一种促进神经肌肉再生的复方制剂及其制备方法
专利名称：一种促进神经肌肉再生的复方制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属中药领域，涉及中药复方制剂，具体涉及一种含党参等中药的促进神经 肌肉再生的复方制剂及其制备方法。
背景技术：
创伤是20世纪以来三大死因之一，同时在发达国家创伤也是造成青壮年死亡和 病残的首因，给患者带来极度的痛苦，也给社会造成巨大的经济损失。随着现代医学的发 展，尤其是60年代后显微外科的发展，极大程度地提高了创伤后的成活率，使众多患者看 到了希望，然而在被挽救的患者中，尚有许多伤者不能返回原来的工作岗位，由于创伤后神 经肌肉功能的恢复仍然是当今医学界的一大难题，而这一难题的解决不仅需要大量的临床 工作，还涉及到一系列基础问题，作为神经支配的效应器，骨骼肌在失去神经支配后不可避免的发生萎缩变性，同 时由于神经再生非常缓慢，往往在神经再支配前，肌细胞已丧失了再生的物质基础，即形成 不可逆的肌萎缩，其功能将不可恢复。因此如何加速神经再生是解决创伤后功能恢复的关 键问题之一。为此，国内外学者作了不懈努力。早在20世纪50年代，国外学者便发现了神 经生长因子(NGF)，先后有研究报道了 NGF家族(NGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5等)和非NGF 家族(CNTF、IGF、GDNF, SDNF等)多种来源各异、不尽相同的神经营养因子，并在实验研究 中取得了一系列成果，然而在临床上是否能促进神经再生仍存在较大争论，并且至今尚未 有突破性的临床进展。近年来，中药对周围神经再生的作用受到临床越来越多的关注，有研究显示出，中 药对加速周围神经损伤后的再生有初步疗效，且其价格便宜，毒副作用小，拥有十分巨大的 临床应用潜力。与本发明相关的现有技术有如下参考文献1 Oliveira ALR, Risling M, Deckner M, et al. Neonatal sciatic nervetransection induces TUNEL labling of neurons in the rat spinal cord andDRG. Neuroreport, 1997,8 :2837-2840.2Inoue M, Hojo T, Yano T, et al. The effects of electroacupuncture onperipheral nerve regeneration in rats. Acupunct Med,2003,21 (1-2) :9-17.3Lazar DA,Curra FP,Mohr B, et al.Acceleration of recovery after injuryto the peripheral nervous system using ultrasound and other therapeuticmodalities. Neurosurg Clin N Am，2001，12(2) :353-357.4Rush RA, Mayo R, Zettler C. The regulation of nerve growth factorsynthesis and delivery to peripheral neurons. Pharmacol ther,1995,65 931-933.5ffong BJ, Crumley RL. Nerve wound healing. Otolaryngol Clin North Am, 1995,28(5) :881-895.6钟世镇.周围神经基础研究的进展.中华手外科杂志，1997，13(1) :1_2.
7Bain JR, Mackinnon SE，Hunter DA. Functional evaluation of completesciatic， peroneal， and posterior tibial nerve lesions in the rat. PlastReconstr Surg, 1989 ；83 :129-136.8Dahl in LB, Kanje M. Conditioning effect induced by chronic nervecompression. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg，1992，26 :37-41.9Kanje M，Lundborg G，Edstrom A. A new method for studi es of the effectsof locally applied drugs on peripheral nerve regeneration in vivo. BrainRes,1988,439 :116-121.10陈中伟.周围神经损伤临床与实验研究.济南山东科学技术出版社，1998， 22-63.1 IVanessa Vilela MR ,Claudio HB, Nilton M，et al. Can therapeuticultrasound influence the regeneration of peripheral nerves ？ Journal ofNeuroscience Methods，2005，142 :185-192.12Tomas H， Goran N， Martin K， et al.Hyperbaric oxygen treatment enhancesregeneration of the rat sciatic nerve. Experimental Neurology，1998，149 : 433-43813范秀红，周祥吉，范启申.