多价性蛋内dna疫苗的制作方法
专利名称：多价性蛋内dna疫苗的制作方法
技术领域：
本发明是有关一种在禽卵内取得胚胎免疫性的多重性DNA疫苗及/或多价性DNA 疫苗。该多重性DNA疫苗包含二个或二个以上的DNA构建物，每个构建物含有一个编码禽 类病毒蛋白或其片段的DNA分子，该蛋白或其片段能在禽类体内诱导出抗禽类病毒疾病的 保护性免疫反应。该多价性DNA疫苗包含一个DNA构建物，该构建物含有二个或二个以上 的DNA分子，各DNA分子为一个禽类病毒基因或其片段。该多价性DNA疫苗能表达出二个 或二个以上的病毒抗原且能在禽类体内诱导出抗禽类病毒疾病的保护性免疫反应。该多重 性DNA疫苗和该多价性DNA疫苗两者优选在禽卵受精约18天后注射到禽卵的羊膜内。
背景技术：
Sharma等人已经全面地说明含病毒疫苗的蛋内疫苗接种(in ovo vaccination) (美国专利第4， 458，630号)。尤其是，其讲授到可以将活的马立克病病毒(Marek'sdisease virus)注射到卵的羊膜的内，其后胚胎受到感染并且疫苗病毒复制到一高病毒效价 (titer)，从而在受处理的胚胎内诱导出保护性抗体的形成。(参阅，Sharma(1985)， Avian Diseases 29,1155,1167-68)。 在全世界的家禽产业中众所周知，某些病毒疾病，例如马立克病病毒(MDV)、传染 性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus) (NDV)、传染性支气管 炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、鸡贫血病毒(CAV)、鸡 痘病毒(FPV)、禽流感病毒(AIV)、理奥病毒(reovirus)、禽白血病病毒(ALV)、网状内皮组 织增生病毒(REV)、禽腺病毒和出血性肠炎病毒(HEV)，可能造成重大疫情爆发且导致养禽 商业明显经济损失。其中，MDV、 IBDV、NDV和IBV由于其毒性本质而显得特别重要。
马立克病(MD)为一种会在鸡中自然发生的恶性淋巴增生失调疾病。该疾病是由 一种疱疹病毒_马立克病病毒(MDV)所引起的。MD普遍存在于全世界的禽类生产国家中， 在密集生产系统下饲养的鸡不可避免地会遭受来自马立克病所造成的损失。MD病征广泛地 出现于受到感染的鸡的神经、生殖器官、内部器官、眼睛和皮肤，造成运动障碍(由于神经 受到感染时因麻痹所致)，内部器官的功能性障碍(因肿瘤所致)，与慢性营养不足(若内 部器官有受到病毒侵袭时)。MD会感染约6周龄以上的鸡，最常发生于12周至24周龄鸡 中。 至目前为止，尚未有治疗MD的方法。该疾病的控制主要基于管理方法，例如将正 在生长的鸡与感染源隔离，使用在遗传上具有抗性的品系，以及接种疫苗。不过，管理程序CN 101703770 A
通常不具成本效益，且针对具有增加遗传上控制抵抗力的禽系的选择而言，其进展亦令人 失望。现今，MD的控制几乎完全根基于疫苗接种。 传染性华氏囊病病毒(IBDV)会造成幼鸡的高度接触感染免疫抑制性疾病，进而 造成全世界禽业的明显损失(参阅Kibenge(1988)， J. Gen. Virol. ，69 :1757-1775)。感染 了病毒性传染性华氏囊病病毒系的敏感性鸡，可能会产生被称为传染性华氏囊病(IBD)的 高度接触感染免疫抑制性状况。对华氏囊(the bursa of Fabricius)的淋巴滤泡和脾所 造成的伤害，可能会加重其它病原体所造成的感染，并且减低鸡对疫苗的反应能力(参阅 Cosgrove(1962) ， Avian Dis. ， 6 :385-3894)。 IBDV为双RNA病毒科(Birnaviridae)的一员，其基因组由两个片段的双链RNA 所构成(参阅Dobos et al. (1979) ， J. Virol. ，32 :593-605)。较小的片段B(约2800bp) 编码VP1，即dsRNA聚合酶。较大的基因片段A(约3000bp)在单一开放读码区(0RF)内编 码为一个110kDa多肽前体，经处理成为成熟的VP2、VP3和VP4(参阅Azad et al. (1985)， Virology, 143 :35-44)。从与该多肽的ORF部分重叠的一个小0RF，片段A也可编码出VP5， 一具有未知功能的17kDa蛋白质(参阅Kibenge et al (1991) ， J. Gen. Virol. 71 :569-577)。
虽然VP2和VP3都是病毒粒子的主要结构蛋白，不过VP2才是主要的保护性免疫 原且会引起宿主诱导出中和抗体(参阅Becht et al. (1988) ， J. Gen. Virol. ，69 :631-640 ; Fahey et al. (1988) ， J. Gen. Virol. ， 70 :1473-1481) 。 VP3被认为是一种组特异性抗原 (group-specific antigen)，是因为其可被来源于血清型1和2中直接抗VP3的单克隆抗 体(Mabs)所识别(参阅Becht et al (1988) ， J. Gen. Virol. ，69 :631-640) 。 VP4为一种由 病毒编码的蛋白酶且参与蛋白质前体的处理(参阅Jagadish et al. (1988) ， J. Virol. ，62 : 1084-1087)。 在过去，幼鸡IBDV感染的控制是由使用无毒性品系进行活疫苗接种，或主要通过 将活的或经杀死的IBDV疫苗饲养母鸡后所诱导出的母体抗体转移而达成。不幸的是，最近 数年内，在美国从经疫苗接种过的鸡群中已分离出毒性IBDV变异株(参阅，例如，Snyder et al. (1988)，Avian Dis. ， 32 :535-539 ;Van der Marel et al. (1990) ， Dtsch. Tierarztl. Wschr. ，97 :81-83)，此事实严重地破坏了对IBDV使用活疫苗接种的效用性。
开发对IBDV的重组疫苗已有成效，并已将IBDV的基因组克隆出来(参阅Azad etal (1985) " Virology", 143 :35-44) 。 IBDV的VP2基因也克隆出且在酵母菌内(参 阅Macreadie et al. (1990) ， Vaccine，8 :549-552)，以及重组禽痘病毒内表达出(参阅 Bayliss et al (1991) ， Arch. Virol. ， 120 :193-205)。当鸡使用从酵母菌表达的VP2抗原予 以免疫处理时，抗血清可提供鸡对抗传染性华氏囊病病毒感染的被动保护。在用于主动免 疫研究时，以禽痘病毒为载体的(fowlpox virus-vectored) VP2抗原可提供对抗死亡的保 护，但是不能提供对抗华氏囊伤害的保护。 新城鸡瘟病毒(NDV)为一种有鞘膜的病毒，其包含一线形、单链、未分段、负义 (negative sense)的RNA基因组。具有特色地，包含负义基因组的带有鞘膜的单链RNA的 病毒族被分类为具有未分段的基因组(例如，副黏病毒科(Paramyxoviridae)和弹状病毒 科(Rhabdoviridae))或具有分段的基因组(例如，正黏病毒科(0rthomyxoviridae)、布尼 亚病毒科(Bunyaviridae)和砂粒病毒科(Arenaviridae))。新城鸡瘟病毒，与副流感病毒、 仙台病毒(Sendai virus)、猿猴病毒5 (simian virus5)、禾口月思腺炎病毒(mumps virus)者卩属于副黏病毒科。 NDV的构造成分包括一源于细胞膜的双层脂质的病毒鞘膜。从鞘膜突出的糖蛋白， 血球凝集素-神经胺酸酶(HN)，可使病毒同时具有血球凝集和神经胺酸酶两种活性。而融 合糖蛋白(F)也会与病毒鞘膜产生相互作用，它首先以无活性的前体形式产生，然后经转 译后处理，被切断产生两条由双硫键联结的多肽链。活化的F蛋白经由帮助病毒鞘膜与宿 主细胞膜的融合使新城鸡瘟病毒穿透到宿主细胞内。基质蛋白(M)则与病毒组装有关，且 与病毒鞘膜和核壳体蛋白(皿celoc即sid proteins)两者相互作用。 NDV核壳体的主要蛋白亚单位为核壳体蛋白(NP)，其赋予核壳螺旋对称性。与核 壳体结合的为P和L蛋白。磷酸化的磷蛋白(P)被认为在转录作用中具有调节的作用，并 可能与甲基化、磷酸化和聚腺苷酸化作用有关。编码RNA依赖的RNA聚合酶的L基因系与 P蛋白一起为合成病毒RNA所需。占有病毒基因组的编码容量几乎一半的L蛋白是各种病 毒蛋白中最大的，且在转录和复制上均扮有重要角色。 所有负链RNA病毒，包括NDV，其复制皆因不含有复制RNA所需的细胞机构而变 得复杂。此外，负链基因组不能直接转译成为蛋白质，而必须先转录到正链(mRNA)拷贝的 中。所以，在进入宿主细胞内的后，病毒不能马上合成RNA依赖的RNA聚合酶。L、P和NP 蛋白必须在感染时一起与基因组进入细胞的内。NDV的负链基因组(vRNAs)和反基因组 (antigenome)两者均由核壳体蛋白所封装(enc即sidated);唯一未被封装的RNA种类为病 毒mRNAs。细胞质为NDV的病毒RNA复制的场所，也是其转录的场所。各病毒成分的组装在 宿主细胞膜进行，且成熟病毒通过出芽而释放出来。 在美国专利5， 427， 791中，Ahmad等人述及针对NDV的胚胎疫苗接种，其中需要通 过使用乙基甲基磺酸酯(EMS)将病毒修饰。然而，EMS为一种突变剂，使得经由使用EMS制 备成的疫苗也被怀疑具有突变剂的作用，对于正常疫苗的施用并不适宜。不过，在没有使用 EMS的改变的下，新城鸡瘟病毒疫苗就不能用于卵内疫苗接种，因为在使用未修饰的病毒注 射到卵内的后，几乎所有的胚胎都会死掉。 传染性支气管炎病毒(IBV)，为冠状病毒科(Coronaviridae)的原型，是为传染性 支气管炎(IB)的病原。该病毒具有一有正极性的单链RNA基因组，长度约20kb，且其尺寸 常约80-100nm，为有突出20纳米剌突(spike)的圆形。传染性支气管炎病毒为所有年龄鸡 的急性高度接触传染性疾病的肇因剂，会感染呼吸、生殖和肾等系统。 IBV含有三个结构蛋白剌突糖蛋白(S)、膜糖蛋白和核壳体蛋白。该剌突糖蛋白 因其存在于病毒脂质膜突出的剌突或泪滴状表面突起而得此名称。该剌突蛋白被认为与 病毒的致免疫性有关，部分是因为其类似于其它冠状病毒的剌突蛋白，且另一部分则由于 体外(in vitro)中和实验(参阅，例如，D. Cavanagh et al. (1984) ， AvianPathology， 13， 573-583)。该病毒含有两种剌突糖蛋白，为Sl(90kDa)和S2 (84kDa)。糖多肽链SI和S2的 多肽成分经酶法移除寡醣的后估计具有约125kDa的合并分子量。剌突糖蛋白显然是通过 S2多肽链接着到病毒鞘膜的。 IBV已广泛分布于已经发展出密集养鸡工业的国家中。生长到4周年龄的幼鸡最 容易受到传染性支气管炎病毒所感染，其感染会导致高度发病率及因二次细菌感染所致死 亡率。感染也会导致蛋产量下降，或完全不能下蛋，加上产生具有薄壳、畸形、粗糙和软壳的 低级蛋，而对经济造成严重的影响。
给予蛋中(卵内)正发育的小鸡活的疫苗，已被证明为一种免疫婴儿鸡使在其 孵出前抗某些疾病的快速(40， 000颗蛋每小时)，有效(100 %蛋接受疫苗)，且省劳力 (100， 000美金每年每孵化场)的方法。 第一个用于鸡孵化蛋的具卵内疫苗接种机器是由Raleigh， N. C.的Embrex， Inc. 于80年代晚期发展出来的。(参阅，美国专利第5，056，464号和5， 699,751号)。此种卵 内机器目前用于约80X的美国肉鸡孵化场中，主要是用来施打MD疫苗。该机器用于鸡抗 MD的疫苗接种中被证明为安全有效的机器，也逐渐被用来施打IBD和ND疫苗。
下面文段内所呈现的本发明中，要介绍的是一种以DNA为媒介的免疫作用(总称 为"DNA疫苗")。有两类型的DNA疫苗，亦即，一种多重性DNA疫苗和一种多价性DNA疫苗。 本发明的多重性DNA疫苗含有两种或更多种DNA构建物的组合，各构建物含有为一病毒基 因或其片段的单一 DNA分子。本发明的多价性DNA疫苗包含在一个DNA构建物中联结在一 起的二个或更多个病毒基因或其片段。制备该多重性DNA疫苗或该多价性DNA疫苗任一中 所使用的病毒基因或其片段可编码出病毒的肽链，该肽链为宿主体液和细胞免疫系统的抗 原且可诱导该体液和细胞免疫系统。该DNA疫苗首选用针施打到卵内。蛋内DNA疫苗注射 会导致令人惊讶地强烈的免疫反应，其中不仅包括抗体诱导和有细胞介质分泌的T-细胞 活化，而且包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生。
发明内容
本发明提供一种用于蛋内注射的多重性DNA疫苗。该多重性DNA疫苗包含二个或 二个以上DNA构建物，各DNA构建物可表达出会在禽类内造成禽类病毒疾病的禽类病毒的 抗原蛋白。该禽类病毒的抗原蛋白能诱导出抗禽类病毒疾病的保护性免疫反应。该多重性 DNA疫苗优选地是注射到禽蛋内，特别是禽卵的羊水内。该卵优选地是经受精约18天。优 选的禽类包括鸡、火鸡、鸭和鹅。 该DNA构建物包含一个DNA分子和一个载体(vector)。该载体可为一质粒 (plasmid)或一病毒载体，优选载体为质粒，质粒的例子包括，但是不限于，pcDNA3、 pVAXl、 pSectag、 pTracer、 pDisplay、 pUC系统质粒(例如pUC7、 pUC8、 pUC18)、与pGEM系统质粒。 或者，也可以使用含有一个启动子(promoter)例如CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、 和P-肌动蛋白启动子等的任何质粒来制备DNA构建物。最适合的质粒为pcDNA3。优选病 毒载体为选自杆状病毒、疱疹病毒、和痘病毒所构成的群组中的一种。 禽类病毒的例子包括，但不限于，马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒 (IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽 类脑脊髓炎病毒(AEV)、禽类白血病病毒(ALV)、禽痘病毒(FPV)、禽类副黏病毒(APV)、鸭肝 炎病毒(DHV)、和出血性肠炎病毒(HEV)。 特别适合用来诱导保护性免疫反应以对抗上面所述禽类病毒疾病的DNA分子包 括，但不限于，具有SEQ ID N0:1的DNA序列的马立克病病毒(MDV) gB基因的全序列或其片 段；具有SEQ ID NO :2的DNA序列的传染性华氏囊病病毒(IBDV) VP2基因的全序列或其片 段；具有SEQ ID N0:3的DNA序列的新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因(自第6321至第8319碱基 对)的全序列或其片段(亦即SEQ ID N0:3为新城鸡瘟病毒的整个基因组)；具有SEQ ID N0:4的DNA序列的传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的全序列或其片段；具有SEQ ID NO:5的DNA序列的传染性喉气管炎病毒(ILTV)的糖蛋白G基因的全序列或其片段；禽类脑脊 髓炎病毒(AEV)的VP1、VP0、或VP3基因的全序列或其片段(VP1基因具有SEQ ID NO :6的 DNA序列；VPO基因具有SEQ ID NO :7的DNA序列；且VP3基因具有SEQ ID NO :8的DNA序 列)；具有SEQ ID N0:9的DNA序列的禽类副流感病毒(APV)的副糖蛋白G基因的全序列或 其片段；具有SEQ ID NO :10的DNA序列的出血性肠炎病毒(HEV)的A型五角体基(penton base)基因的全序列或其片段；与具有SEQ ID NO :11的DNA序列的禽痘病毒(FPV)的鞘膜 抗原基因的全序列或其片段。 —个优选的DNA疫苗例子包含两个DNA构建物，每个含有一个能够表达来自马立 克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、或传染性支气管炎病 毒(IBV)的基因或其片段的DNA分子。 多重性DNA疫苗的另一优选例子含有3或3个以上的DNA构建物，每个含有一个 能够表达来自马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、或 传染性支气管炎病毒(IBV)的基因或其片段的DNA分子。 本发明也提供一种给禽卵接种的方法与一种制备该多重性DNA疫苗的方法。该给 禽卵接种的方法包括向禽蛋内注射上述多重性DNA疫苗。该制备该多重性DNA疫苗的方法 包括将一个DNA分子黏接(ligating)到质粒或病毒载体以形成DNA构建物；然后将该二个 或更多个该DNA构建物混合以形成多重性DNA疫苗。将DNA分子插入于载体内的步骤可以 用常规方法来达成，亦即，基因和适合的载体都用相同的限制酶予以酶切以藉此产生互补 的DNA末端，使用如T4DNA黏接酶(ligase)的酶黏接DNA分子。对于pcDNA3，优选的限制 酶为BamHl和EcoRl。 在另一具体实例中，提供了一种蛋内注射用的多价性DNA疫苗。该多价性DNA疫苗 包含一个DNA构建物，各构建物含有用一个载体联结的二个或二个以上的DNA分子。每个 DNA分子可表达出一种禽类病毒的抗原蛋白，该抗原蛋白能在禽类体内诱导出抗该禽类病 毒疾病的保护性免疫反应。该多价性DNA疫苗优选注射到禽蛋内。该多价性DNA疫苗的每一 个DNA分子为来自马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、 传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽类脑脊髓炎病毒(AEV)、禽类 白血病病毒(ALV)、禽痘病毒(FPV)、禽类副流感病毒(APV)、鸭肝炎病毒(DHV)、和出血性肠 炎病毒(HEV)的一个基因或其片段。
具体实施例方式
传统禽类疫苗包括经化学灭活的病毒疫苗或经修饰的活病毒疫苗。灭活疫苗需要 额外的免疫化处理，如此不仅制造起来昂贵且执行起来繁琐。再者，某些传染性病毒颗粒可 能在灭活程序中存活，并可能在施打到动物后引发疾病。 整体而言，经减毒的活病毒疫苗比经灭活疫苗较适当，因为其可诱发通常同时基 于体液和细胞反应的免疫反应。这种疫苗通常是以在组织培养中的毒性病毒株连续传代为 基础。然而，减毒程序会诱导病毒基因组的突变，产生有关毒性和免疫性质互相异质的一族 群病毒粒子。此外，众所周知，传统经减毒的活病毒疫苗可能回复毒性，而导致在所接种的 动物上爆发疾病并可能将病原散布到其它动物上。 因此，以重组DNA技术为基础的疫苗对产业界来说是具有其优点的。所得DNA疫苗只含有且只表达出所必需的和相关的免疫原物质，此免疫原物质能够诱发抗病原的保护性免疫反应，且不会显现出上述活疫苗或经灭活的疫苗的缺点。 为了制备多重性DNA疫苗及/或多价性重组DNA疫苗的目的，基因的DNA序列(也可以与"DNA分子"互换地使用)不需要含有编码该多肽链的DNA的全部长度。在大部分情况中，编码一个抗原决定部位区的基因片段应该就足够供免疫反应所用。抗原决定部位区的DNA序列可以通过将其它病毒株的对应部份予以定序且互相比较而找出。主要的抗原决定子(antigenic determinant)可能为显示出最大异质性(heterology)者。此外，这些抗原决定部位区也可能位于蛋白质的构象结构之内。 一个或更多个该编码抗原决定子的基因片段可以通过化学合成或重组DNA技术予以制备。如果需要，这些基因片段可以键联在一起或联结到其它DNA分子。 同时，病毒基因也不需要在DNA内。事实上，某些常见的禽类病毒疾病是由双链或单链RNA病毒所引起的。例如，马立克病病毒(MDV)为一种双链RNA病毒，而传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV)都是单链RNA病毒。不过，RNA病毒序列可以使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术反转录到DNA内，接着以常用的重组DNA技术将之加到载体内。 此外，因为遗传密码的简并性，可能会有许多RNA和DNA序列编码着一个特定的氨基酸序列。因此，可表达出具有抗体结合特性的多肽链的所有RNA和DNA序列都为本发明所涵盖。 要构建重组DNA疫苗时，不论单价或多价，均可将病毒基因的DNA序列黏接到于自然界中不相关或联结的其它DNA分子。任意地，可将一个病毒基因的DNA序列黏接另一个DNA分子中，即载体，该载体含有其编码融合蛋白质序列例如13 -半乳糖苷酶的DNA，产生所谓的重组核酸分子或DNA构建物，其可用来转殖到适当的宿主。此种载体优选是衍生自，如质粒或存在于噬菌体、黏接质粒或病毒中的核酸序列。 可以用来克隆根据本发明的核酸序列的特定载体都是本领域所知的，且包括质粒或病毒载体。质粒的例子包括，但不限于，pBR322、 pcDNA3、 pVAXl、 pSectag、 pTracer、pDisplay、 pUC系统质粒(例如pUC7、 pUC8、 pUC18) 、 pGEM系统质粒、Bluescript质粒或有包括CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、和P-肌动蛋白启动子等的任何其它质粒。优选质粒为pcDNA3。病毒载体的例子包括，但不限于，噬菌体(例如，A和M13-衍生的噬菌体)、SV40、腺病毒、多瘤病毒(polyoma)、杆状病毒、疱疹病毒(HVT)或痘病毒(例如禽痘病毒)。 构建重组核酸分子所用的方法都是本领域所知悉的技术。例如，当基因和适合的克隆载体都用相同的限制酶酶切以产生互补的DNA末端后，核酸序列在一克隆载体中的插入可以很容易地通过如T4DNA连接酶的酶连接得到。 或者，通过消化单链DNA或使用恰当的DNA聚合酶来填充隐性末端来修饰限制酶切部位以产生钝端(blunt end)可能也是需要的。随后，可以使用如T4DNA黏接酶的酶进行钝端黏接。如果需要，可以通过将黏接臂黏接到DNA末端上来产生任何限制酶切部位。这类黏接臂可包括编码限制酶切部位序列的特定寡核苷酸序列。经限制酶酶切过的载体和核酸序列也可通过均聚物加尾(homopolymeric tailing)来进行修饰。 本发明提供两种DNA疫苗。第一种多重性DNA疫苗，其包含二个或二个以上的单价DNA疫苗，各含有一条DNA序列，该DNA序列编码着至少一种多肽链，该多肽链能提供保护作用以对抗一种禽类病毒疾病例如马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、禽痘病毒(FPV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ALV)、鸭肝炎病毒B基因和出血性肠炎病毒(HEV)，并插入到商业上可用的质粒中。 第二种为多价性重组DNA疫苗，其包含来自不同病毒的二种或二种以上的基因或基因片段。这些基因或基因片段通过一个有用的载体所携载，该载体可为质粒或病毒载体。该多价性重组DNA疫苗编码着二个或二个以上的抗原多肽链，该抗原多肽链可提供保护作用以对抗至少两种病毒疾病包括，但不限于，马立克病、传染性华氏囊病、新城鸡瘟病或传染性支气管炎之保护。该病毒基因或基因片段可被有效地连接到载体的读码区内以使其可在宿主体内表达出来。由该载体所携带的不同结构DNA序列可用终止序列和起始序列分隔使得该蛋白质可以分开表达，或成为一个单一读码区的一部分，因而可用本领域中已知的方法以融合蛋白质的形式产生。 优选的DNA序列包括，但不限于，具有SEQ ID NO :1的DNA序列的马立克病病毒(MDV)gB基因的全序列或其片段；具有SEQ ID NO :2的DNA序列的传染性华氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的全序列或其片段；具有SEQ ID NO :3中自第6321至8319碱基对的DNA序列的新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因的全序列或其片段；具有SEQ ID NO :4的DNA序列的传染性支气管炎病毒(IBV)Sl基因的全序列或其片段。 编码马立克病病毒的gB多肽链的DNA序列具有SEQ ID NO : 1的核酸序列。该DNA序列包含线型DNA的3650个碱基对。 编码传染性华氏囊病病毒的VP2多肽链的DNA序列具有SEQ ID NO :2的核酸序列。该DNA序列包含线型DNA分子的3004碱基对，可由传染性华氏囊病病毒的RNA模板反转录而来。 整个新城鸡瘟病毒基因组的DNA序列包含15186碱基对的DNA，其中(1)第56至1792碱基对编码NP多肽链，为一核壳体蛋白；(2)第1804-3244碱基对编码P多肽链，为一磷蛋白；(3)第3256-4487碱基对编码M多肽链，为一基质蛋白；(4)第4498-6279碱基对编码F多肽链，为一融合蛋白质；(5)第6321-8319碱基对编码HN多肽链，为血球凝集素神经胺酸酶；(6)第8370-15073碱基对编码L多肽链，为一大的聚合酶蛋白质。新城鸡瘟病毒基因组具有SEQ ID NO :3的DNA序列。 SI多肽链的DNA序列含有如SEQ ID NO :4所示1611个碱基对线型DNA序列，是从传染性支气管炎病毒的RNA模板反转录而得。 下面的实验设计为示范说明，而不用来限制本发明的范围。其中可做出合理的变化，例如合理技术操作所发生者，不违离本发明的范围。
I.材料与方法
(A)病毒与疫苗 禽类传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性华氏囊病(IBD)和新城鸡瘟病(ND)疫苗都购自Intervet Inc.。 (B)病毒RNA分离与反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 将200微升回收的减毒疫苗(Intervet Inc.)溶解于冰冷的GTC缓冲液(4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH 7. 0，0. 5%Sarkosyl，0. 1M氢硫基乙醇)和醋酸钠(pH4)中。加入等体积的苯酚-氯仿(l : 1)震荡后静置于冰上15分钟。离心后收集水层且使用等体积的异丙醇沉淀出RNA。在4t:下以12， 000rpm离心20分钟将沉淀的RNA分离出，然后悬浮在经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水中且贮存在-7(TC。
(C)誠棚 反转录聚合酶连锁反应所用的寡核苷酸引物(primer)都是购自Promega，且都是
分别针对禽类传染性支气管炎病毒(Beaudette CK株)、新城鸡瘟病毒(Lasota株)和禽类
传染性华氏囊病病毒的基因组来设计。PCR所用各引物的序列为 IBS1F' 5' CGGGATCCGCCGCCGCCATGTTGGTAACACCTCTT 3' ; (SEQ ID NO :12) IBS1R， 5， CGGAATTCTTAACGTCTAAAACGACGTGT 3， ； (SEQ ID NO :13)NDF F' 5' CGGGATCCGCCGCCGCCATGGGCTCCAGACCTTCTACC 3' ; (SEQ ID NO :14)NDF R' 5' CCGCTCGAGTTACATTTTTGTAGTGGCTCTCATT 3' ; (SEQ ID NO :15)NDHN F' 5' CGGGATCCGCCGCCGCCATGGACCGCGCCGTTAGGCAAG 3' ; (SEQ ID NO :16)NDHN R， 5' GCTCTAGATTACTCAACTAGCCAGACCTG 3' ; (SEQ ID NO :17) IBDVP2F， 5' CGGGATCCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGAT 3' ; (SEQ ID NO :18) IBDVP2R' 5' CGGAATTCTTACCTTATGGCCCGGATTAT 3' ; (SEQ ID NO :19) (D)反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR) 传染性支气管炎病毒、新城鸡瘟病和传染性华氏囊病病毒的RNA反转录是在42°C于2. 5倍Taq缓冲液(200mM NaCl，15mM Tris-HCl， pH 7. 4， 15mM MgCl2， 15mM P -氢硫基乙醇，和各0. 25mM的dATP、 dCTP、 dGTP，和dTTP)中进行30分钟。除了 Taq缓冲液之外，反应混合物(40微升)也含有病毒RNA，2.4U的禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)反转录酶(Promega) ， 16U的RNasin (Promega)，和0. Olnmol的反向引物(IBDVP2R、NDF F、NDHN F或IBS1R)。反应混合物的最后体积为40微升。反转录之后，在反转录混合物中加入下列药剂0. 02nmol的各核苷三磷酸(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP) ，0. Olnmol的前向引物(IBDVP2F、 NDFR、 NDHN R或IBS1F)和1. 5U的Taq DNA聚合酶(Strategene)。然后加水到终体积100微升。反应在ThermalCycler(PerkinElmer-Cetus)内进行32个循环。每一PCR循环包括在94。C下变性(denaturat ion) 1分钟，在57。C下退火(annealing) 1分钟，与在72。C下延长(elongation) 2分钟。
