基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠和包含普伐他汀钠的组合物的制作方法
专利名称：基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠和包含普伐他汀钠的组合物的制作方法
有关申请的交叉引用本申请根据35 U.S.C.119(e)要求以2000年10月5日申请的美国临时申请No.60/238,276为优先权，该申请在此引入作为参考。
普伐他汀为化合物[1S-[1α(β*，δ*)2α，6α，8β(R*)，8aα]]-1，2，6，7，8，8a-六氢-β，δ，6-三羟基-2-甲基-8-(2-甲基-1-氧代丁氧基)-1-萘-庚酸的普通药物名(CAS登记号为81093-370)。普伐他汀的分子结构由式(Ia)表示，其中R＝OH。内酯形式由式(Ib)表示，其中对原子加以标记以表示原子的编号。 普伐他汀，可杷汀(式Ia，R＝H)，洛伐他汀(式Ia，R＝CH3)，西伐他汀，氟伐他汀和阿托伐他汀各自具有一个以羧基为端基的烷基链，且在相对于羧酸基的β和δ位带有两个羟基。羧基和在δ位的羟基容易如式(Ib)所示内酯化。可内酯化的化合物例如抑制素可以以游离酸形式或内酯形式，或以两种形式的平衡混合物形式存在。内酯化作用导致抑制素药物制造中的加工困难，因为化合物的游离酸和内酯形式具有不同的极性。纯化一种形式的方法可能将另一种形式与杂质一起除去，而导致收率降低。因此，为了以高收率分离可内酯化的化合物，在处理时必须非常小心。
目前最经济可行的普伐他汀制造方法是通过在可杷汀的C-6位的微生物羟化进行的。尽管酶催化工艺是高度立体选择性的，但对于所获得的普伐他汀钠常见的是，在从发酵肉汤中分离后被大量的普伐他汀C-6差向异构体(″表普伐他汀(epiprava)″)所污染。C-6位为双烯丙基，因此C-6位原子易于差向异构化。为了将差向异构作用减到最少，需要小心地控制普伐他汀分离期间的pH值及其它条件。由发酵肉汤分离普伐他汀的已知方法既不合适于以普伐他汀钠盐的形式分离普伐他汀，也不合适于制造被大量普伐他汀内酯和/或表普伐他汀(epiprava)污染的普伐他汀钠。本发明满足本领域的需要，提供了一种由发酵肉汤以高纯度、高收率、在制备级规模以及无需色谱纯化来分离普伐他汀钠的有效方法。
该方法的一种优选实施方案包括由含水的发酵肉汤中将普伐他汀萃取到有机溶剂中，反萃取普伐他汀至碱性水溶液中，并再萃取至有机溶剂中，得到相对于发酵肉汤中普伐他汀的起始浓度被富集了的普伐他汀有机溶液。普伐他汀可以从富集了的溶液中通过以其铵盐形式沉淀而后通过重结晶提纯该铵盐来获得。然后将重结晶的盐置换成普伐他汀钠盐的形式，并用离子交换树脂清除过量的钠离子。然后可以将普伐他汀钠盐通过重结晶，冷冻干燥或其它方式从溶液中以高纯态分离出来。发明的详细说明本发明提供了基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠，和由发酵肉汤中以高纯度分离普伐他汀钠的后续方法。可杷汀的酶催化羟化用于分离普伐他汀的酶催化羟化的肉汤可以为任何已知的工业规模发酵的可杷汀肉汤水溶液，例如美国专利5,942,423和4,346,227中所述方法的肉汤。优选，酶催化羟化可用Steptomyces的活培养物与可杷汀和葡萄糖的营养混合物进行。如果肉汤在发酵完成后为中性或碱性，那么向其加入酸将肉汤pH值调至约1到6之间，优选1和5.5之间，且更优选在2到4之间。可以使用的酸包括盐酸，硫酸，三氟乙酸或任何其它质子酸，优选具有小于1的pH值的酸，以1M水溶液的形式。发酵肉汤的酸化将肉汤中的任何普伐他汀羧酸酯盐转化为游离酸和/或内酯。基本上纯的普伐他汀钠的分离普伐他汀首先从在相对高浓缩的有机溶液中的含水发酵肉汤通过一系列萃取和反萃取步骤获得。