周围神经检测研究进展.中华显微外科杂志，200023 237-239.14Mackinnon SE, Hudson AR, Hunter DA.Histologic assessment of nerveregeneration in the rat. Plast Reconstr Surg，1985，75 :384-388.15Bruno C，Cuppini R，Sartini S，et al. Regeneration of motor nerves inbilobalide-treated rats. Planta Med,1993,59 :302-307.16Hsu SH, Chang CJ, Tang CM，et al. In vitro and in vivo effects of GinkgobiIoba extract EGb 761 on seeded Schwann cells within poly(DL-lacticacid-co-glycolic acid)conduits for peripheral nerve regeneration. JBiomater Appl，2004，19 :163-182.17张烽，顾玉东，徐建光，等.银杏叶提取物促进大鼠坐骨神经再生的实验研 究·中华显微外科杂志，2000，23 :279-281.18薛锋，顾玉东，陈德松，等.周围神经损伤后银杏叶提取物Ε(Λ761对感觉神经元 的保护作用.复旦学报医学版，2002, ) =251-254.19杨藻寰.医用药理学.第2版北京人民卫生出版杜.1987，29-31.20Sundland S. Regeneraion of axon and related changes. In, ed Nerves andnerve injuries、Edinburgh :Churchitl Livingstone. 1991,91-11
发明内容
本发明的目的是提供一种具有促进神经肌肉再生作用的的中药复方制剂及其制 备方法。本发明复方制剂由有效成分与药物载体制成促进神经肌肉再生的复方制剂，所述 有效成分是由下述重量份配比的原料药组分组成党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，余为辅料。所述的辅料是药学上可以接受的辅料或辅助性成分。本发明所涉及的中药材党参、黄芪、丹参、生地、当归和红花为中国药典2000年版 一部所收载中药，并符合药典质量要求。所述党参其作用同人参，可促进DNA的合成和糖解，有提高能量代谢和蛋白质合 成及补元气，固脱生津的的作用；黄芪有强化机体的作用；当归有提高全身代谢的作用；红 花、丹参与生地具有活血化瘀，凉血养血的作用。本发明复方制剂通过下述方法和步骤制备，按照组方配比进行称量，除红花外，取其余药材洗净，于通风处晾干后切成1 2cm的小碎块，以4-10倍量水浸泡1 后煎煮^iX 2次，水提液过滤后静置12h，再过滤一 次，加热浓缩至所需体积，得中药中间体(水提浸膏)，干燥后，气流粉碎方法粉碎成超细粉 1(Γ15 μ m ；细粉混合均勻，加入加入辅料或辅助性成分，混勻，制成复方制剂。所述的复方制剂可以制成冲剂、散剂、颗粒剂，丸剂或胶囊。本发明比较了不同方法制备的上述中药中间体的促外周神经生长作用，结果显示 不同制备方法中以水提法药效为佳，并经进一步的药理和定性分析实验，探索其中的主要 有效成分，在此基础上，建立有生物活性的化学成分的定量分析方法，以水提法为基础，以 多糖、阿魏酸、丹参素及中间体的得率为考察指标，应用正交试验方法优选出最佳工艺。本 发明优选中间体的制备工艺其中以8倍量水加热回流提取3次，每次回流提取时间为1小 时。本发明以中间体(水提浸膏)为材料，用比色法测定了浸膏中多糖含量，结果显示 在2. 09 6. 21 %之间；用HPLC法测定阿魏酸和丹参素含量，测定结果显示分别在0. 050 0. 092yg/(mg 浸膏)和 0. 234 0. 419 μ g/(mg 浸膏)之间。本发明复方制剂进行了药理学实验，联合应用实时定量RT-PCR方法及免疫组织 化学方法观测其对周围神经损伤后神经远端GAP-43mRNA表达及其蛋白合成的影响，及对 损伤神经相应感觉神经元的超微结构变化进行了观察，结果显示，可以使早期损伤神经中 的GAP-43表达增加，这些增加的GAP-43更能竞争性地结合到G蛋白反应位点，促进轴突快 速生长，有利于突触重建；在大鼠坐骨神经损伤后应用复方中药后，神经损伤后相应感觉神 经元线粒体的肿胀变性程度，本发明复方制剂组明显好于对照组，其卫星细胞与神经元相 连，胞内细胞器丰富；实验结果显示，本发明复方制剂能促进机体的新陈代谢，增加受损部 位的血供，有利于神经改善缺血状态，清除溃变的髓鞘，促进雪旺细胞的分裂和增殖，进一 步通过影响远端靶组织产生的逆行性信号来调控GAP-43，利于神经的再生，对小鼠和大鼠 坐骨神经的早期再生均有明显的促进作用，对坐骨神经损伤后相应的感觉神经元也有一定 的保护作用，结果证实，本发明复方制剂具有促进周围神经再生的药理作用。本发明进行了治疗周围神经损伤动物实验，结果显示，本复方制剂对加速周围神 经损伤后的再生明显有效，本复方制剂可进一步制成临床用促进神经肌肉再生的药物，造 福更多的神经损伤病人。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明精神的限定内可适当变更。
