一种菠萝蛋白酶的制备方法
专利名称：一种菠萝蛋白酶的制备方法
一种菠萝蛋白酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及菠萝蛋白酶技术领域，具体地说，是一种菠萝蛋白酶的制备方法。背景技术：
菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称，主要存 在于菠萝茎和果实中，根据提取部位的不同，分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。菠萝蛋 白酶作为有活性的蛋白质，易受到温度、PH、金属离子等的影响。菠萝蛋白酶的最适反应温 度介于(55 60) °C，温度再高，酶的热失活增强，反应速度下降；菠萝蛋白酶的最适pH在 6. 5 7. 5，在7. 1附近达最大值，在酸性环境中，酶反应速度下降快，在碱性下有个较宽的 应用范围，酶较稳定的PH范围在3. 5 4. 5。菠萝蛋白酶的应用已有很长的历史，随着提取纯化技术的进步，它将有更广泛的 应用。我国菠萝资源丰富，年产菠萝100万吨以上，每年都有大量的菠萝皮、茎被浪费掉。同 时，我国对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多，特别是高活性的菠萝蛋白酶。在医药领域，对菠 萝蛋白酶的纯度要求越来越高，甚至要明确起功能作用的具体成分，而目前工业化生产的 酶很难达到此标准，就要求提取纯化技术要不断进步，以满足各领域的需求。菠萝蛋白酶作 为生物活性物质，决定了其易受到外部环境的影响而失活。因此，在生产、储存、运输过程中 保持所需的酶活至关重要，这就要求酶的固定化技术等要有所突破。目前国内菠萝蛋白酶的现状菠萝蛋白酶的提取纯化方法很多，用于工业化生产 的提取方法主要有3种高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩法。以上方法中，高岭土吸 附法所得产品酶活较高，但生产工艺和操作都比较复杂，所需设备多，原材料消耗也多，酶 活回收率低，污染环境，环保投资大；单宁沉淀法，生产工艺和操作比较简单，但酶活回收率 低，所得酶的活性也不高，所加的单宁对环境造成一定污染。国内工业上生产大多采用超滤 浓缩的方法。此法利用分子截留原理，把大于和小于蛋白酶分子的大部分物质过滤除去，以 达到浓缩酶液的目的，菠萝汁超滤浓缩后，再进行干燥得到酶制品。这种方法较前两种方法 操作步骤少，条件温和，降低了酶活损失，生产和环保投入少，但所得酶制品中含有没有酶 活性的杂蛋白较多，此类蛋白分子量和菠萝蛋白酶近似，所以超滤过程无法除去。同时，我国对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多，特别是高活性的菠萝蛋白酶。在医药 领域，对菠萝蛋白酶的纯度要求越来越高，目前工业化生产的酶很难到达此标准，这就要求 提取纯化技术要不断进步，以满足各领域的需求。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种菠萝蛋白酶的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在pH值为6 8，以0. 01 0. 15mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0. 6 2. Omol/L 的KCl作为洗脱液进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在0. 5 1. 5min内就 能完成，此时的菠萝蛋白酶的酶活回收率为7.4% ；所述的磷酸缓冲液的浓度优选为0. lmol/L ；所述的洗脱液KCL的浓度优选为1 1. 2mol/L ；所述的吸附和解吸过程时间优选为Imin ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷质量百分数为(含量)为5 15%，共聚物的分子量为 2000g/mol，共聚物质量百分比为1 10%，温度为20 30°C，pH值为5 7，盐溶液浓度 在5 20mmol/L时，酶活回收率可达到94. 2%，酶活达到6. 55X106U/g ；所述的共聚物中环氧乙烷含量为10% ；所述的共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质量百分比为5% ；所述的温度为25°C，pH值为6. 0，盐溶液浓度为15mmol/L。本发明制备的菠萝蛋白酶的应用本发明生产的菠萝蛋白酶具有重要的药用价值具有免疫刺激作用，研究表明，通 过对辅助细胞的刺激作用和对T细胞的直接抑制反应，可以增强和抑制T细胞的免疫反应； 能够防治心血管疾病，它能加速纤维蛋白原的分解，缓解心绞痛和中风；在各种组织中能有 效地治疗水肿和炎症，并能治疗腹泻；菠萝蛋白酶用于烧伤脱痂，能选择性地除去死皮，对 正常皮肤无不良影响，脱痂彻底，对治疗烧伤有重要意义；菠萝蛋白酶能够抑制肿瘤细胞的 生长，降低毒素结合活性，并能抑制热不稳定毒素及霍乱毒素的分泌效应；能增进药物的吸 收，与各种抗生素联用能提高其疗效，并能促进营养物质的吸收。与现有技术相比，本发明的积极效果是(1)本发明的菠萝蛋白酶生产简单，可大规模的工业化生产；(2)本发明的菠萝蛋白酶来源于天然植物，具有安全无毒、作用范围广等特；(3)本发明制备的菠萝蛋白酶具有重要的药用价值具有免疫刺激作用；应用广 泛。
具体实施方式以下提供本发明一种菠萝蛋白酶的制备方法的具体实施方式
。实施例1一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉 淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接近100%，在PH值为6，以0. 01mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0. 6mol/L的KCl作为洗脱液 进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在0. 5min内就能完成，此时的菠萝蛋白 酶的酶活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷含量为5%，共聚物的分子量为2000为g/mol，共聚物质量百 分比为1%，温度为20°C，pH值为5，盐溶液浓度在5mmol/L时，酶活回收率可达到94. 2%， 酶活达到6. 55X106U/g。实施例2一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉 淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值为6. 5，以0. 05mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0. 9mol/L的KCl作为洗脱 液进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在0. 7min内就能完成，此时的菠萝蛋 白酶的酶活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷含量为8%，共聚物的分子量为2000为g/mol，共聚物质量 百分比为3%，温度为23°C，pH值为5. 