在第一步中，从发酵肉汤中提取普伐他汀。C2-C4烷基甲酸和C2-C4羧酸的C1-C4烷基酯能够有效地从含水发酵肉汤中提取出普伐他汀。烷基基团可以是直链、支链或环状的。优选的酯包括甲酸乙酯，甲酸正丙酯，甲酸异丙酯，甲酸正丁酯，甲酸仲丁酯，甲酸异丁酯，甲酸叔丁酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸正丙酯，乙酸异丙酯，乙酸正丁酯，乙酸仲丁酯，乙酸异丁酯，乙酸叔丁酯，丙酸甲酯，丙酸乙酯，丙酸正丙酯，丙酸异丙酯，丙酸丁酯，丁酸甲酯，丁酸乙酯，丁酸正丙酯，丁酸异丙酯，丁酸丁酯，异丁酸甲酯，异丁酸乙酯，异丁酸丙酯和异丁酸丁酯。在这些优选的有机溶剂中我们发现乙酸乙酯，乙酸异丁酯，乙酸丙酯和甲酸乙酯是特别适合的。最优选的萃取溶剂为乙酸异丁酯。可以用其它有机溶剂代替酯。可以使用卤代的卤化烃，芳香化合物，酮和醚，例如二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，1，2-二氯乙烷，苯，丁基甲基酮，乙醚和甲基叔丁基醚。
将普伐他汀任选地反萃取到pH值约8.0到约9.5的碱性水溶液中。优选碱为NaOH，NH4OH或KOH，最优选NaOH。最好将萃取溶剂与碱性水溶液接触，直到普伐他汀在有机相中的量已经基本上耗尽，可通过薄层色谱法测定或任何其它方法确定，包括主观判断完全萃取时已经发生了足够的接触。为了得到最佳收率可以进行多次反萃取。然而，当有机相为乙酸异丁酯时一次反萃取就是高效的。反萃取可通过使用小于有机萃取液的体积的碱水溶液用于浓缩普伐他汀。优选，用小于三分之一有机萃取液体积的碱性水溶液体积来进行反萃取，更优选，用小于四分之一有机萃取液体积的碱性水溶液，且最优选用约小于五分之一有机萃取液体积的碱性水溶液体积来进行反萃取。
优选将水溶液用酸酸化，优选用三氟乙酸，盐酸，硫酸，乙酸，或磷酸，更优选硫酸，酸化至pH值约1.0到约6.5，更优选约2.0到约3.7。
优选将普伐他汀再萃取至先前所描述的适合于从发酵肉汤中萃取普伐他汀的有机溶剂的一种之中。有机溶剂可以是，但不必是，与从发酵肉汤中萃取普伐他汀所使用的相同溶剂。在此再萃取中，普伐他汀的进一步富集可以通过再萃取至优选小于约50％(v/v)水提取物的量的有机溶剂，更优选约33％(v/v)到约20％(v/v)，且更加优选约25％(v/v)水提取物的量的有机溶剂中来实现。普伐他汀可以从100L发酵肉汤中以89％的收率从初始的有机萃取液中浓缩至8L富集的有机溶液。本领域技术人员将完全了解可以通过进行多次提取来获得较高收率的纯化普伐他汀，其中已经在实际应用本发明的优选方式中描述了只有单次萃取的情况。该优选的方式实现了节约溶剂和高产品产率的平衡。离开此优选的方式而进一步通过反复进行萃取来进一步提高收率，其中仅仅有一次萃取已经如以上所描述，未必是背离了本发明的实质。在通过“盐析”从富集的有机溶液中得到普伐他汀之前，优选将富集的有机溶液干燥，干燥可使用常规的干燥剂例如MgSO4，Na2SO4，CaSO4，二氧化硅，珍珠岩等等进行，且任选地用活性碳脱色。然后优选将干燥和/或脱色了的富集的有机溶液常规分离，例如通过过滤或倾析。