具体实施例方式实施例1称量中药材党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，按照组方重量份称配比称量中药材党参黄芪丹参生 地当归红花为10 10 10 10 5 2，除红花外，取其余药材洗净，于通风处晾干 后切成1 2cm的小碎块，以4-10倍量水浸泡1 后煎煮池X 2次，水提液过滤后静置12h， 再过滤一次，加热浓缩至所需体积，得中药中间体(水提浸膏)，干燥后，气流粉碎方法粉碎 成超细粉1(Γ 5μπι ；细粉混合均勻，加入加入辅料或辅助性成分，混勻，制成复方制剂。所述的复方制剂可以制成冲剂、散剂、颗粒剂，丸剂或胶囊。实施例2称量中药材党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，按照组方重量份称配比称量中药材党参黄芪丹参生 地当归红花为10 10 10 10 5 2，除红花外，取其余药材洗净，于通风处晾 干后切成1 2cm的小碎块，以8倍量水浸泡1 加热回流提取3次，每次回流提取时间为 1小时，水提液过滤后静置12h，再过滤一次，加热浓缩至所需体积，得中药中间体(水提浸 膏)，干燥后，气流粉碎方法粉碎成超细粉1(Γ15 μ m ；细粉混合均勻，加入加入辅料或辅助 性成分，混勻，制成复方制剂。所述的复方制剂可以制成冲剂、散剂、颗粒剂，丸剂或胶囊。实施例3对大鼠坐骨神经再生影响实验动物SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠90只，体重180g 200g (购自复旦大学 实验动物部)。将大鼠随机分为A、B、C 3组，每组30只。A组为损伤对照组；B组为本发明制剂 组；C组为银杏酮酯组。每组又按坐骨神经损伤后不同时间点(l、2、4、6、8w)分为5个亚组， 每个亚组6只。设备及药品台式手术显微镜及10倍、16倍目镜(SXP-1B，上海医用光学仪器厂)，显微外科器 械及11-0、12-0医用无损伤缝合针线(宁波市成和显微器械厂)，3-0慕丝手术缝线(强生 公司)，肌张力换能器(复旦大学上海医学院生理教研室SMU-PC型生物信号处理系统)， Phasis4导程肌电诱发仪(意大利ESATO公司)，IMS细胞图像分析系统医学图像软件(上 海申腾信息技术有限公司)，常规手术器械自动拉钩，尖头持针器，蚊式手术钳，眼科剪刀 (上海医疗器械厂)，自制神经拉钩。0. 25%硫喷妥钠(上海新亚药业有限公司)，美解眠注 射液(第二军医大学朝晖制药厂)，0.9%氯化钠注射液(上海长征富明药业有限公司)，青 霉素钠粉剂(上海先锋药业有限公司)。方法动物以0. 25%硫喷妥钠(0. lml/kg)作腹腔注射麻醉。无菌条件下作右臀部斜切 口，于臀肌间隙显露右侧坐骨神经，距梨状肌下缘0. 8cm处切断坐骨神经，立即在手术显微 镜下以11-0无创尼龙针线缝合，关闭切口。术后A组每天给予生理盐水Iml灌胃，B组给 予Ε(Λ50(上海杏灵科技药业股份有限公司)提供，批号2004105) 200mg · kg-1 · d_l用生 理盐水稀释成Iml灌胃，C组给予本发明制剂浓缩液Iml灌胃，分别于术后1周行感觉神经再生距离检测，术后2、4、6、8周用电生理学、组织学和功能测定评估坐骨神经再生和功能 恢复情况。观察指标①坐骨神经功能指数(sciaticfunctional index, SFI)自制大鼠足行走箱，通道长90cm，宽15cm，高15cm。通道近端放置一个鼠箱，长 20cm，宽15cm，高15cm，单侧开门，箱底放置连续记录纸(20cm宽)。受试鼠双后足蘸炭素墨 水，放入行走箱入口，鼠在向远端爬行过程中每侧留4 5个足印，选实验侧足(E)和正常 侧足(N)足印，测量以下三个变量。(1)足印长度(p0d0gramlength，PL)，指足印最长距离， 即足跟到足尖的距离。(2)足耻宽度(width betweenthe first and fifth toes, TW)，即 第一趾到第五趾连线的距离。(3)中间足趾距离(inter-toesdistancedT)，即第二趾到第 四趾连线的距离。将上述三个变量代入Bain公式计算SFI，以SFI 0为正常值，-100为神 经完全断离指标。SFI = -38. 3(EPL-NPL)/NPL+109. 5(ETS-NTS)/NTS+13. 3(EIT-NIT)/NIT-8. 8。②感觉神经再生距离(Pinch test)术后第7天，麻醉后暴露右侧坐骨神经，在手术显微镜下用显微外科镊子从吻合 口远端2cm处向近端每间隔0. 5mm距离钳夹坐骨神经，直到出现背部肌肉收缩为止，用游标 卡尺测量该点到吻合口的距离(精确到mm)即为感觉神经再生的距离。③电生理检测用意大利Wmsis肌电仪测试。以双极电极作为刺激电极置于神经吻合口的近、远 端5mm处进行刺激(未手术侧刺激电极分别置于相对应位置)，同芯针电极为记录电极，插 入小腿三头肌。刺激神经近、远端，记录其诱发电位，根据其潜伏期及刺激点距离求得运动 神经传导速度。电刺激和记录参数方波持续时间0. 1ms，刺激强度0. 3mA，刺激频率1Hz， 扫描速度ans/D。整个操作过程中用温生理盐水保持神经湿润，避免刺激电极接触周围肌肉 组织。a)小腿三头肌最大诱发电位波幅(MAP)恢复率将损伤侧(右)与对侧(左)最 大波幅相比(R/LX100% )得出恢复率(％ )。b)运动神经传导速度(MNCV)恢复率将损伤侧(右)与对侧(左)运动神经传 导速度相比(R/LX100% )得出恢复率(％ )。④肌张力测定采用SMU-PC型生物信号处理系统(复旦大学上海医学院生理教研室)测定小腿 三头肌的单收缩力和强直收缩力。用12号针头固定膝关节，结扎并切断小腿三头肌远端肌 腱。通过1-0丝线将其断端连于张力换能器上，输出导线与两道生理记录仪相连，以特制的 银丝电极刺激神经吻合口的近端，调整肌肉的最适初长度，以电压5V、波宽0. ans、频率IHZ 的刺激作单刺激后，记录肌肉的单收缩力。