芳基硫脲及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：：芳基硫脲及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及芳基硫脲新化合物、合成及其抑制VEGFR-2的用途，更具体地说，是含芳基硫脲化合物作为高效的靶向VEGFR的抗肿瘤药及其合成和用途，属药物领域。
背景技术：
：血管内皮生长因子受体(VascularEndothelialGrowthFactorRec印tor，VEGFR)酪氨酸激酶因其在介导肿瘤血管生成过程中的关键作用，是目前最受关注的抗肿瘤药物设计革巴标[Sebolt—Leopold，J.S.;English，J.M.，Mechanismsofdruginhibitionofsignallingmolecules.Nature2006，441，(7092)，457-62]。这个生长因子受体家族现发现了三个调控跨膜糖蛋白受体[Neufeld，G.;Cohen，T.;Gengrinovitch，S.;Poltorak，Z.，Vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)anditsreceptors.FASEBJ1999,13，(1)，9-22.]:VEGFR-l(Fms-likeTyrosineKinase,Flt-1)、VEGFR-2(KinaseInsertDomainContainingRec印tor，KDR/Fsk-1)禾PVEGFR-3。像其它蛋白激酶一样，它们通过催化转移ATP末端磷酸，把细胞生长信号转移到靶蛋白基体的酪氨酸残基上，由此调控着许多生命过程，如细胞增殖，生长，转移和凋亡等。VEGFR-2是单次跨膜蛋白，与所有VEGFR—样，分为膜外的配体结合域、跨膜区和膜内的酪氨酸激酶域。VEGFR-2的膜外区结构柔性大，在与VEGF结合前后其构象变化也大，因此不是小分子化合物的理想作用靶点。VEGFR-2膜内酪氨酸激酶域分为几个重要的功會g区[Crystalstructureofthekinasedomainofhumanvascularendothelialgrowthfactorreceptor2:akeyenzymeinangiogenesis.Structure1999,7，(3)，319-30.]:A)连接两个蛋白小叶的绞链区；B)两小叶之间扁平的三磷酸腺苷(AdenosineTri-Phosphate，ATP)结合域；C)富含甘氨酸的核苷结合环，催化环，高度柔性的活化环和激酶插入域。小分子抑制剂与ATP竞争性地与酶结合，阻止酶的活化，从而阻断VEGF的信号传导通路，达到抑制VEGF介导的血管生成的目的。因此，VEGFR-2膜内酪氨酸激酶域的ATP结合域自然地成为理想的小分子抑制剂的结合位点。目前为止，VEGFR-2的抑制剂研究取得了比较大的进展。索拉非尼(nexavar，sorafenib)是由美国Onyx制药公司和德国拜尔公司开发的针对VEGFR-2，VEGFR-3，RAF/MEK/ERK等信号途径的多靶点抗肿瘤药物，它在临床前实验中能有效地抑制肿瘤细胞的增殖和血管的生成。在转移性肾细胞癌的临床III期试验中，索拉非尼显著地提高了患者的总生存期[Preclinicaloverviewofsorafenib，amultikinaseinhibitorthattargetsbothRafandVEGFandPDGFreceptortyrosinekinasesignaling.MolCancerTher2008，7，(10)，3129-40.]。另一个能作用于VEGFR-2的TKI药物是辉瑞公司的舒尼替尼(sutent，sunitinib)，在随机临床III期治疗中，舒尼替尼成功地抑制了对伊马替尼产生抗性的胃肠道间质瘤患者的肿瘤发展[Efficacyandsafetyofsunitinibinpatientswithadvancedgastrointestinalstromaltumourafterfailureofimatinib:arandomisedcontrolledtrial.Lancet2006,368，(9544)，1329-38.]。5现有药物还是不能完全满足临床用药的需求，因此目前药物研发者还在积极地寻找新的具有VEGFR-2抑制作用的化合物。如CN101056871A、CN101052634A公开了作为VEGFR激酶抑制剂的邻氨基苯甲酰胺吡啶脲类化合物。CN1972925A公开了一类具有VEGFR激酶抑制作用的双芳基脲衍生物，但通式中取代基定义的多种基团化合物从未实施，并且与已公开的取代基化合物有较大的性质差异，因此我们无法预见通式中包含的硫脲类化合物是否具有VEGFR激酶抑制活性及其药物安全性能。
