曲克芦丁在制备抗病毒性肝炎药物中的用途的制作方法

专利名称：：曲克芦丁在制备抗病毒性肝炎药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及曲克芦丁(Troxerutin)在药物中的用途；尤其涉及曲克芦丁在制备抗病毒性肝炎药物中的新用途，特别是在制备抗病毒性乙肝和病毒性丙肝药物中的新用途。
背景技术：
：病毒性乙型肝炎是一种严重危害人类健康的常见病，它的防治是一个全球性公共卫生问题，已引起世界各国政府的关注。我国是病毒性肝炎的高发区，平均发病率为120140/10万。其中尤以乙型肝炎为突出。乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者超过2.8亿，我国约占9300万。其中1/3出现肝损害的临床表现，目前我国有乙肝患者3000万，每年约有30万人死于与乙肝有关的肝硬化或肝癌。中国肝炎防治基金会于2005年公布的《中国肝炎的流行现状及其相关问题分析报告》显示，仅有19%的人目前正在接受抗病毒这一正确的治疗方式。我国肝炎病毒携带者的数量正以每年平均250万人左右的速度迅猛增长。乙型肝炎不仅严重危害我国人民的健康，而且还给国家带来严重的社会经济负担。乙型肝炎的治疗时间长，医疗费用较高，再加不恰当的滥用药物，更加重了额外的经济负担。我国每年用于治疗乙型肝炎、肝硬化、肝癌的直接医疗耗费约为300亿元人民币。因此，加强病毒性肝炎的预防，探求乙型肝炎的有效治疗方法，是当前亟待解决的重大课题。慢性乙型肝炎治疗关键是抗病毒治疗。病毒性丙型肝炎也是波及全球的传染病之一，全球有1.7亿人感染了丙型肝炎病毒，我国可能有37004000万丙型肝炎病毒感染者，其发病率有逐年增高趋势。美国疾病控制中心预测，从1990年至2015年，具有慢性肝脏疾病的危险人群中，丙型肝炎患者将增加4倍。以此推算，如果我国丙型肝炎病毒的感染和丙型肝炎的流行不能得到很好的控制，至2015年，我们所面临的丙型肝炎状况和今天所面临的慢性乙型肝炎的局面一样严峻。因此，加强丙型肝炎的研究具有重要性和迫切性。而且，由于缺乏有效的预防性疫苗，对丙型肝炎的防治还将是长期的。丙型肝炎病毒感染是慢性肝病的重要原因，约50%的感染者可转为慢性肝炎，约10%-20%的丙型肝炎20年内演变为肝硬化，且与肝细胞癌(HCC)的发生关系密切。丙型肝炎的病理机制及药物研究是研究热点之一，但目前还缺乏特异的病理动物模型，且临床上也没有理想的药物进行治疗。中国发明专利(申请号为200810038858.1)公开了戸丁在制备抗乙肝病毒药物中的应用，经乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBeAg)检测试剂实验，结果表明芦丁能显著抑制乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBeAg)，具有显著抑制乙肝病毒作用。曲克芦丁为维生素P属的一种，系芦丁经羟乙基化的衍生物，曲克芦丁已知的药理作用能抑制血小板的凝集，有防止血栓形成的作用；同时能对抗5-羟色胺和缓激肽引起的血管损伤，增加毛细血管抵抗力，降低毛细血管通透性，可防止血管通透性升高引起的水肿；对急性缺血性脑损伤有显著的保护作用。曲克芦丁的安全性和有效性通过临床试验，已经得到充分肯定；所以，国家食品药品监督管理局已经批准曲克芦丁作为药物使用，现有曲克芦丁片剂、胶囊剂、口服液、注射剂等剂型，临床适用于脑血栓形成和脑栓塞所致的偏瘫、失语以及心肌梗塞前综合征、动脉硬化、中心性视网膜炎、血栓性静脉炎、静脉曲张、血管通透性升高引起的水肿等。曲克戸丁的化学结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>经检索，未发现曲克芦丁对抗乙肝病毒和丙肝病毒作用的相关研究报道，而本发明能使曲克芦丁的应用拓展到一个新的领域。
发明内容本发明提供曲克芦丁在制备抗病毒性肝炎药物中的新用途，特别是在制备抗病毒性乙肝和病毒性丙肝药物中的新用途。本发明对曲克芦丁进行了新的药理实验本发明对曲克芦丁进行了体外抗乙肝表面抗原(HBeAg)和乙肝核心抗原(HBsAg)实验(参见实施例l)，体内鸭感染乙型肝炎病毒实验(参见实施例2)，结果(参见表1，2和3)证明曲克芦丁具有显著的乙肝病毒抑制作用，而且其最大优点是在停药后未见明显的乙肝病毒重新复制的"反跳"现象；因此可将曲克芦丁用于制备抗病毒性乙肝的药物。本发明对曲克芦丁又进行了体内对卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)所致小鼠免疫性肝损伤模型的肝保护作用的实验(参见实施例3)，结果(参见表4)显示曲克芦丁可不同程度地抑制BCG和LPS诱导的小鼠血清ALT、AST水平的升高，对小鼠免疫性肝损伤具有保护作用；因此可将曲克芦丁用于制备抗病毒性丙肝的药物。根据上述药理实验结果，曲克芦丁在抗乙肝、丙肝病毒活性试验中显示出优良的效果。