(E)DNA构建物的制备 使用分别来源于传染性华氏囊病毒疫苗、传染性支气管炎病毒疫苗和新城鸡瘟病毒疫苗的VP2、Sl、NDF和NDHN等基因放置于市售质粒pcDNA3(Invitrogen，U. S. A.)的下游处，构成质粒pCMV-VP2、 pCMV-Sl 、 pCMV-NDF和pCMV-NDHN。使用限制酶BamHl 、 EcoRl 、 Xbal和XhoI将所有的基因插入到pcDNA3载体之内(引物序列中带下划线的字母)。在pcDNA3
载体内的所有基因的序列都经过两方向测序予以验证。
(F) DNA和DNA传递的制备 经亲和层析法(Qiagen. Inc.)纯化的质粒DNA的定量用波长为260和280nm的分光光度计测量。将各100微克分量的DNA悬浮在100微升PBS中(0. 14M氯化钠，lOmM磷酸钠，pH 7.4)。对于DNA传递，使用含有20号l又l/2时针头的lcc注射筒。对于蛋内注射组，是从每一个蛋的大头端用针头穿透气室将0. 1毫升的DNA疫苗(100微克)注射到胚胎内(取自鸡窝盘中18天的已受精且正发育的卵)。然后将该卵转移到孵化场，且放在该处直到在约21天时孵化为止。对于IM(肌肉内)组，所有疫苗(1/5剂量的活疫苗)注射到
孵化后io天鸡的胸肉内。 II.实验设计 将无特定病原(SPF)受精蛋(n = 60)随机分成12组。所有组的所有蛋(一组5颗蛋)都分别给予100微升的试剂。A组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN混合物，B组的每一颗蛋注射100微克pCMV-Sl， C组的每一颗蛋注射100微克pCMV-VP2， D组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-Sl (ND+IB) ， E组的每 一 颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-VP2 (ND+IBD) ， F组的每 一 颗蛋注射100微克pCMV-VP2+100微克pCMV-VP2混合物(IB+IBD) ， G组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-Sl+100微克pCMV-VP2 (ND+IB+IBD)，作为阳性对照组的H组的每一颗蛋注射1剂量的市售蛋内IBD疫苗(Embrex， Inc) ， I、 J、 K和L组的每一颗蛋注射100微升的PBS。在此实验中的所有鸡都是在孵化后10天鸡的胸肉内注射100微升的疫苗(1/5剂量的活疫苗)。A和I组中的鸡注射NDV疫苗，B和J组注射IBV疫苗，C和K组注射IBDV疫苗，D组注射NDV+IB疫苗混合物，E组注射NDV+IBD疫苗混合物，F组注射IB+IBD疫苗混合物，且G和L组注射NDV、 IB和IBD疫苗混合物。
III.血清检测 在孵化后10天(同时注射低剂量活疫苗)、17天、24天和31天收集所有血清样品。抗体效价的检测使用购自IDEXX Laboratories, Inc.的IB、 IBD和NDV抗体检测试剂盒用ELISA检测。所有样品都进行重复检测。在检定之前使用样品稀释剂将检验样品稀释500倍(l : 500)。检测程序按照试剂盒手册进行。为了使检测正确，测量且记录在波长650nm的吸光值，A(650)。未知样中的相对抗体含量通过计算样品对阳性样(S/P)比例来确定。终点效价使用公式计算:Log10效价=1. 09(Log10S/P)+3. 36。
结果 如表1中所示，结果证实，对于抗-IBD抗体的检测，IBDV重组抗原VP2可以被表达并能起到原发剌激作用。在一低剂量疫苗强化后效价迅速增加。在孵化17天之后(亦即，M注射后7天)，C、E、F和G等组的效价明显地高于K和L组的效价。最重要的，IBDV抗原的表达不会受其它单价DNA疫苗(新城鸡瘟病毒和传染性支气管炎病毒)所干扰。对于IB和NDV DNA疫苗也有相同的结果。孵化后17天，B、 D、 F和G等组的效价都高于J和L组的效价(表2)且孵化后17天，A、D、E和G等组的效价都高于I和L组的效价(表3)。唯一未预料到的结果是抗-NDV效价不能用三价DNA疫苗高度诱导出来(表3，G组)，不过抗-IBD和抗-IB则都可以(表1和2， G组)。
表1用IDEXX IBD抗体检测试剂盒检测的血清样品[OO79](抗体效价对应于平均效价± SD)_免疫化和样品采集时间表(天)_
动物组另U_10天PH4 17天PH 24天PH 31天PHC(IBD)-—**4535 ±126716623 ±310521254±3852
E(IBD+ND) —1685±65517339±218519041 ±2967
F(IBD+IB) —8252 ±220510057 ±129517561 ±2006
G(IBD+IB+ND) —9111±170113127±176316694±2134
H(IBD阳性)6635 ±85113025±213118015±159218853±2614
K(PBS/IBD) ——1853 ±30217002 ±2965
L(PBS/IBD+IB+ND) ———6923 ±116818063 ±2531
补H:孵化后
**-一 平均效价低于396 (被IDEXX试剂盒作为阴性) 表2用IDEXX IB抗体检测试剂盒检测的血清样品 (抗体效价对应于平均效价±SD)
HZIZI" 免疫化和样品采集时间表(天)
动物组别
IO天PIP 17天PH 24天PH 31天PH
B(IB)—**441 ±1172426 ±2643214±877
D(IB+ND)— 586 ±182805 ±2211988±501
F(IB+IBD)—- 509 ±89685 ±1861192±237
G(IBD+IB+ND)— 499±81688 ±782551±531
J(PBS/IB)— —485 ±761662±441
L(PBS/IBD+IB+ND)— —819±2021332±488
补H:孵化后
**-一 平均效价低于396 (被IDEXX试剂盒作为阴性)
表3用IDEXX ND抗体检测试剂盒检测的血清样品t
(抗体效价系对应于平均效价±SD)
免疫化和样品采集时间表(天)动物组别.10天PH^ 17天PH24天ra31天PH
A(ND)—** 466±1012394±4568103±2198
D(ND + IB)— 706 ±1401778±3786811 ±2206
E(ND+IBD;)— 517±1043021 ±4115991 ±1695
G(IBD+IB+ND)— ——_783 ±201
1(PBS/ND)— —1853 ±3243912±304
L(PBS/IBD+IB+ND)— —4027 ±6625術±1996
补H:孵化后
**-一 平均效价低于396 (被IDEXX试剂盒作为阴性)
序列表
〈110〉郭村勇
〈120〉多重性和多价性蛋内DNA疫苗 〈130>39734-186920
〈160>19〈170>PatentIn version3. 2〈210>1〈211>3650〈212>DNA〈213〉马立克病病毒〈400>1tcgagctcgccggggatgtttagtcacgatagacatcggt tcgcccagcc60gcattatettttagtgttga皿atgtegggctgcttcctc acttaaaggagga皿tggct120cgattcatgtttcatagcagteg^皿acagattggaccg tcagteagttt卿gggttt180tatgactttataatgtaactgcggcccatc gcatggcttg240tttttgcaacagctttettttcttctgtat ttaaatgtggcgaattgcac300atctgtcgtgccgacagtttgcagatc^c3gc^tggag actetgtetg360cgaatatccacttateatga ttctggggtcag^tc^gc4203CttC3g朋3gactgcaattattgatacag atgttttttcgttgctttat480tctattttgcagtetetggcccccgttacggc3gatragg tgcgagtegaacagattacc540朋C3gCC3Cgcccccatctgacccgtccaatattcttgtg tccctgcattttatctcaca600caatttatgaacagcatcatteagatcatctcactetgca ctattttaggCgg皿ttgC3660tttttttccttetagttattctatatggtacgaactcatc tccgagtacc720agttgtttcgagcgtccagttgtctgagga agagtctecgttttetcttt780gtcccccacc解tgggttcaaccgtgatccgtcteg^cc gccgcg3皿3tgtcccgaac840cteg朋朋gcC3CCg3gtggggtg啷g3aaatatcagtc■te^gtgacgctttattata^^tetcat tc3gacgacg3C3tgg3Cgg960gg3cgacateteg3cagatcacteatcgat3tecagateggacgcccgtttccattgaag10203g3tC3Cgg3tcteatcgacggC皿3gg皿gatgctcatcte皿gc皿gateccttegaa1080ac朋tgtetetgttg皿gcgtttg織gggatgcggg卿cttcteaaac1140C皿C3CgCCCg皿tctegggcatggcacacgacteatgagacgteteccg1200tgtggggatctetcg皿cgggaacctccgtcaattgtetegtegagga皿1260tggatgcccgctctgtgtttccgtettcatattttgcaatggcc皿tggcgacatcgcg31320acatetctccattttetggtctetccccaccagaggctgccgcagaaccc3tgggatetc1380ccc3ggateactegategctatttttcaatgg3tttgg3C皿gcgtcg皿1440皿gc皿gccttccagtcaagcgteactttctcatcacatcacacttcacagttgggtggg1500actgggctcccgtgtetgttc皿tgacteagtgg腿gaggtgactga皿1560tgttgcgtgc皿cagtteatgggagatec3gatttetggcccgtgaactttcggcaacgt1620ttetcagteatecgactgagtttgatccaaatcgcatcatatteggac皿tgtetteaac1680gcg郷c卿3gC3gC皿tCg3gcagatettteggac皿33teteatgacagtcacgtca1740郷ttgg織tgtecaatetttcttggctctcgggggatttettgtegcatetcagcctg1800ttctetccaaatccctggctcatetgteccgatgagagac皿C3gg3CCg1860atgagatgctcgacctggte皿c皿teagcatgcaatttegctecctcat1920
13
tgtcacgattgcggcg卿tattcga^tgttegacgac31980ccacagctette朋tcgacatcgtctgttcaattcgccatgctccaatttctttetgatc2040ccatetteatgatetgtttegteggattgccacagcttggtgcgaattgc21003g朋tegag3acttgttttetggcacg皿gggate皿gatteatcctegcgctecagcg32160gtgcaacattElgg朋gg卿gtggctg咖卿tgttgggggatgtcgctgctgtetcga2220gctgcactgctetegatgcggaatccgtcactttgcaaaattctetgcgagttetcacat2280ccacteatecatgttetegccgaccattggttctettttcatetggag皿皿cc皿gg皿23403C3tecagggacaactcggtg皿皿c皿cgagttgcttcc皿cgctegaggctgt卿gc2400catgctcggcteatcatcgtagatettttctgtttggatccggttetgct2460acteteattttgtteagatggt卿cgctgccgatetecagattgctegcacatttgtcg2520agctteatctaaccctgctega卿tcgggaaattttgcctttetccgtttecac皿皿g2580El卿gttgCgtgatgttggtgtettggattatgcag^gtagctcgccgc2640atg朋ctteaattttetgacteateg皿gtggatec皿3ttecgcgttte2700tgaacggtttggccg朋ttgttteacggtetgggtcaggtagggc皿gctateggc皿3g2760ttgtegteggggctgccggtgcaatcgtetcteccatetctggtgtctctgctttcatgt2820caatccctttggggctttcggcaatcggttteatcattet3gC3gg3CtCgtggctgcat2880ttttagcatatcgttetgtea朋gc朋tcc皿tga皿gccctttatccte2940tg3C朋C3g3agtgctteaggC3C3ggC皿cgcgtgagttgratggcgag3000atttgg朋cgaacatctatt3gctegag皿3060atatggcgttagtctccgcgg皿g皿cgcc3CtgCgg3g33卿ggCg3g3120gcacteccgccgttctetcggaccacctggagteacccte3180朋tetgateagttacctactacatattcagtgatgctgtgt皿gtgggra3240ctattetetttg朋ctg朋tgagcatgatetggtttectcatttattgcg3300agatete朋gcatattcaatacgatetettgcg皿cgtgaategctccct3360gtattettgatgcgccatcatttgatteat3朋tecatcgacgccggcatcactggtgcg3420gtgtetaccagctacggcgctegcattcatggtetcccgtgattgctcgatgctttcctt3480ctgaattccgtcggaacgctcctgagagatggtcgcagttattggtecatttcgaccagc3540ctccggatctg朋3CtggC3C3gg皿tgC3ccgtggaattggt卿賜tttttccttccg3600tgg朋ggCEltagggcgttcgactcccatgggCC3tg皿3Ctgtgggatgt3650〈210>2〈211>3004〈212>DNA〈213〉传染性华氏囊病病毒(IBDV)〈400>2tgatgccaacaaccggaccg gcgtccattcCgg3Cg3C3Ccctggag皿gcacactctca60ggtcagagacctcgacctecaatttgactgtggggg織c郷gtc郷gcteattgtct120ttttccctggattccctggctcaattgtgggtgctcactecacactgcag3gC皿tggg3180actecaagttcgatcagatg ctcctgactgcccagaacctaccggccagttecaactect240gcaggctegtgagtcggagtctcacagtgaggtc皿gcacacttcctggtggcgtttetg300
cacte朋cgggccgtgaccttcc皿gg皿gcctgagtg皿360ttegctecaatgggttgatgtctgcaacagggg皿cgtcc420tegtegggg3gtcctcagcttecccacatcatetgatcttgggtetgtga■ggcttggtgaccccattcccgc皿tegggcttgacccaaa皿tggtegcc540gcagtgacaggcccagagtcctgcagccgatgatteccaattctcatcac600agteccaacc郷tggggtetgttctcagccaacattgatgccatcacaa660gcctcagcgttggggg卿gctcgtgtttcg皿c皿gcgtccacggccttgtectgggcg720ccaccatctecctcateggctttgatgggac皿cggteatcaccagggctgtggccgc皿780acactgggctgacgaccggc3CCg3C皿CCttetgccattcaatcttgtg840acgagateacccagccaatcacatccatca皿ctggagatagtgacctcc3腿gtggtg■gtcaggcaggggatc卿tgttetggtcggcctegcagtgacgatccatg960gtggc朋ctetccaggggccctccgtcccgtcacgctegtggcctecg皿3g3gtggC朋1020caggatccgtcgttecggtcgctggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcctgaac1080tegca朋g朋cctggttecag皿tecggccgatttgaccc3gg3gCC3tga a c t a c a c aa1140aattgatactgagtg卿gggaccgtcttggcatc^gaccgtctggccaac朋gggagt1200acactgactttcgtgaatectggccgacctcaactctcccctg朋gattg1260C3gg3gC3ttcggcttcaaagacateatccgggccateagg郷ategctgtgccggtgg1320tctccacattgttcccacctgccgctcccctegcccatgc皿ttgggg皿ggtgt卿ct1380acctgctgggcgatgaggcacaggctgcttcagg朋ctgctcgagccgcgtcagg朋朋g1440c朋gagctgcctcaggccgcateaggcagctgactctcgccgccgac皿ggggtecgagg1500tegtcgcg朋tctettccaggtgccccagaatcccgtegtCg3Cggg3ttcttgcttcac1560ctggggtectccgcggtgcacacaacctcgactgcgtgtt皿g卿gggtgccacgctet1620tccctgtggttattecgacagtgga卿cgccatgacacc朋cagc朋朋1680tgtttgctgtcattg朋ggcgtgcg卿agacctcc皿cctccatctcaaagaggatcct1740tcatecgaactctctctggacacagagtctatggatetgctcc卿tggggtecttccac1800tgg卿ctgggagagactecaccgttgtccc皿tegatgatgtctgggacgacagcatte1860tgctgtccaaagatcccatecctcctattgtggg朋3C3gtgg朋atctegccategctt1920acatggatgtgtttcgaccctccatgtggctetgacgggagccctcaatg1980cttgtggcgagattgag^agteagcttteg皿gracc皿gctcgccactgcacaccgac2040ttggcctteagttggctggtcccggagcattcgatgte皿caccgggccc朋ctgggc朋2100cgttcatcaaacgtttccctC3C皿tCC3Cgcgactgggacaggctcccctecctcaacc2160teccateccttccacccaatgcaggacgccagteccaccttgccatggctgcatcagagt2220tC3朋g3g3Cccccgaactcg卿gtgccgtcagagc^tgg皿gC3gC3gccaacgtgg2280acccactattccaatctgcactcagtgtgttcatgtggctgg皿gag皿tgggattgtga2340ctgacatggccaacttcgcactcagcgacccgaacgcccatcggatgcg3aattttcttg2400C3朋CgC3CC3C皿gC3ggCagc皿gtcgca皿gggcc皿gtecgggacagcaggctecg2460g3gtgg郷Ctcggggcccc3C3CC3g3gg皿gC3C3g3gacacggatct2520ggagaccatgggcatctectttgcaacacc卿atgggtegcactcaatg2580ggcaccgagggccaagccccggccagctea3gtectggcag皿C3C3Cg3ga朋teccgg2640
3CCC3朋Cg3ggactetcte gactecgtgc 3tgc3gag皿gagccggttg gcatcag^g2700皿gggC3gCt 3CgtCg3tct 3CggggCtCC 3gg3C3ggC3 gagccacccc2760aagctttcat3g3Cg皿gtt gcca皿gtct 3tg3皿tC皿CC3tgg3Cgt ggCCC皿3CC2820g皿3gatctg ctcttgactg cgatgg3gat g皿gcatcgc皿tcccaggc2880gggctcteccaaagcccaag ccaaaaccca atgctccaac acagagaccc cctggtcggc2940tgggccgctggatcaggacc gtctctgatg aggaccttga gtgaggctcc tggaagtctc3000ccga3004〈210>3〈211>15186〈212>DNA〈213〉新城疫病毒(NDV)〈400>3g33tccgtg3 gttecgatea ^ggcg^gggtcgcacggg60t卿3ggtgtg33tctCg3g tgCg3gCCCg ^gC3C^3Ctcgaga^gccttctgccaa120catgtcttccgtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcggctcagactcgccccaatgg1803gCtC3tgg3ggggg3g333皿gggagtec ctte皿agtegacgtcccggtattcactct240t朋C3gtg3tgacccag^g 3tegatggag ctttgtggtettctgcctccggattgctgt300tegcg朋gatgccaacaaac cactcaggca aggtgctctcatatctcttttatgctccca360ctcacaggta3tg3gg^CC 3tgttgCC3t tgC3ggg^3ccacattggc420cgtgcttgagattgatggct ttgccaacgg cacgccccagggagtggagt480gtctg3卿g3gagc3C3g3 gatttgcgat gategcagg3tctctccctcgggratgcag540c朋cgg朋ccccgttcgtca C3gCCggggC 3g^g3tg3tgC3CC3g^gacatcaccga600taccctggagaggatcctct ctatccaggc tcaagtatggc^皿gccat660gactgcgtatg3g3CtgC3g 3tg3gtCgg3 ^c^ggcga720aggcagggtccaaaagaaat acatcctcta ccccgtetgc3gg3gC3C^tccaactcac780g3tC3g3C3gtctcttgcag tccgcatctt tttggttagcgagctc^gagaggccgc皿840cacggcaggtggtacctcta cttattetaa cctggtaggggacgtegactcatacatcag■gaataccgggcttactgcat tcttcttgac actcaagtacgg^tc^caccaagacatc960agcccttgcacttegtagcc tctcaggcga catccagaag atgaagcagc tcatgcgttt1020gtetcggatg朋3ggagate atgcgccgte catg3C3tte cttggtgate gtgaccagat1080gagctttgcgcctgccgagt atgcacaact ttectccttt gccatgggte tggcatcagt1140cctegate朋ggtectggga aateccaatt tgccagggac tttetgagca catcattctg1200g卿CttggElgtegagtecg ctcaggctc3 ggg皿gtegc att朋cgagg atetggctgc1260cgagctaaagcteaccccag cagcaatgaa gggcctggca gctgctgccc aacgggtctc1320cgacgataccagcagcatat acatgcctec tcaacaagtc ggagtcctca ctgggctteg1380cgagggggggtccc朋gctc tec皿ggcgg atcg朋tega tcgc朋gggc朋ccag朋gc1440CggggEltggggagaccc朋t tcctggatct gatgagagcg gtegca朋te gratgaggg31500ggcgccaaactctgcacagg gcactcccca atcggggcct cccccaactc ctgggccatc1560ccaagataacg3caccgact gggggtettg atggac朋皿cccagcctgc ttccac朋朋1620