发明内容本发明的技术方案是提供一类具有抑制血管内皮生长因子受体信号传导的芳基硫脲类新化合物。本发明的技术方案是提供一类芳基硫脲化合物的制备方法及用途。本发明提供的一类芳基硫脲化合物，具有如下结构I其中，R为C6—1Q芳基，C4_C8杂芳基，取代的C6—1Q芳基，取代的C4_C8杂芳基，所述的C6—1Q芳基或C4-C8杂芳基被一个或多个以下基团取代-CN、-CF3、-N02、-CO具、-C(O)NR^'、、、卤素或至多全卤代；&和R/独立的选自H，C卜1Q烷基，C6—14芳基，C3—13杂芳基，至多全卤代的C卜1Q烷基。本发明所述化合物优选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>化合物3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>化合物16本发明式I化合物的合成如下反应式所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>具体的说，以异硫腈酸酯(II)及[4-(4-氨基苯甲氧基)(2-吡啶基)]_^甲基甲酰胺(III)为原料，在溶剂中混合直接縮合得到芳基硫脲衍生物。其中，溶剂选自乙腈，乙酸乙酯，甲醇，乙醇，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)。反应温度为20-10(TC，一般在室温下或溶剂的回流温度下进行反应。[4-(4-氨基苯甲氧基)(2-吡啶基)]-N-甲基甲酰胺(III)与异硫腈酸酯(II)的原料摩尔比为1:0.8-1.2。本发明式I化合物作为VEGFR的抑制剂的用途，优选其在制备抗肿瘤药物中的用途。所述的肿瘤包括但不限于结肠癌、十二指肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、导管癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌、胃癌、非小细胞肺癌、神经恶性肿瘤和血液恶性肿瘤。我们通过计算机分子模型设计合成了大量的新系列化合物。通过大量的体外筛选实验研究发现本发明提供的这一系列芳基硫脲化合物具有显著的抑制VEGFR-2和抗肿瘤的活性，且其作用显著优于脲类化合物sorafenib。此外，通过考察对正常肝细胞增殖的影响，我们还意外地发现本发明提供的芳基硫脲化合物对正常肝细胞增殖的影响要显著小于脲类化合物sorafenib，也就是说本发明提供的芳基硫脲化合物对人正常肝细胞具有更低毒性，表现其更加良好的抗肿瘤药物安全性能。本发明是基于VEGFR蛋白激酶与小分子抑制相互作用的晶体结构[Harris,P.A.;Cheung,M.;Hunter，R.N.，3rd;Brown，M丄；Veal，J.M.;Nolte，R.T.;Wang，L.;Liu，W.;Crosby，R.M.;Johnson，J.H.;Epperly，A.H.;Kumar，R.;Luttrell，D.K.;Stafford，J.A.，Discoveryandevaluationof2_anilino_5_aryloxazolesasanovelclassofVEGFR2kinaseinhibitors.JMedChem2005，48，(5)，1610-9.]，通过聚焦型化合物库的合成方法，选定以药效团芳基硫脲为核心结构，通过在硫脲氮原子上引进不同的取代基，合成一系列不同取代芳基硫脲新化合物，在分子水平测定了各化合物对血管内皮生长因子受体蛋白激酶的抑制活性，同时在细胞水平测定了各化合物对血管内皮生长因子受体过度表达的肿瘤细胞生长的抑制活性，并通过动物实验证明了本发明化合物对肿瘤的抑制作用。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不构成对本发明的限制。实施例1中间体111的合成步骤1:250mL三口瓶中，通氮气置换空气，并于N2保护下加入36mLS0Cl2，小心滴入1.2mL干燥的DMF，控温42"，搅拌10min后，缓慢加入12g2-吡啶甲酸(30min内加完)，然后升温至72。C，搅拌反应16h，冷却至室温，加入lOOmL甲苯，减压浓縮至40mL，再加入60mL甲苯后浓縮至40mL，重复上述过程一次，有少量红色固体出现，抽滤，用50mL甲苯洗涤固体，滤液置于250mL烧瓶中，冰水浴下缓慢加入40mL甲醇，搅拌10min，撤去冰浴，室温下搅拌45min，再置于冰水浴中5min，加入40mL乙醚，有白色沉淀析出，过滤，用30mL乙醚洗涤所得固体，干燥后得淡黄色粉末(2)14.9g，产率73.5%。步骤2:250mL三口瓶中，化合物(2)14.9g溶于10mL甲醇与50mLTHF的混合溶剂中，N2保护下(TC搅拌10min，缓慢滴入70mL甲胺醇溶液，保持反应温度低于5°C，滴毕，(TC下反应5h后，减压蒸干溶剂，加入150mL乙酸乙酯洗涤残余物，过滤，用50mL乙酸乙酯洗涤所得滤渣，所得滤液无水Na2S04干燥后，旋蒸得黄色油状液体(3)12.4g。步骤3:250mL烧瓶中加入8.8g对氨基苯酚，130mL无水DMF和8.5g叔丁醇钾，室温下搅拌2h后，加入5.4g无水K2C03及12.4g化合物(3)，N2保护下升温至8(TC反应6h，反应液中加入乙酸乙酯及饱和Na2C03溶液分液，有机层用饱和食盐水洗，无水Na2S04干燥后，硅胶柱层析分离(PE:EA=2:1(v/v))得6.Og棕黄色固体(III)。