5，盐溶液浓度在8mmol/L时，酶活回收率可达到 94. 2%，酶活达到 6. 55X106U/g。实施例3一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉 淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在pH值为7，以0. lmol/L的磷酸缓冲液和浓度为lmol/L的KCl作为洗脱液进行 洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在Imin内就能完成，此时的菠萝蛋白酶的酶 活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷含量10%，共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质量百分 比为5%，温度为25°C，pH值为6，盐溶液浓度在15mmol/L时，酶活回收率可达到94. 2%， 酶活达至Ij 6. 55X106U/g。实施例4一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值为7. 8，以0. 12mol/L的磷酸缓冲液和浓度为1. 6mol/L的KCl作为洗脱 液进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在1. 2min内就能完成，此时的菠萝蛋 白酶的酶活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷含量为12%，共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质量 百分比为8 %，温度为27 V，pH值为6. 6，盐溶液浓度在17mmol/L时，酶活回收率可达到 94. 2%，酶活达到 6. 55X106U/g。实施例5一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉 淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值为8，以0. 15mol/L的磷酸缓冲液和浓度为2. Omol/L的KCl作为洗脱液 进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在1.5min内就能完成，此时的菠萝蛋白 酶的酶活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白 酶，分离条件为共聚物中环氧乙烷含量为15%，共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质 量百分比为10%，温度为30°C，pH值为7，盐溶液浓度在20mmol/L时，酶活回收率可达到 94. 2%，酶活达到 6. 55X106U/g。本发明的菠萝蛋白酶生产简单，可大规模的工业化生产；菠萝蛋白酶来源于天然 植物，具有安全无毒、作用范围广等特；本发明制备的菠萝蛋白酶具有重要的药用价值具有 免疫刺激作用；应用广泛。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压干燥等步骤得到高活 性酶制品；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接近 100%，在pH值为6 8，以0. 01 0. 15mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0. 6 2. Omol/L的 KCl作为洗脱液进行洗脱，吸附和解吸过程在0. 5 1. 5min内完成；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶，分离 条件为共聚物中环氧乙烷质量百分数为5 15%，共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质 量百分比为1 10%，温度为20 30°C，pH值为5 7，盐溶液浓度为5 20mmol/L。
2.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(一) 中，所述的磷酸缓冲液的浓度为0. lmol/L。
3.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(一) 中，所述的洗脱液KCL的浓度为1 1. 2mol/L。
4.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(一) 中，所述的吸附和解吸过程时间为lmin。
5.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(二) 中，所述的共聚物中环氧乙烷含量为10%。
6.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(二) 中，所述的共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质量百分比为5%。
7.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(二) 中，所述的温度为25°C，pH值为6. 0，盐溶液浓度为15mmol/L。
8.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的菠萝蛋白酶 在药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种菠萝蛋白酶的制备方法，具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取，用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品；二、菠萝蛋白酶的纯化，(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接近100％，在pH值为6～8，以0.01～0.15mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0.6～2.0mol/L的KCl作为洗脱液进行洗脱，吸附和解吸过程在0.5～1.5min内完成；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶。本发明的优点生产简单，可大规模的工业化生产；来源于天然植物，具有安全无毒、作用范围广等特；应用广泛。
文档编号A61P35/00GK102108350SQ20091020075
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者羌利民 申请人:南通远大生物科技发展有限公司
一种菠萝蛋白酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及菠萝蛋白酶技术领域，具体地说，是一种菠萝蛋白酶的制备方法。背景技术：
菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称，主要存 在于菠萝茎和果实中，根据提取部位的不同，分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。菠萝蛋 白酶作为有活性的蛋白质，易受到温度、PH、金属离子等的影响。菠萝蛋白酶的最适反应温 度介于(55 60) °C，温度再高，酶的热失活增强，反应速度下降；菠萝蛋白酶的最适pH在 6. 5 7. 5，在7. 1附近达最大值，在酸性环境中，酶反应速度下降快，在碱性下有个较宽的 应用范围，酶较稳定的PH范围在3. 5 4. 5。菠萝蛋白酶的应用已有很长的历史，随着提取纯化技术的进步，它将有更广泛的 应用。我国菠萝资源丰富，年产菠萝100万吨以上，每年都有大量的菠萝皮、茎被浪费掉。同 时，我国对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多，特别是高活性的菠萝蛋白酶。在医药领域，对菠 萝蛋白酶的纯度要求越来越高，甚至要明确起功能作用的具体成分，而目前工业化生产的 酶很难达到此标准，就要求提取纯化技术要不断进步，以满足各领域的需求。菠萝蛋白酶作 为生物活性物质，决定了其易受到外部环境的影响而失活。因此，在生产、储存、运输过程中 保持所需的酶活至关重要，这就要求酶的固定化技术等要有所突破。目前国内菠萝蛋白酶的现状菠萝蛋白酶的提取纯化方法很多，用于工业化生产 的提取方法主要有3种高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩法。以上方法中，高岭土吸 附法所得产品酶活较高，但生产工艺和操作都比较复杂，所需设备多，原材料消耗也多，酶 活回收率低，污染环境，环保投资大；单宁沉淀法，生产工艺和操作比较简单，但酶活回收率 低，所得酶的活性也不高，所加的单宁对环境造成一定污染。国内工业上生产大多采用超滤 浓缩的方法。此法利用分子截留原理，把大于和小于蛋白酶分子的大部分物质过滤除去，以 达到浓缩酶液的目的，菠萝汁超滤浓缩后，再进行干燥得到酶制品。这种方法较前两种方法 操作步骤少，条件温和，降低了酶活损失，生产和环保投入少，但所得酶制品中含有没有酶 活性的杂蛋白较多，此类蛋白分子量和菠萝蛋白酶近似，所以超滤过程无法除去。同时，我国对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多，特别是高活性的菠萝蛋白酶。在医药 领域，对菠萝蛋白酶的纯度要求越来越高，目前工业化生产的酶很难到达此标准，这就要求 提取纯化技术要不断进步，以满足各领域的需求。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种菠萝蛋白酶的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在pH值为6 8，以0. 01 0. 15mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0. 6 2. Omol/L 的KCl作为洗脱液进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在0. 5 1. 5min内就 能完成，此时的菠萝蛋白酶的酶活回收率为7.4% ；所述的磷酸缓冲液的浓度优选为0. lmol/L ；所述的洗脱液KCL的浓度优选为1 1. 2mol/L ；所述的吸附和解吸过程时间优选为Imin ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷质量百分数为(含量)为5 15%，共聚物的分子量为 2000g/mol，共聚物质量百分比为1 10%，温度为20 30°C，pH值为5 7，盐溶液浓度 在5 20mmol/L时，酶活回收率可达到94. 2%，酶活达到6. 55X106U/g ；所述的共聚物中环氧乙烷含量为10% ；所述的共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质量百分比为5% ；所述的温度为25°C，pH值为6. 0，盐溶液浓度为15mmol/L。本发明制备的菠萝蛋白酶的应用本发明生产的菠萝蛋白酶具有重要的药用价值具有免疫刺激作用，研究表明，通 过对辅助细胞的刺激作用和对T细胞的直接抑制反应，可以增强和抑制T细胞的免疫反应； 能够防治心血管疾病，它能加速纤维蛋白原的分解，缓解心绞痛和中风；在各种组织中能有 效地治疗水肿和炎症，并能治疗腹泻；菠萝蛋白酶用于烧伤脱痂，能选择性地除去死皮，对 正常皮肤无不良影响，脱痂彻底，对治疗烧伤有重要意义；菠萝蛋白酶能够抑制肿瘤细胞的 生长，降低毒素结合活性，并能抑制热不稳定毒素及霍乱毒素的分泌效应；能增进药物的吸 收，与各种抗生素联用能提高其疗效，并能促进营养物质的吸收。与现有技术相比，本发明的积极效果是(1)本发明的菠萝蛋白酶生产简单，可大规模的工业化生产；(2)本发明的菠萝蛋白酶来源于天然植物，具有安全无毒、作用范围广等特；(3)本发明制备的菠萝蛋白酶具有重要的药用价值具有免疫刺激作用；应用广 泛。
具体实施方式以下提供本发明一种菠萝蛋白酶的制备方法的具体实施方式
。实施例1一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉 淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接近100%，在PH值为6，以0. 01mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0. 6mol/L的KCl作为洗脱液 进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在0. 5min内就能完成，此时的菠萝蛋白 酶的酶活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷含量为5%，共聚物的分子量为2000为g/mol，共聚物质量百 分比为1%，温度为20°C，pH值为5，盐溶液浓度在5mmol/L时，酶活回收率可达到94. 2%， 酶活达到6. 55X106U/g。实施例2一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉 淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值为6. 5，以0. 05mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0. 9mol/L的KCl作为洗脱 液进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在0. 7min内就能完成，此时的菠萝蛋 白酶的酶活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷含量为8%，共聚物的分子量为2000为g/mol，共聚物质量 百分比为3%，温度为23°C，pH值为5. 5，盐溶液浓度在8mmol/L时，酶活回收率可达到 94. 2%，酶活达到 6. 55X106U/g。