对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列的制作方法
专利名称：对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列的制作方法
技术领域：
本专利涉及对流感病毒有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定
背景技术：
流行性感冒(Influenza)，简称流感，被称为最古老和最致命的人类瘟疫之一。据 历史记载，早在1510年英国就发生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美国每年 有2万人死于流感，俄罗斯每年也有1万人死于流感，英国每年有5万人由流感发展成肺 炎，其中约20%死亡。据估计，全球每年流感患者死亡人数高达60万人，多于艾滋病患者死 亡的人数。美国已将流感列为继心脏病、癌症、中风、肺气肿之后的威胁生命的第五大"杀手"。
流行性感冒，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流行性感冒病毒(Influenzavirus) 分别引起的急性呼吸道传染病。甲乙丙不仅反映了病毒被发现的年代及前后顺序，更主要 的是反映了对人类危害程度的顺序。甲型变动常以流行形式出现，引起世界性流感大流行， 在动物中分布广泛，并也能在动物引起流感流行和造成大量动物死亡。
尽管由死病毒、减毒毒株或重组表面糖蛋白组成的抗流感疫苗能够有效地保护约 70 80%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分毒株，对于新的潜在爆发的 毒株可能没有作用。而且，对于高风险人群如婴孩、老人、孕妇和其它各种免疫力低下的人 群，疫苗的保护作用是非常有限的，保护率低于40%。由于大部分的死亡都是发生在高风险 人群中，疫苗对于这些最需要它们的人却不能起到很好的保护作用。正在应用的几种抗流 感药物也能够降低流感感染的发生和减轻流感感染时的症状。但是，药物的副作用、病人的 承受能力、可能出现的抗药性变异限制了这些药物的大规模使用。所以，对于预防和治疗流 感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特别是在高风险人群中和爆发流感时。因此，流感 的防治至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的预防和治疗途径是医学 研究的重大课题。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是1998年首先在线虫发现的由双链RNA介 导的序列特异性的转录后基因沉默机制。RNAi —经发现，迅速成为生物学研究领域中最 为活跃的热点之一，Science杂志在2001年将其列为十大科学成就之一，2002年又将其列 为十大科技之首；Nature杂志也将小RNA评为2002年度最重要的科技发现之一 ；Andrew Z. Fire和Craig C. Mello因RNA干扰的发现而获得了 2006年诺贝尔生理医学奖。随着广 泛深入的实验研究的进行，人们对RNAi的机制有了更多的了解。 目前认为RNAi的主要过程为①siRNA形成阶段。RNAi的诱导物在细胞质内被 RNaseIII Dicer切割成为21_23nt的小分子干扰RNA (small interferingRNA， siRNA)，siRNA的结构特征是5'端单磷酸，3'端羟基，而且3'端有2 3_nt的碱基突出；②RNA 诱导的沉默复合物(RNA-induced Silencing Complex, RISC)的形成阶段。siRNA与RNAi 特异性酶(如Ago-2)结合，形成RISC，具有特异性的核酸内切酶活性能特异性地降解与 siRNA同源的mRNA ;③效应阶段。RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义RNA，反义RNA仍 结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目 标mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5'端10-nt)，从而阻断了其翻译成蛋白质， 表现为基因沉默。miRNA导致基因沉默的机制与此稍有不同，它们与靶mRNA 3'非编码区 (untranslated region, UTR)通过不完全互补结合，抑制翻译过程和蛋白质的合成。