力NMR(600MHz，CDC13):S3.00(d，3H)，3.69(brs，2H)，6.71(d，2H)，6.87(d，2H)，6.90-6.91(m，1H)，7.66(d，1H)，7.99(brs，1H)，8.32(d，1H)实施例2中间体II异硫腈酸酯的合成方法1:100mL单口瓶中加入1.85g对甲氧基苯胺，6.3mL三乙胺和20mL甲苯，室温搅拌下，于20min内滴加2.7mLCS2，加完后继续室温反应直至析出大量固体。冰水浴下冷却上述反应液，缓慢滴加溶有1.48g三聚光气(BTC)的15mL甲苯溶液，加完后继续室温反应约4h，过滤，滤渣用甲苯洗2次，滤液减压蒸馏得粗品，硅胶柱层析分离(纯PE)得无色液体II-l1.86g，产率75.1%。^NMR(600MHz，CDC13):S3.79(s，3H)，6.83-6.84(d，2H)，7.13-7.15(d，2H).方法2:lOOmL单口瓶中加入O.89g对三氟甲氧基苯胺，3.30g三乙烯二胺六水和10mL甲苯，室温搅拌下，于20min内滴加0.9mLCS2(溶于15mL甲苯)，加完后继续室温反应直至析出大量固体。抽滤，并用少量甲苯洗涤所得固体，烘干得黄色固体。以上黄色固体悬浮于15mL二氯甲烷中，冰水浴冷却至5-10°C，缓慢滴加溶有0.50g三聚光气(BTC)的15mL二氯甲烷溶液，加完后室温反应lh，然后升温回流反应完全，冷却至室温，过滤除去不溶物，滤液减压蒸馏得粗品，硅胶柱层析分离(纯PE或PE:EA=5:1(v/v))得无色液体II-20.56g，产率50.7%。力NMR(600MHz，CDC13):S7.18-7.20(d，2H)，7.23-7.24(d，2H)实施例3化合物1的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>25mL单口瓶中，73mg中间体III溶于5mLDMF中，冰水浴冷却搅拌下滴加溶于5mLDMF中的对三氟甲氧苯异硫腈酸酯71mg，滴毕室温反应，TLC板检测反应完成后，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水NS04干燥后，硅胶柱层析分离(PE:EA=2:l(v/v))得76mg浅灰色粉末，产率52.8%。1HNMR(600MHz，DMS0_d6):S2.96-2.97(d，3H)，7.01-7.02(m，1H)，7.05—7.06(d，2H)，7.18—7.19(d，2H)，7.42—7.45(t，4H)，7.62(d，1H)，8.11-8.12(brd，1H)，8.39-8.40(d，1H)，8.64(s，1H)，8.70(s，1H)MS(ESI):461.06(M_H)实施例4化合物2的制备操作方法同实施例3，所用中间体II为对氟苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:0.8。所用溶剂为DMF，温度50。C，产率为86%。1HNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.91(d，3H)，6.90(d，2H)，6.98(d，2H)，7.02(m，1H)，7.07(m，1H)，7.31(d，2H)，7.55(d，2H)，8.05(br，3H)，8.51(m，1H)MS(ESI):395.02(M—H)实施例5化合物3的制备操作方法同实施例3，所用中间体II为对溴苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.2所用溶剂为DMF，温度20。C，产率为67%。1HNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.99-3.00(d，3H)，7.02-7.03(m，1H)，7.10-7.12(t，4H)，7.36-7.38(m，2H)，7.44-7.45(d，2H)，7.67(d，1H)，7.85(s，1H)，7.87(s，1H)，8.01(brd，1H)，8.41—8.42(d，1H).MS(ESI):456.34(M-H)实施例6化合物4的制备COOEt操作方法同实施例3，所用中间体II为间苯甲酸乙酯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.O，所用溶剂为DMF，温度20。C，产率为75%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S1.36(t，3H)，2.98(s，3H)，4.36(q，2H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.01(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.45(m，1H)，7.74(m，1H)，7.95(d，1H)，8.16(d，1H)，8.39(br，3H)，8.51(d，lH).11MS(ESI):450.51(M)+实施例7化合物5的制备,NH^NHCONHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为1-萘异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为l:1.2，所用溶剂为DMS0，温度100。