以电压5V、波宽0. ans、频率50HZ的刺激，刺激 并记录其强直收缩力。操作过程中室温保持在180C 250C，温生理盐水保持神经肌肉湿 润。a)最大单次肌肉收缩力恢复率取单刺激肌肉收缩最大波幅(P-P value)，与健 侧比较得出恢复率(％)。b)最大强直收缩力恢复率在刺激频率为50HZ下持续刺激，记录最大强直收缩力，与健侧比较得出恢复率(％)。⑤小腿三头肌湿重测定测完肌张力后，处死大鼠，紧贴骨面取出两侧小腿三头肌，剔除表面结缔组织，滤 纸吸干表面血液后，即刻在电子分析天平上(R200D，1/10万，Germany)称重。并和自身健 侧小腿三头肌湿重比较求出恢复率(％ )。⑥有髓神经纤维通过率(Pass ratio, PR)神经吻合口以近2mm，以远3mm取材，分别取长约2mm—段神经，10 %福尔马林固 定，石蜡包埋、切片，甲苯胺蓝染色。所得切片每隔3张取1张，连取5张。用IMS细胞图 像分析系统的医学图像软件进行远近端有髓神经纤维计数，求出远端有髓神经纤维通过率)。⑦小腿三头肌肌细胞截面积恢复率取双侧小腿三头肌中部肌肉标本，常规石蜡切片，片厚5 μ m，HE染色。每个标本切 片5张，随机取5个视野中的20个肌纤维，用IMS细胞图像处理系统测量肌细胞截面积，将 实验侧和健侧肌细胞截面积作比较，得出肌细胞截面积恢复率(% )。采用SPSS11. 0统计学软件进行统计学处理，每组样本采用均数和标准差计算，以 G士 S)表示，单因素方差分析进行统计学检验，P < 0. 05为有统计学意义。结果显示，坐骨神经功能指数(SFI) :B、C组在术后各时间点SFI均明显优于A组，差异有统 计学意义(P < 0. 01)。本发明制剂组和银杏酮酯组相比差异无统计学意义(P > 0. 05)。感觉神经再生距离(Pinch test)术后1周，B、C组感觉神经再生距离明显大于A 组，其差异有统计学意义(P < 0. 01)。B、C组之间的差异无统计学意义(P > 0. 05)。电生理检测B、C组在术后2、4、6、8周各时间点的运动神经传导速度及诱发电位 波幅恢复率均优于A组(P < 0. 01)。术后2、4周，B、C组之间的差异无统计学意义(P > 0. 05)。术后6、8周，B组优于C组(P < 0. 05)。单纯肌张力A组术后2周2只大鼠实验侧单纯肌张力未引出。B、C组各时间点 小腿三头肌单纯肌张力的恢复率均优于A组，差异有统计学意义(P<0.01)。术后2周，B 组单纯肌张力恢复率优于C组(P < 0. 05)，术后4、6、8周，B、C组之间的差异无统计学意义 (P > 0. 05)。强直收缩力B、C组各时间点小腿三头肌强直收缩力的恢复率，与A组相比，两者 差异有统计学意义(P <0.01)。B、C组之间的差异无统计学意义(P >0.05)。肌肉湿重恢复率B、C组在术后2、4、6、8周各时间点的小腿三头肌肌肉湿重恢复 率均优于A组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。B、C组之间的差异无统计学意义(P > 0. 05)。肌细胞截面积术后2、4、6、8周A组小腿三头肌肌细胞截面积恢复率均明显低于 B、C组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。B、C组之间差异无统计学意义(P > 0. 05)。有髓神经纤维计数B、C组各时间点有髓神经纤维通过率均明显优于A组，差异有 统计学意义(P < 0. 01)。术后2、4、6周，B组有髓神经纤维通过率和C组差别无统计学意 义(P > 0. 05)，术后8周，C组优于B组(P < 0. 05)。实验结果证明，本发明复合制剂对simderland V度神经损伤具有促进神经肌肉再 生的实际作用。
权利要求
1.一种促进神经肌肉再生的复方制剂，其特征是由有效成分与药物载体制成，所述有 效成分是由下述重量份配比的原料药组分组成党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，余为辅料；所述的辅料是药学上可以接受的辅料或辅助性成 分。
2.权利要求1的促进神经肌肉再生的复方制剂的制备方法，其特征是采用包括下述步骤，按照组方重量份称配比称量中药材党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，除红花外，取其余药材洗净，于通风处晾干后切成1 2cm的 小碎块，以4-10倍量水浸泡1 后煎煮池X 2次，水提液过滤后静置12h，再过滤一次，加热 浓缩至所需体积，得水提浸膏，干燥后，气流粉碎方法粉碎成超细粉1(Γ 5μπι ；细粉混合均 勻，加入辅料或辅助性成分，混勻，制成复方制剂。
3.按权利要求2所述的方法，其特征是其中所述的药材洗净、晾干、切成小碎块后，以8 倍量水浸泡1 加热回流提取3次，每次回流提取时间为ι小时。
4.按权利要求1的促进神经肌肉再生的复方制剂，其特征是，所述的复方制剂是冲剂、 散剂、颗粒剂，丸剂或胶囊。
全文摘要
本发明属中药领域，涉及一种促进神经肌肉再生的复方制剂及其制备方法。本发明采用水提法将特定重量配比的原料药党参，黄芪，丹参等加以药学上可以接受的辅料或辅助性成分制成复方制剂，经药理学实验，结果显示，可使早期损伤神经中的GAP-43表达增加，能竞争性地结合到G蛋白反应位点，促进轴突快速生长，有利于突触重建；动物实验结果显示，本复方制剂能促进机体的新陈代谢，增加受损部位的血供，清除溃变的髓鞘，促进雪旺细胞的分裂和增殖，对加速周围神经损伤后的再生明显有效，本复方制剂可进一步制成临床用促进神经肌肉再生的药物，造福更多的神经损伤病人。
文档编号A61K36/804GK102091166SQ20091020110