acatcccaatgccctcacccgtegtcgacccctcgatttgcggctctetetgaccacacc1680catccccctctttcctccctccccctgctgtecaactccgcacgcccteg17403tecrac3ggcac朋tgcggctcacteaca3gCCg郷g31800賜tecgggtega卿gggatC3gggC朋gtctcccgagtctctgctctct1860cctctacctgategacc3ggccacctttec3tCg3Cg3gC1920tatttgagac皿gtgg皿ctgtcattgaca3gCCC3gggt朋3CC3gC3g1980卿ctgttgg皿gg3gtgC3atcccacaaggc朋gacc朋ggtgctgagcgragratggg20403g朋gC3tggg3gC3tCC3gccaccggccagtc皿gac朋ccccgatcga2100CCCg3gC3朋cgaccccgcatgacagcccgccggccacat2160ccgccgaccagCCCCCC3CCC3ggCC3C3g3Cg皿gCCgtCg3C3C3C3gttcaggaccg2220gagc朋gc朋ctctctgctgttgatgcttg3C朋gCtC3gtccaatgcta2280朋朋gggccc3tggtCg賜CCCCC朋g3gggg朋tC3CC3acgtccgactC皿C3gC3gg2340ggagtc朋ccC3gtCgCgg3朋C3gtC3gg皿3g3CCgC3g朋cc朋gtcaaggccgccc2400Ctgg朋3CC3gggC3C3g3Cgtg皿C3C3gcatatcatgg3C皿tggg3gg3gtC3C皿C2460tatcagctggtgcaacccctcatgctctccgatc朋ggragagcc朋gacaatacccttg2520tatctgcggatcatgtccagccacctgtegactttgtgcatctatgatgg2580aggcgatetc3C3g3gagteactatcagctagatcttgtc2640catcctccatccctatgatgcggtccga朋tccaacagctgttgcagtca2700tgg皿gcc朋cttggg皿tgtggatcccggttgtgccaacatttcatctc2760tgagtgatctacgggragttgcccgatctcacccggttttagtttcaggccctggagacc2820cctctccctagg郷cg咖tggcactteateaactttcgcaaccagtgc2880cacatccatctgaattgatt朋3CCCgCC3ctgcatgcgggcctgatetegg賜tgg咖2940ccgtgcattgatcatgtcacgcccaatgcacccgagttcttcagccaagc3000tccteagcaagccgggtcgatcgagg朋ataagcgccttg3060ctcteaatggctaattactectgccacacgtegcgggtccctgtccactcggcatcacac3120gg朋tctgcaccgagttcccccccgcagacccaaggtccaactctccaagcggcaatcct3180ctctcgcttcctcagccccactgaatggtcgcgteaccgtgctacattta32403gatteag朋皿皿tecgggteg皿ttggagtgccccaattgtgcc皿gatggactcatc3300teggac朋ttgggctgtectttgattctgcccattcttctagcaacctgttagcatttcc3360gatcgtcctaC朋ggC3C3gg卿tggg朋g皿gca朋tcgccccgcaat3teggatcc33420gcgccttgacttgtggactgategteagg3ggactcagtettcatcaccacctatggatt3480catctttcaagttggg皿tg朋g皿gccactgtcggcatgatcgatgate朋ccc皿gcg3540cgagttectttccgctgcgatgctctgcctagg皿gcgtcccaaataccggagaccttet3600tg賜ctggraagggcctgtctcactatgatagtcacatgc皿g朋gagtg3660tg卿g朋tggttttctcagtegtgc郷caccccaagtgctgcaaagctgtagggttgt3720tectcatcagtg朋tgcagtC皿gC3Cgtg3朋gCgCC3gag朋gattcc3780cggg賜tggaaccctegaatctttgtctccttgactgtggteccg朋g朋3840ggatgtctec皿g3tCCC3gctgcagtattgaaggtttctggctcgagtctgtacaatct3900tgcgctcaatgtcactatteatgtgg郷t3g3CCCg3ggagtcctttggttaaatcttt3960
gtcteagtctgacagcggatactatgcteacctcttcttgcatettggacttetgaccac4020cgt卿tegg皿gggga卿朋gtgacatttgac朋gctgg朋朋g皿皿teaggagcct4080tgatctetctgtcgggctcagtgatgtgctcgggccttccgtgttggt皿朋gc朋gagg4140tgcacggactaagcttttggcacctttcttctctegcagtgggacagcctgctatcccat4200agca朋tgcttctcctcaggtggcc皿gatactctggagtcaaaccgcgtgcctgcggag4260cgtteaaatcattetccaagcaggtacccaacgcgctgtcgcagtgaccgccgaccacga4320ggttecctctact朋gctggcacccttgcccttttaagaa4380at朋gctgcgtctctgagattgcgctccgcccactracccagatcatcat4440actaatctgtcttgattetttacagttagtttecctgtctatc朋gtteg4500ggt卿卿ttctggatcccggttggcgccctccaggtgca卿tgggctccagaccttc4560tecc朋g皿cccagcacctetgatgctgactetccgggttgcgctggtectgagttgcat4620ctgtccggcaaactccattgatggcaggcctcttgcagctgc郷朋ttgtggtt織gg46803g3C朋3gCCgtcaacatatacacctcatcCC3g3C3gg3tcaatcatagtteagctcct4740cccgaatctgccc朋ggatetgcg朋agcccccttggatgcatec皿c3g■0gacattgaccactttgctcaccccccttggtgactctatccgteggatec朋gagtctgt4860gactecatctgg郷ggggag織ggggcgcctteteggcgccattattggcggtgtggc4920tcttggggttgcaactgccg3gCggCCgC3gctctgatac4980aaatgctgccaacatcctccgactte朋gagagcattgccgc皿cc皿tg5040tgaggtcactgacggattetcgcaactagcagtggragttggga卿tgcagcagtttgt5100teatgacc朋C3gCtC3gg3attagactgcC3C3gC朋gt5160tggtgt卿gctcaacctgtaccteaccgaattgactacagtattcggac5220ttcacctgcttgactattcaggcactttecaatctegctggtgg朋atet5280ggattacttattgactaagtteggtgteggctcagctcatteatcggteg5340cggctteatcaccggtaaccctettctatacgactcacagactcaactcttgggteteca5400ggtaactctaccttcagtcggg朋ccte朋teatetgcgtgccacctecttggaaacctt5460atccgteagc3C皿CC3ggggatttgcctcggcacttgtcccc朋agtgg5520cggttctgtgateg皿g朋cttgacacctcatectgtatag朋actgact5580ttgtec朋gaategt朋cgttccctatgtcccctggtatttettcctgcttgagcggc朋5640tacgtcggcctgtetgtectC3朋g3CCg3aggcgcacttactecaccatacatgactet5700gtcatcgccaactgc^gatgac^catgtagatgtgteaaccccccggg5760tatcatetcggag皿gccgtgtctcteatacatgcaatgt5820tttatccttaggcgggat皿cttteaggctragtgggg朋ttcgatgtaacttatcagaa5880gaatetctcaatec^gattctcaagtaat皿teac3ggcaatcttgatetctcaactga5940gcttggg皿tgtcaacaacttgctttgaat皿gtt卿gg6000朋朋ctegactcaaactgactegcacatctgctctcattecctatatcgt6060tttgactatcatatctcttgtttttggtetacttegcctgattctegcatgctacctaat6120gtec朋gc朋皿ggcgc朋cattatggcttggg朋teatectctegatca6180gatgagagccgatgagg皿cgaaggtttcc6240tttgtgtgaaagttctggtegtctgtcagttcagagagtt皿g朋朋朋ctaccggttgt6300
aggacgatet3cgggteg朋Cggt朋g3g3ggccgcccctc皿ttgcgag6360ccaggcttcacaacctccgttctaccgcttC3CCg3C皿Cagtcctcaatcatggaccgc6420gccgttegccaagttgcgtt3gag朋tgatg咖g卿ggc aaaaaa t a catggcgcttg6480atettccggattgcaatcttattctteacagtegtgaccttggctetetctgtagcctcc6540cttttatatagratgggggctagcacacctagcgatcttgteggcateccgacteggatt6600tcragggcagtecatcteracttggttccaatc朋gatgt6660atetet朋gcaagtggcccttgagtctccgttggcattgtte皿tectgagaccacaatt6720atg皿cgc朋teacatctctctcttatcagatteatggagctgca朋c皿ragtgggtgg6780ggggcacctetccatgacccagattetetegggggg咖ggca朋g皿ctcattgtegat6840gatgctegtgatgtcacatcattctatccctctgcatttcgaattttatc6900ccggcgcctactacaggatcaggttgcactcgaataccctcatttgacatgagtgctacc6960cattectgcttgtaatettgtctggatgcagagatcactcacattcatet7020cagtetttegcacttggtgtgctccggacatctgcaacaggg郷gtettcttttctact7080ctgcgttccatcaacctggaCg3C3CCC朋皿tcgg朋gtcttgcagtgtgagtgc朋ct7140cccctgggttgtgatetgctgtgctcga朋gtC3Cgg3g3C3g3gg皿g3agatteteac7200tcagctgtccctacgcggatggt織tggg郷ttegggttcgacggccagteccacg朋7260朋ggacctegatgtcacaacattattcggggactgggtggcc皿cteccc郷agteggg7320ggtggatcttttattgacagccgcgtetggttctcagtctacgg郷gtt7380tcacccagtgacactgtecagg朋ggg咖tetgtgatetac皿gcgateC朋tg3C3C37440tgcccagatgagc朋gacteccagattcgaatggcc朋gtcttcgtataagcctggacgg7500tttggtggga皿cgcatec3gcaggctatcttetctetca解gtgtc朋catcctteggc7560g皿gacccggtectgactgtaccgccc皿cacagtcacactcatgggggccgaaggcaga7620attctcacagtegggacatctcatttcttgtetc朋cgagggtcatcatecttctctccc7680gcgttattetatcctetgac3gtC3gC皿Cctcttcatagtccttataca7740ttcaatgccttcactcggccaggtegtetcccttgccaggcttcagcaagatgccccaac7800tcgtgtgttactggagtctetec3gatcc3tetccccteatcttctatag7860ttgcg郷ggtettcgggacaatgcttgatggtgtec皿gc朋gactteaccctgcgtct7920gcagtattcgatagcacatcccgcagtcgcattactcgagtgagttc朋gC3gtecca朋7980gc3gcatec3ttgttttaaagtggtra卿cteat朋gacctattgtctc8040agcattgctgtactctcttcggag朋ttcagaatcgtcccgttactegtt8100gagatcctca皿gatgacggggtt卿g朋gccaggtctggctegttgag8160tgtatcacctatcttctgcgtcaaaccgaa8220tgccggcgcgtgctcgaattccatgttgccagttgaccac皿tC3gCC3gtgctcatgcg8280gccttgtcattaatctcttg皿tgt朋gtggcaatgagat8340acagctcatgcgggteggacatggcgagctccggtcctga8400朋gggc卿gcatcagattetccteccagagccacacctgtcttcaccattggtc朋gca8460caaactectctettactggagctaccgcttcctgatgaatgtgacttcga8520ccacctcattctcagccgactcggcctctcctgatactga8580gag皿tgatea朋ctcgg皿gggcagteraccaaactcttCC3g朋t朋C8640
cggagtgctccaccccaggtgttteg朋caactggctaatattgaggtcccagattcaac8700cgga卿ttgccaaattcac3tggag朋ct8760gttcac朋ggctgtgtacgcatetegag朋ga朋ctgctggggtcatcttggtcteac朋8820tgtcccccggtc卿gg賜ttcagcagcattcgtecggatccggcattctggtttcactc88803C3gCC皿gtttgcatggctc c at atggcatctgat8940ggtggcagct皿gac朋ggtctgcggccaaC3朋ttggtgatgcteacccate郷tegg■0ccaagtctttgtcactcctgaacttgtcgttgtgacgcatacaagttcac9060atgtcttacccagg皿cttgtattgatgtatgcagatetgg卿tetggt9120tcaaccacggcggtgcatctcag皿gcttettgatgacat9180tttgcggttaatagacgctctggc朋朋gacttgggteatcaagtctecgatgttgtatc9240acteatggagggatttgcat3Cgg賜Ctgtccagctectcgagccgtcaggtecatttgc9300aggagatttcttcgcattca3CCtgC3gg3gctte皿gacattcteattggcctcctccc9360c皿tgatetegcag皿tccgtgactcatgcaatcgctactgtattctctggttteg朋ca9420gctg卿tgttgtgtctgttgcgtctgtggggtcacccactgcttgagtc9480ccgtettgcagC3朋ggC3gtC3gg3gCC3皿tgtgcgcaccg朋朋tggtagactttga9540tatgatccttcaggtectgtctttcttcaaggg皿c朋tcatc朋cgggt9600gtgtggccgcgagtca朋gtggatec朋tetetggg皿ggtcattgggca9660actacatgcaagatttcacacgatetcatgttg賜卿gt9720atctgcacttg朋tttgagccatgteteg3atetgaccctgtcaccaacctgagcatgtt9780ccte朋agac皿ggc朋tcgC3C3CCCC朋cgat朋ttggcttgcctcgttteggcgg朋9840ccttctctccg朋g3CC3g3acttcgacteatcgcctctt9900gategagtttttegagtc皿atgattttgag卿tgg朋tatctgacgac9960ccttgagtaccttegagatg3C朋tgtggCagtatcatactcgctcaaggag朋gg朋gt10020gg3Cgg3tcttcgctaagct10080ggcgg皿gggatcctagccgatcagattgcacctttctttC3ggg3朋tggagtcattca皿40ggategcatetccttgaccaagagtetgctcaactgtctt10200teag朋acgtatcactgactgte皿ga朋gagtatcttcaaaccgcaatcatgatccg朋10260朋gc朋g朋ccgtcgg卿gttgcaaccttgacctgca朋agtactgtct10320teattggagatetc3gac皿tcaaattgttcgctcatgccatcaatcagttgatgggcct10380acctcacttcttcg朋tggattcacctaagactacgatgttcgtegg卿10440ccctttcaatcctccaagtgaccctactgactgtgacctctcaagagtccct朋tgatga10500gtcagtgccacg朋ggattetgccag朋gctetggac皿t10560gatctcaattgctgcaatccaacttgctgcagctegatcgcattgtcgtgttgcctgtet10620ggt織gggtgateatc朋gteategcagt朋Cg3g3g3gacgactctcc10680gg卿tggtgttgacacagttgcatcaagcragtgateatttcttcaagg10740tgtcaatcatttgattggccggatcgtg皿accatcaggt10800cttcatetactcttcaaagatggagc朋tcctcagtcaag10860ttcatctaaattegtgctagtctcagtgaatgtcctgtgc10920caacattgcctctactgtagcacggctatgCg卿3Cgggcttcccaaagacttctgtta1098019/28页ctettteaacteteteatgagttgtgtgcagacatactttgactctgagttctccatcac11040caacaattcgcaccccgatctteatcagtcgtggattg3ggacatctcttttgtgcactc11100atetgttctgactcctgccc朋ttegggggcttcaatactcaaggctcta11160cacteg3朋tatcggtgacctgcttttgcagagatc朋gcgacteg朋gc112203gtgggattectgagtccteacattatgactaatetctteactaggccgcctggg皿tgg11280卿ttgggccagtctgtgcaacgacccatectctttcaattttgagactgttgcaagccc11340ctteaga朋catecgc朋3gagtcctetttgaaacttgttcaaatccctt11400attgtctggagtgC3C3C3g3ggateatg3ggc卿卿g朋ggrattggctgaattctt11460gctteatcaaatccccgcgttgcgcatgcccaagctctgt11520郷tegg卿朋gggcttgttteagattgc11580gcttectagg3ggccatteggcatc皿g3ggctgatgcggategtcaattattctagcat11640gcatgc朋tgctgtttegagacgatgttttttcctccagtagatccaaccaccccttagt11700ctcttctaatatgtgttctctgacactggc3gactetgc3cgg皿teg朋gctggtcacc11760tttgacgggaggcagg朋皿tectgggtgtatcteatcctgatecgateg朋ctcgtega11820gggtg卿ttcttagtgtaagcgg郷gtgtec皿gatgtg織gcgg賜11880tacttggttccatcttccaagc朋tetegaattgaccgatg3C3CC3gC3agaatcctcc11940gatg郷gteccatetctcgggtc朋agac織gg卿ggagagctgcctcacttgcaaa12000aatagctcatatgtcgccacatgte皿ggctgcccteagggcatcatccgtgttgatctg12060ggcttetggggateatg朋gte朋ttggactgctgctcttacgattgc朋aatctcggtg12120teatgte朋cttegagtatcttcggttactgtcccctttacccacggctgggaatcttca12180acategactegatgatggtetaactcagatgacattcacccctgcatctctctacaggtg12240tcaccttacattcacatatccaatgattctca朋ggctgttcactg朋g312300g郷gg朋tgtggttteccagctcttgggtttetctcteatcgaatcgat12360ctttccaatgggacatetg3ctgcacctac12420tagttgctgtcacctgttgcggttcctttcgagctacttggggtggtecc12480gg雄tg郷acagtgacctca朋teagtttatgtatgatcctagccctgtetcgg郷g12540agactttgcgagacttgacttagctatcttc皿gagttetgagctteatctggagtcate12600tcccacgategagcteatg3acattctttcaatatccagcggg皿gttgattggccagtc12660tgtggtttcttetgatg朋gatecctccatgccateategtgtetgac朋12720tacccgaaattggatragtg朋gctcag朋ttcagatgtggtccgcctetttgaatetgc12780gtgctcctcgactgttctteccaactctattecctgagagteagaggcct12840agac朋tettgtcttatatetgggtgattt3tgCC3gg朋ttctectttc12900caacattgcagctacaatatctcatcccgtcattcattca3ggttecatgcagtgggcct12960ggtcaaccatgacggatcacaccaacttgc3gatecggattttatcgaaatgtctgcaaa13020actattegtetcttgcacccg3Cgtgtg3tctccggcttatettcagg朋at朋gtetga13080tctgctgttcccatctgtcttegatgateacctg朋tgagaagatgcttcagctgatatc13140ccggttetgctgtctgtacacggtectctttgctecaacacg朋朋teag13200aggctteactgC3g朋g3g3aatgttcaatactcactgagtatttactgtcggatgctgt13260cttagccccgctctetcatgtctccteaca13320
21ctgtectacatgtctcggaa gagcctcaat ttgatcaggg aaagggagga13380cagggatectatcctggcgttgttgttccc ccaagagcca ttattagagt tcccttctgt13440gc朋gatettggtgctcgagtgaaagatcc attcacccga caacctgcgg catttttgca135003gagttegatttgagtgctccagcaaggte tgacgcattc acacttegtc agattcatcc13560tgaactcacatctccaaatccggaggaaga ctacttagta cgatacttgt tcagagggat136203ggg3CtgC3tcttcctcttggtataaggc atctcatctc ctttctgtec ccgaggtaag13680cacggg朋ctccttetectt agctgaaggg agcggagcca tcatgagtct13740tctcgaactgcatgtaccacatgaaactat ctettacaat acgctctttt caaatgagat13800gaaccccccgcaacgacatttcgggccgac cccaactcag tttttgaatt cggttgttta13860tegg朋tctec郷cgg郷taacatgcaa agatggattt gtccaagagt tccgtccatt139203tgg3gag皿朋tecagagg朋3gtgacct gacctcagat朋3gcagtgg ggtetettec13980atctgcagtgccctecagatctgtetcatt gctgcattgt gacattgaaa ttcctccagg14040gtccaatcaaagcttactagatcaactagc tatcaattte tctctgattg ccatgcattc14100tgte郷gagggcggggtegtaatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat actactttca14160tctactcatgaacttgtttgctccgtgttc cacaaaagga tatattctct cteatggtta14220tgcatgtcgagg卿tetggagtgttecct ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc14280tacatttgteratg郷tggtgaggatggc aaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct14340cttgtctaaatcacactgac caggttettc acctcacagc ggcagcgtgt14400ctetccagtcctttecc朋g atteate朋g tecttgagga 3g朋tettga14460cactgcgctgattg朋gccgggggacagcc cgtccgtcca ttctgtgcgg agagtctggt14520gagcacgctegcg皿cateactcagataac ccagattatc gctagtcaca ttgacacagt14580tatccggtctgtgatetetetggaagctga gggtgatctc gctgacacag tatttctatt14640taccccttacaatctctctectgacggg朋朋3gagg3C3 tcacttetec 3gtgcacg3g14700acagatcctegaggttec皿tecteggtct tegagtcg朋朋tctc朋te朋ateggcga14760tataatcagcctegtgctte朋ggcatgat ctccatggag gaccttetcc C3ct朋ggac14820atecttg朋gcatagtecctgccctaaate tttgaaggct gtcctaggta tteccaaact14880tttacagacacttctgtatt gtecttgact cgtgctcaac aaaaattcta14940ateggc朋tgC3gtca朋gg atettecagt朋ctgtgact ctt朋cg朋315000atcacatattaataggctccttttttggcc aattgtettc ttgttgattt aatcatetta15060ctgactcctt aggactcgaa ttcgaactca aataaatgtc15120gttgcgcacaattattcttg agtgtagtct cgtcattcac caaatctttg15180tttggt15186〈210〉4〈211〉1611〈212〉DNA〈213〉传染性支气管炎病毒(IBV)〈400〉4atgttggtea cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgctttg60tatgacagta gttcttacgtgtectactec caaagtgcct tcagaccacc tgatggttgg120