C，产率为86%。lHNMR(600MHz，DMSO-d6):S2.75-2.76(d，3H)，7.10-7.12(m，1H)，7.14-7.16(d，2H)，7.38(d，1H)，7.50-7.55(m，4H)，7.59-7.60(d，2H)，7.83-7.85(t，1H)，7.93-7.97(m，2H)，8.48(d，1H)，8.71(br，1H)，9.78(s，1H)，9.89(s，1H)MS(ESI):429.22(M+H)+实施例8化合物6的制备,NH，CONHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为6-吲哚异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为l:0.8，所用溶剂为乙酸乙酉旨，温度70。C，产率为54%。lHNMR(600腿z，DMSO-d6):S2.76-2.77(d，3H)，6.45(s，1H)，7.04-7.07(t，1H)，7.11-7.12(m，1H)，7.13-7.14(d，2H)，7.22—7.25(t，2H)，7.32—7.33(t，1H)，7.39(d，1H)，7.60—7.62(d，2H)，8.49-8.50(d，1H)，8.72(brd，1H)，9.61(s，1H)，9.84(s，1H)，11.16(brs，1H)MS(ESI):416.20(M_H)+实施例9化合物7的制备、CTvCONHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为1-吡咯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:0.8，所用溶剂为乙醇，温度20"，产率为48%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.98(s，3H)，5.97(d，1H)，6.23(m，1H)，6.90(d，2H)，6.96(d，1H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.35(dd，2H)，8.51(d，1H)，9.52(br，4H).MS(ESI):367.41(M)+实施例10化合物8的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>操作方法同实施例3，所用中间体II为3-苯甲酰甲胺异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.0，所用溶剂为DMF，温度2(TC，产率为84^。1HNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.82(s，3H)，2.98(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.68(m，1H)，7.76(m，1H)，7.82(m，1H)，8.01(br，4H)，8.13(d，1H)，8.51(d，1H)MS(ESI):436.49(M+H)+实施例ll化合物9的制备CONHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为4-苯甲酰苯胺异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.2，所用溶剂为DMF，温度IO(TC，产率为78%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.91(s，1H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.14(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.39(m，2H)，7.86(m，2H)，7.89(dd，2H)，8.16(dd，2H)，8.38(br，4H)，8.51(d，1H)MS(ESI):498.56(M+H)+实施例12化合物10的制备CONHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为4-苯甲硫醚异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.2，所用溶剂为DMF，温度50。C，产率为79%。