合浦珠母贝抗体活体注射实验方法
专利名称：合浦珠母贝抗体活体注射实验方法
技术领域：
本发明属于活体内实验技术领域，涉及一种对珍珠贝的矿化过程进行活体研究的
技术，具体涉及一种合浦珠母贝抗体活体注射实验方法。
背景技术：
合浦珠母贝(Pinctada fucata Martenssi)，又称马氏珠母贝，属于软体动物门 (Mollusca)，瓣鳃纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，珍珠贝科(Pteriidae)，珠母贝属 (Pinctada)，主要分布在我国沿海，是目前世界上用于海水珍珠生产的主要贝类。
在以合浦珠母贝为实验材料开展的珍珠质形成的分子机理研究过程中，发现了一 系列与生物矿化有关的基因，得到了参与矿化的相关蛋白，但是关于这些蛋白在生物矿化 中的作用不十分清楚。除了从它们的肽链结构特征方面去了解这些蛋白质可能的作用外， 目前只能通过一系列间接的实验，如体外晶体实验和体外哺乳动物细胞系的激活试验等， 研究上述蛋白在合浦珠母贝体内的作用以及可能的生物矿化机制。但这些研究都缺乏直接 证据的支持，主要原因是无法获得贝类细胞，尤其是能够在体外稳定传代培养的珍珠质分 泌细胞(外套膜上皮细胞或其前体细胞)，导致无法进一步深入了解这些蛋白的体内作用， 使得珍珠形成过程中关键因子的矿化功能的研究受到很大限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种合浦珠母贝抗体活体注射实验方法，能够对贝类的矿化 过程进行动态观察，进一步深入了解贝类的矿化过程。 本发明所采用的技术方案是，合浦珠母贝抗体活体注射实验方法，通过对活体珠 母贝注射抗体，并观察最内层珍珠层的异常生长情况，研究贝类的矿化过程，该实验方法按 以下步骤进行 步骤l :选取壳径4. 5cm 6cm、湿重32g 40g的合浦珠母贝，置于人工海水中饲 养3天 5天，留用健康个体； 步骤2 :取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新 西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化； 步骤3 :分别取步骤2中纯化后的抗体和步骤1中留用的健康个体，将健康个体 分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射 1. 0 i！ g纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体注射到注射组健康个体的体内，对照组中的健 康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射3天 5天；
步骤4 :分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例， 将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液； 步骤5 :分别取步骤3注射后的健康个体和步骤4制得的NaOH溶液，将健康个体 的贝壳分离，用去离子水清洗，然后，浸没于NaOH溶液中8h;
步骤6 :将步骤5处理后的贝壳用去离子水清洗，置于空气中干燥12h 18h ; 步骤7 :取步骤6干燥后的贝壳，截取注射点周围lmm 2mm内的区域，将截取的 该区域贴在金属片上，然后，将金属粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，金属粉的喷涂厚度 为20nm 30nm ; 步骤8 :将步骤7中喷涂有金属粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠 层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的 作用。 所述步骤1中的人工海水，按200L曝气后的自来水中溶解6.67kg海盐的比例配 制而成，其pH值为8.2。 所述步骤3中的注射，采用微量注射器穿过健康个体的外套膜将抗体注射到外套 腔的中心部位。 所述步骤4中的去离子水采用经超纯水仪器过滤后的三蒸水。
所述步骤7中的金属片采用能够导电的金属片。
所述步骤7中的金属粉采用金粉或者铂金粉。
本发明实验方法具有如下优点 1.通过抗体与基质蛋白结合的抑制作用影响贝壳的矿化过程，为矿化模型的研究 提供了新思路，以往的结晶过程的观察大都使用体外结晶实验，对贝类的矿化过程了解不 能深入，活体实验对整个矿化过程能够进行动态观察。 2.利用抗原抗体结合的原理，特异性高，结合效果好，实验结果稳定，重复性好。
3.对贝类活体的外套膜损伤小，基本不影响贝类的存活和生长。
4.适用范围广，适用于有壳类软体动物。
5.易于操作，成本较低。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明进行详细说明。 本发明实验方法，通过对活体珠母贝注射抗体，并观察最内层珍珠层的异常生长
情况，研究贝类的矿化过程。 本实验方法，按以下步骤进行 步骤1 :选取壳径4. 5 6cm、湿重32 40g的合浦珠母贝，置于人工海水中饲养 3 5天，淘汰其中不健康的个体，留用健康的个体； 人工海水，按200L曝气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成，其pH值 为8. 2。 步骤2 :取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新 西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化； 步骤3 :分别取步骤2中纯化后的抗体和步骤1中留用的健康个体，将健康个体 分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射 1. 0 ii g纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体 内，注射时穿过健康个体的外套膜注射到外套腔的中心部位，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射3 5天； 步骤4 :分别取NaOH固体和超纯水(miliq水)，按100ml超纯水中加入5g NaOH 固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；
步骤5 :分别取步骤3注射后的健康个体和步骤4制得的NaOH溶液，将健康个体的 贝壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中8h，以去除贝壳表面黏附的有机质；
步骤6 :将步骤5处理后的贝壳用去离子水清洗，置于空气中干燥12h 18h，然 后，储存于干燥器内； 去离子水采用经超纯水(miliq)仪器过滤后的三蒸水。 步骤7 :取步骤6干燥后的贝壳，截取注射点周围1mm 2mm内的区域，将截取的 该区域贴在金属片上，然后，将金属粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，金属粉的喷涂厚度 为20 30nm ; 金属片采用能够导电的金属片；金属粉采用金粉或者铂金粉； 步骤8 :将步骤7中喷涂有金属粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠 层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的 作用。 实施例1 选取壳径4. 5cm、湿重32g的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解 6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为8. 2的人工海水中饲养3天，淘汰其中不健康的个 体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到 新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化；分别取纯化后的抗体和留用的健康个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组 由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射1. 