22
catttacatg ggggtgcgtetgcggttgtt aatatttcte gtgaatctea taatgcaggc180tcttcatctg ggtgtactgttggtettattcatggtggtc gtgttgttea tgcttcttct240atagctatga cggcaccgtcatcaggtatg gcttggtcte gcagtcagtt ttgtectgca300tactgteacttttcagatactacagtgtttgttacacatt gttacaaaca tgttgggtgt360ccteteactggcatgcttcaacagcattctatecgtgtttctgctetgaa3朋tggCC3g420ctttttteteattteacagttegtgtegctaagtecccte ctttteaatcatttcagtgt■gtteateattteacatccgtggtgatcttg tttecacctcteatgagacc5403cagatgttecatctgcaggtgtttetttta皿gctggtg gaccteteactteteaagtt6003tgagag朋gttegagccctggcttettttgtteatggte ctgc3c皿gatgttettttg660tgtgatgggtcacctegaggcttgttegcatgccagtete atectggc皿tttttcagat720ggcttttetccttttecteagtteagcag3 agtttettgtctetcgtgaa780atactacttttecgttecac aatttcactt ttcateatga gactggcgcc840ctegtggtgtccag^tett c^acttecc ^3C3C3^c agctcagagt■ggttattetaattttaatttttcctttctg agtagttttg tttateagga gtcteatttt960atgtetggatcttetcaccctttegactegteatggtttg1020tggttteattcactttcagtttcaattgcttecggtcctcttc朋ggtggttgc朋gc朋1080tctgtctttegtggt卿gcaacctgttgttetgcttectC3tetgg3ggtcctttgctg1140tgt腿ggtgtttettcaggtgagttegatcateattttg朋tgtggactgttegtttet1200gttecteagagcggtggctctcgtetecaaacagccactgaaccgccagt1260ttteaatecttgtgttgatttggcag朋ct1320ggc咖ggtttgteaccgactcagctgttegtteteattetctegcagac1380gcaggtttggctettttegatecatctggttccategacatctttgtcgt1440tetggtctteggtteacccttgcga卿tgtcaaccagcagtttgtegtt1500tctggtggte皿ttegteggtettcttecttcacgteatgagactggttcccagcttctt1560gag^tcagttttecatcaagg皿cacgtcgttttegacgt1611〈210〉5〈211〉960〈212〉DNA〈213〉传染性喉气管炎病毒(ILTV)〈400〉5gg郷gg卿gagac皿cttcagctcg皿gtctg皿gagacatcatgagcggcttcagte60acateggatcgattgccaccgtttccctegtetgctcgcttttgtgcgcatctgtetteg120gggcgccggtactggacgggctcgagtcgagccctttcccgttcgggggc180cccaggcgtgc皿ccgcacctgacggtcccgtggagcgactectctggtc240gcaccg皿ggagtgtcagtcg郷tg腿tggttctecggg朋tegteatcccgaaagct300tcgtgttcggggtggategcg皿3CgggC3gtgg3C3Cg3ggacctgtctacgtgctggg360ctcteatccateatctgaacgcgtctgtgtgcagggcgtctgacgccgggatecctgatt420tcgac^gcagtgcg^^agtgC3g3g皿gactgcgctccggggtgg朋cttggtegtt■acgtgtctggcaatggatccctggtgctgt3CCC3ggg3tgtecgatgccggcatctecg540
cctaccagctctcagtgggtggg皿gggatateccgggtctgtttetctegacgtcggac600caaaccccggatgccacgacragtetgggtacacctettecagcctggccgacg郷cgt660cagacttetcatcttetgacgtegcctcgcccgaactcgacggtcctetg720attccaattgtctegacatg cccccgctecgcccatggacaaccgtttgttcgcatgacg780tcgaggagcagg朋朋cgcc3Cgg3Cg3gCtttecctetgggacg郷皿tgcgccggtc840cgctggacgagtecgtcgacg皿3ggtC3gagacgatgccgtcttttcac■cgccctctecgctccagcag tegccacccgagagtgttttttgtgagcgcCC3CgC皿C3960〈210>6〈211>810〈212>DNA〈213〉禽脑脊髓炎病毒(AEV)〈400>6ggg腿g郷Eltg朋ggElggatttttcagtgtgcctg皿gtggagc^catgttgttgag60gateagg朋cC3C3ggg3CCtttgcacgtgacaccttttggcgctgtteaagctetggag120gacccccaattggccaggaaaacacctggcacattccctgaattegctcctggteaacct180cgacatecagtggaccacatggatctgtet皿gttcatggggcgtgcccattecttgtgg240ggacatg朋ttecacattccagateccattaagtcccatt300腿g郷gttttgtgacgggtecactteggtggttttteagtcttttccaactgtetcgt360ggttctctcgacatteccatgacatttgca3tgtgg3tggcattgtgtec420tttgtgcctgagggtgttgcgategagactg卿ggg郷agcagacccctttgctcaca■ttgaacteteaggtgccattaggttteateCtgg3C皿3Ctecgaatgtc540cagttteggatccctttctecacgccactgg皿C3C3tCgcaacccattc600atggattcagtcttgggggccagatcacteactetegtgc660tetttgcaggttecctectecatcagtttccacagttttctgttcccaga720gcggtgccagtggtcagctcattcactgacacatctegcag皿tecatet780tggcttgatgatgacgagttggt卿卿g810〈210>7〈211>726〈212>DNA〈213〉禽脑脊髓炎病毒(AEV)〈400>73tg3gC3朋Ctettttctectgteggc郷actgttgatgaggttttgtctgtgctcaat60g￡ltg￡lgg￡ltectgaatctte tgctggccctgatcgcactgragtegttgg120ctgac朋cggtegaccagag ttcagttegcacggctec皿tggg皿gtttac皿gatgte180C3gtecagg3ctgcagtcga tettcctggttctegagtgaC3C皿ggtg3gaggttcttc240cttetcgatc3gCgtg3gtg g皿CtC皿C3ggcagttettgggra卿tt300gacategtea皿gagctgcttgatcagtcgtetgctgttgatggccttttg皿gteccat360tcttetgcaaggtttggcttggatgtcattgttcagatteatccaacatcattccaggca420gggggcctcategcagctctcgteccttetg紅郷ttgacattgaatcaattgttgcc■
atgaccacttattgccatgg c朋ggtteattgc^cateaactecgttgt皿ggatg皿g540gtgccatetetetecagtcg aggttgttec皿cctteggaactcagcatectccatttgg600atgcttgtgateagagtgtg gtcacggctgragttgggatctggcacttc660actetcaccaccttggcteg gtttgtggatttggaactgcatggacttegccctttggtc720gC3C3g726〈210>8〈211>735〈212>DNA〈213〉禽脑脊髓炎病毒(AEV)〈400>8atgatgcgcaacgaatttcgactgtcgtcatctegcaacattgtcaatttggcteattet60gacgatgc朋g3gCC3朋gtgtctctegcgctgggac皿gaagagttttcC3g3g3CtCg120tcaagteccggggggg朋ttggtgcatcatttttcacagtggacgtccattccgtgcctt180gccttcacttttecattccccggcacggtegggcc郷ractcacatctggtcaaccacg240gtggaccctttttcctgteacttgagggcgtctegcactgtgcaccccacteacttgagc300tcgattgcgggtetgttctgtttttggagaggtg織ttgtetttgagtttcaagtcttt360tgcaccaagtatcattccggtttgtgtetgtgcctggcga420cctteactgctctectggtcttectgctgtttttgatetc■朋tggtgteaattcaacactggtgttt卿tgccctttcatctctgacacaccttecagg540gtg朋tcc朋cgactcateagtccctctggccttetgcaactggcaagcttgtgtgctet600gtctecaatetectgaacgcacctgccagtgtetcaccaaccctgcccatteatgtgtec660朋朋gtgctgcggatctggagttgtetgcacctgtttetggggtttctccC3CC皿C3CC720tcaatttttgttcaa735〈210>9〈211>1500〈212>DNA〈213〉禽副流感病毒(APV)〈400>9ggggggtgtgcatggtegggtgggg皿ggtagccaattcctgcccattgggccgaccgte60cc朋gag朋gtc朋cag朋gtetegatgcagggcg織tgg郷gtegccgtgateacct120cacagtegatgatg朋tteag郷ttegcttetegagttgtetccctcct180attgatggtgagtgccttgateatctctetagteatcctg3cg3gagate3C3gCC皿3g240cateatcacggcgatcaaccagtcgtetgacgcagactcaC3gggatega300aggg朋朋tcacctcaatcatgactgatecgctcgatecc3gg皿tgC3gctcttctcca360cattccactccagctcaatecacttgaggcaaacctgttgtccgccctcggaggttecac420gggaattggccccggagatctegagcactgtcgttetccggttcatgactccgcttecct■gcatggagtcaatcgattectcatcaatca皿C3gCtg3Ctec3C3gcagaaggccccct540ggatcatgtgaacttcattccggcaccagttecgactectgg3tgC3C皿ggatcccatc600cttttctgtetcatcatccatttggtgctegtgattga皿C3ggttgC皿660
tgaccactcaggtegteatc皿tetetcagtetgggggtgatte卿gggctggc皿cgg720ctteccttecttctcaacagtcgtgagteagtetctgaccgatgggttg3780ctgttccgtegctgcgggatccgggcattgttecctcctttgtegcctegtgtcagagcc840cgaacctgatgactetgtgtcaccagatcccacaccgatg郷tteggggtgcteac皿g■ggatgggtcttecactgaac郷tggtecctetggagcgc960aaacteccctggggtegggtcaggtgctet皿ggtgttettcccatttte1020CggCggElgtg朋g朋tggatcaacccctgaggtgatg皿tattectecat1080ccaggatccaaatgactettgccctgacccgctgcaagatcagatctteagggC3g皿C31140atcgtettetcctectcgatttggteggagg3tggt皿tgC3ggg3gtCCteacatgtcc1200agtetccaactegccagccaatgccaatcttectetttcaacaactcatt1260aggattcatcggggcgg皿tcteggatctettecctcaatggteacatttacctttetca1320朋g朋gctcgagctggtggcCtC3CCCCC3aatttecctecttgattccaggattg咖g1380tccgggtecgactcaggcgtteacctc皿gttectgtcat1440tecacgaccatcatctggcttttgteategtgcccteatgactgcttett1500〈210>10〈211>1440〈212>DNA〈213〉出血性肠炎病毒(HEV)〈400>10g朋3tgtt朋tgttagaccatactgaccaattcctggttc attttagatggaatcttcga60acactgccactegaatttttgctccaacgg^gggag^3 cagteteatttacagcaact120tgcctcctgttttetetega teac皿ggcc180gatcattcta240acatttcaactettgattcatct卿tggg300gaggag朋ctttagtaacatctgttetgaa ttgtactaaacattttaatt360c卿teggtgattcagactattaagagtcc acctacatttg^tgga^g420朋ttga朋3t3CCtg3ggg3aactatgttttaaatgagtt tattgattta480gtettacttctttataccttggc^caggg tgtecttg33g^gacateg540g朋t朋朋tttgatactcgcttggteaaga tccaactactaatcttgtte600ctcctggtaaatacttgttt皿gggttetcatgctgatat aatacttcttcctggttggg660ctettgatttttctttttct卿ttgggtecgtgagactt720ate朋gctggctttttgattccaccactgt780tggatgttgctctacaagtc^gcte^cc attettecaggatccatctg840gcagatcttaccacgttatgctaacagacc tgtgactgcatataggtctt■ttgttttgtcg卿gtgctgc皿^tte^ gtttttgatgtgtetgagtg960ateteacggg gggtctc朋tcagctgtettggtgtttgcctgattcttet皿3CCgCC3g1020tetcttttea gc朋ga朋cg c朋gtegate朋ctgcctgttgttggtetg caactttttt1080tcctttttgtttgteaatctgtgtettctg gtgctgctgtttecacacag tteattgaac11403gc3gacte3 tttgacac朋attttteac3 gatttcatga teatg朋3tt1200
ctccatetgtttettggctgcateaatgtt皿tcaggg皿1260attttcaactcttccaggagtecagagagtggttgtgg皿gacgategga1320g皿g皿ctgtaccctecgttaccaagtcacttgctecagtatetccg皿ggttttgtcte1380gcaaaactttgc皿teatgcattctgttgtttettctccagggg織gteg郷atgggg1440〈210〉11〈211〉2995〈212〉DNA〈213〉禽痘病毒(FPV)〈400〉11ctctteattctggga皿tettttteagcctccgattetca60gattgtgg皿acagteccaca^gctteacagctetteattctecteatctttctectte120tgaatgtttta^cgttteategatctegcatctecategctecgttttg180ttgteaccteagtecteatcctg郷gtectgacatectetcgatgtttc240gagte皿gtttctgtetetettttegtegatg卿gragtcctcateaag300gatteagtcttcccatetteagtegateteggtgtgctteateatg皿tc3603gtegg3皿cttgtteggteatttctgggt3gtggat皿gcttcacttttateteggteg420tgcgtctcttatggg腿tgcgcteacaacatgggcatet■teattctttegc皿tggatttetetttcagatcgttggacteagc皿g皿540ttcttteccag皿tggccac皿3gteccatttcttcaaaaaccateacgg600tetettcttttcagattctcC3g皿catetggteggt卿ttgacttgga660ttgtgttettcattetetegacgcggcg皿gtctectetegatctegcgategtetctct720tcttccteca皿gag皿c皿aagattctetcgtctettgg^gatgcatt780皿tecgggccgtetteg皿cactecgagtgctetteggat840皿cggatgttaagcctteacg皿cteggagttgaccatet■agatetctctacte皿gtettteggtttcccgtteattcta^gtegatg960ttcteaaatgatgattetegatgg皿ggtetgctcatgttatgactgcteacctegacgg1020gtctcattttaatcaccatgcttttgttegcttteactgtatggatc皿c1080g皿gtgtttg朋agggactggatetctccttecgc皿皿ga^tegatet1140gtctcaaatetagtetatetgate^^gate皿tetegc1200teg皿cagttacaatcttcttectttcaccgtttagatettetggtttta1260aagattttcattteccacaategatgacgagteattecag1320tcaacaatgtaccattagteacteggtteateacgtttgattttttegat1380cgttteategtacttgtettateacttccaggatettgatacagatectt1440attttetaccaaattcgttetcactectegtetgatgteg1500皿cteag3gatctetcatttgcteteatgtcgga朋tg皿teacgatg皿ttgaga^te1560gtgatettgtatctctaaac朋atggctecateagcateatttectegactec朋atteg1620tecteateagtgatetcgatag皿gateteac皿teattg1680atgttetatccgte皿tggtatetetgggt1740attcaccggaatectteagatggtctategatette^ag3gCC3C3g皿agt朋teact1800
ggttaccgtatagccagtct ateaaccctttg皿tg皿皿tetetecgct tttg皿ttte1860tegctecttt3g皿3g3tCC朋t gage getteaatatcgg agcgatettc ctgtatccgg1920tecaggtega朋c皿cg皿gatet朋tega a皿gttttte gatragtteg1980朋g朋gt朋tgtettgtttt aacaggttet catcteacat2040ttttegag朋tectetttte gagagatetetcagteagte te皿gactgg attttterat2100gteatcgtctagtecattgt皿皿ccggractgaagtett cttetttgat gccgctetet2160tttttccatcctcteateag a^ggatetgte皿3cattg gac3ggte皿a皿tte皿tt2220tttcc皿皿3 gategtcagctega皿皿te cate皿teat皿cagtgteg2280cag朋cgtetatettettte cagtcttctttec3c皿gca tetetcctgt cteatega皿2340ttttcgagttaaatggattt gatttteatttttctgggtt gttegatete cttettttca2400gtettcgtgtteag皿teat皿tggteattactetteccc teaacattct tcagctgtga2460atttgatgttgtcatctett tecacggactattetgctet tgatgatete gate皿gate2520gteag3朋cttgttttteac tctetttttccttteateat gg皿ggatet teccctg皿g2580g朋朋ccttettetecga皿3C3ccra皿g皿gggtettt gtc皿tetgt ttetgtgatg2640tega朋tetcteatgatete朋g皿tcctetettgtettg te皿g皿皿c皿gtcagcte2700gg朋gtttecaggagtettc aratctgtegatetegatec cgctgtea皿cteag3ggat2760ggccteatea皿tea皿tte ttcgac皿te2820tetgttetct3tcagg3tte c3C3C3cgat ga皿皿tctt2880tec朋ggctetcttttttct tetttectte皿ggc皿cgt teccg皿gat gttttegcte2940tg朋朋gttgtetcatttet aateagttec tgcag2995〈210>12〈211>35〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，IBSIF'〈400>12cgggatccgccgccgccatg ttggtaacac ctctt35〈210>13〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，IBSIR'〈400>13cggaattctt^cgtcte^ acgacgtgt29〈210>14〈211>38〈212>DNA
28
〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，NDF F'〈400>14cgggatccgc cgccgccatgggctccagaccttctacc〈210>15〈211>34〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，NDF R'〈400>15ccgctcgagt tacatttttgtagtggctctcatt〈210>16〈211>39〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，NDHN F'〈400>16cgggatccgc cgccgccatggaccgcgccgtteggc朋g〈210>17〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，NDHN R'〈400>17gctctagatt actcaactagccagacctg〈210>18〈211>35〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，IBDVP2F，〈400>18cgggatccgc cgccgccatgacaaacctgc朋gat〈210>19〈211>29
29
〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223>PCR引物，IBDVP2R' <400>19 cggaattctt accttatggc ccggattat 29
权利要求
一种用于蛋内注射的多价性DNA疫苗，包括一个含有二个DNA分子的DNA构建物，其中，每个所述DNA分子能表达出一个会在禽类内造成禽类病毒疾病的禽类病毒的抗原蛋白；所述禽类病毒的抗原蛋白能在所述禽类诱导出抗所述禽类病毒疾病的保护性免疫反应；所述DNA分子选自传染性华氏囊病病毒及新城鸡瘟病毒所构成的群组之中的一个基因或其片段。
2. 根据权利要求l的多价性DNA疫苗，其中，所述载体为一个质粒或一个病毒载体。
3. 根据权利要求2的多价性DNA疫苗，其中，所述质粒为选自pcDNA3、pVAXl、pSectag、 pTracer、 pDisplay、 pUC系统质粒与pGEM系统质粒所构成的群组中的一种。
4. 根据权利要求2的多价性DNA疫苗，其中，所述质粒包括一个启动子，所述启动子选 自CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子和13 -肌动蛋白启动子所构成的群组。
5. 根据权利要求2的多价性DNA疫苗，其中，所述病毒载体为选自杆状病毒、疱疹病毒 和痘病毒所构成的群组中的一种。
6. 根据权利要求1的多价性DNA疫苗，其中，所述DNA分子为具有SEQ ID NO :2的DNA 序列的传染性华氏囊病病毒(IBDV) VP2基因的全序列或其片段。
7. 根据权利要求1的多价性DNA疫苗，其中，所述DNA分子为具有SEQ ID NO :3中自 第6321至8319碱基对的DNA序列的新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因的全序列或其片段。
8. 根据权利要求l的多价性DNA疫苗，其中，所述禽类为选自鸡、火鸡、鸭和鹅所构成的 群组。
9. 一种制备权利要求1所述多价性DNA疫苗的方法，包括将二个DNA分子黏接到一个质粒或病毒载体以形成一个DNA构建物，该一个DNA构建 物即为所述多价性DNA疫苗；其中，所述DNA分子包括选自传染性华氏囊病病毒及新城鸡瘟病毒所构成的群组之中 的基因或其片段。
全文摘要
本发明提供一种用在禽类蛋内以获得胚胎免疫性的多价性DNA疫苗。该多价性DNA疫苗包含一个含有二个或二个以上DNA分子的DNA构建物，每个DNA分子代表一种禽类病毒基因或其片段。该多价性DNA疫苗能表达出二个或二个以上病毒抗原且在禽类体内诱导出抗禽类病毒疾病的保护性免疫反应。
文档编号A61K39/17GK101703770SQ200910212389