lHNMR(600腿z，DMS0-d6):S2.60(s，3H)，2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.30(dd，2H)，7.31(dd，2H)，7.51(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.51(d，1H).MS(ESI):424.53(M)+实施例13化合物11的制备0v、C0NHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为4-吡啶异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.0，所用溶剂为DMF，温度20。C，产率为62%。lHNMR(600MHz，13DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.80(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.45(dd，2H)，8.51(d，1H)MS(ESI):397.75(M)+实施例14化合物12的制备CONHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为3-硝基苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.1，所用溶剂为乙腈，温度50"，产率为87%。lHNMR(600腿z，DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.67(m，1H)，7.86(m，1H)，8.05(br，3H)，8.20(m，1H)，8.51(d，1H)，8.87(d，1H)MS(ESI):422.44(M_H)+实施例15化合物13的制备N中间体III和中lHNMR(600MHz，CTv、CONHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为2-腈基苯异硫腈酸酯间体II的摩尔比例为1:1.2，所用溶剂为匿F，温度2(TC，产率为79%DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.22(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.54(m，1H)，7.66(m，1H)，7.75(m，1H)，8.07(br，3H)，8.51(d，1H)MS(ESI):402.45(M_H)+实施例16化合物14的制备CONHCH3操作方法同实施例3，所用中间体II为4-氯_3-三氟甲基苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.0，所用溶剂为乙腈，温度3(TC，产率为85X。1H画R(600MHz，DMS0-d6):S2.97-2.98(d，3H)，7.05-7.06(m，1H)，7.07-7.08(d，2H)，7.41-7.44(t，3H)，7.60(d，1H)，7.66-7.68(dd，1H)，7.71(d，1H)，8.14-8.15(brd，1H)，8.41-8.42(d，1H)，8.61(s，1H)，8.81(s，1H).MS(ESI):479.04(M—H)+，■10(M+)14实施例17化合物15的制备操作方法同实施例3，所用中间体II为5-氯萘异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为1:1.0，所用溶剂为DMF，温度20。C，产率为65%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.90(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.31(dd，2H)，7.39(m，1H)，7.44(m，1H)，7.71(m，1H)，7.78(m，1H)，8.05(m，1H)，8.05(br，3H)，8.09(m，1H)，8.51(d，lH).MS(ESI):462.95(M)+实施例18化合物16的制备操作方法同实施例3，所用中间体II为苯异硫腈酸酯，中间体III和中间体II的摩尔比例为l:1.O，所用溶剂为DMF，温度20。C，产率为91%。lHNMR(600MHz，DMS0-d6):S2.91(s，3H)，6.91(dd，2H)，7.02(m，1H)，7.07(d，1H)，7.06(m，1H)，7.31(dd，2H)，7.34(m，2H)，7.58(dd，2H)，8.05(br，3H)，8.51(d，1).MS(ESI):378.45(M)+以下通过具体药效试验证明本发明的有益效果。试验例1本发明化合物对血管内皮生长因子受体[VEGFR]蛋白激酶抑制活性测试将VEGFR-2蛋白激酶的胞质区序列Val805_Val1356在Sf9细胞中大量表达，接种于6孔板(5'105/孔)，无血清培养液同步化24小时后，在4t:下用细胞裂解液作用20分钟，刮下细胞，超声破碎细胞，离心后收集上清，通过连续色谱发分离得到纯度>90%的激酶蛋白。