0i! g纯化后抗体的比例，将纯化 后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注 射到外套腔的中心部位，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组 均连续注射3天；分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例， 将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个 体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中 8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置 于空气中干燥12h，然后，储存于干燥器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围1mm内的区 域，将截取的该区域贴在能够导电的金属片上，然后，将金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表 面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠 层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的 作用。 实施例2 选取壳径6cm、湿重40g的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解 6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为8. 2的人工海水中饲养5天，淘汰其中不健康的个 体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到 新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化；分别取纯化后的抗体和留用的健康个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射1. 0i! g纯化后抗体的比例，将纯化
后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注 射到外套腔的中心部位，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组
均连续注射5天；分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例， 将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个 体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中 8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置 于空气中干燥18h，然后，储存于干燥器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周2mm内的区域， 将截取的该区域贴在能够导电的金属片上，然后，将铂金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表 面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有铂金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍 珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中 的作用。 实施例3 选取壳径5. 3cm、湿重36g的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解 6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为8. 2的人工海水中饲养4天，淘汰其中不健康的个 体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到 新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化；分别取纯化后的抗体和留用的健康个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组 由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射1. 0i! g纯化后抗体的比例，将纯化 后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注 射到外套腔的中心部位，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组 均连续注射4天；分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例， 将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个 体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中 8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置 于空气中干燥15h，然后，储存于干燥器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围1.5mm内的区
域，将截取的该区域贴在能够导电的金属片上，然后，将铂金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳 表面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有铂金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层
珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程 中的作用。 本发明实验方法通过观察抗体与基质蛋白结合的抑制作用对贝壳矿化过程的影 响，提供一种体内研究生物贝类矿化以及体内因子和信号通路的研究方式，为矿化模型的 研究提供了新思路，具有特异性高，结果稳定，对活体影响小和适用范围广的特点。
8
权利要求
合浦珠母贝抗体活体注射实验方法，通过对活体珠母贝注射抗体，并观察最内层珍珠层的异常生长情况，研究贝类的矿化过程，其特征在于，该实验方法按以下步骤进行步骤1选取壳径4.5cm～6cm、湿重32g～40g的合浦珠母贝，置于人工海水中饲养3天～5天，留用健康个体；步骤2取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯化；步骤3分别取步骤2中纯化后的抗体和步骤1中留用的健康个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射1.0μg纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体注射到注射组健康个体的体内，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射3天～5天；步骤4分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；步骤5分别取步骤3注射后的健康个体和步骤4制得的NaOH溶液，将健康个体的贝壳分离，用去离子水清洗，然后，浸没于NaOH溶液中8h；步骤6将步骤5处理后的贝壳用去离子水清洗，置于空气中干燥12h～18h；步骤7取步骤6干燥后的贝壳，截取注射点周围1mm～2mm内的区域，将截取的该区域贴在金属片上，然后，将金属粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，金属粉的喷涂厚度为20nm～30nm；步骤8将步骤7中喷涂有金属粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。
2. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤1中的人工海水，按200L曝 气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成，其pH值为8. 2。
3. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤3中的注射，采用微量注射 器穿过健康个体的外套膜将抗体注射到外套腔的中心部位。
4. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤4中的去离子水采用经超纯 水仪器过滤后的三蒸水。
5. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤7中的金属片采用能够导电 的金属片。
6. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤7中的金属粉采用金粉或者 铂金粉。
7. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，该方法为选取壳径4. 5cm、湿重32g 的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为 8. 2的人工海水中饲养3天，淘汰其中不健康的个体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重 组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿 化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯化；分别取纯化后的抗体和留用的健康 个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射l.Oi!g纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注射到外套腔的中心部位，对照组中的 健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射3天；分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度 为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝 壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处 理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置于空气中干燥12h，然后，储存于干燥 器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围lmm内的区域，将截取的该区域贴在能够导电的金 属片上，然后，将金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有金 粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过 程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。
8. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，该方法为选取壳径6cm、湿重40g的 合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为 8. 2的人工海水中饲养5天，淘汰其中不健康的个体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重 组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿 化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯化；分别取纯化后的抗体和留用的健康 个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康 个体的湿重注射l.Oiig纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体采用微量注射器注射到注射 组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注射到外套腔的中心部位，对照组中的 健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射5天；分别取NaOH固体和 超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度 为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝 壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处 理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置于空气中干燥18h，然后，储存于干燥 器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围2mm内的区域，将截取的该区域贴在能够导电的金 属片上，然后，将铂金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有 铂金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿 化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。
9. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，该方法为选取壳径5. 3cm、湿重36g 的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为 8. 2的人工海水中饲养4天，淘汰其中不健康的个体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重 组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿 化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯化；分别取纯化后的抗体和留用的健康 个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康 个体的湿重注射1. 0 ii g纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体采用微量注射器注射到注射 组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注射到外套腔的中心部位，对照组中的 健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射4天；分别取NaOH固体和 超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度 为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝 壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处 理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置于空气中干燥15h，然后，储存于干燥 器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围1. 5mm内的区域，将截取的该区域贴在能够导电的金属片上，然后，将铂金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂 有铂金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对 矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。
全文摘要
合浦珠母贝抗体活体注射实验方法，将合浦珠母贝置于人工海水中饲养，留用健康个体；制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并纯化该抗体；按比例，将纯化抗体注射到注射组健康个体的体内，对照组等量注射未免疫的兔血清；将注射后的健康个体的贝壳分离，清洗，浸没于NaOH溶液中8h，再清洗，空气干燥；将干燥的贝壳，截取注射点周围的区域，并贴在金属片上，在贝壳表面喷涂金属粉；然后，置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。本发明提供了一种体内研究生物贝类矿化以及体内因子和信号通路的研究方式，为矿化模型的研究提供了新思路。