RNAi能够被迅速应用于多种生物和功能的研究，得益于它的实验方法相对简单， 周期短，表型易于观察。RNAi实验中最关键的因素是干扰靶点的选择、siRNA的制备和基因 导入方法 作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，尤其是发现在哺乳动物细胞也 存在这一机制后，RNAi被广泛用于基因功能的研究以及肿瘤、病毒性疾病和遗传性疾病的 治疗研究。 自2003年以来RNAi抗IAV的已经有很多，有细胞水平的，也有动物水平的，有用 合成的siRNA的，也有用载体的。Ge等针对A型流感病毒病毒的八个基因设计并合成了 20 个siRNA，与H1N1共转染MDCK细胞和十日龄鸡胚，结果提示以NP和PA基因为耙点的siRNA 对A型流感病毒病毒感染有较好的抑制作用。Eric Ka-Wai Hui等通过研究指出以病毒的M 基因为靶点的化学合成siRNA能够特异性地抑制293T细胞中流感病毒的基质蛋白Ml的表 达，并且利用慢病毒载体来表达针对M基因的siRNAs同样能够特异性地抑制MDCK细胞中 Ml的表达和流感病毒的复制。我国学者郭骁才等采用自己编写的计算机程序结合系统发 育重建方法，对6101个siRNA分子进行了计算机筛选，结果表明设计的siRNA的分子针对 NP和PB1应该是最有效的。在动物水平实验上，St印hen等证明了针对A型流感病毒HlNl 的NP和PA高度保守区域的特异的siRNA能够抑制病毒在小鼠体内的复制，并且能够抑制 多种H5和H7亚型病毒的体内复制。另外，Qing Ge等发现将化学合成的siRNAs和一种多 聚阳离子载体PEI —起静脉注射到小鼠后眼窝，可以抑制病毒感染的小鼠的肺部内的病毒 复制。同样的结果也可见于小鼠被能够表达siRNAs前体的慢病毒载体与PEI共注射或与 Infasurf共灌输到小鼠肺部。
发明内容
本发明的目的在于提供3条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码 序列。所述的3条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA的序列分别如序列表400〈1>、 400〈2>和400〈3>所示。 本发明所述的三条siRNA的动物水平的实验结果表明，RNAi不但能有效抑制HINI 的病毒复制，而且能够抑制A型流感病毒其它亚型(如H3N1)的复制，为其用于流感的治疗 和预防提供了实验依据。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 :siRNA序列的设计和靶点的选择 设计和合成siRNA应遵循的一般原则是①应避免选择5'和3'端UTR和起始密 码区；②应根据目的基因的mRNA，选择其AUG起始密码子下游50 100nt区域处的编码序 列；③GC含量应在30% 50%之间；④尽量避免3个同样的核苷酸连续出现；⑤每条链的 3'端要有2个碱基(最好是TT)突出；⑥最后，选择的DNA片段经BLAST查询，应与其它人 类基因无同源性，以避免非特异性抑制。 采用这一原则，设计出序列表所述的三条siRNA序列〈400>1、 〈400>2、以及 〈400>3 ，并采用常规方法进行合成，进行以下的试验。
实施例2 :shRNA表达载体的构建 以129Sv/Ev小鼠基因组DNA为模板进行PCR，扩增出276bp的U6启动子序列。PCR
产物经EcoRI和Xbal双酶切，与经同样双酶切的pBluescript载体(美国Stratagene公
司)连接得到载体pU6P，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒进行测序，以
证实插入序列的正确性。 实施例3 :pU6-siHlNl载体的构建 载体pU6P用EcoRV-Xba I双酶切，质粒酶切产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳分离，切 胶用胶回收试剂盒进行胶回收，与合成的siRNA寡核苷酸链进行连接反应。转化后挑取阳 性克隆。 实施例4 :鸡胚实验验证pU6-siHlNl干扰H1NI流感病毒增殖的有效性 同时注射H1N1流感病毒(1000倍稀释液0. lml)和pU6-siHlNl (5微克)进九日