在96孔板中，用poly(Glu4-Tyr)在Tris缓冲溶液(25mMTris，pH7.2，150mMNaCl)中配比成0.5mg/mL的悬液，1小时候用TBS溶液洗涤两次。VEGFR-2激酶稀释到激酶反应缓冲溶液中，加入用匿SO配制的化合物溶液孵化10分钟。在各孔中加入ATP/MgCl2激发反应，最后的溶液浓度组成是1M的ATP，10mM的MgCl2，lmM的MnCl2，4mM的HEPES，pH为7.4，20mM的Na3V04，20mg/mL的BSA，和2%的DMSO。室温下40分钟后，除去清液，并用TBST溶液(TBSwith0.05%Tween20)洗涤3次。加入浓度约0.lmg/mL的铕共轭抗磷酸酪氨酸抗体75ml孵化1小时，然后用TBST溶液洗涤3次，加入100ml增强液在暗箱中孵化15分钟。然后将96孔板置于维克多电压多标签柜台使用默认的铕检测协议进行读数。与空白样数据进行比较计算出化合物的抑制百分率。表l化合物l-16对VEGFR蛋白激酶的抑制效果化合物编号抑制率(％)(浓度lOPg/mL)分子水平的酶活性测试显示，本发明提供的芳基硫脲化合物对血管内皮生长因子受体蛋白激酶有很强的抑制效果，其抑制率显著高于sorafenib，特别是化合物2，4，5，6，9，10，14和16。试验例2本发明化合物对血管内皮生长因子受体[VEGFR]蛋白激酶高表达的肿瘤细胞生长抑制活性测试人脐静脉内皮细胞[HUVEC]高表达血管内皮生长因子受体，用来测试化合物对肿瘤细胞生长的抑制效果。用四氮唑盐(MTT)法观察化合物对于细胞的增殖作用将对数生长期的HUVEC，用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎小牛血清的1640培养基培养液配成单个细胞悬液，以每孔104个细胞接种于96孔板，每孔100mL，在培养箱中孵化24h。在无菌条件下，以无药培养液和各种浓度的含药培养液处理96孔培养板(每种化合物设3个平行)24-72小时。培养结束前4小时加入MTT显色，在活细胞内可形成有色结晶，悬浮细胞离心后吸弃上清液。用匿S0溶解结晶后，测定570nm处的吸光度。按以下方法求得抑制率(％)。增殖抑制率=1-(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)表2化合物1-16对人脐静脉内皮细胞[HUVEC]生长的抑制效果化合物编号抑制率％(浓度l(mg/mL)细胞水平的药理结果显示，本发明提供的芳基硫脲化合物是一类高活性的肿瘤生长抑制剂，对血管内皮生长因子受体高表达的肿瘤细胞显示很高的抑制活性，显著优于sorafenib，尤其是化合物6，9，11，12和14。试验例3本发明化合物对肝癌的作用将对数期生长的肝癌S匪C-7721细胞用磷酸缓冲液(PBS)制成密度为5乂107个/ml的细胞悬液，取0.2ml接种于70只BALB/C裸鼠右腋部皮下。于8d后随机分为模型组、对照组和化合物2、6、9、11、14组。口服给药，实验组分别给予0.lg/kg体重的化合物2、6、9U1、14，每天1次，同样给予模型组等量的生理盐水，对照组O.lg/kg体重的sorafenib。4周后处死动物，无菌状态下取出瘤块，测量移植瘤的长径、短径，并称瘤重。肿瘤体积(V)=(长径X短径)2/2，体积抑瘤率=(对照组体积-实验组体积)/对照组体积X100%;重量抑瘤率=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重X100%。肿瘤微血管密度(MVD)按Wendner法(张必翔等，环氧合酶_2和血管内皮生长因子共表达与肝细胞癌血管形成的关系，中华实验外科杂质，2004，21:671-675)进行检测。表3化合物对肝癌作用的实验结果组别体积抑瘤率(％)重量抑瘤率(％)MVD模型组0020.94±5.63对照组61.3259.289.64±1.91*化合物274.3972.947.88±1.79*△Sorafenib64.35180.55282.14380.26489.35589.52694.35787.35880.87991.271087.361195.681294.281387.541497.361579.991685.24合合合合合合合合合JJ^MJ，J,tbbk.tbIs."Iv:l乂l乂l乂lzl乂l乂l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注*:与模型组比较P<0.01△:与对照组比较P<0.05动物实验的结果显示，本发明提供的芳基硫脲化合物和sorafenib均可以显著抑制肿瘤的生长，显著降低MVD，证实了二者均有抑制肿瘤血管形成的作用。与sorafenib比较，化合物2、6、9、11、14的抑瘤率显著提高，降低模型动物MVD的作用也显著增强(P<0.05)。