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者方有生, 陈德松, 顾玉东 申请人:复旦大学附属华山医院
技术领域：
本发明属中药领域，涉及中药复方制剂，具体涉及一种含党参等中药的促进神经 肌肉再生的复方制剂及其制备方法。
背景技术：
创伤是20世纪以来三大死因之一，同时在发达国家创伤也是造成青壮年死亡和 病残的首因，给患者带来极度的痛苦，也给社会造成巨大的经济损失。随着现代医学的发 展，尤其是60年代后显微外科的发展，极大程度地提高了创伤后的成活率，使众多患者看 到了希望，然而在被挽救的患者中，尚有许多伤者不能返回原来的工作岗位，由于创伤后神 经肌肉功能的恢复仍然是当今医学界的一大难题，而这一难题的解决不仅需要大量的临床 工作，还涉及到一系列基础问题，作为神经支配的效应器，骨骼肌在失去神经支配后不可避免的发生萎缩变性，同 时由于神经再生非常缓慢，往往在神经再支配前，肌细胞已丧失了再生的物质基础，即形成 不可逆的肌萎缩，其功能将不可恢复。因此如何加速神经再生是解决创伤后功能恢复的关 键问题之一。为此，国内外学者作了不懈努力。早在20世纪50年代，国外学者便发现了神 经生长因子(NGF)，先后有研究报道了 NGF家族(NGF、BDNF、NT-3、NT-4、NT-5等)和非NGF 家族(CNTF、IGF、GDNF, SDNF等)多种来源各异、不尽相同的神经营养因子，并在实验研究 中取得了一系列成果，然而在临床上是否能促进神经再生仍存在较大争论，并且至今尚未 有突破性的临床进展。近年来，中药对周围神经再生的作用受到临床越来越多的关注，有研究显示出，中 药对加速周围神经损伤后的再生有初步疗效，且其价格便宜，毒副作用小，拥有十分巨大的 临床应用潜力。与本发明相关的现有技术有如下参考文献1 Oliveira ALR, Risling M, Deckner M, et al. Neonatal sciatic nervetransection induces TUNEL labling of neurons in the rat spinal cord andDRG. Neuroreport, 1997,8 :2837-2840.2Inoue M, Hojo T, Yano T, et al. The effects of electroacupuncture onperipheral nerve regeneration in rats. Acupunct Med,2003,21 (1-2) :9-17.3Lazar DA,Curra FP,Mohr B, et al.Acceleration of recovery after injuryto the peripheral nervous system using ultrasound and other therapeuticmodalities. Neurosurg Clin N Am，2001，12(2) :353-357.4Rush RA, Mayo R, Zettler C. The regulation of nerve growth factorsynthesis and delivery to peripheral neurons. Pharmacol ther,1995,65 931-933.5ffong BJ, Crumley RL. Nerve wound healing. Otolaryngol Clin North Am, 1995,28(5) :881-895.6钟世镇.周围神经基础研究的进展.中华手外科杂志，1997，13(1) :1_2.
7Bain JR, Mackinnon SE，Hunter DA. Functional evaluation of completesciatic， peroneal， and posterior tibial nerve lesions in the rat. PlastReconstr Surg, 1989 ；83 :129-136.8Dahl in LB, Kanje M. Conditioning effect induced by chronic nervecompression. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg，1992，26 :37-41.9Kanje M，Lundborg G，Edstrom A. A new method for studi es of the effectsof locally applied drugs on peripheral nerve regeneration in vivo. BrainRes,1988,439 :116-121.10陈中伟.周围神经损伤临床与实验研究.济南山东科学技术出版社，1998， 22-63.1 IVanessa Vilela MR ,Claudio HB, Nilton M，et al. Can therapeuticultrasound influence the regeneration of peripheral nerves ？ Journal ofNeuroscience Methods，2005，142 :185-192.12Tomas H， Goran N， Martin K， et al.Hyperbaric oxygen treatment enhancesregeneration of the rat sciatic nerve. Experimental Neurology，1998，149 : 433-43813范秀红，周祥吉，范启申.周围神经检测研究进展.