龄鸡胚气室下尿囊腔，33t:培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。 血凝试验测定尿囊液病毒滴度，具体过程如下 (1)于微量血凝板的每孔中滴加稀释液1 XPBS 50 ii L，根据被检样品数量定所加 排数。 (2)吸取被检尿囊液分别滴加于第一列孔，每个样品50ii L，然后由左至右顺序倍
比稀释至第ll列孔，再从第11列孔各吸取50iiL弃之。最后一列不加样品作空白对照。 (3)于每孔中加入0. 5%红细胞悬液50 ii L。 (4)置微型振荡器上振荡lmin，或手持血凝板绕圆圈混匀。 (5)放室温下(l8 20°C ):30min，或;3rC下l5 加min，观察结果。 经三次重复实验，序列表所述的三条序列〈400>1、 〈400>2、以及〈400>3对流感病
毒复制的抑制率如下
序列抑制后病毒滴度/未抑制病毒滴度
序列〈400>18/512
序列〈400>216/512
序列〈400>364/512
5
序列表〈110〉中山大学〈120〉对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列〈160〉3〈210〉1〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1aatccgaccg ctcttaata 19〈210>2<211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>2朋tctggcgc c朋gct朋te a 21〈210>3〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>3gaaatctcac tcagttatt 19
权利要求
一种对流感病毒复制有干扰作用的siRNA，其核苷酸序列如序列表400<3>所示。
2. 权利要求1所述的siRNA作为治疗流感病毒的药物的应用。
3. 含有权利要求1所述的siRNA的表达载体。
全文摘要
本发明公开了一条对流感病毒复制有抑制作用的siRNA；针对H1N1的shRNA表达载体pU6-siH1N1的构建及其对A型流感病毒的干扰作用的鉴定技术。本发明首先利用分子生物学的实验技术构建了十几条siRNA的表达载体；然后通过鸡胚实验测HA滴度的方法确定了siRNA对流感病毒干扰的有效性。
文档编号A61P31/16GK101760457SQ200910205078
公开日2010年6月30日 申请日期2008年3月6日 优先权日2008年3月6日
发明者任政华, 周亮, 周俊祺, 徐安龙, 李荣辉, 谢征, 邬明月 申请人:中山大学
技术领域：
本专利涉及对流感病毒有干扰作用的siRNA序列的设计和干扰作用的鉴定
背景技术：
流行性感冒(Influenza)，简称流感，被称为最古老和最致命的人类瘟疫之一。据 历史记载，早在1510年英国就发生了由全球第一起由流感引起的流行病。如今，美国每年 有2万人死于流感，俄罗斯每年也有1万人死于流感，英国每年有5万人由流感发展成肺 炎，其中约20%死亡。据估计，全球每年流感患者死亡人数高达60万人，多于艾滋病患者死 亡的人数。美国已将流感列为继心脏病、癌症、中风、肺气肿之后的威胁生命的第五大"杀手"。
流行性感冒，是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流行性感冒病毒(Influenzavirus) 分别引起的急性呼吸道传染病。甲乙丙不仅反映了病毒被发现的年代及前后顺序，更主要 的是反映了对人类危害程度的顺序。甲型变动常以流行形式出现，引起世界性流感大流行， 在动物中分布广泛，并也能在动物引起流感流行和造成大量动物死亡。
尽管由死病毒、减毒毒株或重组表面糖蛋白组成的抗流感疫苗能够有效地保护约 70 80%的健康成年人免于患病，但是疫苗只能针对一小部分毒株，对于新的潜在爆发的 毒株可能没有作用。而且，对于高风险人群如婴孩、老人、孕妇和其它各种免疫力低下的人 群，疫苗的保护作用是非常有限的，保护率低于40%。由于大部分的死亡都是发生在高风险 人群中，疫苗对于这些最需要它们的人却不能起到很好的保护作用。正在应用的几种抗流 感药物也能够降低流感感染的发生和减轻流感感染时的症状。但是，药物的副作用、病人的 承受能力、可能出现的抗药性变异限制了这些药物的大规模使用。所以，对于预防和治疗流 感病毒感染的方法仍然有很急切的需要，特别是在高风险人群中和爆发流感时。