因此可将曲克芦丁用来制备抗病毒性乙肝或丙肝药物用于动物，优选用于哺乳动物，特别是人。曲克芦丁制备的抗病毒性肝炎药物，药物中含有有效量的曲克芦丁及常规的可药用载体。该药物可用常规的药物制备方法，将曲克芦丁与一种或多种固体或液体药物赋形剂和(或)辅剂结合，制成可作为药物使用的适当的施用形式或剂量形，如片剂、丸剂、胶囊剂、口服液、注射剂等剂型的制剂，也可以制成缓释制剂、控释制剂、靶向制剂以及各种微粒给药制剂。制剂中含有O.1_90重量％的曲克芦丁。本发明曲克芦丁的给药剂量取决于诸多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。通常体重约75公斤患者，所给曲克芦丁的日剂量为0.001mg/kg体重-70mg/kg体重，优选0.Olmg/kg体重-10mg/kg体重。给药剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。具体病例可由医师根据病情调整。本发明的创新之处在于1.本发明提供了曲克芦丁在制备抗病毒性乙肝药物方面的新用途。2.本发明提供了曲克芦丁在制备抗病毒性丙肝药物方面的新用途。3.本发明曲克芦丁制备的抗病毒性乙肝、丙肝药物，可以制成不同剂型，可以不同方式给药，增加临床应用的选择性。4.本发明所需的原料价格低，原料易得，便于大范围内使用。具体实施例方式下面的实施例仅用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。实施例1曲克芦丁体外抗乙肝病毒试验1.材料和方法1.1细胞培养及药物以H印G22.2.15细胞为模型，将H印G22.2.15细胞接种至25cm2培养瓶中，每瓶加入DMEM培养基混合培养液(含10%FBS及380yg/mlG418)5ml，置37°C，5%C02恒温培养箱中，34天传代。用5%NaHC03调pH值至7.2。(DMEM培养基及胎牛血清为GIBCO公司产品；G418为Sigma公司产品)。阿德福韦酯(苏州葛兰素史克制药有限公司产品)，以二甲基亚砜溶解，制成lmg/ml的溶液，以培养液稀释成5iig/ml。曲克芦丁(陕西森弗生物技术有限公司产品)，以二甲基亚砜溶解，制成lmg/ml的溶液，以培养液分别稀释成1yg/ml，2.5iig/ml，5yg/ml的溶液。培养细胞消化液用0.25%胰蛋白酶(Costar公司产品)消化成单个细胞，吹打混匀后，分别接种于96孔培养板(每孔细胞数为1X104)及24孔培养板(每孔细胞数为1X105)上。分别加入培养液200ul及lml，37°C5%C02孵箱培养48h。待细胞贴壁后，弃培养上清液，换用含不同药物浓度的培养液，每3天换用含同等药物浓度的新鲜培养液。实验共进行9天，第9天末收集培养上清液，-2(TC保存；同批试剂盒检测上清液中HBsAg、HBeAg1.2实验分组联合用药采用棋盘法设计。分为单用曲克芦丁、阳性对照药物为阿德福韦酯和不加药物的阴性对照组。曲克芦丁浓度取1、2.5和5iig/ml，阳性对照药物阿德福韦酯浓度取5iig/ml。每组重复实验3次。1.2.1每孔加入待测标本50ul，设阴、阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照(或阳性对照)各一滴，并设空白对照一孔。1.2.2每孔加入酶结合物1滴(空白对照孔除外)，充分混匀，封板，置37t:孵育30分钟;1.2.3弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复五次后拍干；1.2.4每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，封板，置37°C孵育15分钟；1.2.5每孔加入终止液1滴，混匀；1.2.6用酶标仪读数，取波长450nm，参考波长630nm，读取各孔读数。1.3上清液HBsAg和HBeAg的检测采用放射免疫法，结果以复孔平均值表示。立可读乙肝HBsAg、HBeAg诊断试剂盒(上海科华生物技术有限公司产品)操作方法按试剂盒说明书进行。计算方法抑制率(％)=(阴性对照组cpm-实验组cpm)/阴性对照组2.结果组间比较用方差分析，采用SPSS11.0完成(见表1)表1曲克芦丁对HBsAg和HBeAg抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述实验结果表明，曲克芦丁具有乙肝病毒抑制作用；因此，可将曲克芦丁用于制备抗病毒性乙肝的药物。实施例2曲克戸丁体内抗乙肝病毒试验1.实验材料1.1病毒鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清，采自上海麻鸭，_70°C保存。1.2动物1日龄北京鸭(北京医科院药植所动物饲养场产品)。1.3药物阿德福韦酯(中国苏州葛兰素史克制药有限公司产品)；曲克芦丁(陕西森弗生物技术有限公司产品)。