中华显微外科杂志，200023 237-239.14Mackinnon SE, Hudson AR, Hunter DA.Histologic assessment of nerveregeneration in the rat. Plast Reconstr Surg，1985，75 :384-388.15Bruno C，Cuppini R，Sartini S，et al. Regeneration of motor nerves inbilobalide-treated rats. Planta Med,1993,59 :302-307.16Hsu SH, Chang CJ, Tang CM，et al. In vitro and in vivo effects of GinkgobiIoba extract EGb 761 on seeded Schwann cells within poly(DL-lacticacid-co-glycolic acid)conduits for peripheral nerve regeneration. JBiomater Appl，2004，19 :163-182.17张烽，顾玉东，徐建光，等.银杏叶提取物促进大鼠坐骨神经再生的实验研 究·中华显微外科杂志，2000，23 :279-281.18薛锋，顾玉东，陈德松，等.周围神经损伤后银杏叶提取物Ε(Λ761对感觉神经元 的保护作用.复旦学报医学版，2002, ) =251-254.19杨藻寰.医用药理学.第2版北京人民卫生出版杜.1987，29-31.20Sundland S. Regeneraion of axon and related changes. In, ed Nerves andnerve injuries、Edinburgh :Churchitl Livingstone. 1991,91-11
发明内容
本发明的目的是提供一种具有促进神经肌肉再生作用的的中药复方制剂及其制 备方法。本发明复方制剂由有效成分与药物载体制成促进神经肌肉再生的复方制剂，所述 有效成分是由下述重量份配比的原料药组分组成党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，余为辅料。所述的辅料是药学上可以接受的辅料或辅助性成分。本发明所涉及的中药材党参、黄芪、丹参、生地、当归和红花为中国药典2000年版 一部所收载中药，并符合药典质量要求。所述党参其作用同人参，可促进DNA的合成和糖解，有提高能量代谢和蛋白质合 成及补元气，固脱生津的的作用；黄芪有强化机体的作用；当归有提高全身代谢的作用；红 花、丹参与生地具有活血化瘀，凉血养血的作用。本发明复方制剂通过下述方法和步骤制备，按照组方配比进行称量，除红花外，取其余药材洗净，于通风处晾干后切成1 2cm的小碎块，以4-10倍量水浸泡1 后煎煮^iX 2次，水提液过滤后静置12h，再过滤一 次，加热浓缩至所需体积，得中药中间体(水提浸膏)，干燥后，气流粉碎方法粉碎成超细粉 1(Γ15 μ m ；细粉混合均勻，加入加入辅料或辅助性成分，混勻，制成复方制剂。所述的复方制剂可以制成冲剂、散剂、颗粒剂，丸剂或胶囊。本发明比较了不同方法制备的上述中药中间体的促外周神经生长作用，结果显示 不同制备方法中以水提法药效为佳，并经进一步的药理和定性分析实验，探索其中的主要 有效成分，在此基础上，建立有生物活性的化学成分的定量分析方法，以水提法为基础，以 多糖、阿魏酸、丹参素及中间体的得率为考察指标，应用正交试验方法优选出最佳工艺。本 发明优选中间体的制备工艺其中以8倍量水加热回流提取3次，每次回流提取时间为1小 时。本发明以中间体(水提浸膏)为材料，用比色法测定了浸膏中多糖含量，结果显示 在2. 09 6. 21 %之间；用HPLC法测定阿魏酸和丹参素含量，测定结果显示分别在0. 050 0. 092yg/(mg 浸膏)和 0. 234 0. 419 μ g/(mg 浸膏)之间。本发明复方制剂进行了药理学实验，联合应用实时定量RT-PCR方法及免疫组织 化学方法观测其对周围神经损伤后神经远端GAP-43mRNA表达及其蛋白合成的影响，及对 损伤神经相应感觉神经元的超微结构变化进行了观察，结果显示，可以使早期损伤神经中 的GAP-43表达增加，这些增加的GAP-43更能竞争性地结合到G蛋白反应位点，促进轴突快 速生长，有利于突触重建；在大鼠坐骨神经损伤后应用复方中药后，神经损伤后相应感觉神 经元线粒体的肿胀变性程度，本发明复方制剂组明显好于对照组，其卫星细胞与神经元相 连，胞内细胞器丰富；实验结果显示，本发明复方制剂能促进机体的新陈代谢，增加受损部 位的血供，有利于神经改善缺血状态，清除溃变的髓鞘，促进雪旺细胞的分裂和增殖，进一 步通过影响远端靶组织产生的逆行性信号来调控GAP-43，利于神经的再生，对小鼠和大鼠 坐骨神经的早期再生均有明显的促进作用，对坐骨神经损伤后相应的感觉神经元也有一定 的保护作用，结果证实，本发明复方制剂具有促进周围神经再生的药理作用。本发明进行了治疗周围神经损伤动物实验，结果显示，本复方制剂对加速周围神 经损伤后的再生明显有效，本复方制剂可进一步制成临床用促进神经肌肉再生的药物，造 福更多的神经损伤病人。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明精神的限定内可适当变更。
