药用植物资源具有重要价值，是用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病等方面的安全原料。具体实施例方式本发明研究了现有的活性天然产物B的新的药理作用和新的用途，提供了一种能够用于制备抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症预防、诊断、保护和治疗等产品的原料，便于医疗行业和相关行业如食品、饮料等领域的安全使用。活性天然产物B及其组合物的常用药物制剂的制备方法
技术领域：
：本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为取活性天然产物B，加入赋形剂，加水溶解，调节pH，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷、白蛋白、pH调节剂等中的一种或几种。每瓶含活性天然产物Bl100mg。本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其歩骤为取活性天然产物B，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含活性天然产物B10100mg。本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、环糊精、39抗氧剂、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。注射剂可以配制成溶液、微乳液、乳液、脂质体、微球、微囊或其它适合于高药物浓度的有序结构，其中可包括延迟吸收的药剂，例如单5i脂酸盐、明胶、乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚Jf.酯或聚乳酸等，以达到注射组合物的延长吸收。每支含活性天然产物Bl100mg。本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸、二甲基乙酰胺、pH调节剂、表面活性剂、抗氧剂、环糊精、金属离子络合剂、抑菌剂中的一种或几种。每瓶含活性天然产物Bl100mg。本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。可包括高分子聚合物载体，如羟丙甲基纤维素或聚氧乙烯等，以达到口服组合物的延长释放。在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。下面通过实施例对本发明作详细描述。实施例1、活性天然产物B粉针剂的制备取活性天然产物B10g，加入右旋糖苷30g，加1500ml注射用水，调节pH至9.0，搅拌使其溶解；加注射用水至2000ml，加3.0g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22nm微孔滤膜过滤；分装，半轧塞；冷冻干燥，再压塞轧盖即可。实施例2、活性天然产物B粉针剂的制备取活性天然产物B50g，加入甘露醇60g，加5000ml注射用水，调节pH至8.0，搅拌使其溶解；加注射用水至6000ml，加lg针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22pm微孔滤膜过滤；分装，半轧塞；冷冻干燥，再压塞轧盖即可。实施例3、活性天然产物B粉针剂的制备取活性天然产物Blg，加入葡萄糖50g,加900ml注射用水，调节pH至8.5，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22pm微孔滤膜过滤；分装，半轧塞；冷冻干燥，再压塞轧盖即可。实施例4、活性天然产物B小针剂的制备取活性天然产物B5g，加900ml注射用水，调节pH至9.0，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加l.Og针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22)im微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶10ml。实施,例5、活性天然产物B小针剂的制备取活性天然产物B10g，加入乙醇600ml，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml,加0.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22pm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶5ml。实施例6、活性天然产物B葡萄糖输液的制备取活性天然产物B2g，加入，乙二醇10g，加入葡萄糖500g，加4500ml注射用水，搅拌使其溶解；加5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；加注射用水至5000ml;用0,22iim微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶500ml，热压灭菌。实施例7、活性天然产物B氯化钠输液的制备取活性天然产物Blg，加入氯化钠90g，加卯OOml注射用水，搅拌使其溶解；加10g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；加注射用水至10000ml;用0.22pm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，热压灭菌即可。实施例8、活性天然产物B片剂的制备(1)处方活性天然产物B1000.0g微晶纤维素1170.0g预胶化淀粉690.0g乳糖125.0g5。/oPVP无水乙醇适量硬脂酸镁15.0g共制成10000片包衣液处方胃溶薄膜衣料85G61235,上海卡乐康包衣技术有限公司(2)制备工艺按以上处方分别称取处方量的主药与辅料，按等量递加法混合均匀，5。/。PVP无水乙醇制软材、干燥、整粒，加入硬脂酸镁混匀，测定含量，计算片重后压片，控制裸片硬度57kg，共制得片剂9698片，成品率为％.98%。采用常规高效包衣锅包衣，工艺如下将裸片(硬度57kg)放入包衣锅中，启动搅拌装置和鼓风加热装置，待裸片温度升至4(TC时，丌始打丌喷枪对准片床的上1/3处喷入包衣液包衣，控制片床温度3842"C，气磅压力6kg，包衣液流速为50mL/min，包衣膜重占包衣片重的3%。实施例9、活性天然产物B片剂的制备(1)处方活性天然产物BlOO.Og乳糖80.0g淀粉60.0g羧甲基淀粉钠15.0g10%PVP水溶液适量'硬脂酸镁_3.0g共制成^1000片(2)制备工艺取原辅料分别过80目筛，混合均匀，用适量1(T/。PVP溶液制软材，干燥，加入硬脂酸镁3g，整粒，压片，制成1000片。实施例IO、活性天然产物B胶囊剂的制备(1)处方活性天然产物B1000.0g-微晶纤维素1000g淀粉140g无水乙醇适量'滑石粉__共制成10000胶囊(2)制备工艺分别取原料药活性天然产物B及处方中其它辅料分别过100目筛，置6(TC烘干，称取处方量活性天然产物B与微晶纤维素、淀粉等量递加法混合均匀，用适量无水乙醇制软材，30目筛制粒，506(VC干燥2小时，用30目筛整粒，加入处方量的滑石粉混合均匀，填充。实施例11、检测活性天然产物B的抗病原真菌活性1.材料l丄菌株-ATCC标准株白念珠菌(Candidaalbicans)ATCC76615、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)ATCC32609均由长征医院菌种保存中心赠送.临床株红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)0504656、烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)0504656，分别采自上海长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定.1.2.培养液RPMI1640培养液RPMI1640(GibcoBRL)10g，NaHC032.0g，吗啡啉丙磺酸42(morpholinepropanesulfonicacid，MOPS)(Sigma)34.5g(0.165M)，加三蒸水900ml溶解，NaOH调pH至7.0(25。