公开日2010年5月12日 申请日期2003年3月6日 优先权日2002年3月8日
发明者郭村勇 申请人:施怀哲股份有限公司
技术领域：
本发明是有关一种在禽卵内取得胚胎免疫性的多重性DNA疫苗及/或多价性DNA 疫苗。该多重性DNA疫苗包含二个或二个以上的DNA构建物，每个构建物含有一个编码禽 类病毒蛋白或其片段的DNA分子，该蛋白或其片段能在禽类体内诱导出抗禽类病毒疾病的 保护性免疫反应。该多价性DNA疫苗包含一个DNA构建物，该构建物含有二个或二个以上 的DNA分子，各DNA分子为一个禽类病毒基因或其片段。该多价性DNA疫苗能表达出二个 或二个以上的病毒抗原且能在禽类体内诱导出抗禽类病毒疾病的保护性免疫反应。该多重 性DNA疫苗和该多价性DNA疫苗两者优选在禽卵受精约18天后注射到禽卵的羊膜内。
背景技术：
Sharma等人已经全面地说明含病毒疫苗的蛋内疫苗接种(in ovo vaccination) (美国专利第4， 458，630号)。尤其是，其讲授到可以将活的马立克病病毒(Marek'sdisease virus)注射到卵的羊膜的内，其后胚胎受到感染并且疫苗病毒复制到一高病毒效价 (titer)，从而在受处理的胚胎内诱导出保护性抗体的形成。(参阅，Sharma(1985)， Avian Diseases 29,1155,1167-68)。 在全世界的家禽产业中众所周知，某些病毒疾病，例如马立克病病毒(MDV)、传染 性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus) (NDV)、传染性支气管 炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、鸡贫血病毒(CAV)、鸡 痘病毒(FPV)、禽流感病毒(AIV)、理奥病毒(reovirus)、禽白血病病毒(ALV)、网状内皮组 织增生病毒(REV)、禽腺病毒和出血性肠炎病毒(HEV)，可能造成重大疫情爆发且导致养禽 商业明显经济损失。其中，MDV、 IBDV、NDV和IBV由于其毒性本质而显得特别重要。
马立克病(MD)为一种会在鸡中自然发生的恶性淋巴增生失调疾病。该疾病是由 一种疱疹病毒_马立克病病毒(MDV)所引起的。MD普遍存在于全世界的禽类生产国家中， 在密集生产系统下饲养的鸡不可避免地会遭受来自马立克病所造成的损失。MD病征广泛地 出现于受到感染的鸡的神经、生殖器官、内部器官、眼睛和皮肤，造成运动障碍(由于神经 受到感染时因麻痹所致)，内部器官的功能性障碍(因肿瘤所致)，与慢性营养不足(若内 部器官有受到病毒侵袭时)。MD会感染约6周龄以上的鸡，最常发生于12周至24周龄鸡 中。 至目前为止，尚未有治疗MD的方法。该疾病的控制主要基于管理方法，例如将正 在生长的鸡与感染源隔离，使用在遗传上具有抗性的品系，以及接种疫苗。不过，管理程序CN 101703770 A
通常不具成本效益，且针对具有增加遗传上控制抵抗力的禽系的选择而言，其进展亦令人 失望。现今，MD的控制几乎完全根基于疫苗接种。 传染性华氏囊病病毒(IBDV)会造成幼鸡的高度接触感染免疫抑制性疾病，进而 造成全世界禽业的明显损失(参阅Kibenge(1988)， J. Gen. Virol. ，69 :1757-1775)。感染 了病毒性传染性华氏囊病病毒系的敏感性鸡，可能会产生被称为传染性华氏囊病(IBD)的 高度接触感染免疫抑制性状况。对华氏囊(the bursa of Fabricius)的淋巴滤泡和脾所 造成的伤害，可能会加重其它病原体所造成的感染，并且减低鸡对疫苗的反应能力(参阅 Cosgrove(1962) ， Avian Dis. ， 6 :385-3894)。 IBDV为双RNA病毒科(Birnaviridae)的一员，其基因组由两个片段的双链RNA 所构成(参阅Dobos et al. (1979) ， J. Virol. ，32 :593-605)。较小的片段B(约2800bp) 编码VP1，即dsRNA聚合酶。较大的基因片段A(约3000bp)在单一开放读码区(0RF)内编 码为一个110kDa多肽前体，经处理成为成熟的VP2、VP3和VP4(参阅Azad et al. (1985)， Virology, 143 :35-44)。从与该多肽的ORF部分重叠的一个小0RF，片段A也可编码出VP5， 一具有未知功能的17kDa蛋白质(参阅Kibenge et al (1991) ， J. Gen. Virol. 71 :569-577)。
虽然VP2和VP3都是病毒粒子的主要结构蛋白，不过VP2才是主要的保护性免疫 原且会引起宿主诱导出中和抗体(参阅Becht et al. (1988) ， J. Gen. Virol. ，69 :631-640 ; Fahey et al. (1988) ， J. Gen. Virol. ， 70 :1473-1481) 。 VP3被认为是一种组特异性抗原 (group-specific antigen)，是因为其可被来源于血清型1和2中直接抗VP3的单克隆抗 体(Mabs)所识别(参阅Becht et al (1988) ， J. Gen. Virol. ，69 :631-640) 。 VP4为一种由 病毒编码的蛋白酶且参与蛋白质前体的处理(参阅Jagadish et al. (1988) ， J. Virol. ，62 : 1084-1087)。 在过去，幼鸡IBDV感染的控制是由使用无毒性品系进行活疫苗接种，或主要通过 将活的或经杀死的IBDV疫苗饲养母鸡后所诱导出的母体抗体转移而达成。不幸的是，最近 数年内，在美国从经疫苗接种过的鸡群中已分离出毒性IBDV变异株(参阅，例如，Snyder et al. (1988)，Avian Dis. ， 32 :535-539 ;Van der Marel et al. (1990) ， Dtsch. Tierarztl. Wschr. ，97 :81-83)，此事实严重地破坏了对IBDV使用活疫苗接种的效用性。
开发对IBDV的重组疫苗已有成效，并已将IBDV的基因组克隆出来(参阅Azad etal (1985) " Virology", 143 :35-44) 。 IBDV的VP2基因也克隆出且在酵母菌内(参 阅Macreadie et al. (1990) ， Vaccine，8 :549-552)，以及重组禽痘病毒内表达出(参阅 Bayliss et al (1991) ， Arch. Virol. ， 120 :193-205)。当鸡使用从酵母菌表达的VP2抗原予 以免疫处理时，抗血清可提供鸡对抗传染性华氏囊病病毒感染的被动保护。在用于主动免 疫研究时，以禽痘病毒为载体的(fowlpox virus-vectored) VP2抗原可提供对抗死亡的保 护，但是不能提供对抗华氏囊伤害的保护。 新城鸡瘟病毒(NDV)为一种有鞘膜的病毒，其包含一线形、单链、未分段、负义 (negative sense)的RNA基因组。具有特色地，包含负义基因组的带有鞘膜的单链RNA的 病毒族被分类为具有未分段的基因组(例如，副黏病毒科(Paramyxoviridae)和弹状病毒 科(Rhabdoviridae))或具有分段的基因组(例如，正黏病毒科(0rthomyxoviridae)、布尼 亚病毒科(Bunyaviridae)和砂粒病毒科(Arenaviridae))。新城鸡瘟病毒，与副流感病毒、 仙台病毒(Sendai virus)、猿猴病毒5 (simian virus5)、禾口月思腺炎病毒(mumps virus)者卩属于副黏病毒科。 NDV的构造成分包括一源于细胞膜的双层脂质的病毒鞘膜。从鞘膜突出的糖蛋白， 血球凝集素-神经胺酸酶(HN)，可使病毒同时具有血球凝集和神经胺酸酶两种活性。而融 合糖蛋白(F)也会与病毒鞘膜产生相互作用，它首先以无活性的前体形式产生，然后经转 译后处理，被切断产生两条由双硫键联结的多肽链。活化的F蛋白经由帮助病毒鞘膜与宿 主细胞膜的融合使新城鸡瘟病毒穿透到宿主细胞内。基质蛋白(M)则与病毒组装有关，且 与病毒鞘膜和核壳体蛋白(皿celoc即sid proteins)两者相互作用。 NDV核壳体的主要蛋白亚单位为核壳体蛋白(NP)，其赋予核壳螺旋对称性。与核 壳体结合的为P和L蛋白。磷酸化的磷蛋白(P)被认为在转录作用中具有调节的作用，并 可能与甲基化、磷酸化和聚腺苷酸化作用有关。编码RNA依赖的RNA聚合酶的L基因系与 P蛋白一起为合成病毒RNA所需。占有病毒基因组的编码容量几乎一半的L蛋白是各种病 毒蛋白中最大的，且在转录和复制上均扮有重要角色。 所有负链RNA病毒，包括NDV，其复制皆因不含有复制RNA所需的细胞机构而变 得复杂。此外，负链基因组不能直接转译成为蛋白质，而必须先转录到正链(mRNA)拷贝的 中。所以，在进入宿主细胞内的后，病毒不能马上合成RNA依赖的RNA聚合酶。L、P和NP 蛋白必须在感染时一起与基因组进入细胞的内。NDV的负链基因组(vRNAs)和反基因组 (antigenome)两者均由核壳体蛋白所封装(enc即sidated);唯一未被封装的RNA种类为病 毒mRNAs。细胞质为NDV的病毒RNA复制的场所，也是其转录的场所。各病毒成分的组装在 宿主细胞膜进行，且成熟病毒通过出芽而释放出来。 在美国专利5， 427， 791中，Ahmad等人述及针对NDV的胚胎疫苗接种，其中需要通 过使用乙基甲基磺酸酯(EMS)将病毒修饰。然而，EMS为一种突变剂，使得经由使用EMS制 备成的疫苗也被怀疑具有突变剂的作用，对于正常疫苗的施用并不适宜。不过，在没有使用 EMS的改变的下，新城鸡瘟病毒疫苗就不能用于卵内疫苗接种，因为在使用未修饰的病毒注 射到卵内的后，几乎所有的胚胎都会死掉。 传染性支气管炎病毒(IBV)，为冠状病毒科(Coronaviridae)的原型，是为传染性 支气管炎(IB)的病原。该病毒具有一有正极性的单链RNA基因组，长度约20kb，且其尺寸 常约80-100nm，为有突出20纳米剌突(spike)的圆形。传染性支气管炎病毒为所有年龄鸡 的急性高度接触传染性疾病的肇因剂，会感染呼吸、生殖和肾等系统。 IBV含有三个结构蛋白剌突糖蛋白(S)、膜糖蛋白和核壳体蛋白。该剌突糖蛋白 因其存在于病毒脂质膜突出的剌突或泪滴状表面突起而得此名称。该剌突蛋白被认为与 病毒的致免疫性有关，部分是因为其类似于其它冠状病毒的剌突蛋白，且另一部分则由于 体外(in vitro)中和实验(参阅，例如，D. Cavanagh et al. (1984) ， AvianPathology， 13， 573-583)。该病毒含有两种剌突糖蛋白，为Sl(90kDa)和S2 (84kDa)。糖多肽链SI和S2的 多肽成分经酶法移除寡醣的后估计具有约125kDa的合并分子量。剌突糖蛋白显然是通过 S2多肽链接着到病毒鞘膜的。 IBV已广泛分布于已经发展出密集养鸡工业的国家中。生长到4周年龄的幼鸡最 容易受到传染性支气管炎病毒所感染，其感染会导致高度发病率及因二次细菌感染所致死 亡率。感染也会导致蛋产量下降，或完全不能下蛋，加上产生具有薄壳、畸形、粗糙和软壳的 低级蛋，而对经济造成严重的影响。
给予蛋中(卵内)正发育的小鸡活的疫苗，已被证明为一种免疫婴儿鸡使在其 孵出前抗某些疾病的快速(40， 000颗蛋每小时)，有效(100 %蛋接受疫苗)，且省劳力 (100， 000美金每年每孵化场)的方法。 第一个用于鸡孵化蛋的具卵内疫苗接种机器是由Raleigh， N. C.的Embrex， Inc. 于80年代晚期发展出来的。(参阅，美国专利第5，056，464号和5， 699,751号)。此种卵 内机器目前用于约80X的美国肉鸡孵化场中，主要是用来施打MD疫苗。该机器用于鸡抗 MD的疫苗接种中被证明为安全有效的机器，也逐渐被用来施打IBD和ND疫苗。
下面文段内所呈现的本发明中，要介绍的是一种以DNA为媒介的免疫作用(总称 为"DNA疫苗")。有两类型的DNA疫苗，亦即，一种多重性DNA疫苗和一种多价性DNA疫苗。 本发明的多重性DNA疫苗含有两种或更多种DNA构建物的组合，各构建物含有为一病毒基 因或其片段的单一 DNA分子。本发明的多价性DNA疫苗包含在一个DNA构建物中联结在一 起的二个或更多个病毒基因或其片段。制备该多重性DNA疫苗或该多价性DNA疫苗任一中 所使用的病毒基因或其片段可编码出病毒的肽链，该肽链为宿主体液和细胞免疫系统的抗 原且可诱导该体液和细胞免疫系统。该DNA疫苗首选用针施打到卵内。蛋内DNA疫苗注射 会导致令人惊讶地强烈的免疫反应，其中不仅包括抗体诱导和有细胞介质分泌的T-细胞 活化，而且包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生。
发明内容
本发明提供一种用于蛋内注射的多重性DNA疫苗。该多重性DNA疫苗包含二个或 二个以上DNA构建物，各DNA构建物可表达出会在禽类内造成禽类病毒疾病的禽类病毒的 抗原蛋白。该禽类病毒的抗原蛋白能诱导出抗禽类病毒疾病的保护性免疫反应。该多重性 DNA疫苗优选地是注射到禽蛋内，特别是禽卵的羊水内。该卵优选地是经受精约18天。优 选的禽类包括鸡、火鸡、鸭和鹅。 该DNA构建物包含一个DNA分子和一个载体(vector)。该载体可为一质粒 (plasmid)或一病毒载体，优选载体为质粒，质粒的例子包括，但是不限于，pcDNA3、 pVAXl、 pSectag、 pTracer、 pDisplay、 pUC系统质粒(例如pUC7、 pUC8、 pUC18)、与pGEM系统质粒。 或者，也可以使用含有一个启动子(promoter)例如CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、 和P-肌动蛋白启动子等的任何质粒来制备DNA构建物。最适合的质粒为pcDNA3。优选病 毒载体为选自杆状病毒、疱疹病毒、和痘病毒所构成的群组中的一种。 禽类病毒的例子包括，但不限于，马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒 (IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽 类脑脊髓炎病毒(AEV)、禽类白血病病毒(ALV)、禽痘病毒(FPV)、禽类副黏病毒(APV)、鸭肝 炎病毒(DHV)、和出血性肠炎病毒(HEV)。 特别适合用来诱导保护性免疫反应以对抗上面所述禽类病毒疾病的DNA分子包 括，但不限于，具有SEQ ID N0:1的DNA序列的马立克病病毒(MDV) gB基因的全序列或其片 段；具有SEQ ID NO :2的DNA序列的传染性华氏囊病病毒(IBDV) VP2基因的全序列或其片 段；具有SEQ ID N0:3的DNA序列的新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因(自第6321至第8319碱基 对)的全序列或其片段(亦即SEQ ID N0:3为新城鸡瘟病毒的整个基因组)；具有SEQ ID N0:4的DNA序列的传染性支气管炎病毒(IBV)S1基因的全序列或其片段；具有SEQ ID NO:5的DNA序列的传染性喉气管炎病毒(ILTV)的糖蛋白G基因的全序列或其片段；禽类脑脊 髓炎病毒(AEV)的VP1、VP0、或VP3基因的全序列或其片段(VP1基因具有SEQ ID NO :6的 DNA序列；VPO基因具有SEQ ID NO :7的DNA序列；且VP3基因具有SEQ ID NO :8的DNA序 列)；具有SEQ ID N0:9的DNA序列的禽类副流感病毒(APV)的副糖蛋白G基因的全序列或 其片段；具有SEQ ID NO :10的DNA序列的出血性肠炎病毒(HEV)的A型五角体基(penton base)基因的全序列或其片段；与具有SEQ ID NO :11的DNA序列的禽痘病毒(FPV)的鞘膜 抗原基因的全序列或其片段。 —个优选的DNA疫苗例子包含两个DNA构建物，每个含有一个能够表达来自马立 克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、或传染性支气管炎病 毒(IBV)的基因或其片段的DNA分子。 多重性DNA疫苗的另一优选例子含有3或3个以上的DNA构建物，每个含有一个 能够表达来自马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、或 传染性支气管炎病毒(IBV)的基因或其片段的DNA分子。 本发明也提供一种给禽卵接种的方法与一种制备该多重性DNA疫苗的方法。该给 禽卵接种的方法包括向禽蛋内注射上述多重性DNA疫苗。该制备该多重性DNA疫苗的方法 包括将一个DNA分子黏接(ligating)到质粒或病毒载体以形成DNA构建物；然后将该二个 或更多个该DNA构建物混合以形成多重性DNA疫苗。将DNA分子插入于载体内的步骤可以 用常规方法来达成，亦即，基因和适合的载体都用相同的限制酶予以酶切以藉此产生互补 的DNA末端，使用如T4DNA黏接酶(ligase)的酶黏接DNA分子。对于pcDNA3，优选的限制 酶为BamHl和EcoRl。 在另一具体实例中，提供了一种蛋内注射用的多价性DNA疫苗。该多价性DNA疫苗 包含一个DNA构建物，各构建物含有用一个载体联结的二个或二个以上的DNA分子。每个 DNA分子可表达出一种禽类病毒的抗原蛋白，该抗原蛋白能在禽类体内诱导出抗该禽类病 毒疾病的保护性免疫反应。该多价性DNA疫苗优选注射到禽蛋内。该多价性DNA疫苗的每一 个DNA分子为来自马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、 传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽类脑脊髓炎病毒(AEV)、禽类 白血病病毒(ALV)、禽痘病毒(FPV)、禽类副流感病毒(APV)、鸭肝炎病毒(DHV)、和出血性肠 炎病毒(HEV)的一个基因或其片段。
具体实施例方式
传统禽类疫苗包括经化学灭活的病毒疫苗或经修饰的活病毒疫苗。灭活疫苗需要 额外的免疫化处理，如此不仅制造起来昂贵且执行起来繁琐。再者，某些传染性病毒颗粒可 能在灭活程序中存活，并可能在施打到动物后引发疾病。 整体而言，经减毒的活病毒疫苗比经灭活疫苗较适当，因为其可诱发通常同时基 于体液和细胞反应的免疫反应。这种疫苗通常是以在组织培养中的毒性病毒株连续传代为 基础。然而，减毒程序会诱导病毒基因组的突变，产生有关毒性和免疫性质互相异质的一族 群病毒粒子。此外，众所周知，传统经减毒的活病毒疫苗可能回复毒性，而导致在所接种的 动物上爆发疾病并可能将病原散布到其它动物上。 因此，以重组DNA技术为基础的疫苗对产业界来说是具有其优点的。所得DNA疫苗只含有且只表达出所必需的和相关的免疫原物质，此免疫原物质能够诱发抗病原的保护性免疫反应，且不会显现出上述活疫苗或经灭活的疫苗的缺点。 为了制备多重性DNA疫苗及/或多价性重组DNA疫苗的目的，基因的DNA序列(也可以与"DNA分子"互换地使用)不需要含有编码该多肽链的DNA的全部长度。在大部分情况中，编码一个抗原决定部位区的基因片段应该就足够供免疫反应所用。抗原决定部位区的DNA序列可以通过将其它病毒株的对应部份予以定序且互相比较而找出。主要的抗原决定子(antigenic determinant)可能为显示出最大异质性(heterology)者。此外，这些抗原决定部位区也可能位于蛋白质的构象结构之内。 一个或更多个该编码抗原决定子的基因片段可以通过化学合成或重组DNA技术予以制备。如果需要，这些基因片段可以键联在一起或联结到其它DNA分子。 同时，病毒基因也不需要在DNA内。事实上，某些常见的禽类病毒疾病是由双链或单链RNA病毒所引起的。例如，马立克病病毒(MDV)为一种双链RNA病毒，而传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV)都是单链RNA病毒。不过，RNA病毒序列可以使用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术反转录到DNA内，接着以常用的重组DNA技术将之加到载体内。 此外，因为遗传密码的简并性，可能会有许多RNA和DNA序列编码着一个特定的氨基酸序列。因此，可表达出具有抗体结合特性的多肽链的所有RNA和DNA序列都为本发明所涵盖。 要构建重组DNA疫苗时，不论单价或多价，均可将病毒基因的DNA序列黏接到于自然界中不相关或联结的其它DNA分子。任意地，可将一个病毒基因的DNA序列黏接另一个DNA分子中，即载体，该载体含有其编码融合蛋白质序列例如13 -半乳糖苷酶的DNA，产生所谓的重组核酸分子或DNA构建物，其可用来转殖到适当的宿主。此种载体优选是衍生自，如质粒或存在于噬菌体、黏接质粒或病毒中的核酸序列。 可以用来克隆根据本发明的核酸序列的特定载体都是本领域所知的，且包括质粒或病毒载体。质粒的例子包括，但不限于，pBR322、 pcDNA3、 pVAXl、 pSectag、 pTracer、pDisplay、 pUC系统质粒(例如pUC7、 pUC8、 pUC18) 、 pGEM系统质粒、Bluescript质粒或有包括CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、和P-肌动蛋白启动子等的任何其它质粒。优选质粒为pcDNA3。病毒载体的例子包括，但不限于，噬菌体(例如，A和M13-衍生的噬菌体)、SV40、腺病毒、多瘤病毒(polyoma)、杆状病毒、疱疹病毒(HVT)或痘病毒(例如禽痘病毒)。 构建重组核酸分子所用的方法都是本领域所知悉的技术。例如，当基因和适合的克隆载体都用相同的限制酶酶切以产生互补的DNA末端后，核酸序列在一克隆载体中的插入可以很容易地通过如T4DNA连接酶的酶连接得到。 或者，通过消化单链DNA或使用恰当的DNA聚合酶来填充隐性末端来修饰限制酶切部位以产生钝端(blunt end)可能也是需要的。随后，可以使用如T4DNA黏接酶的酶进行钝端黏接。如果需要，可以通过将黏接臂黏接到DNA末端上来产生任何限制酶切部位。这类黏接臂可包括编码限制酶切部位序列的特定寡核苷酸序列。经限制酶酶切过的载体和核酸序列也可通过均聚物加尾(homopolymeric tailing)来进行修饰。 本发明提供两种DNA疫苗。第一种多重性DNA疫苗，其包含二个或二个以上的单价DNA疫苗，各含有一条DNA序列，该DNA序列编码着至少一种多肽链，该多肽链能提供保护作用以对抗一种禽类病毒疾病例如马立克病病毒(MDV)、传染性华氏囊病病毒(IBDV)、新城鸡瘟病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、禽痘病毒(FPV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ALV)、鸭肝炎病毒B基因和出血性肠炎病毒(HEV)，并插入到商业上可用的质粒中。 第二种为多价性重组DNA疫苗，其包含来自不同病毒的二种或二种以上的基因或基因片段。这些基因或基因片段通过一个有用的载体所携载，该载体可为质粒或病毒载体。该多价性重组DNA疫苗编码着二个或二个以上的抗原多肽链，该抗原多肽链可提供保护作用以对抗至少两种病毒疾病包括，但不限于，马立克病、传染性华氏囊病、新城鸡瘟病或传染性支气管炎之保护。该病毒基因或基因片段可被有效地连接到载体的读码区内以使其可在宿主体内表达出来。由该载体所携带的不同结构DNA序列可用终止序列和起始序列分隔使得该蛋白质可以分开表达，或成为一个单一读码区的一部分，因而可用本领域中已知的方法以融合蛋白质的形式产生。 优选的DNA序列包括，但不限于，具有SEQ ID NO :1的DNA序列的马立克病病毒(MDV)gB基因的全序列或其片段；具有SEQ ID NO :2的DNA序列的传染性华氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的全序列或其片段；具有SEQ ID NO :3中自第6321至8319碱基对的DNA序列的新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因的全序列或其片段；具有SEQ ID NO :4的DNA序列的传染性支气管炎病毒(IBV)Sl基因的全序列或其片段。 编码马立克病病毒的gB多肽链的DNA序列具有SEQ ID NO : 1的核酸序列。该DNA序列包含线型DNA的3650个碱基对。 编码传染性华氏囊病病毒的VP2多肽链的DNA序列具有SEQ ID NO :2的核酸序列。该DNA序列包含线型DNA分子的3004碱基对，可由传染性华氏囊病病毒的RNA模板反转录而来。 整个新城鸡瘟病毒基因组的DNA序列包含15186碱基对的DNA，其中(1)第56至1792碱基对编码NP多肽链，为一核壳体蛋白；(2)第1804-3244碱基对编码P多肽链，为一磷蛋白；(3)第3256-4487碱基对编码M多肽链，为一基质蛋白；(4)第4498-6279碱基对编码F多肽链，为一融合蛋白质；(5)第6321-8319碱基对编码HN多肽链，为血球凝集素神经胺酸酶；(6)第8370-15073碱基对编码L多肽链，为一大的聚合酶蛋白质。新城鸡瘟病毒基因组具有SEQ ID NO :3的DNA序列。 SI多肽链的DNA序列含有如SEQ ID NO :4所示1611个碱基对线型DNA序列，是从传染性支气管炎病毒的RNA模板反转录而得。 下面的实验设计为示范说明，而不用来限制本发明的范围。其中可做出合理的变化，例如合理技术操作所发生者，不违离本发明的范围。
I.材料与方法
(A)病毒与疫苗 禽类传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性华氏囊病(IBD)和新城鸡瘟病(ND)疫苗都购自Intervet Inc.。 (B)病毒RNA分离与反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 将200微升回收的减毒疫苗(Intervet Inc.)溶解于冰冷的GTC缓冲液(4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH 7. 0，0. 5%Sarkosyl，0. 1M氢硫基乙醇)和醋酸钠(pH4)中。加入等体积的苯酚-氯仿(l : 1)震荡后静置于冰上15分钟。离心后收集水层且使用等体积的异丙醇沉淀出RNA。在4t:下以12， 000rpm离心20分钟将沉淀的RNA分离出，然后悬浮在经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水中且贮存在-7(TC。
(C)誠棚 反转录聚合酶连锁反应所用的寡核苷酸引物(primer)都是购自Promega，且都是
分别针对禽类传染性支气管炎病毒(Beaudette CK株)、新城鸡瘟病毒(Lasota株)和禽类
传染性华氏囊病病毒的基因组来设计。PCR所用各引物的序列为 IBS1F' 5' CGGGATCCGCCGCCGCCATGTTGGTAACACCTCTT 3' ; (SEQ ID NO :12) IBS1R， 5， CGGAATTCTTAACGTCTAAAACGACGTGT 3， ； (SEQ ID NO :13)NDF F' 5' CGGGATCCGCCGCCGCCATGGGCTCCAGACCTTCTACC 3' ; (SEQ ID NO :14)NDF R' 5' CCGCTCGAGTTACATTTTTGTAGTGGCTCTCATT 3' ; (SEQ ID NO :15)NDHN F' 5' CGGGATCCGCCGCCGCCATGGACCGCGCCGTTAGGCAAG 3' ; (SEQ ID NO :16)NDHN R， 5' GCTCTAGATTACTCAACTAGCCAGACCTG 3' ; (SEQ ID NO :17) IBDVP2F， 5' CGGGATCCGCCGCCGCCATGACAAACCTGCAAGAT 3' ; (SEQ ID NO :18) IBDVP2R' 5' CGGAATTCTTACCTTATGGCCCGGATTAT 3' ; (SEQ ID NO :19) (D)反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR) 传染性支气管炎病毒、新城鸡瘟病和传染性华氏囊病病毒的RNA反转录是在42°C于2. 5倍Taq缓冲液(200mM NaCl，15mM Tris-HCl， pH 7. 4， 15mM MgCl2， 15mM P -氢硫基乙醇，和各0. 25mM的dATP、 dCTP、 dGTP，和dTTP)中进行30分钟。除了 Taq缓冲液之外，反应混合物(40微升)也含有病毒RNA，2.4U的禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV)反转录酶(Promega) ， 16U的RNasin (Promega)，和0. Olnmol的反向引物(IBDVP2R、NDF F、NDHN F或IBS1R)。反应混合物的最后体积为40微升。反转录之后，在反转录混合物中加入下列药剂0. 02nmol的各核苷三磷酸(dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP) ，0. Olnmol的前向引物(IBDVP2F、 NDFR、 NDHN R或IBS1F)和1. 5U的Taq DNA聚合酶(Strategene)。然后加水到终体积100微升。反应在ThermalCycler(PerkinElmer-Cetus)内进行32个循环。每一PCR循环包括在94。C下变性(denaturat ion) 1分钟，在57。C下退火(annealing) 1分钟，与在72。C下延长(elongation) 2分钟。