具体实施例方式实施例1称量中药材党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，按照组方重量份称配比称量中药材党参黄芪丹参生 地当归红花为10 10 10 10 5 2，除红花外，取其余药材洗净，于通风处晾干 后切成1 2cm的小碎块，以4-10倍量水浸泡1 后煎煮池X 2次，水提液过滤后静置12h， 再过滤一次，加热浓缩至所需体积，得中药中间体(水提浸膏)，干燥后，气流粉碎方法粉碎 成超细粉1(Γ 5μπι ；细粉混合均勻，加入加入辅料或辅助性成分，混勻，制成复方制剂。所述的复方制剂可以制成冲剂、散剂、颗粒剂，丸剂或胶囊。实施例2称量中药材党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，按照组方重量份称配比称量中药材党参黄芪丹参生 地当归红花为10 10 10 10 5 2，除红花外，取其余药材洗净，于通风处晾 干后切成1 2cm的小碎块，以8倍量水浸泡1 加热回流提取3次，每次回流提取时间为 1小时，水提液过滤后静置12h，再过滤一次，加热浓缩至所需体积，得中药中间体(水提浸 膏)，干燥后，气流粉碎方法粉碎成超细粉1(Γ15 μ m ；细粉混合均勻，加入加入辅料或辅助 性成分，混勻，制成复方制剂。所述的复方制剂可以制成冲剂、散剂、颗粒剂，丸剂或胶囊。实施例3对大鼠坐骨神经再生影响实验动物SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠90只，体重180g 200g (购自复旦大学 实验动物部)。将大鼠随机分为A、B、C 3组，每组30只。A组为损伤对照组；B组为本发明制剂 组；C组为银杏酮酯组。每组又按坐骨神经损伤后不同时间点(l、2、4、6、8w)分为5个亚组， 每个亚组6只。设备及药品台式手术显微镜及10倍、16倍目镜(SXP-1B，上海医用光学仪器厂)，显微外科器 械及11-0、12-0医用无损伤缝合针线(宁波市成和显微器械厂)，3-0慕丝手术缝线(强生 公司)，肌张力换能器(复旦大学上海医学院生理教研室SMU-PC型生物信号处理系统)， Phasis4导程肌电诱发仪(意大利ESATO公司)，IMS细胞图像分析系统医学图像软件(上 海申腾信息技术有限公司)，常规手术器械自动拉钩，尖头持针器，蚊式手术钳，眼科剪刀 (上海医疗器械厂)，自制神经拉钩。0. 25%硫喷妥钠(上海新亚药业有限公司)，美解眠注 射液(第二军医大学朝晖制药厂)，0.9%氯化钠注射液(上海长征富明药业有限公司)，青 霉素钠粉剂(上海先锋药业有限公司)。方法动物以0. 25%硫喷妥钠(0. lml/kg)作腹腔注射麻醉。无菌条件下作右臀部斜切 口，于臀肌间隙显露右侧坐骨神经，距梨状肌下缘0. 8cm处切断坐骨神经，立即在手术显微 镜下以11-0无创尼龙针线缝合，关闭切口。术后A组每天给予生理盐水Iml灌胃，B组给 予Ε(Λ50(上海杏灵科技药业股份有限公司)提供，批号2004105) 200mg · kg-1 · d_l用生 理盐水稀释成Iml灌胃，C组给予本发明制剂浓缩液Iml灌胃，分别于术后1周行感觉神经再生距离检测，术后2、4、6、8周用电生理学、组织学和功能测定评估坐骨神经再生和功能 恢复情况。观察指标①坐骨神经功能指数(sciaticfunctional index, SFI)自制大鼠足行走箱，通道长90cm，宽15cm，高15cm。通道近端放置一个鼠箱，长 20cm，宽15cm，高15cm，单侧开门，箱底放置连续记录纸(20cm宽)。受试鼠双后足蘸炭素墨 水，放入行走箱入口，鼠在向远端爬行过程中每侧留4 5个足印，选实验侧足(E)和正常 侧足(N)足印，测量以下三个变量。(1)足印长度(p0d0gramlength，PL)，指足印最长距离， 即足跟到足尖的距离。(2)足耻宽度(width betweenthe first and fifth toes, TW)，即 第一趾到第五趾连线的距离。(3)中间足趾距离(inter-toesdistancedT)，即第二趾到第 四趾连线的距离。将上述三个变量代入Bain公式计算SFI，以SFI 0为正常值，-100为神 经完全断离指标。SFI = -38. 3(EPL-NPL)/NPL+109. 5(ETS-NTS)/NTS+13. 3(EIT-NIT)/NIT-8. 8。②感觉神经再生距离(Pinch test)术后第7天，麻醉后暴露右侧坐骨神经，在手术显微镜下用显微外科镊子从吻合 口远端2cm处向近端每间隔0. 5mm距离钳夹坐骨神经，直到出现背部肌肉收缩为止，用游标 卡尺测量该点到吻合口的距离(精确到mm)即为感觉神经再生的距离。③电生理检测用意大利Wmsis肌电仪测试。以双极电极作为刺激电极置于神经吻合口的近、远 端5mm处进行刺激(未手术侧刺激电极分别置于相对应位置)，同芯针电极为记录电极，插 入小腿三头肌。刺激神经近、远端，记录其诱发电位，根据其潜伏期及刺激点距离求得运动 神经传导速度。电刺激和记录参数方波持续时间0. 1ms，刺激强度0. 3mA，刺激频率1Hz， 扫描速度ans/D。整个操作过程中用温生理盐水保持神经湿润，避免刺激电极接触周围肌肉 组织。a)小腿三头肌最大诱发电位波幅(MAP)恢复率将损伤侧(右)与对侧(左)最 大波幅相比(R/LX100% )得出恢复率(％ )。b)运动神经传导速度(MNCV)恢复率将损伤侧(右)与对侧(左)运动神经传 导速度相比(R/LX100% )得出恢复率(％ )。④肌张力测定采用SMU-PC型生物信号处理系统(复旦大学上海医学院生理教研室)测定小腿 三头肌的单收缩力和强直收缩力。用12号针头固定膝关节，结扎并切断小腿三头肌远端肌 腱。通过1-0丝线将其断端连于张力换能器上，输出导线与两道生理记录仪相连，以特制的 银丝电极刺激神经吻合口的近端，调整肌肉的最适初长度，以电压5V、波宽0. ans、频率IHZ 的刺激作单刺激后，记录肌肉的单收缩力。以电压5V、波宽0. ans、频率50HZ的刺激，刺激 并记录其强直收缩力。操作过程中室温保持在180C 250C，温生理盐水保持神经肌肉湿 润。