以上药物分别制成lmg/ml的脂质体，以注射用水稀释后给药。1.4试剂a-32P_dCTP(北京福瑞公司产品)；缺口翻译药盒(普洛麦格公司产品)；S印hadexG-50，Fico11PVP(瑞典Pharmacia公司产品)；SDS(德国Merck公司产品)；鱼精DNA、牛血清白蛋白(中国科学院生物物理所产品)；硝酸纤维素膜0.45um(安普公司产品)。2.实验方法2.1复制鸭乙型肝炎病毒感染模型取1日龄北京鸭30只，随机分成5组模型对照组，阳性对照组，曲克戸丁低、中、高剂量组。每组6只。每只经腿胫静脉注射0.2ml上海麻鸭DHBV-DNA强阳性鸭血清。2.2药物治疗在感染后7天自鸭腿胫静脉取血，分离血清，为治疗前样本(TO)，-7(TC保存待检。DHBV感染雏鸭7天后进行药物治疗试验，曲克芦丁低、中、高剂量组分别给予曲克芦丁10、25、50iig/kg，阳性对照组给予阿德福韦酯50iig/kg，模型对照组给予生理盐水。灌胃给药，每日2次，连续10天，在用药第5天(T5)，第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭腿胫静脉取血，分离血清，_701:保存待检。2.3DHBV-DNA的测定鸭血清样品用32P_DHBVDNA探针作斑点杂交，X射线底片上得到放射自显影像，以酶标仪于490nm处测定其OD值，半定量计算DNA水平。3.结果雏鸭感染乙肝病毒后DHBV-DNA全部阳性，曲克芦丁25yg/kg、50yg/kg对DHBV-DNA有明显抑制作用(P<0.05)，且曲克芦丁在停药后未见明显的乙肝病毒重新复制的"反跳"现象。阳性对照药阿德福韦酯在用药期间可显著抑制鸭DHBV-DNA(P<0.05)，但停药后出现乙肝病毒重新复制的"反跳"现象(P<0.05)(见表2、表3)。表2曲克戸丁对鸭血清DHBV-DNA水平的影响(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>P<0.05。表3曲克戸丁对鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的影响(n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述实验结果表明，曲克芦丁具有显著的乙肝病毒抑制作用；因此，可将曲克芦丁用于制备抗病毒性乙肝的药物。实施例3曲克芦丁体内对卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)所致小鼠免疫性肝损伤模型的肝保护作用的实验1.实验材料1.1实验动物昆明种小鼠，i，1822g(第二军医大学实验动物中心产品)。1.2药品与试剂曲克戸丁(陕西森弗生物技术有限公司产品)制成lmg/ml的脂质体，用水稀释后以注射给药。利巴韦林注射液(上海信谊药业有限公司产品)。卡介苗(BCG)(上海生物制品公司产品)。脂多糖(LPS)(Sigma公司产品)。ALT、AST试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)2.实验方法和结果动物随机分组，尾ivBCG2Sit/只，正常对照组给予等量生理盐水，治疗组给予不同剂量的药物，每日l次，阳性对照组给予利巴韦林，50ug/kg，每日l次。正常饲养10天，末次给药后再次尾ivLPS10ug/只，进行攻击，16h后眼眶静脉取血，进行肝功能检测(血清ALT、AST测定)(见表4)。表4曲克卢丁对免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响(n二6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>P<0.05上述实验结果表明，曲克戸丁可不同程度地抑制BCG和LPS诱导的小鼠血清ALT、AST水平的升高，对小鼠免疫性肝损伤具有保护作用；因此，可将曲克芦丁用于制备抗病毒性丙肝的药物。权利要求曲克芦丁在制备抗病毒性肝炎药物中的用途。2.权利要求1所述曲克芦丁在制备抗病毒性肝炎药物中的用途，其特征在于所述曲克芦丁在制备抗病毒性乙肝药物中的用途。3.权利要求1所述曲克芦丁在制备抗病毒性肝炎药物中的用途，其特征在于所述曲克芦丁在制备抗病毒性丙肝药物中的用途。全文摘要本发明涉及曲克芦丁在药物中的新用途。通过对曲克芦丁进行体外和体内抗乙肝病毒、丙肝病毒的药理实验，结果证明，曲克芦丁具有显著的抑制乙肝病毒、丙肝病毒作用。因此，可将曲克芦丁用于制备抗病毒性肝炎药物，特别是用于制备抗病毒性乙肝和病毒性丙肝的药物。而且所需的原料价格低，原料易得，便于大范围内使用。文档编号A61K31/7048GK101708182SQ20091019842公开日2010年5月19日申请日期2009年11月6日优先权日2009年11月6日发明者徐从立,黄山申请人:上海双科医药科技有限公司