在下一步中，可以从富集的有机溶液中用氨或胺以盐析出普伐他汀。胺可以是伯、仲或叔胺。可以使用任何烷基或芳基胺，只要其位阻不是太大以至于阻止了胺中的氮与普伐他汀的羧基的离子相互作用就可以。胺包括，但不局限于，甲基，二甲基，三甲基，乙基，二乙基，三乙基及其它C1-C6伯、仲和叔胺；且进一步包括吗啉，N-甲基吗啉，异丙基环己基胺，哌啶等等。无论在氮上没有、存在或有多重取代，由氨或胺反应形成的盐在下文中都被称为铵盐。其含义是意图包括胺的盐以及氨的盐。
普伐他汀的铵盐沉淀还可以通过单独添加铵盐或与氨或胺结合一起加入铵盐来诱导。优选的铵盐为下面的氨的盐NH4Cl，NH4Br，NH4I，(NH4)2SO4，NH4NO3，(NH4)3PO4，(NH4)2S2O4和NH4OAc，最优选NH4Cl。可以通过常规方法加入铵盐和高沸点液体和固体胺，优选在具有良好通风的地方，或者以固体，纯的液体或者以在水中或有机溶剂中的溶液的形式加入。气态氨的加入需要用来处理腐蚀性气体的特殊设备。这样的设备包括压力容器，控制器，阀门和管线是可普遍得到的。在特别优选的实施方案中，普伐他汀是从富集的有机溶液中通过向富集的有机溶液中加入气态氨和NH4Cl以普伐他汀氨盐的形式获得的。
加入氨，胺和/或铵盐的温度可通过常规实验确定，即通过进行小规模地反应并监测反应的放热性来确定。优选溶液温度不能超过40℃。尽管在高达80℃的温度下经验没有发现普伐他汀显著的分解，但本发明的许多有机溶剂将在较低的温度下沸腾。当使用氨时，适宜的温度范围在约-10℃到约40℃。
优选，一旦看起来沉淀已经停止或一旦通过用其它方法测定普伐他汀的消耗基本上完成，就应该停止加入。当使用氨或挥发性胺时，优选容器是可排气的以将过剩量的烟分散。然后可以将结晶通过过滤、溶剂的倾析、溶剂的蒸发或其它诸如此类的方法分离，优选通过过滤分离。然后将结晶洗涤，优选用乙酸异丁酯和丙酮洗涤。
在任选地洗涤沉淀结晶后，将普伐他汀铵盐优选通过一或多次，或最优选通过三次重结晶纯化。为纯化普伐他汀铵盐，优选将盐溶于水中。优选通过加入反溶剂(anti-solvent)减少溶液的极性。反溶剂优选为水溶性的有机溶剂或溶剂混合物，普伐他汀盐在其中是几乎不可溶的，优选乙酸异丁酯和丙酮。
可以将普伐他汀盐自然地重结晶，或可以通过进行进一步的加入共同离子的步骤而被诱导重结晶。根据其中普伐他汀以铵盐的形式被纯化的优选方法，可加入NH4Cl诱导铵盐的重结晶。
重结晶可以在约-10℃到约40℃下进行，优选在约0℃到约40℃下进行。当普伐他汀盐已经基本上从溶液中重结晶出来后，分离结晶，并可以用例如1∶1的乙酸异丁酯和丙酮的混合物洗涤，而后干燥。干燥可以在环境温度下进行，但优选在适度地升温至小于45℃且优选约40℃的温度下进行。可以任选地反复重结晶以得到好的效果，如实施例3和4所示。每次重复的收率约9 2％。
提纯普伐他汀铵盐后，优选将普伐他汀铵盐置换为普伐他汀钠。优选通过溶解在含水溶剂中，用任何一种质子酸但优选硫酸酸化至pH值约2到约4，更优选约pH3.1，并用有机溶剂萃取普伐他汀，将普伐他汀从铵盐中释放出来。可将有机溶剂，其可以是以上所列的任何有机溶剂，但优选为乙酸异丁酯，任选地与酸化的溶液接触，直到普伐他汀基本上完全转入有机相。优选将有机相与水相分离，并在任选地用水洗涤以除去铵残余物后，优选用氢氧化钠水溶液在pH值约7.4至约13.0下反萃取普伐他汀。反萃取优选在降温至约8到约10℃下进行。