因此，流感 的防治至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的预防和治疗途径是医学 研究的重大课题。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是1998年首先在线虫发现的由双链RNA介 导的序列特异性的转录后基因沉默机制。RNAi —经发现，迅速成为生物学研究领域中最 为活跃的热点之一，Science杂志在2001年将其列为十大科学成就之一，2002年又将其列 为十大科技之首；Nature杂志也将小RNA评为2002年度最重要的科技发现之一 ；Andrew Z. Fire和Craig C. Mello因RNA干扰的发现而获得了 2006年诺贝尔生理医学奖。随着广 泛深入的实验研究的进行，人们对RNAi的机制有了更多的了解。 目前认为RNAi的主要过程为①siRNA形成阶段。RNAi的诱导物在细胞质内被 RNaseIII Dicer切割成为21_23nt的小分子干扰RNA (small interferingRNA， siRNA)，siRNA的结构特征是5'端单磷酸，3'端羟基，而且3'端有2 3_nt的碱基突出；②RNA 诱导的沉默复合物(RNA-induced Silencing Complex, RISC)的形成阶段。siRNA与RNAi 特异性酶(如Ago-2)结合，形成RISC，具有特异性的核酸内切酶活性能特异性地降解与 siRNA同源的mRNA ;③效应阶段。RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义RNA，反义RNA仍 结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶目 标mRNA切断(切割位置在siRNA的中央，距离5'端10-nt)，从而阻断了其翻译成蛋白质， 表现为基因沉默。miRNA导致基因沉默的机制与此稍有不同，它们与靶mRNA 3'非编码区 (untranslated region, UTR)通过不完全互补结合，抑制翻译过程和蛋白质的合成。
RNAi能够被迅速应用于多种生物和功能的研究，得益于它的实验方法相对简单， 周期短，表型易于观察。RNAi实验中最关键的因素是干扰靶点的选择、siRNA的制备和基因 导入方法 作为一种快速、有效、特异的抑制基因表达的工具，尤其是发现在哺乳动物细胞也 存在这一机制后，RNAi被广泛用于基因功能的研究以及肿瘤、病毒性疾病和遗传性疾病的 治疗研究。 自2003年以来RNAi抗IAV的已经有很多，有细胞水平的，也有动物水平的，有用 合成的siRNA的，也有用载体的。Ge等针对A型流感病毒病毒的八个基因设计并合成了 20 个siRNA，与H1N1共转染MDCK细胞和十日龄鸡胚，结果提示以NP和PA基因为耙点的siRNA 对A型流感病毒病毒感染有较好的抑制作用。Eric Ka-Wai Hui等通过研究指出以病毒的M 基因为靶点的化学合成siRNA能够特异性地抑制293T细胞中流感病毒的基质蛋白Ml的表 达，并且利用慢病毒载体来表达针对M基因的siRNAs同样能够特异性地抑制MDCK细胞中 Ml的表达和流感病毒的复制。我国学者郭骁才等采用自己编写的计算机程序结合系统发 育重建方法，对6101个siRNA分子进行了计算机筛选，结果表明设计的siRNA的分子针对 NP和PB1应该是最有效的。在动物水平实验上，St印hen等证明了针对A型流感病毒HlNl 的NP和PA高度保守区域的特异的siRNA能够抑制病毒在小鼠体内的复制，并且能够抑制 多种H5和H7亚型病毒的体内复制。另外，Qing Ge等发现将化学合成的siRNAs和一种多 聚阳离子载体PEI —起静脉注射到小鼠后眼窝，可以抑制病毒感染的小鼠的肺部内的病毒 复制。同样的结果也可见于小鼠被能够表达siRNAs前体的慢病毒载体与PEI共注射或与 Infasurf共灌输到小鼠肺部。
发明内容
本发明的目的在于提供3条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码 序列。所述的3条对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA的序列分别如序列表400〈1>、 400〈2>和400〈3>所示。 本发明所述的三条siRNA的动物水平的实验结果表明，RNAi不但能有效抑制HINI 的病毒复制，而且能够抑制A型流感病毒其它亚型(如H3N1)的复制，为其用于流感的治疗 和预防提供了实验依据。