实施例3一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉 淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在pH值为7，以0. lmol/L的磷酸缓冲液和浓度为lmol/L的KCl作为洗脱液进行 洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在Imin内就能完成，此时的菠萝蛋白酶的酶 活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷含量10%，共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质量百分 比为5%，温度为25°C，pH值为6，盐溶液浓度在15mmol/L时，酶活回收率可达到94. 2%， 酶活达至Ij 6. 55X106U/g。实施例4一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值为7. 8，以0. 12mol/L的磷酸缓冲液和浓度为1. 6mol/L的KCl作为洗脱 液进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在1. 2min内就能完成，此时的菠萝蛋 白酶的酶活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶， 分离条件为共聚物中环氧乙烷含量为12%，共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质量 百分比为8 %，温度为27 V，pH值为6. 6，盐溶液浓度在17mmol/L时，酶活回收率可达到 94. 2%，酶活达到 6. 55X106U/g。实施例5一种菠萝蛋白酶的制备方法，其具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取对超滤浓缩法进行了改进，把用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉 淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品，酶活达到6. 01 X 106U/g ；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接 近100%，在PH值为8，以0. 15mol/L的磷酸缓冲液和浓度为2. Omol/L的KCl作为洗脱液 进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附和解吸过程在1.5min内就能完成，此时的菠萝蛋白 酶的酶活回收率为7.4% ；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白 酶，分离条件为共聚物中环氧乙烷含量为15%，共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质 量百分比为10%，温度为30°C，pH值为7，盐溶液浓度在20mmol/L时，酶活回收率可达到 94. 2%，酶活达到 6. 55X106U/g。本发明的菠萝蛋白酶生产简单，可大规模的工业化生产；菠萝蛋白酶来源于天然 植物，具有安全无毒、作用范围广等特；本发明制备的菠萝蛋白酶具有重要的药用价值具有 免疫刺激作用；应用广泛。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压干燥等步骤得到高活 性酶制品；二、菠萝蛋白酶的纯化(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接近 100%，在pH值为6 8，以0. 01 0. 15mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0. 6 2. Omol/L的 KCl作为洗脱液进行洗脱，吸附和解吸过程在0. 5 1. 5min内完成；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶，分离 条件为共聚物中环氧乙烷质量百分数为5 15%，共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质 量百分比为1 10%，温度为20 30°C，pH值为5 7，盐溶液浓度为5 20mmol/L。
2.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(一) 中，所述的磷酸缓冲液的浓度为0. lmol/L。
3.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(一) 中，所述的洗脱液KCL的浓度为1 1. 2mol/L。
4.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(一) 中，所述的吸附和解吸过程时间为lmin。
5.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(二) 中，所述的共聚物中环氧乙烷含量为10%。
6.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(二) 中，所述的共聚物的分子量为2000g/mol，共聚物质量百分比为5%。
7.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，在所述的步骤(二) 中，所述的温度为25°C，pH值为6. 0，盐溶液浓度为15mmol/L。
8.如权利要求1所述的一种菠萝蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述的菠萝蛋白酶 在药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种菠萝蛋白酶的制备方法，具体步骤为一、菠萝蛋白酶的提取，用PSA膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压干燥等步骤得到高活性酶制品；二、菠萝蛋白酶的纯化，(1)利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶的吸附率接近100％，在pH值为6～8，以0.01～0.15mol/L的磷酸缓冲液和浓度为0.6～2.0mol/L的KCl作为洗脱液进行洗脱，吸附和解吸过程在0.5～1.5min内完成；(2)用环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离萃取高纯度的菠萝蛋白酶。本发明的优点生产简单，可大规模的工业化生产；来源于天然植物，具有安全无毒、作用范围广等特；应用广泛。
文档编号A61P35/00GK102108350SQ20091020075
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月25日 优先权日2009年12月25日
发明者羌利民 申请人:南通远大生物科技发展有限公司
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