实施例4:药物对人体正常肝细胞L0-2增殖的影响将处于对数生长期的人正常肝细胞L0-2用lml0.5%的胰蛋白酶消化后，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有的细胞表面。在室温下孵育约8min，将培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现胞质回縮、细胞间隙增大后，立即终止消化。倒掉培养瓶内消化液，加入含牛血清的培养液，用弯头吸管反复吹打瓶内壁细胞，制成细胞悬液。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞悬液浓度为1.OX105个/L。取190uL细胞悬液接种于96孔培养板，371\5%C02培养箱中培养12h。待细胞贴壁后，在样品孔中分别加入10ul索拉非尼、化合物2、化合物6、化合物9、化合物11和化合物14，每组均设6个平行孔。空白对照组加入等体积培养液。在药物作用24、48、72h后，每孔加入10ul浓度为5mg/mL的四噻唑蓝溶液，37"、5%0)2培养箱中继续孵育4h后，每孔加匿S0150ul，中速振荡15s，以空白对照孔调零，用酶标仪在570nm处检测各样品孔吸光度(D)，每孔重复测定两次。增殖抑制率(%)=(D对照-D测定)/D对照X100%。表4化合物对人正常肝细胞L0-2增殖抑制率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注*:与sorafenib组比较P<0.05;**:与sorafenib组比较P<0.01结果表明各组对人正常肝细胞L0-2均表现出不同程度的抑制细胞生长作用，并随着作用时间的延长，抑制作用呈现增强的趋势。在药物作用24小时后，化合物6、9、11及化合物14的增殖抑制率明显低于sorafenib对照药物(P<0.05或P<0.01)。作用48、72小时后，所有化合物的细胞抑制作用均显著低于sorafenib(P<0.05或P<0.01)。因此，通过体内外实验证明本发明提供的芳基硫脲化合物是一类高活性的新的血管内皮生长因子受体蛋白激酶生长抑制剂和肿瘤生长抑制剂，并且对人体正常肝细胞(人正常肝细胞L0-2)具有显著的低细胞毒性，表现其更加良好的抗肿瘤药物安全性能。19权利要求一类芳基硫脲类化合物，结构通式为其中R为C6-10芳基，C4-C8杂芳基，取代的C6-10芳基或取代的C4-C8杂芳基。F2009102061390C0000011.tif2.根据权利要求l所述的芳基硫脲类化合物，其特征在于所述的CV,。芳基或CfCs杂芳基被一个或多个以下基团取代广CN、-CF3、-N02、-CO具、-C(0)NR凡'、-OR、-SR"卤素或至多全卤代；其中，&和IV为H、1Q垸基、C6—14芳基、CV,3杂芳基或至多全卤代的C卜w烷基。3.权利要求2所述的芳基硫脲化合物，其特征在于所述的化合物为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>化合物1化合物2化合物3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>化合物4化合物5化合物6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>CONHCH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>化合物14化合物16。4.权利要求l-3任意一项所述的芳基硫脲化合物的制备方法，其特征在于将式II化合物及式HI化合物在溶剂中混合直接缩合得到式I:H2N.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>5.根据权利要求4所述的制备芳基硫脲化合物的方法，其特征在于所使用的溶剂为乙腈、乙酸乙酉旨、甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。6.根据权利要求4所述的制备芳基硫脲化合物的方法，其特征在于反应温度为20-100°C。7.根据权利要求4所述的制备芳基硫脲化合物的方法，其特征在于式III化合物与式II化合物的原料摩尔比为1:0.8-1.2。8.权利要求1-3任意一项所述的化合物在制备治疗由VEGFR激酶引起、介导和/或传播的疾病中的应用。9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的疾病为肿瘤。全文摘要本发明公开了一类芳基硫脲及其制备方法和用途，如下具体有通式I的化合物。这类具有芳基取代硫脲的新化合物展示有非常高的抑制肿瘤细胞生长的活性，尤其对于VEGFR高表达的HUVEC细胞的生长具有显著的抑制效果，半数抑制率在10μg/mL都大于70％。本发明也提供了这类化合物的制备方法。文档编号A61K31/44GK101723890SQ200910206139公开日2010年6月9日申请日期2009年10月10日优先权日2008年10月10日发明者姬建新,左承森,李炎飞,金毅申请人:中国科学院成都生物研究所