a)最大单次肌肉收缩力恢复率取单刺激肌肉收缩最大波幅(P-P value)，与健 侧比较得出恢复率(％)。b)最大强直收缩力恢复率在刺激频率为50HZ下持续刺激，记录最大强直收缩力，与健侧比较得出恢复率(％)。⑤小腿三头肌湿重测定测完肌张力后，处死大鼠，紧贴骨面取出两侧小腿三头肌，剔除表面结缔组织，滤 纸吸干表面血液后，即刻在电子分析天平上(R200D，1/10万，Germany)称重。并和自身健 侧小腿三头肌湿重比较求出恢复率(％ )。⑥有髓神经纤维通过率(Pass ratio, PR)神经吻合口以近2mm，以远3mm取材，分别取长约2mm—段神经，10 %福尔马林固 定，石蜡包埋、切片，甲苯胺蓝染色。所得切片每隔3张取1张，连取5张。用IMS细胞图 像分析系统的医学图像软件进行远近端有髓神经纤维计数，求出远端有髓神经纤维通过率)。⑦小腿三头肌肌细胞截面积恢复率取双侧小腿三头肌中部肌肉标本，常规石蜡切片，片厚5 μ m，HE染色。每个标本切 片5张，随机取5个视野中的20个肌纤维，用IMS细胞图像处理系统测量肌细胞截面积，将 实验侧和健侧肌细胞截面积作比较，得出肌细胞截面积恢复率(% )。采用SPSS11. 0统计学软件进行统计学处理，每组样本采用均数和标准差计算，以 G士 S)表示，单因素方差分析进行统计学检验，P < 0. 05为有统计学意义。结果显示，坐骨神经功能指数(SFI) :B、C组在术后各时间点SFI均明显优于A组，差异有统 计学意义(P < 0. 01)。本发明制剂组和银杏酮酯组相比差异无统计学意义(P > 0. 05)。感觉神经再生距离(Pinch test)术后1周，B、C组感觉神经再生距离明显大于A 组，其差异有统计学意义(P < 0. 01)。B、C组之间的差异无统计学意义(P > 0. 05)。电生理检测B、C组在术后2、4、6、8周各时间点的运动神经传导速度及诱发电位 波幅恢复率均优于A组(P < 0. 01)。术后2、4周，B、C组之间的差异无统计学意义(P > 0. 05)。术后6、8周，B组优于C组(P < 0. 05)。单纯肌张力A组术后2周2只大鼠实验侧单纯肌张力未引出。B、C组各时间点 小腿三头肌单纯肌张力的恢复率均优于A组，差异有统计学意义(P<0.01)。术后2周，B 组单纯肌张力恢复率优于C组(P < 0. 05)，术后4、6、8周，B、C组之间的差异无统计学意义 (P > 0. 05)。强直收缩力B、C组各时间点小腿三头肌强直收缩力的恢复率，与A组相比，两者 差异有统计学意义(P <0.01)。B、C组之间的差异无统计学意义(P >0.05)。肌肉湿重恢复率B、C组在术后2、4、6、8周各时间点的小腿三头肌肌肉湿重恢复 率均优于A组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。B、C组之间的差异无统计学意义(P > 0. 05)。肌细胞截面积术后2、4、6、8周A组小腿三头肌肌细胞截面积恢复率均明显低于 B、C组，差异有统计学意义(P < 0. 01)。B、C组之间差异无统计学意义(P > 0. 05)。有髓神经纤维计数B、C组各时间点有髓神经纤维通过率均明显优于A组，差异有 统计学意义(P < 0. 01)。术后2、4、6周，B组有髓神经纤维通过率和C组差别无统计学意 义(P > 0. 05)，术后8周，C组优于B组(P < 0. 05)。实验结果证明，本发明复合制剂对simderland V度神经损伤具有促进神经肌肉再 生的实际作用。
权利要求
1.一种促进神经肌肉再生的复方制剂，其特征是由有效成分与药物载体制成，所述有 效成分是由下述重量份配比的原料药组分组成党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，余为辅料；所述的辅料是药学上可以接受的辅料或辅助性成 分。
2.权利要求1的促进神经肌肉再生的复方制剂的制备方法，其特征是采用包括下述步骤，按照组方重量份称配比称量中药材党参黄芪丹参生地当归红花为 10 10 10 10 5 2，除红花外，取其余药材洗净，于通风处晾干后切成1 2cm的 小碎块，以4-10倍量水浸泡1 后煎煮池X 2次，水提液过滤后静置12h，再过滤一次，加热 浓缩至所需体积，得水提浸膏，干燥后，气流粉碎方法粉碎成超细粉1(Γ 5μπι ；细粉混合均 勻，加入辅料或辅助性成分，混勻，制成复方制剂。
3.按权利要求2所述的方法，其特征是其中所述的药材洗净、晾干、切成小碎块后，以8 倍量水浸泡1 加热回流提取3次，每次回流提取时间为ι小时。
4.按权利要求1的促进神经肌肉再生的复方制剂，其特征是，所述的复方制剂是冲剂、 散剂、颗粒剂，丸剂或胶囊。
全文摘要
本发明属中药领域，涉及一种促进神经肌肉再生的复方制剂及其制备方法。本发明采用水提法将特定重量配比的原料药党参，黄芪，丹参等加以药学上可以接受的辅料或辅助性成分制成复方制剂，经药理学实验，结果显示，可使早期损伤神经中的GAP-43表达增加，能竞争性地结合到G蛋白反应位点，促进轴突快速生长，有利于突触重建；动物实验结果显示，本复方制剂能促进机体的新陈代谢，增加受损部位的血供，清除溃变的髓鞘，促进雪旺细胞的分裂和增殖，对加速周围神经损伤后的再生明显有效，本复方制剂可进一步制成临床用促进神经肌肉再生的药物，造福更多的神经损伤病人。
文档编号A61K36/804GK102091166SQ20091020110
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者方有生, 陈德松, 顾玉东 申请人:复旦大学附属华山医院
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