具体实施例方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 :siRNA序列的设计和靶点的选择 设计和合成siRNA应遵循的一般原则是①应避免选择5'和3'端UTR和起始密 码区；②应根据目的基因的mRNA，选择其AUG起始密码子下游50 100nt区域处的编码序 列；③GC含量应在30% 50%之间；④尽量避免3个同样的核苷酸连续出现；⑤每条链的 3'端要有2个碱基(最好是TT)突出；⑥最后，选择的DNA片段经BLAST查询，应与其它人 类基因无同源性，以避免非特异性抑制。 采用这一原则，设计出序列表所述的三条siRNA序列〈400>1、 〈400>2、以及 〈400>3 ，并采用常规方法进行合成，进行以下的试验。
实施例2 :shRNA表达载体的构建 以129Sv/Ev小鼠基因组DNA为模板进行PCR，扩增出276bp的U6启动子序列。PCR
产物经EcoRI和Xbal双酶切，与经同样双酶切的pBluescript载体(美国Stratagene公
司)连接得到载体pU6P，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒进行测序，以
证实插入序列的正确性。 实施例3 :pU6-siHlNl载体的构建 载体pU6P用EcoRV-Xba I双酶切，质粒酶切产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳分离，切 胶用胶回收试剂盒进行胶回收，与合成的siRNA寡核苷酸链进行连接反应。转化后挑取阳 性克隆。 实施例4 :鸡胚实验验证pU6-siHlNl干扰H1NI流感病毒增殖的有效性 同时注射H1N1流感病毒(1000倍稀释液0. lml)和pU6-siHlNl (5微克)进九日
龄鸡胚气室下尿囊腔，33t:培养72小时，取尿囊液，测血凝效价。 血凝试验测定尿囊液病毒滴度，具体过程如下 (1)于微量血凝板的每孔中滴加稀释液1 XPBS 50 ii L，根据被检样品数量定所加 排数。 (2)吸取被检尿囊液分别滴加于第一列孔，每个样品50ii L，然后由左至右顺序倍
比稀释至第ll列孔，再从第11列孔各吸取50iiL弃之。最后一列不加样品作空白对照。 (3)于每孔中加入0. 5%红细胞悬液50 ii L。 (4)置微型振荡器上振荡lmin，或手持血凝板绕圆圈混匀。 (5)放室温下(l8 20°C ):30min，或;3rC下l5 加min，观察结果。 经三次重复实验，序列表所述的三条序列〈400>1、 〈400>2、以及〈400>3对流感病
毒复制的抑制率如下
序列抑制后病毒滴度/未抑制病毒滴度
序列〈400>18/512
序列〈400>216/512
序列〈400>364/512
5
序列表〈110〉中山大学〈120〉对A型流感病毒复制有抑制作用的siRNA及其编码序列〈160〉3〈210〉1〈211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1aatccgaccg ctcttaata 19〈210>2<211>21〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>2朋tctggcgc c朋gct朋te a 21〈210>3〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>3gaaatctcac tcagttatt 19
权利要求
一种对流感病毒复制有干扰作用的siRNA，其核苷酸序列如序列表400<3>所示。
2. 权利要求1所述的siRNA作为治疗流感病毒的药物的应用。
3. 含有权利要求1所述的siRNA的表达载体。
全文摘要
本发明公开了一条对流感病毒复制有抑制作用的siRNA；针对H1N1的shRNA表达载体pU6-siH1N1的构建及其对A型流感病毒的干扰作用的鉴定技术。本发明首先利用分子生物学的实验技术构建了十几条siRNA的表达载体；然后通过鸡胚实验测HA滴度的方法确定了siRNA对流感病毒干扰的有效性。
文档编号A61P31/16GK101760457SQ200910205078
公开日2010年6月30日 申请日期2008年3月6日 优先权日2008年3月6日
发明者任政华, 周亮, 周俊祺, 徐安龙, 李荣辉, 谢征, 邬明月 申请人:中山大学
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