(E)DNA构建物的制备 使用分别来源于传染性华氏囊病毒疫苗、传染性支气管炎病毒疫苗和新城鸡瘟病毒疫苗的VP2、Sl、NDF和NDHN等基因放置于市售质粒pcDNA3(Invitrogen，U. S. A.)的下游处，构成质粒pCMV-VP2、 pCMV-Sl 、 pCMV-NDF和pCMV-NDHN。使用限制酶BamHl 、 EcoRl 、 Xbal和XhoI将所有的基因插入到pcDNA3载体之内(引物序列中带下划线的字母)。在pcDNA3
载体内的所有基因的序列都经过两方向测序予以验证。
(F) DNA和DNA传递的制备 经亲和层析法(Qiagen. Inc.)纯化的质粒DNA的定量用波长为260和280nm的分光光度计测量。将各100微克分量的DNA悬浮在100微升PBS中(0. 14M氯化钠，lOmM磷酸钠，pH 7.4)。对于DNA传递，使用含有20号l又l/2时针头的lcc注射筒。对于蛋内注射组，是从每一个蛋的大头端用针头穿透气室将0. 1毫升的DNA疫苗(100微克)注射到胚胎内(取自鸡窝盘中18天的已受精且正发育的卵)。然后将该卵转移到孵化场，且放在该处直到在约21天时孵化为止。对于IM(肌肉内)组，所有疫苗(1/5剂量的活疫苗)注射到
孵化后io天鸡的胸肉内。 II.实验设计 将无特定病原(SPF)受精蛋(n = 60)随机分成12组。所有组的所有蛋(一组5颗蛋)都分别给予100微升的试剂。A组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN混合物，B组的每一颗蛋注射100微克pCMV-Sl， C组的每一颗蛋注射100微克pCMV-VP2， D组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-Sl (ND+IB) ， E组的每 一 颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-VP2 (ND+IBD) ， F组的每 一 颗蛋注射100微克pCMV-VP2+100微克pCMV-VP2混合物(IB+IBD) ， G组的每一颗蛋注射100微克pCMV-NDF+100微克pCMV-NDHN+100微克pCMV-Sl+100微克pCMV-VP2 (ND+IB+IBD)，作为阳性对照组的H组的每一颗蛋注射1剂量的市售蛋内IBD疫苗(Embrex， Inc) ， I、 J、 K和L组的每一颗蛋注射100微升的PBS。在此实验中的所有鸡都是在孵化后10天鸡的胸肉内注射100微升的疫苗(1/5剂量的活疫苗)。A和I组中的鸡注射NDV疫苗，B和J组注射IBV疫苗，C和K组注射IBDV疫苗，D组注射NDV+IB疫苗混合物，E组注射NDV+IBD疫苗混合物，F组注射IB+IBD疫苗混合物，且G和L组注射NDV、 IB和IBD疫苗混合物。
III.血清检测 在孵化后10天(同时注射低剂量活疫苗)、17天、24天和31天收集所有血清样品。抗体效价的检测使用购自IDEXX Laboratories, Inc.的IB、 IBD和NDV抗体检测试剂盒用ELISA检测。所有样品都进行重复检测。在检定之前使用样品稀释剂将检验样品稀释500倍(l : 500)。检测程序按照试剂盒手册进行。为了使检测正确，测量且记录在波长650nm的吸光值，A(650)。未知样中的相对抗体含量通过计算样品对阳性样(S/P)比例来确定。终点效价使用公式计算:Log10效价=1. 09(Log10S/P)+3. 36。
结果 如表1中所示，结果证实，对于抗-IBD抗体的检测，IBDV重组抗原VP2可以被表达并能起到原发剌激作用。在一低剂量疫苗强化后效价迅速增加。在孵化17天之后(亦即，M注射后7天)，C、E、F和G等组的效价明显地高于K和L组的效价。最重要的，IBDV抗原的表达不会受其它单价DNA疫苗(新城鸡瘟病毒和传染性支气管炎病毒)所干扰。对于IB和NDV DNA疫苗也有相同的结果。孵化后17天，B、 D、 F和G等组的效价都高于J和L组的效价(表2)且孵化后17天，A、D、E和G等组的效价都高于I和L组的效价(表3)。唯一未预料到的结果是抗-NDV效价不能用三价DNA疫苗高度诱导出来(表3，G组)，不过抗-IBD和抗-IB则都可以(表1和2， G组)。
表1用IDEXX IBD抗体检测试剂盒检测的血清样品[OO79](抗体效价对应于平均效价± SD)_免疫化和样品采集时间表(天)_
动物组另U_10天PH4 17天PH 24天PH 31天PHC(IBD)-—**4535 ±126716623 ±310521254±3852
E(IBD+ND) —1685±65517339±218519041 ±2967
F(IBD+IB) —8252 ±220510057 ±129517561 ±2006
G(IBD+IB+ND) —9111±170113127±176316694±2134
H(IBD阳性)6635 ±85113025±213118015±159218853±2614
K(PBS/IBD) ——1853 ±30217002 ±2965
L(PBS/IBD+IB+ND) ———6923 ±116818063 ±2531
补H:孵化后
**-一 平均效价低于396 (被IDEXX试剂盒作为阴性) 表2用IDEXX IB抗体检测试剂盒检测的血清样品 (抗体效价对应于平均效价±SD)
HZIZI" 免疫化和样品采集时间表(天)
动物组别
IO天PIP 17天PH 24天PH 31天PH
B(IB)—**441 ±1172426 ±2643214±877
D(IB+ND)— 586 ±182805 ±2211988±501
F(IB+IBD)—- 509 ±89685 ±1861192±237
G(IBD+IB+ND)— 499±81688 ±782551±531
J(PBS/IB)— —485 ±761662±441
L(PBS/IBD+IB+ND)— —819±2021332±488
补H:孵化后
**-一 平均效价低于396 (被IDEXX试剂盒作为阴性)
表3用IDEXX ND抗体检测试剂盒检测的血清样品t
(抗体效价系对应于平均效价±SD)
免疫化和样品采集时间表(天)动物组别.10天PH^ 17天PH24天ra31天PH
A(ND)—** 466±1012394±4568103±2198
D(ND + IB)— 706 ±1401778±3786811 ±2206
E(ND+IBD;)— 517±1043021 ±4115991 ±1695
G(IBD+IB+ND)— ——_783 ±201
1(PBS/ND)— —1853 ±3243912±304
L(PBS/IBD+IB+ND)— —4027 ±6625術±1996
补H:孵化后
**-一 平均效价低于396 (被IDEXX试剂盒作为阴性)
序列表
〈110〉郭村勇
〈120〉多重性和多价性蛋内DNA疫苗 〈130>39734-186920
〈160>19〈170>PatentIn version3. 2〈210>1〈211>3650〈212>DNA〈213〉马立克病病毒〈400>1tcgagctcgccggggatgtttagtcacgatagacatcggt tcgcccagcc60gcattatettttagtgttga皿atgtegggctgcttcctc acttaaaggagga皿tggct120cgattcatgtttcatagcagteg^皿acagattggaccg tcagteagttt卿gggttt180tatgactttataatgtaactgcggcccatc gcatggcttg240tttttgcaacagctttettttcttctgtat ttaaatgtggcgaattgcac300atctgtcgtgccgacagtttgcagatc^c3gc^tggag actetgtetg360cgaatatccacttateatga ttctggggtcag^tc^gc4203CttC3g朋3gactgcaattattgatacag atgttttttcgttgctttat480tctattttgcagtetetggcccccgttacggc3gatragg tgcgagtegaacagattacc540朋C3gCC3Cgcccccatctgacccgtccaatattcttgtg tccctgcattttatctcaca600caatttatgaacagcatcatteagatcatctcactetgca ctattttaggCgg皿ttgC3660tttttttccttetagttattctatatggtacgaactcatc tccgagtacc720agttgtttcgagcgtccagttgtctgagga agagtctecgttttetcttt780gtcccccacc解tgggttcaaccgtgatccgtcteg^cc gccgcg3皿3tgtcccgaac840cteg朋朋gcC3CCg3gtggggtg啷g3aaatatcagtc■te^gtgacgctttattata^^tetcat tc3gacgacg3C3tgg3Cgg960gg3cgacateteg3cagatcacteatcgat3tecagateggacgcccgtttccattgaag10203g3tC3Cgg3tcteatcgacggC皿3gg皿gatgctcatcte皿gc皿gateccttegaa1080ac朋tgtetetgttg皿gcgtttg織gggatgcggg卿cttcteaaac1140C皿C3CgCCCg皿tctegggcatggcacacgacteatgagacgteteccg1200tgtggggatctetcg皿cgggaacctccgtcaattgtetegtegagga皿1260tggatgcccgctctgtgtttccgtettcatattttgcaatggcc皿tggcgacatcgcg31320acatetctccattttetggtctetccccaccagaggctgccgcagaaccc3tgggatetc1380ccc3ggateactegategctatttttcaatgg3tttgg3C皿gcgtcg皿1440皿gc皿gccttccagtcaagcgteactttctcatcacatcacacttcacagttgggtggg1500actgggctcccgtgtetgttc皿tgacteagtgg腿gaggtgactga皿1560tgttgcgtgc皿cagtteatgggagatec3gatttetggcccgtgaactttcggcaacgt1620ttetcagteatecgactgagtttgatccaaatcgcatcatatteggac皿tgtetteaac1680gcg郷c卿3gC3gC皿tCg3gcagatettteggac皿33teteatgacagtcacgtca1740郷ttgg織tgtecaatetttcttggctctcgggggatttettgtegcatetcagcctg1800ttctetccaaatccctggctcatetgteccgatgagagac皿C3gg3CCg1860atgagatgctcgacctggte皿c皿teagcatgcaatttegctecctcat1920
13
tgtcacgattgcggcg卿tattcga^tgttegacgac31980ccacagctette朋tcgacatcgtctgttcaattcgccatgctccaatttctttetgatc2040ccatetteatgatetgtttegteggattgccacagcttggtgcgaattgc21003g朋tegag3acttgttttetggcacg皿gggate皿gatteatcctegcgctecagcg32160gtgcaacattElgg朋gg卿gtggctg咖卿tgttgggggatgtcgctgctgtetcga2220gctgcactgctetegatgcggaatccgtcactttgcaaaattctetgcgagttetcacat2280ccacteatecatgttetegccgaccattggttctettttcatetggag皿皿cc皿gg皿23403C3tecagggacaactcggtg皿皿c皿cgagttgcttcc皿cgctegaggctgt卿gc2400catgctcggcteatcatcgtagatettttctgtttggatccggttetgct2460acteteattttgtteagatggt卿cgctgccgatetecagattgctegcacatttgtcg2520agctteatctaaccctgctega卿tcgggaaattttgcctttetccgtttecac皿皿g2580El卿gttgCgtgatgttggtgtettggattatgcag^gtagctcgccgc2640atg朋ctteaattttetgacteateg皿gtggatec皿3ttecgcgttte2700tgaacggtttggccg朋ttgttteacggtetgggtcaggtagggc皿gctateggc皿3g2760ttgtegteggggctgccggtgcaatcgtetcteccatetctggtgtctctgctttcatgt2820caatccctttggggctttcggcaatcggttteatcattet3gC3gg3CtCgtggctgcat2880ttttagcatatcgttetgtea朋gc朋tcc皿tga皿gccctttatccte2940tg3C朋C3g3agtgctteaggC3C3ggC皿cgcgtgagttgratggcgag3000atttgg朋cgaacatctatt3gctegag皿3060atatggcgttagtctccgcgg皿g皿cgcc3CtgCgg3g33卿ggCg3g3120gcacteccgccgttctetcggaccacctggagteacccte3180朋tetgateagttacctactacatattcagtgatgctgtgt皿gtgggra3240ctattetetttg朋ctg朋tgagcatgatetggtttectcatttattgcg3300agatete朋gcatattcaatacgatetettgcg皿cgtgaategctccct3360gtattettgatgcgccatcatttgatteat3朋tecatcgacgccggcatcactggtgcg3420gtgtetaccagctacggcgctegcattcatggtetcccgtgattgctcgatgctttcctt3480ctgaattccgtcggaacgctcctgagagatggtcgcagttattggtecatttcgaccagc3540ctccggatctg朋3CtggC3C3gg皿tgC3ccgtggaattggt卿賜tttttccttccg3600tgg朋ggCEltagggcgttcgactcccatgggCC3tg皿3Ctgtgggatgt3650〈210>2〈211>3004〈212>DNA〈213〉传染性华氏囊病病毒(IBDV)〈400>2tgatgccaacaaccggaccg gcgtccattcCgg3Cg3C3Ccctggag皿gcacactctca60ggtcagagacctcgacctecaatttgactgtggggg織c郷gtc郷gcteattgtct120ttttccctggattccctggctcaattgtgggtgctcactecacactgcag3gC皿tggg3180actecaagttcgatcagatg ctcctgactgcccagaacctaccggccagttecaactect240gcaggctegtgagtcggagtctcacagtgaggtc皿gcacacttcctggtggcgtttetg300
cacte朋cgggccgtgaccttcc皿gg皿gcctgagtg皿360ttegctecaatgggttgatgtctgcaacagggg皿cgtcc420tegtegggg3gtcctcagcttecccacatcatetgatcttgggtetgtga■ggcttggtgaccccattcccgc皿tegggcttgacccaaa皿tggtegcc540gcagtgacaggcccagagtcctgcagccgatgatteccaattctcatcac600agteccaacc郷tggggtetgttctcagccaacattgatgccatcacaa660gcctcagcgttggggg卿gctcgtgtttcg皿c皿gcgtccacggccttgtectgggcg720ccaccatctecctcateggctttgatgggac皿cggteatcaccagggctgtggccgc皿780acactgggctgacgaccggc3CCg3C皿CCttetgccattcaatcttgtg840acgagateacccagccaatcacatccatca皿ctggagatagtgacctcc3腿gtggtg■gtcaggcaggggatc卿tgttetggtcggcctegcagtgacgatccatg960gtggc朋ctetccaggggccctccgtcccgtcacgctegtggcctecg皿3g3gtggC朋1020caggatccgtcgttecggtcgctggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcctgaac1080tegca朋g朋cctggttecag皿tecggccgatttgaccc3gg3gCC3tga a c t a c a c aa1140aattgatactgagtg卿gggaccgtcttggcatc^gaccgtctggccaac朋gggagt1200acactgactttcgtgaatectggccgacctcaactctcccctg朋gattg1260C3gg3gC3ttcggcttcaaagacateatccgggccateagg郷ategctgtgccggtgg1320tctccacattgttcccacctgccgctcccctegcccatgc皿ttgggg皿ggtgt卿ct1380acctgctgggcgatgaggcacaggctgcttcagg朋ctgctcgagccgcgtcagg朋朋g1440c朋gagctgcctcaggccgcateaggcagctgactctcgccgccgac皿ggggtecgagg1500tegtcgcg朋tctettccaggtgccccagaatcccgtegtCg3Cggg3ttcttgcttcac1560ctggggtectccgcggtgcacacaacctcgactgcgtgtt皿g卿gggtgccacgctet1620tccctgtggttattecgacagtgga卿cgccatgacacc朋cagc朋朋1680tgtttgctgtcattg朋ggcgtgcg卿agacctcc皿cctccatctcaaagaggatcct1740tcatecgaactctctctggacacagagtctatggatetgctcc卿tggggtecttccac1800tgg卿ctgggagagactecaccgttgtccc皿tegatgatgtctgggacgacagcatte1860tgctgtccaaagatcccatecctcctattgtggg朋3C3gtgg朋atctegccategctt1920acatggatgtgtttcgaccctccatgtggctetgacgggagccctcaatg1980cttgtggcgagattgag^agteagcttteg皿gracc皿gctcgccactgcacaccgac2040ttggcctteagttggctggtcccggagcattcgatgte皿caccgggccc朋ctgggc朋2100cgttcatcaaacgtttccctC3C皿tCC3Cgcgactgggacaggctcccctecctcaacc2160teccateccttccacccaatgcaggacgccagteccaccttgccatggctgcatcagagt2220tC3朋g3g3Cccccgaactcg卿gtgccgtcagagc^tgg皿gC3gC3gccaacgtgg2280acccactattccaatctgcactcagtgtgttcatgtggctgg皿gag皿tgggattgtga2340ctgacatggccaacttcgcactcagcgacccgaacgcccatcggatgcg3aattttcttg2400C3朋CgC3CC3C皿gC3ggCagc皿gtcgca皿gggcc皿gtecgggacagcaggctecg2460g3gtgg郷Ctcggggcccc3C3CC3g3gg皿gC3C3g3gacacggatct2520ggagaccatgggcatctectttgcaacacc卿atgggtegcactcaatg2580ggcaccgagggccaagccccggccagctea3gtectggcag皿C3C3Cg3ga朋teccgg2640
3CCC3朋Cg3ggactetcte gactecgtgc 3tgc3gag皿gagccggttg gcatcag^g2700皿gggC3gCt 3CgtCg3tct 3CggggCtCC 3gg3C3ggC3 gagccacccc2760aagctttcat3g3Cg皿gtt gcca皿gtct 3tg3皿tC皿CC3tgg3Cgt ggCCC皿3CC2820g皿3gatctg ctcttgactg cgatgg3gat g皿gcatcgc皿tcccaggc2880gggctcteccaaagcccaag ccaaaaccca atgctccaac acagagaccc cctggtcggc2940tgggccgctggatcaggacc gtctctgatg aggaccttga gtgaggctcc tggaagtctc3000ccga3004〈210>3〈211>15186〈212>DNA〈213〉新城疫病毒(NDV)〈400>3g33tccgtg3 gttecgatea ^ggcg^gggtcgcacggg60t卿3ggtgtg33tctCg3g tgCg3gCCCg ^gC3C^3Ctcgaga^gccttctgccaa120catgtcttccgtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcggctcagactcgccccaatgg1803gCtC3tgg3ggggg3g333皿gggagtec ctte皿agtegacgtcccggtattcactct240t朋C3gtg3tgacccag^g 3tegatggag ctttgtggtettctgcctccggattgctgt300tegcg朋gatgccaacaaac cactcaggca aggtgctctcatatctcttttatgctccca360ctcacaggta3tg3gg^CC 3tgttgCC3t tgC3ggg^3ccacattggc420cgtgcttgagattgatggct ttgccaacgg cacgccccagggagtggagt480gtctg3卿g3gagc3C3g3 gatttgcgat gategcagg3tctctccctcgggratgcag540c朋cgg朋ccccgttcgtca C3gCCggggC 3g^g3tg3tgC3CC3g^gacatcaccga600taccctggagaggatcctct ctatccaggc tcaagtatggc^皿gccat660gactgcgtatg3g3CtgC3g 3tg3gtCgg3 ^c^ggcga720aggcagggtccaaaagaaat acatcctcta ccccgtetgc3gg3gC3C^tccaactcac780g3tC3g3C3gtctcttgcag tccgcatctt tttggttagcgagctc^gagaggccgc皿840cacggcaggtggtacctcta cttattetaa cctggtaggggacgtegactcatacatcag■gaataccgggcttactgcat tcttcttgac actcaagtacgg^tc^caccaagacatc960agcccttgcacttegtagcc tctcaggcga catccagaag atgaagcagc tcatgcgttt1020gtetcggatg朋3ggagate atgcgccgte catg3C3tte cttggtgate gtgaccagat1080gagctttgcgcctgccgagt atgcacaact ttectccttt gccatgggte tggcatcagt1140cctegate朋ggtectggga aateccaatt tgccagggac tttetgagca catcattctg1200g卿CttggElgtegagtecg ctcaggctc3 ggg皿gtegc att朋cgagg atetggctgc1260cgagctaaagcteaccccag cagcaatgaa gggcctggca gctgctgccc aacgggtctc1320cgacgataccagcagcatat acatgcctec tcaacaagtc ggagtcctca ctgggctteg1380cgagggggggtccc朋gctc tec皿ggcgg atcg朋tega tcgc朋gggc朋ccag朋gc1440CggggEltggggagaccc朋t tcctggatct gatgagagcg gtegca朋te gratgaggg31500ggcgccaaactctgcacagg gcactcccca atcggggcct cccccaactc ctgggccatc1560ccaagataacg3caccgact gggggtettg atggac朋皿cccagcctgc ttccac朋朋1620