C)，定容至1000ml，滤过消毒，4。C保存.沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA):蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4°C保存。YEPD培养液酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g,加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高压灭菌后4。C保存.1.3.试药氟康唑(fluconazole)和酮康唑(ketoconazole)由本院有机化学教研室提供.DMSO为国产分析纯，用前重蒸.1.4.仪器隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；MultiskanMK3'酶标分析仪(LabsystemsDragon);2.操作歩骤2丄菌液制备实验前，用接种圈从4'C保存的SDA培养基上挑取新生隐球菌、白念珠菌和近平滑念珠菌等球状菌少量，接种至lmlYEPD培养液，于35'C，250rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期.取该菌液至lmlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI1640培养液调整菌液浓度至lxl()S5xlOJ个/m1..将烟曲霉菌接种至SDA斜面，35'C培养一周；红色毛癣菌，28'C培养两周.各菌按本方法活化两次后，加适量RPMI1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使真菌孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤.培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至lxl()35xl03个/m1.2.2.药液制备受试药物分别用DMSO配成6.4g，L—1溶液，一20'C保存，实验前，将药液取出置35°C温箱融化备用.2.3.药敏板制备取无菌％孔板，于每排1号孔加RPMI1640100pl作空白对照；312号孔各加新鲜配制的菌液120pi;2号孔分别加菌液160pi和受试化合物溶液1.6p1.211号孔10级4倍稀释，使各孔中的药物终浓度分别为64、16、4、1、0.25和0.0625、0.0156、0.0039、0.00097、0.00024mg七"，各孔中DMSO含量均低于1%;12号孔不含药物，作阳性对照，各药敏板于35'C培养.2.4.MIQo值判定念珠菌、新生隐球菌及丝状菌分别于35t:培养24h、72h和一周后，用酶标分析仪于630nm测各孔OD值.与阳性对照孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC8Q(真菌生长80%被抑制时的药物浓度).当药物的MIQo值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计MICso值高于最高浓度64mg'L"时，计为"〉64mg七""；MIQo值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为"50.00024mg七—'".上述实验均平行操作2到3次，当MIC犯值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MICso值，当MICso值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。表13中数据显示化合物B对于白色念珠菌，新生隐球菌的作用优于灰黄霉素.4权利要求1.活性天然产物B在制备抗真菌产品、抗肿瘤产品及抗血管性痴呆产品中的应用。2、根据权利要求1所述的活性天然产物B的组合物在制备抗真菌产品、抗肿瘤产品及抗血管性痴呆产品中的应用。3、根据权利要求1所述的活性天然产物B的药材原料在制备抗真菌产品、抗肿瘤产品及抗血管性痴呆产品中的应用。4、根据权利要求3所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的活性天然产物B的药材原料是海洋真菌或海洋真菌粗提物中的一种。5、根据权利要求4所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的活性天然产物B的药材原料是海洋真菌Afo^san'"a加"/cato或海洋真菌Afa^an'/wr粗提物中的一种。6、根据权利要求1所述的活性天然产物B的药材原料的组合物在制备抗真菌产品、抗肿瘤产品及抗血管性痴呆产品中的应用。7、根据权利要求6所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的活性天然产物B的药材原料是海洋真菌或海洋真菌粗提物中的一种。8、根据权利要求7所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的活性天然产物B的药材原料是海洋真菌Mowan'"fl^m'cato或海洋真菌Afowan'"a^m'ca/a粗提物中的一种。9、根据权利要求18任一项所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的抗真菌产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究病原真菌及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的病原真菌是指白念球菌、新生隐球菌、红色毛癣菌和烟曲霉菌。10、根据权利要求18任一项所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤产品是指直接用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究肿瘤及其直接相关疾病的产品中的一种或多种，所述的肿瘤是指肝癌、乳腺癌和肺癌。11、根据权利要求18任一项所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的抗血管性痴呆产品是指直接用于预防、珍断、检测、保护、治疗和研究血管性痴呆及其直接相关疾病的产品中的一种或多种。12、根据权利要求18任一项所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的抗真菌产品、抗肿瘤产品及抗血管性痴呆产品是包括药物、试剂或食品中的一种。13、根据权利要求12所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的抗真菌产品、抗肿瘤产品及抗血管性痴呆产品是药物。14.根据权利要求18任一项所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，该活性天然产物B是指白藜芦醇-3-0-P-D-葡萄糖苷，结构式如下o15.根据权利要求14所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的活性天然产物B的纯度》95%。16.根据权利要求14所述的活性天然产物B的应用，其特征在于，所述的活性天然产物B的使用方式是包括单独使用或与其他化学物质联合使用中的一种。全文摘要本发明涉及海洋真菌提取物——活性天然产物B的用途。经体外研究试验显示，活性天然产物B对白念球菌、新生隐球菌、红色毛癣菌和烟曲霉菌等常见临床病原真菌有一定抑制作用，能不同程度抑制肝癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞株的生长，并能对大鼠多发性梗塞性脑缺血损伤等造成的病理损伤有较强的保护作用，能够显著改善痴呆大鼠的学习记忆功能，可用于制备抗血管性痴呆产品。本发明为临床抗真菌、抗肿瘤、抗血管性痴呆症及其直接相关疾病治疗提供了一种新的药物来源，对开发利用我国的药用资源具有重要价值。文档编号A61K45/00GK101642569SQ200910194849公开日2010年2月10日申请日期2009年8月31日优先权日2009年8月31日发明者冯建平,徐丽莉,飞游,秦路平申请人:杭州双马生物工程有限公司