文档编号A61K39/395GK101711867SQ20091021908
公开日2010年5月26日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者上官俊龙, 刘晓军, 周玉娟, 张荣庆, 李琪, 谢莉萍 申请人:清华大学
技术领域：
本发明属于活体内实验技术领域，涉及一种对珍珠贝的矿化过程进行活体研究的
技术，具体涉及一种合浦珠母贝抗体活体注射实验方法。
背景技术：
合浦珠母贝(Pinctada fucata Martenssi)，又称马氏珠母贝，属于软体动物门 (Mollusca)，瓣鳃纲(Bivalvia)，珍珠贝目(Pterioida)，珍珠贝科(Pteriidae)，珠母贝属 (Pinctada)，主要分布在我国沿海，是目前世界上用于海水珍珠生产的主要贝类。
在以合浦珠母贝为实验材料开展的珍珠质形成的分子机理研究过程中，发现了一 系列与生物矿化有关的基因，得到了参与矿化的相关蛋白，但是关于这些蛋白在生物矿化 中的作用不十分清楚。除了从它们的肽链结构特征方面去了解这些蛋白质可能的作用外， 目前只能通过一系列间接的实验，如体外晶体实验和体外哺乳动物细胞系的激活试验等， 研究上述蛋白在合浦珠母贝体内的作用以及可能的生物矿化机制。但这些研究都缺乏直接 证据的支持，主要原因是无法获得贝类细胞，尤其是能够在体外稳定传代培养的珍珠质分 泌细胞(外套膜上皮细胞或其前体细胞)，导致无法进一步深入了解这些蛋白的体内作用， 使得珍珠形成过程中关键因子的矿化功能的研究受到很大限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种合浦珠母贝抗体活体注射实验方法，能够对贝类的矿化 过程进行动态观察，进一步深入了解贝类的矿化过程。 本发明所采用的技术方案是，合浦珠母贝抗体活体注射实验方法，通过对活体珠 母贝注射抗体，并观察最内层珍珠层的异常生长情况，研究贝类的矿化过程，该实验方法按 以下步骤进行 步骤l :选取壳径4. 5cm 6cm、湿重32g 40g的合浦珠母贝，置于人工海水中饲 养3天 5天，留用健康个体； 步骤2 :取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新 西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化； 步骤3 :分别取步骤2中纯化后的抗体和步骤1中留用的健康个体，将健康个体 分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射 1. 0 i！ g纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体注射到注射组健康个体的体内，对照组中的健 康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射3天 5天；
步骤4 :分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例， 将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液； 步骤5 :分别取步骤3注射后的健康个体和步骤4制得的NaOH溶液，将健康个体 的贝壳分离，用去离子水清洗，然后，浸没于NaOH溶液中8h;
步骤6 :将步骤5处理后的贝壳用去离子水清洗，置于空气中干燥12h 18h ; 步骤7 :取步骤6干燥后的贝壳，截取注射点周围lmm 2mm内的区域，将截取的 该区域贴在金属片上，然后，将金属粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，金属粉的喷涂厚度 为20nm 30nm ; 步骤8 :将步骤7中喷涂有金属粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠 层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的 作用。 所述步骤1中的人工海水，按200L曝气后的自来水中溶解6.67kg海盐的比例配 制而成，其pH值为8.2。 所述步骤3中的注射，采用微量注射器穿过健康个体的外套膜将抗体注射到外套 腔的中心部位。 所述步骤4中的去离子水采用经超纯水仪器过滤后的三蒸水。
所述步骤7中的金属片采用能够导电的金属片。
所述步骤7中的金属粉采用金粉或者铂金粉。
本发明实验方法具有如下优点 1.通过抗体与基质蛋白结合的抑制作用影响贝壳的矿化过程，为矿化模型的研究 提供了新思路，以往的结晶过程的观察大都使用体外结晶实验，对贝类的矿化过程了解不 能深入，活体实验对整个矿化过程能够进行动态观察。 2.利用抗原抗体结合的原理，特异性高，结合效果好，实验结果稳定，重复性好。
3.对贝类活体的外套膜损伤小，基本不影响贝类的存活和生长。
4.适用范围广，适用于有壳类软体动物。
5.易于操作，成本较低。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明进行详细说明。 本发明实验方法，通过对活体珠母贝注射抗体，并观察最内层珍珠层的异常生长
情况，研究贝类的矿化过程。 本实验方法，按以下步骤进行 步骤1 :选取壳径4. 5 6cm、湿重32 40g的合浦珠母贝，置于人工海水中饲养 3 5天，淘汰其中不健康的个体，留用健康的个体； 人工海水，按200L曝气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成，其pH值 为8. 2。 步骤2 :取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新 西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化； 步骤3 :分别取步骤2中纯化后的抗体和步骤1中留用的健康个体，将健康个体 分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射 1. 0 ii g纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体 内，注射时穿过健康个体的外套膜注射到外套腔的中心部位，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射3 5天； 步骤4 :分别取NaOH固体和超纯水(miliq水)，按100ml超纯水中加入5g NaOH 固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；
步骤5 :分别取步骤3注射后的健康个体和步骤4制得的NaOH溶液，将健康个体的 贝壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中8h，以去除贝壳表面黏附的有机质；
步骤6 :将步骤5处理后的贝壳用去离子水清洗，置于空气中干燥12h 18h，然 后，储存于干燥器内； 去离子水采用经超纯水(miliq)仪器过滤后的三蒸水。 步骤7 :取步骤6干燥后的贝壳，截取注射点周围1mm 2mm内的区域，将截取的 该区域贴在金属片上，然后，将金属粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，金属粉的喷涂厚度 为20 30nm ; 金属片采用能够导电的金属片；金属粉采用金粉或者铂金粉； 步骤8 :将步骤7中喷涂有金属粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠 层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的 作用。 实施例1 选取壳径4. 5cm、湿重32g的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解 6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为8. 2的人工海水中饲养3天，淘汰其中不健康的个 体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到 新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化；分别取纯化后的抗体和留用的健康个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组 由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射1. 