acatcccaatgccctcacccgtegtcgacccctcgatttgcggctctetetgaccacacc1680catccccctctttcctccctccccctgctgtecaactccgcacgcccteg17403tecrac3ggcac朋tgcggctcacteaca3gCCg郷g31800賜tecgggtega卿gggatC3gggC朋gtctcccgagtctctgctctct1860cctctacctgategacc3ggccacctttec3tCg3Cg3gC1920tatttgagac皿gtgg皿ctgtcattgaca3gCCC3gggt朋3CC3gC3g1980卿ctgttgg皿gg3gtgC3atcccacaaggc朋gacc朋ggtgctgagcgragratggg20403g朋gC3tggg3gC3tCC3gccaccggccagtc皿gac朋ccccgatcga2100CCCg3gC3朋cgaccccgcatgacagcccgccggccacat2160ccgccgaccagCCCCCC3CCC3ggCC3C3g3Cg皿gCCgtCg3C3C3C3gttcaggaccg2220gagc朋gc朋ctctctgctgttgatgcttg3C朋gCtC3gtccaatgcta2280朋朋gggccc3tggtCg賜CCCCC朋g3gggg朋tC3CC3acgtccgactC皿C3gC3gg2340ggagtc朋ccC3gtCgCgg3朋C3gtC3gg皿3g3CCgC3g朋cc朋gtcaaggccgccc2400Ctgg朋3CC3gggC3C3g3Cgtg皿C3C3gcatatcatgg3C皿tggg3gg3gtC3C皿C2460tatcagctggtgcaacccctcatgctctccgatc朋ggragagcc朋gacaatacccttg2520tatctgcggatcatgtccagccacctgtegactttgtgcatctatgatgg2580aggcgatetc3C3g3gagteactatcagctagatcttgtc2640catcctccatccctatgatgcggtccga朋tccaacagctgttgcagtca2700tgg皿gcc朋cttggg皿tgtggatcccggttgtgccaacatttcatctc2760tgagtgatctacgggragttgcccgatctcacccggttttagtttcaggccctggagacc2820cctctccctagg郷cg咖tggcactteateaactttcgcaaccagtgc2880cacatccatctgaattgatt朋3CCCgCC3ctgcatgcgggcctgatetegg賜tgg咖2940ccgtgcattgatcatgtcacgcccaatgcacccgagttcttcagccaagc3000tccteagcaagccgggtcgatcgagg朋ataagcgccttg3060ctcteaatggctaattactectgccacacgtegcgggtccctgtccactcggcatcacac3120gg朋tctgcaccgagttcccccccgcagacccaaggtccaactctccaagcggcaatcct3180ctctcgcttcctcagccccactgaatggtcgcgteaccgtgctacattta32403gatteag朋皿皿tecgggteg皿ttggagtgccccaattgtgcc皿gatggactcatc3300teggac朋ttgggctgtectttgattctgcccattcttctagcaacctgttagcatttcc3360gatcgtcctaC朋ggC3C3gg卿tggg朋g皿gca朋tcgccccgcaat3teggatcc33420gcgccttgacttgtggactgategteagg3ggactcagtettcatcaccacctatggatt3480catctttcaagttggg皿tg朋g皿gccactgtcggcatgatcgatgate朋ccc皿gcg3540cgagttectttccgctgcgatgctctgcctagg皿gcgtcccaaataccggagaccttet3600tg賜ctggraagggcctgtctcactatgatagtcacatgc皿g朋gagtg3660tg卿g朋tggttttctcagtegtgc郷caccccaagtgctgcaaagctgtagggttgt3720tectcatcagtg朋tgcagtC皿gC3Cgtg3朋gCgCC3gag朋gattcc3780cggg賜tggaaccctegaatctttgtctccttgactgtggteccg朋g朋3840ggatgtctec皿g3tCCC3gctgcagtattgaaggtttctggctcgagtctgtacaatct3900tgcgctcaatgtcactatteatgtgg郷t3g3CCCg3ggagtcctttggttaaatcttt3960
gtcteagtctgacagcggatactatgcteacctcttcttgcatettggacttetgaccac4020cgt卿tegg皿gggga卿朋gtgacatttgac朋gctgg朋朋g皿皿teaggagcct4080tgatctetctgtcgggctcagtgatgtgctcgggccttccgtgttggt皿朋gc朋gagg4140tgcacggactaagcttttggcacctttcttctctegcagtgggacagcctgctatcccat4200agca朋tgcttctcctcaggtggcc皿gatactctggagtcaaaccgcgtgcctgcggag4260cgtteaaatcattetccaagcaggtacccaacgcgctgtcgcagtgaccgccgaccacga4320ggttecctctact朋gctggcacccttgcccttttaagaa4380at朋gctgcgtctctgagattgcgctccgcccactracccagatcatcat4440actaatctgtcttgattetttacagttagtttecctgtctatc朋gtteg4500ggt卿卿ttctggatcccggttggcgccctccaggtgca卿tgggctccagaccttc4560tecc朋g皿cccagcacctetgatgctgactetccgggttgcgctggtectgagttgcat4620ctgtccggcaaactccattgatggcaggcctcttgcagctgc郷朋ttgtggtt織gg46803g3C朋3gCCgtcaacatatacacctcatcCC3g3C3gg3tcaatcatagtteagctcct4740cccgaatctgccc朋ggatetgcg朋agcccccttggatgcatec皿c3g■0gacattgaccactttgctcaccccccttggtgactctatccgteggatec朋gagtctgt4860gactecatctgg郷ggggag織ggggcgcctteteggcgccattattggcggtgtggc4920tcttggggttgcaactgccg3gCggCCgC3gctctgatac4980aaatgctgccaacatcctccgactte朋gagagcattgccgc皿cc皿tg5040tgaggtcactgacggattetcgcaactagcagtggragttggga卿tgcagcagtttgt5100teatgacc朋C3gCtC3gg3attagactgcC3C3gC朋gt5160tggtgt卿gctcaacctgtaccteaccgaattgactacagtattcggac5220ttcacctgcttgactattcaggcactttecaatctegctggtgg朋atet5280ggattacttattgactaagtteggtgteggctcagctcatteatcggteg5340cggctteatcaccggtaaccctettctatacgactcacagactcaactcttgggteteca5400ggtaactctaccttcagtcggg朋ccte朋teatetgcgtgccacctecttggaaacctt5460atccgteagc3C皿CC3ggggatttgcctcggcacttgtcccc朋agtgg5520cggttctgtgateg皿g朋cttgacacctcatectgtatag朋actgact5580ttgtec朋gaategt朋cgttccctatgtcccctggtatttettcctgcttgagcggc朋5640tacgtcggcctgtetgtectC3朋g3CCg3aggcgcacttactecaccatacatgactet5700gtcatcgccaactgc^gatgac^catgtagatgtgteaaccccccggg5760tatcatetcggag皿gccgtgtctcteatacatgcaatgt5820tttatccttaggcgggat皿cttteaggctragtgggg朋ttcgatgtaacttatcagaa5880gaatetctcaatec^gattctcaagtaat皿teac3ggcaatcttgatetctcaactga5940gcttggg皿tgtcaacaacttgctttgaat皿gtt卿gg6000朋朋ctegactcaaactgactegcacatctgctctcattecctatatcgt6060tttgactatcatatctcttgtttttggtetacttegcctgattctegcatgctacctaat6120gtec朋gc朋皿ggcgc朋cattatggcttggg朋teatectctegatca6180gatgagagccgatgagg皿cgaaggtttcc6240tttgtgtgaaagttctggtegtctgtcagttcagagagtt皿g朋朋朋ctaccggttgt6300
aggacgatet3cgggteg朋Cggt朋g3g3ggccgcccctc皿ttgcgag6360ccaggcttcacaacctccgttctaccgcttC3CCg3C皿Cagtcctcaatcatggaccgc6420gccgttegccaagttgcgtt3gag朋tgatg咖g卿ggc aaaaaa t a catggcgcttg6480atettccggattgcaatcttattctteacagtegtgaccttggctetetctgtagcctcc6540cttttatatagratgggggctagcacacctagcgatcttgteggcateccgacteggatt6600tcragggcagtecatcteracttggttccaatc朋gatgt6660atetet朋gcaagtggcccttgagtctccgttggcattgtte皿tectgagaccacaatt6720atg皿cgc朋teacatctctctcttatcagatteatggagctgca朋c皿ragtgggtgg6780ggggcacctetccatgacccagattetetegggggg咖ggca朋g皿ctcattgtegat6840gatgctegtgatgtcacatcattctatccctctgcatttcgaattttatc6900ccggcgcctactacaggatcaggttgcactcgaataccctcatttgacatgagtgctacc6960cattectgcttgtaatettgtctggatgcagagatcactcacattcatet7020cagtetttegcacttggtgtgctccggacatctgcaacaggg郷gtettcttttctact7080ctgcgttccatcaacctggaCg3C3CCC朋皿tcgg朋gtcttgcagtgtgagtgc朋ct7140cccctgggttgtgatetgctgtgctcga朋gtC3Cgg3g3C3g3gg皿g3agatteteac7200tcagctgtccctacgcggatggt織tggg郷ttegggttcgacggccagteccacg朋7260朋ggacctegatgtcacaacattattcggggactgggtggcc皿cteccc郷agteggg7320ggtggatcttttattgacagccgcgtetggttctcagtctacgg郷gtt7380tcacccagtgacactgtecagg朋ggg咖tetgtgatetac皿gcgateC朋tg3C3C37440tgcccagatgagc朋gacteccagattcgaatggcc朋gtcttcgtataagcctggacgg7500tttggtggga皿cgcatec3gcaggctatcttetctetca解gtgtc朋catcctteggc7560g皿gacccggtectgactgtaccgccc皿cacagtcacactcatgggggccgaaggcaga7620attctcacagtegggacatctcatttcttgtetc朋cgagggtcatcatecttctctccc7680gcgttattetatcctetgac3gtC3gC皿Cctcttcatagtccttataca7740ttcaatgccttcactcggccaggtegtetcccttgccaggcttcagcaagatgccccaac7800tcgtgtgttactggagtctetec3gatcc3tetccccteatcttctatag7860ttgcg郷ggtettcgggacaatgcttgatggtgtec皿gc朋gactteaccctgcgtct7920gcagtattcgatagcacatcccgcagtcgcattactcgagtgagttc朋gC3gtecca朋7980gc3gcatec3ttgttttaaagtggtra卿cteat朋gacctattgtctc8040agcattgctgtactctcttcggag朋ttcagaatcgtcccgttactegtt8100gagatcctca皿gatgacggggtt卿g朋gccaggtctggctegttgag8160tgtatcacctatcttctgcgtcaaaccgaa8220tgccggcgcgtgctcgaattccatgttgccagttgaccac皿tC3gCC3gtgctcatgcg8280gccttgtcattaatctcttg皿tgt朋gtggcaatgagat8340acagctcatgcgggteggacatggcgagctccggtcctga8400朋gggc卿gcatcagattetccteccagagccacacctgtcttcaccattggtc朋gca8460caaactectctettactggagctaccgcttcctgatgaatgtgacttcga8520ccacctcattctcagccgactcggcctctcctgatactga8580gag皿tgatea朋ctcgg皿gggcagteraccaaactcttCC3g朋t朋C8640
cggagtgctccaccccaggtgttteg朋caactggctaatattgaggtcccagattcaac8700cgga卿ttgccaaattcac3tggag朋ct8760gttcac朋ggctgtgtacgcatetegag朋ga朋ctgctggggtcatcttggtcteac朋8820tgtcccccggtc卿gg賜ttcagcagcattcgtecggatccggcattctggtttcactc88803C3gCC皿gtttgcatggctc c at atggcatctgat8940ggtggcagct皿gac朋ggtctgcggccaaC3朋ttggtgatgcteacccate郷tegg■0ccaagtctttgtcactcctgaacttgtcgttgtgacgcatacaagttcac9060atgtcttacccagg皿cttgtattgatgtatgcagatetgg卿tetggt9120tcaaccacggcggtgcatctcag皿gcttettgatgacat9180tttgcggttaatagacgctctggc朋朋gacttgggteatcaagtctecgatgttgtatc9240acteatggagggatttgcat3Cgg賜Ctgtccagctectcgagccgtcaggtecatttgc9300aggagatttcttcgcattca3CCtgC3gg3gctte皿gacattcteattggcctcctccc9360c皿tgatetegcag皿tccgtgactcatgcaatcgctactgtattctctggttteg朋ca9420gctg卿tgttgtgtctgttgcgtctgtggggtcacccactgcttgagtc9480ccgtettgcagC3朋ggC3gtC3gg3gCC3皿tgtgcgcaccg朋朋tggtagactttga9540tatgatccttcaggtectgtctttcttcaaggg皿c朋tcatc朋cgggt9600gtgtggccgcgagtca朋gtggatec朋tetetggg皿ggtcattgggca9660actacatgcaagatttcacacgatetcatgttg賜卿gt9720atctgcacttg朋tttgagccatgteteg3atetgaccctgtcaccaacctgagcatgtt9780ccte朋agac皿ggc朋tcgC3C3CCCC朋cgat朋ttggcttgcctcgttteggcgg朋9840ccttctctccg朋g3CC3g3acttcgacteatcgcctctt9900gategagtttttegagtc皿atgattttgag卿tgg朋tatctgacgac9960ccttgagtaccttegagatg3C朋tgtggCagtatcatactcgctcaaggag朋gg朋gt10020gg3Cgg3tcttcgctaagct10080ggcgg皿gggatcctagccgatcagattgcacctttctttC3ggg3朋tggagtcattca皿40ggategcatetccttgaccaagagtetgctcaactgtctt10200teag朋acgtatcactgactgte皿ga朋gagtatcttcaaaccgcaatcatgatccg朋10260朋gc朋g朋ccgtcgg卿gttgcaaccttgacctgca朋agtactgtct10320teattggagatetc3gac皿tcaaattgttcgctcatgccatcaatcagttgatgggcct10380acctcacttcttcg朋tggattcacctaagactacgatgttcgtegg卿10440ccctttcaatcctccaagtgaccctactgactgtgacctctcaagagtccct朋tgatga10500gtcagtgccacg朋ggattetgccag朋gctetggac皿t10560gatctcaattgctgcaatccaacttgctgcagctegatcgcattgtcgtgttgcctgtet10620ggt織gggtgateatc朋gteategcagt朋Cg3g3g3gacgactctcc10680gg卿tggtgttgacacagttgcatcaagcragtgateatttcttcaagg10740tgtcaatcatttgattggccggatcgtg皿accatcaggt10800cttcatetactcttcaaagatggagc朋tcctcagtcaag10860ttcatctaaattegtgctagtctcagtgaatgtcctgtgc10920caacattgcctctactgtagcacggctatgCg卿3Cgggcttcccaaagacttctgtta1098019/28页ctettteaacteteteatgagttgtgtgcagacatactttgactctgagttctccatcac11040caacaattcgcaccccgatctteatcagtcgtggattg3ggacatctcttttgtgcactc11100atetgttctgactcctgccc朋ttegggggcttcaatactcaaggctcta11160cacteg3朋tatcggtgacctgcttttgcagagatc朋gcgacteg朋gc112203gtgggattectgagtccteacattatgactaatetctteactaggccgcctggg皿tgg11280卿ttgggccagtctgtgcaacgacccatectctttcaattttgagactgttgcaagccc11340ctteaga朋catecgc朋3gagtcctetttgaaacttgttcaaatccctt11400attgtctggagtgC3C3C3g3ggateatg3ggc卿卿g朋ggrattggctgaattctt11460gctteatcaaatccccgcgttgcgcatgcccaagctctgt11520郷tegg卿朋gggcttgttteagattgc11580gcttectagg3ggccatteggcatc皿g3ggctgatgcggategtcaattattctagcat11640gcatgc朋tgctgtttegagacgatgttttttcctccagtagatccaaccaccccttagt11700ctcttctaatatgtgttctctgacactggc3gactetgc3cgg皿teg朋gctggtcacc11760tttgacgggaggcagg朋皿tectgggtgtatcteatcctgatecgateg朋ctcgtega11820gggtg卿ttcttagtgtaagcgg郷gtgtec皿gatgtg織gcgg賜11880tacttggttccatcttccaagc朋tetegaattgaccgatg3C3CC3gC3agaatcctcc11940gatg郷gteccatetctcgggtc朋agac織gg卿ggagagctgcctcacttgcaaa12000aatagctcatatgtcgccacatgte皿ggctgcccteagggcatcatccgtgttgatctg12060ggcttetggggateatg朋gte朋ttggactgctgctcttacgattgc朋aatctcggtg12120teatgte朋cttegagtatcttcggttactgtcccctttacccacggctgggaatcttca12180acategactegatgatggtetaactcagatgacattcacccctgcatctctctacaggtg12240tcaccttacattcacatatccaatgattctca朋ggctgttcactg朋g312300g郷gg朋tgtggttteccagctcttgggtttetctcteatcgaatcgat12360ctttccaatgggacatetg3ctgcacctac12420tagttgctgtcacctgttgcggttcctttcgagctacttggggtggtecc12480gg雄tg郷acagtgacctca朋teagtttatgtatgatcctagccctgtetcgg郷g12540agactttgcgagacttgacttagctatcttc皿gagttetgagctteatctggagtcate12600tcccacgategagcteatg3acattctttcaatatccagcggg皿gttgattggccagtc12660tgtggtttcttetgatg朋gatecctccatgccateategtgtetgac朋12720tacccgaaattggatragtg朋gctcag朋ttcagatgtggtccgcctetttgaatetgc12780gtgctcctcgactgttctteccaactctattecctgagagteagaggcct12840agac朋tettgtcttatatetgggtgattt3tgCC3gg朋ttctectttc12900caacattgcagctacaatatctcatcccgtcattcattca3ggttecatgcagtgggcct12960ggtcaaccatgacggatcacaccaacttgc3gatecggattttatcgaaatgtctgcaaa13020actattegtetcttgcacccg3Cgtgtg3tctccggcttatettcagg朋at朋gtetga13080tctgctgttcccatctgtcttegatgateacctg朋tgagaagatgcttcagctgatatc13140ccggttetgctgtctgtacacggtectctttgctecaacacg朋朋teag13200aggctteactgC3g朋g3g3aatgttcaatactcactgagtatttactgtcggatgctgt13260cttagccccgctctetcatgtctccteaca13320
21ctgtectacatgtctcggaa gagcctcaat ttgatcaggg aaagggagga13380cagggatectatcctggcgttgttgttccc ccaagagcca ttattagagt tcccttctgt13440gc朋gatettggtgctcgagtgaaagatcc attcacccga caacctgcgg catttttgca135003gagttegatttgagtgctccagcaaggte tgacgcattc acacttegtc agattcatcc13560tgaactcacatctccaaatccggaggaaga ctacttagta cgatacttgt tcagagggat136203ggg3CtgC3tcttcctcttggtataaggc atctcatctc ctttctgtec ccgaggtaag13680cacggg朋ctccttetectt agctgaaggg agcggagcca tcatgagtct13740tctcgaactgcatgtaccacatgaaactat ctettacaat acgctctttt caaatgagat13800gaaccccccgcaacgacatttcgggccgac cccaactcag tttttgaatt cggttgttta13860tegg朋tctec郷cgg郷taacatgcaa agatggattt gtccaagagt tccgtccatt139203tgg3gag皿朋tecagagg朋3gtgacct gacctcagat朋3gcagtgg ggtetettec13980atctgcagtgccctecagatctgtetcatt gctgcattgt gacattgaaa ttcctccagg14040gtccaatcaaagcttactagatcaactagc tatcaattte tctctgattg ccatgcattc14100tgte郷gagggcggggtegtaatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat actactttca14160tctactcatgaacttgtttgctccgtgttc cacaaaagga tatattctct cteatggtta14220tgcatgtcgagg卿tetggagtgttecct ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc14280tacatttgteratg郷tggtgaggatggc aaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct14340cttgtctaaatcacactgac caggttettc acctcacagc ggcagcgtgt14400ctetccagtcctttecc朋g atteate朋g tecttgagga 3g朋tettga14460cactgcgctgattg朋gccgggggacagcc cgtccgtcca ttctgtgcgg agagtctggt14520gagcacgctegcg皿cateactcagataac ccagattatc gctagtcaca ttgacacagt14580tatccggtctgtgatetetetggaagctga gggtgatctc gctgacacag tatttctatt14640taccccttacaatctctctectgacggg朋朋3gagg3C3 tcacttetec 3gtgcacg3g14700acagatcctegaggttec皿tecteggtct tegagtcg朋朋tctc朋te朋ateggcga14760tataatcagcctegtgctte朋ggcatgat ctccatggag gaccttetcc C3ct朋ggac14820atecttg朋gcatagtecctgccctaaate tttgaaggct gtcctaggta tteccaaact14880tttacagacacttctgtatt gtecttgact cgtgctcaac aaaaattcta14940ateggc朋tgC3gtca朋gg atettecagt朋ctgtgact ctt朋cg朋315000atcacatattaataggctccttttttggcc aattgtettc ttgttgattt aatcatetta15060ctgactcctt aggactcgaa ttcgaactca aataaatgtc15120gttgcgcacaattattcttg agtgtagtct cgtcattcac caaatctttg15180tttggt15186〈210〉4〈211〉1611〈212〉DNA〈213〉传染性支气管炎病毒(IBV)〈400〉4atgttggtea cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgctttg60tatgacagta gttcttacgtgtectactec caaagtgcct tcagaccacc tgatggttgg120
22
catttacatg ggggtgcgtetgcggttgtt aatatttcte gtgaatctea taatgcaggc180tcttcatctg ggtgtactgttggtettattcatggtggtc gtgttgttea tgcttcttct240atagctatga cggcaccgtcatcaggtatg gcttggtcte gcagtcagtt ttgtectgca300tactgteacttttcagatactacagtgtttgttacacatt gttacaaaca tgttgggtgt360ccteteactggcatgcttcaacagcattctatecgtgtttctgctetgaa3朋tggCC3g420ctttttteteattteacagttegtgtegctaagtecccte ctttteaatcatttcagtgt■gtteateattteacatccgtggtgatcttg tttecacctcteatgagacc5403cagatgttecatctgcaggtgtttetttta皿gctggtg gaccteteactteteaagtt6003tgagag朋gttegagccctggcttettttgtteatggte ctgc3c皿gatgttettttg660tgtgatgggtcacctegaggcttgttegcatgccagtete atectggc皿tttttcagat720ggcttttetccttttecteagtteagcag3 agtttettgtctetcgtgaa780atactacttttecgttecac aatttcactt ttcateatga gactggcgcc840ctegtggtgtccag^tett c^acttecc ^3C3C3^c agctcagagt■ggttattetaattttaatttttcctttctg agtagttttg tttateagga gtcteatttt960atgtetggatcttetcaccctttegactegteatggtttg1020tggttteattcactttcagtttcaattgcttecggtcctcttc朋ggtggttgc朋gc朋1080tctgtctttegtggt卿gcaacctgttgttetgcttectC3tetgg3ggtcctttgctg1140tgt腿ggtgtttettcaggtgagttegatcateattttg朋tgtggactgttegtttet1200gttecteagagcggtggctctcgtetecaaacagccactgaaccgccagt1260ttteaatecttgtgttgatttggcag朋ct1320ggc咖ggtttgteaccgactcagctgttegtteteattetctegcagac1380gcaggtttggctettttegatecatctggttccategacatctttgtcgt1440tetggtctteggtteacccttgcga卿tgtcaaccagcagtttgtegtt1500tctggtggte皿ttegteggtettcttecttcacgteatgagactggttcccagcttctt1560gag^tcagttttecatcaagg皿cacgtcgttttegacgt1611〈210〉5〈211〉960〈212〉DNA〈213〉传染性喉气管炎病毒(ILTV)〈400〉5gg郷gg卿gagac皿cttcagctcg皿gtctg皿gagacatcatgagcggcttcagte60acateggatcgattgccaccgtttccctegtetgctcgcttttgtgcgcatctgtetteg120gggcgccggtactggacgggctcgagtcgagccctttcccgttcgggggc180cccaggcgtgc皿ccgcacctgacggtcccgtggagcgactectctggtc240gcaccg皿ggagtgtcagtcg郷tg腿tggttctecggg朋tegteatcccgaaagct300tcgtgttcggggtggategcg皿3CgggC3gtgg3C3Cg3ggacctgtctacgtgctggg360ctcteatccateatctgaacgcgtctgtgtgcagggcgtctgacgccgggatecctgatt420tcgac^gcagtgcg^^agtgC3g3g皿gactgcgctccggggtgg朋cttggtegtt■acgtgtctggcaatggatccctggtgctgt3CCC3ggg3tgtecgatgccggcatctecg540
cctaccagctctcagtgggtggg皿gggatateccgggtctgtttetctegacgtcggac600caaaccccggatgccacgacragtetgggtacacctettecagcctggccgacg郷cgt660cagacttetcatcttetgacgtegcctcgcccgaactcgacggtcctetg720attccaattgtctegacatg cccccgctecgcccatggacaaccgtttgttcgcatgacg780tcgaggagcagg朋朋cgcc3Cgg3Cg3gCtttecctetgggacg郷皿tgcgccggtc840cgctggacgagtecgtcgacg皿3ggtC3gagacgatgccgtcttttcac■cgccctctecgctccagcag tegccacccgagagtgttttttgtgagcgcCC3CgC皿C3960〈210>6〈211>810〈212>DNA〈213〉禽脑脊髓炎病毒(AEV)〈400>6ggg腿g郷Eltg朋ggElggatttttcagtgtgcctg皿gtggagc^catgttgttgag60gateagg朋cC3C3ggg3CCtttgcacgtgacaccttttggcgctgtteaagctetggag120gacccccaattggccaggaaaacacctggcacattccctgaattegctcctggteaacct180cgacatecagtggaccacatggatctgtet皿gttcatggggcgtgcccattecttgtgg240ggacatg朋ttecacattccagateccattaagtcccatt300腿g郷gttttgtgacgggtecactteggtggttttteagtcttttccaactgtetcgt360ggttctctcgacatteccatgacatttgca3tgtgg3tggcattgtgtec420tttgtgcctgagggtgttgcgategagactg卿ggg郷agcagacccctttgctcaca■ttgaacteteaggtgccattaggttteateCtgg3C皿3Ctecgaatgtc540cagttteggatccctttctecacgccactgg皿C3C3tCgcaacccattc600atggattcagtcttgggggccagatcacteactetegtgc660tetttgcaggttecctectecatcagtttccacagttttctgttcccaga720gcggtgccagtggtcagctcattcactgacacatctegcag皿tecatet780tggcttgatgatgacgagttggt卿卿g810〈210>7〈211>726〈212>DNA〈213〉禽脑脊髓炎病毒(AEV)〈400>73tg3gC3朋Ctettttctectgteggc郷actgttgatgaggttttgtctgtgctcaat60g￡ltg￡lgg￡ltectgaatctte tgctggccctgatcgcactgragtegttgg120ctgac朋cggtegaccagag ttcagttegcacggctec皿tggg皿gtttac皿gatgte180C3gtecagg3ctgcagtcga tettcctggttctegagtgaC3C皿ggtg3gaggttcttc240cttetcgatc3gCgtg3gtg g皿CtC皿C3ggcagttettgggra卿tt300gacategtea皿gagctgcttgatcagtcgtetgctgttgatggccttttg皿gteccat360tcttetgcaaggtttggcttggatgtcattgttcagatteatccaacatcattccaggca420gggggcctcategcagctctcgteccttetg紅郷ttgacattgaatcaattgttgcc■
atgaccacttattgccatgg c朋ggtteattgc^cateaactecgttgt皿ggatg皿g540gtgccatetetetecagtcg aggttgttec皿cctteggaactcagcatectccatttgg600atgcttgtgateagagtgtg gtcacggctgragttgggatctggcacttc660actetcaccaccttggcteg gtttgtggatttggaactgcatggacttegccctttggtc720gC3C3g726〈210>8〈211>735〈212>DNA〈213〉禽脑脊髓炎病毒(AEV)〈400>8atgatgcgcaacgaatttcgactgtcgtcatctegcaacattgtcaatttggcteattet60gacgatgc朋g3gCC3朋gtgtctctegcgctgggac皿gaagagttttcC3g3g3CtCg120tcaagteccggggggg朋ttggtgcatcatttttcacagtggacgtccattccgtgcctt180gccttcacttttecattccccggcacggtegggcc郷ractcacatctggtcaaccacg240gtggaccctttttcctgteacttgagggcgtctegcactgtgcaccccacteacttgagc300tcgattgcgggtetgttctgtttttggagaggtg織ttgtetttgagtttcaagtcttt360tgcaccaagtatcattccggtttgtgtetgtgcctggcga420cctteactgctctectggtcttectgctgtttttgatetc■朋tggtgteaattcaacactggtgttt卿tgccctttcatctctgacacaccttecagg540gtg朋tcc朋cgactcateagtccctctggccttetgcaactggcaagcttgtgtgctet600gtctecaatetectgaacgcacctgccagtgtetcaccaaccctgcccatteatgtgtec660朋朋gtgctgcggatctggagttgtetgcacctgtttetggggtttctccC3CC皿C3CC720tcaatttttgttcaa735〈210>9〈211>1500〈212>DNA〈213〉禽副流感病毒(APV)〈400>9ggggggtgtgcatggtegggtgggg皿ggtagccaattcctgcccattgggccgaccgte60cc朋gag朋gtc朋cag朋gtetegatgcagggcg織tgg郷gtegccgtgateacct120cacagtegatgatg朋tteag郷ttegcttetegagttgtetccctcct180attgatggtgagtgccttgateatctctetagteatcctg3cg3gagate3C3gCC皿3g240cateatcacggcgatcaaccagtcgtetgacgcagactcaC3gggatega300aggg朋朋tcacctcaatcatgactgatecgctcgatecc3gg皿tgC3gctcttctcca360cattccactccagctcaatecacttgaggcaaacctgttgtccgccctcggaggttecac420gggaattggccccggagatctegagcactgtcgttetccggttcatgactccgcttecct■gcatggagtcaatcgattectcatcaatca皿C3gCtg3Ctec3C3gcagaaggccccct540ggatcatgtgaacttcattccggcaccagttecgactectgg3tgC3C皿ggatcccatc600cttttctgtetcatcatccatttggtgctegtgattga皿C3ggttgC皿660
tgaccactcaggtegteatc皿tetetcagtetgggggtgatte卿gggctggc皿cgg720ctteccttecttctcaacagtcgtgagteagtetctgaccgatgggttg3780ctgttccgtegctgcgggatccgggcattgttecctcctttgtegcctegtgtcagagcc840cgaacctgatgactetgtgtcaccagatcccacaccgatg郷tteggggtgcteac皿g■ggatgggtcttecactgaac郷tggtecctetggagcgc960aaacteccctggggtegggtcaggtgctet皿ggtgttettcccatttte1020CggCggElgtg朋g朋tggatcaacccctgaggtgatg皿tattectecat1080ccaggatccaaatgactettgccctgacccgctgcaagatcagatctteagggC3g皿C31140atcgtettetcctectcgatttggteggagg3tggt皿tgC3ggg3gtCCteacatgtcc1200agtetccaactegccagccaatgccaatcttectetttcaacaactcatt1260aggattcatcggggcgg皿tcteggatctettecctcaatggteacatttacctttetca1320朋g朋gctcgagctggtggcCtC3CCCCC3aatttecctecttgattccaggattg咖g1380tccgggtecgactcaggcgtteacctc皿gttectgtcat1440tecacgaccatcatctggcttttgteategtgcccteatgactgcttett1500〈210>10〈211>1440〈212>DNA〈213〉出血性肠炎病毒(HEV)〈400>10g朋3tgtt朋tgttagaccatactgaccaattcctggttc attttagatggaatcttcga60acactgccactegaatttttgctccaacgg^gggag^3 cagteteatttacagcaact120tgcctcctgttttetetega teac皿ggcc180gatcattcta240acatttcaactettgattcatct卿tggg300gaggag朋ctttagtaacatctgttetgaa ttgtactaaacattttaatt360c卿teggtgattcagactattaagagtcc acctacatttg^tgga^g420朋ttga朋3t3CCtg3ggg3aactatgttttaaatgagtt tattgattta480gtettacttctttataccttggc^caggg tgtecttg33g^gacateg540g朋t朋朋tttgatactcgcttggteaaga tccaactactaatcttgtte600ctcctggtaaatacttgttt皿gggttetcatgctgatat aatacttcttcctggttggg660ctettgatttttctttttct卿ttgggtecgtgagactt720ate朋gctggctttttgattccaccactgt780tggatgttgctctacaagtc^gcte^cc attettecaggatccatctg840gcagatcttaccacgttatgctaacagacc tgtgactgcatataggtctt■ttgttttgtcg卿gtgctgc皿^tte^ gtttttgatgtgtetgagtg960ateteacggg gggtctc朋tcagctgtettggtgtttgcctgattcttet皿3CCgCC3g1020tetcttttea gc朋ga朋cg c朋gtegate朋ctgcctgttgttggtetg caactttttt1080tcctttttgtttgteaatctgtgtettctg gtgctgctgtttecacacag tteattgaac11403gc3gacte3 tttgacac朋attttteac3 gatttcatga teatg朋3tt1200
ctccatetgtttettggctgcateaatgtt皿tcaggg皿1260attttcaactcttccaggagtecagagagtggttgtgg皿gacgategga1320g皿g皿ctgtaccctecgttaccaagtcacttgctecagtatetccg皿ggttttgtcte1380gcaaaactttgc皿teatgcattctgttgtttettctccagggg織gteg郷atgggg1440〈210〉11〈211〉2995〈212〉DNA〈213〉禽痘病毒(FPV)〈400〉11ctctteattctggga皿tettttteagcctccgattetca60gattgtgg皿acagteccaca^gctteacagctetteattctecteatctttctectte120tgaatgtttta^cgttteategatctegcatctecategctecgttttg180ttgteaccteagtecteatcctg郷gtectgacatectetcgatgtttc240gagte皿gtttctgtetetettttegtegatg卿gragtcctcateaag300gatteagtcttcccatetteagtegateteggtgtgctteateatg皿tc3603gtegg3皿cttgtteggteatttctgggt3gtggat皿gcttcacttttateteggteg420tgcgtctcttatggg腿tgcgcteacaacatgggcatet■teattctttegc皿tggatttetetttcagatcgttggacteagc皿g皿540ttcttteccag皿tggccac皿3gteccatttcttcaaaaaccateacgg600tetettcttttcagattctcC3g皿catetggteggt卿ttgacttgga660ttgtgttettcattetetegacgcggcg皿gtctectetegatctegcgategtetctct720tcttccteca皿gag皿c皿aagattctetcgtctettgg^gatgcatt780皿tecgggccgtetteg皿cactecgagtgctetteggat840皿cggatgttaagcctteacg皿cteggagttgaccatet■agatetctctacte皿gtettteggtttcccgtteattcta^gtegatg960ttcteaaatgatgattetegatgg皿ggtetgctcatgttatgactgcteacctegacgg1020gtctcattttaatcaccatgcttttgttegcttteactgtatggatc皿c1080g皿gtgtttg朋agggactggatetctccttecgc皿皿ga^tegatet1140gtctcaaatetagtetatetgate^^gate皿tetegc1200teg皿cagttacaatcttcttectttcaccgtttagatettetggtttta1260aagattttcattteccacaategatgacgagteattecag1320tcaacaatgtaccattagteacteggtteateacgtttgattttttegat1380cgttteategtacttgtettateacttccaggatettgatacagatectt1440attttetaccaaattcgttetcactectegtetgatgteg1500皿cteag3gatctetcatttgcteteatgtcgga朋tg皿teacgatg皿ttgaga^te1560gtgatettgtatctctaaac朋atggctecateagcateatttectegactec朋atteg1620tecteateagtgatetcgatag皿gateteac皿teattg1680atgttetatccgte皿tggtatetetgggt1740attcaccggaatectteagatggtctategatette^ag3gCC3C3g皿agt朋teact1800
ggttaccgtatagccagtct ateaaccctttg皿tg皿皿tetetecgct tttg皿ttte1860tegctecttt3g皿3g3tCC朋t gage getteaatatcgg agcgatettc ctgtatccgg1920tecaggtega朋c皿cg皿gatet朋tega a皿gttttte gatragtteg1980朋g朋gt朋tgtettgtttt aacaggttet catcteacat2040ttttegag朋tectetttte gagagatetetcagteagte te皿gactgg attttterat2100gteatcgtctagtecattgt皿皿ccggractgaagtett cttetttgat gccgctetet2160tttttccatcctcteateag a^ggatetgte皿3cattg gac3ggte皿a皿tte皿tt2220tttcc皿皿3 gategtcagctega皿皿te cate皿teat皿cagtgteg2280cag朋cgtetatettettte cagtcttctttec3c皿gca tetetcctgt cteatega皿2340ttttcgagttaaatggattt gatttteatttttctgggtt gttegatete cttettttca2400gtettcgtgtteag皿teat皿tggteattactetteccc teaacattct tcagctgtga2460atttgatgttgtcatctett tecacggactattetgctet tgatgatete gate皿gate2520gteag3朋cttgttttteac tctetttttccttteateat gg皿ggatet teccctg皿g2580g朋朋ccttettetecga皿3C3ccra皿g皿gggtettt gtc皿tetgt ttetgtgatg2640tega朋tetcteatgatete朋g皿tcctetettgtettg te皿g皿皿c皿gtcagcte2700gg朋gtttecaggagtettc aratctgtegatetegatec cgctgtea皿cteag3ggat2760ggccteatea皿tea皿tte ttcgac皿te2820tetgttetct3tcagg3tte c3C3C3cgat ga皿皿tctt2880tec朋ggctetcttttttct tetttectte皿ggc皿cgt teccg皿gat gttttegcte2940tg朋朋gttgtetcatttet aateagttec tgcag2995〈210>12〈211>35〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，IBSIF'〈400>12cgggatccgccgccgccatg ttggtaacac ctctt35〈210>13〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，IBSIR'〈400>13cggaattctt^cgtcte^ acgacgtgt29〈210>14〈211>38〈212>DNA
28
〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，NDF F'〈400>14cgggatccgc cgccgccatgggctccagaccttctacc〈210>15〈211>34〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，NDF R'〈400>15ccgctcgagt tacatttttgtagtggctctcatt〈210>16〈211>39〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，NDHN F'〈400>16cgggatccgc cgccgccatggaccgcgccgtteggc朋g〈210>17〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，NDHN R'〈400>17gctctagatt actcaactagccagacctg〈210>18〈211>35〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>PCR引物，IBDVP2F，〈400>18cgggatccgc cgccgccatgacaaacctgc朋gat〈210>19〈211>29
29
〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223>PCR引物，IBDVP2R' <400>19 cggaattctt accttatggc ccggattat 29
权利要求
一种用于蛋内注射的多价性DNA疫苗，包括一个含有二个DNA分子的DNA构建物，其中，每个所述DNA分子能表达出一个会在禽类内造成禽类病毒疾病的禽类病毒的抗原蛋白；所述禽类病毒的抗原蛋白能在所述禽类诱导出抗所述禽类病毒疾病的保护性免疫反应；所述DNA分子选自传染性华氏囊病病毒及新城鸡瘟病毒所构成的群组之中的一个基因或其片段。
2. 根据权利要求l的多价性DNA疫苗，其中，所述载体为一个质粒或一个病毒载体。
3. 根据权利要求2的多价性DNA疫苗，其中，所述质粒为选自pcDNA3、pVAXl、pSectag、 pTracer、 pDisplay、 pUC系统质粒与pGEM系统质粒所构成的群组中的一种。
4. 根据权利要求2的多价性DNA疫苗，其中，所述质粒包括一个启动子，所述启动子选 自CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子和13 -肌动蛋白启动子所构成的群组。
5. 根据权利要求2的多价性DNA疫苗，其中，所述病毒载体为选自杆状病毒、疱疹病毒 和痘病毒所构成的群组中的一种。
6. 根据权利要求1的多价性DNA疫苗，其中，所述DNA分子为具有SEQ ID NO :2的DNA 序列的传染性华氏囊病病毒(IBDV) VP2基因的全序列或其片段。
7. 根据权利要求1的多价性DNA疫苗，其中，所述DNA分子为具有SEQ ID NO :3中自 第6321至8319碱基对的DNA序列的新城鸡瘟病毒(NDV)HN基因的全序列或其片段。
8. 根据权利要求l的多价性DNA疫苗，其中，所述禽类为选自鸡、火鸡、鸭和鹅所构成的 群组。
9. 一种制备权利要求1所述多价性DNA疫苗的方法，包括将二个DNA分子黏接到一个质粒或病毒载体以形成一个DNA构建物，该一个DNA构建 物即为所述多价性DNA疫苗；其中，所述DNA分子包括选自传染性华氏囊病病毒及新城鸡瘟病毒所构成的群组之中 的基因或其片段。
全文摘要
本发明提供一种用在禽类蛋内以获得胚胎免疫性的多价性DNA疫苗。该多价性DNA疫苗包含一个含有二个或二个以上DNA分子的DNA构建物，每个DNA分子代表一种禽类病毒基因或其片段。该多价性DNA疫苗能表达出二个或二个以上病毒抗原且在禽类体内诱导出抗禽类病毒疾病的保护性免疫反应。
文档编号A61K39/17GK101703770SQ200910212389
公开日2010年5月12日 申请日期2003年3月6日 优先权日2002年3月8日
发明者郭村勇 申请人:施怀哲股份有限公司
最新回复(0)