0i! g纯化后抗体的比例，将纯化 后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注 射到外套腔的中心部位，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组 均连续注射3天；分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例， 将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个 体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中 8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置 于空气中干燥12h，然后，储存于干燥器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围1mm内的区 域，将截取的该区域贴在能够导电的金属片上，然后，将金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表 面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠 层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的 作用。 实施例2 选取壳径6cm、湿重40g的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解 6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为8. 2的人工海水中饲养5天，淘汰其中不健康的个 体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到 新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化；分别取纯化后的抗体和留用的健康个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射1. 0i! g纯化后抗体的比例，将纯化
后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注 射到外套腔的中心部位，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组
均连续注射5天；分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例， 将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个 体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中 8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置 于空气中干燥18h，然后，储存于干燥器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周2mm内的区域， 将截取的该区域贴在能够导电的金属片上，然后，将铂金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表 面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有铂金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍 珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中 的作用。 实施例3 选取壳径5. 3cm、湿重36g的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解 6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为8. 2的人工海水中饲养4天，淘汰其中不健康的个 体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到 新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯 化；分别取纯化后的抗体和留用的健康个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组 由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射1. 0i! g纯化后抗体的比例，将纯化 后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注 射到外套腔的中心部位，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组 均连续注射4天；分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例， 将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个 体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中 8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置 于空气中干燥15h，然后，储存于干燥器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围1.5mm内的区
域，将截取的该区域贴在能够导电的金属片上，然后，将铂金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳 表面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有铂金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层
珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程 中的作用。 本发明实验方法通过观察抗体与基质蛋白结合的抑制作用对贝壳矿化过程的影 响，提供一种体内研究生物贝类矿化以及体内因子和信号通路的研究方式，为矿化模型的 研究提供了新思路，具有特异性高，结果稳定，对活体影响小和适用范围广的特点。
8
权利要求
合浦珠母贝抗体活体注射实验方法，通过对活体珠母贝注射抗体，并观察最内层珍珠层的异常生长情况，研究贝类的矿化过程，其特征在于，该实验方法按以下步骤进行步骤1选取壳径4.5cm～6cm、湿重32g～40g的合浦珠母贝，置于人工海水中饲养3天～5天，留用健康个体；步骤2取合浦珠母贝的重组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯化；步骤3分别取步骤2中纯化后的抗体和步骤1中留用的健康个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射1.0μg纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体注射到注射组健康个体的体内，对照组中的健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射3天～5天；步骤4分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度为50g/L的NaOH溶液；步骤5分别取步骤3注射后的健康个体和步骤4制得的NaOH溶液，将健康个体的贝壳分离，用去离子水清洗，然后，浸没于NaOH溶液中8h；步骤6将步骤5处理后的贝壳用去离子水清洗，置于空气中干燥12h～18h；步骤7取步骤6干燥后的贝壳，截取注射点周围1mm～2mm内的区域，将截取的该区域贴在金属片上，然后，将金属粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，金属粉的喷涂厚度为20nm～30nm；步骤8将步骤7中喷涂有金属粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。
2. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤1中的人工海水，按200L曝 气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成，其pH值为8. 2。
3. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤3中的注射，采用微量注射 器穿过健康个体的外套膜将抗体注射到外套腔的中心部位。
4. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤4中的去离子水采用经超纯 水仪器过滤后的三蒸水。
5. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤7中的金属片采用能够导电 的金属片。
6. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，所述步骤7中的金属粉采用金粉或者 铂金粉。
7. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，该方法为选取壳径4. 5cm、湿重32g 的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为 8. 2的人工海水中饲养3天，淘汰其中不健康的个体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重 组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿 化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯化；分别取纯化后的抗体和留用的健康 个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康个体的湿重注射l.Oi!g纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体采用微量注射器注射到注射组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注射到外套腔的中心部位，对照组中的 健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射3天；分别取NaOH固体和超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度 为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝 壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处 理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置于空气中干燥12h，然后，储存于干燥 器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围lmm内的区域，将截取的该区域贴在能够导电的金 属片上，然后，将金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有金 粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过 程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。
8. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，该方法为选取壳径6cm、湿重40g的 合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为 8. 2的人工海水中饲养5天，淘汰其中不健康的个体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重 组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿 化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯化；分别取纯化后的抗体和留用的健康 个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康 个体的湿重注射l.Oiig纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体采用微量注射器注射到注射 组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注射到外套腔的中心部位，对照组中的 健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射5天；分别取NaOH固体和 超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度 为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝 壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处 理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置于空气中干燥18h，然后，储存于干燥 器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围2mm内的区域，将截取的该区域贴在能够导电的金 属片上，然后，将铂金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂有 铂金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿 化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。
9. 按照权利要求1所述的实验方法，其特征在于，该方法为选取壳径5. 3cm、湿重36g 的合浦珠母贝，置于按200L曝气后的自来水中溶解6. 67kg海盐的比例配制而成的pH值为 8. 2的人工海水中饲养4天，淘汰其中不健康的个体，留用健康的个体；取合浦珠母贝的重 组的可溶性基质蛋白，将该可溶性基质蛋白注射到新西兰兔体内，采用现有方法制取与矿 化相关的可溶性基质蛋白抗体，并将该抗体进行纯化；分别取纯化后的抗体和留用的健康 个体，将健康个体分为注射组和对照组，每个注射组由四个健康个体组成，按每天1克健康 个体的湿重注射1. 0 ii g纯化后抗体的比例，将纯化后的抗体采用微量注射器注射到注射 组健康个体的体内，注射时穿过健康个体的外套膜注射到外套腔的中心部位，对照组中的 健康个体等量注射未免疫的兔血清，注射组和对照组均连续注射4天；分别取NaOH固体和 超纯水，按100ml超纯水中加入5g NaOH固体的比例，将NaOH固体溶解于超纯水，制得浓度 为50g/L的NaOH溶液；分别取注射抗体后的健康个体和制得的NaOH溶液，将健康个体的贝 壳分离，用去离子水洗净，然后，浸没于NaOH溶液中8h，去除贝壳表面黏附的有机质；将处 理后的贝壳用经超纯水仪器过滤后的三蒸水清洗，置于空气中干燥15h，然后，储存于干燥 器内；取干燥后的贝壳，截取注射点周围1. 5mm内的区域，将截取的该区域贴在能够导电的金属片上，然后，将铂金粉喷涂于贴在金属片上的贝壳表面，喷涂厚度为20 30nm，将喷涂 有铂金粉的贝壳置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对 矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。
全文摘要
合浦珠母贝抗体活体注射实验方法，将合浦珠母贝置于人工海水中饲养，留用健康个体；制取与矿化相关的可溶性基质蛋白抗体，并纯化该抗体；按比例，将纯化抗体注射到注射组健康个体的体内，对照组等量注射未免疫的兔血清；将注射后的健康个体的贝壳分离，清洗，浸没于NaOH溶液中8h，再清洗，空气干燥；将干燥的贝壳，截取注射点周围的区域，并贴在金属片上，在贝壳表面喷涂金属粉；然后，置于电子扫描显微镜下，观察最内层珍珠层的异常生长情况，确定抗体对矿化过程的影响，进而定位某一基质蛋白在矿化过程中的作用。本发明提供了一种体内研究生物贝类矿化以及体内因子和信号通路的研究方式，为矿化模型的研究提供了新思路。
文档编号A61K39/395GK101711867SQ20091021908
公开日2010年5月26日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者上官俊龙, 刘晓军, 周玉娟, 张荣庆, 李琪, 谢莉萍 申请人:清华大学
最新回复(0)