萃取至氢氧化钠水溶液中后，使用水不溶性的离子交换树脂清除过量的钠阳离子以获得接近1∶1当量的钠阳离子和普伐他汀。适合离子交换树脂为阳离子的和螯合物类型的树脂，优选强和弱酸性离子交换树脂。
在强酸性阳离子交换树脂中，可以使用具有磺酸(SO3-H+)基团的阳离子交换树脂。这些包括商业产品AmberliteIR-118，IR-120252H；Amberlyst15，36；Amberjet 1200(H)(Rohm & Haas公司)；Dowex50WX系列，Dowex HCR-W2，Dowex 650C，Dowex Marathon C，DowexDR-2030，和Dowex HCR-S，离子交换树脂(道化学公司)；DIAION SK102至DIAION SK 116树脂系列和Lewatit SP 120(Bayer)。优选的强酸性阳离子交换树脂为Amberlite120，Dowex 50WX和DIAION SK系列。
弱酸性阳离子交换树脂包括具有羧酸基团侧基的那些树脂。弱酸性阳离子交换树脂包括商业产品Amberlite CG-50，IRP-64，IRC 50和C67，Dowex CCR系列，Lewatit CNP系列(Bayer)和DIAION WK系列(Mitsubishi)，在这些中最优选AmberliteIRC50，Lewatit CNP80和DIAION WK 10。较少优选螯合物类型离子交换树脂。一些商业可得到的品种包括AmberliteIRC-718和IRC-467。
可将包含普伐他汀钠盐和过量的钠阳离子的溶液与离子交换树脂通过任何本领域已知的方法接触，包括将溶液通过树脂柱或床，或通过将足够量的树脂在烧瓶中与溶液搅拌。接触的方式不是关键的。清除过量的钠离子后，普伐他汀钠溶液的pH值应该在约7到约10的范围内，优选在约7.4到约7.8的范围内，尽管pH值将随稀释度而变化。将普伐他汀钠溶液的pH值从较高pH值降低至较低的pH值，而后在较低水平下pH值的稳定表明已经实质上完成了过量的Na离子的清除。基本上完成钠的清除后，优选将普伐他汀钠溶液与树脂以常规的方式分离。可将其或者以洗脱液的形式从柱或床上收集，或者可通过过滤，倾析等等加以分离。
可以将普伐他汀钠从普伐他汀溶液中通过结晶的方法分离。有效的结晶首先需要部分除去水，可以通过真空蒸馏或微过滤进行水的除去。优选，在结晶之前将普伐他汀钠盐水溶液从约20w/v％浓缩至约50w/v％。如果必要的话，浓缩后可以将普伐他汀钠水溶液用处于H+形式下的离子交换树脂调节pH值至约7到约10之间。
向普伐他汀钠溶液中加入水溶性的有机溶剂或有机溶剂混合物将有助于结晶。特别可提及的是丙酮，和丙酮/乙腈，乙醇/乙腈和乙醇/乙酸乙酯混合物。为了结晶普伐他汀钠，最优选的一种溶剂体系为1/3/12水/丙酮/乙腈混合物，是通过浓缩普伐他汀钠溶液至约30w/v％，而后加入合适体积的1/4丙酮/乙腈混合物而形成的。最优选的结晶溶剂混合物为水-丙酮(1∶15)。
还可以将普伐他汀钠通过冷冻干燥普伐他汀钠水溶液的方法来分离。
不论通过冷冻干燥或结晶，或其它方法分离，都不会减少产品的纯度，在本发明的实际应用中分离的普伐他汀钠都基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀。如以下的实施例所证明，可以分离出带有小于0.5％(w/w)普伐他汀内酯杂质和小于0.2％(w/w)表普伐他汀杂质的普伐他汀钠。根据本发明的优选实施方案，其中两个以实施例1和3所举例说明，可以进一步分离出带有小于0.2％(w/w)普伐他汀内酯和0.1％表普伐他汀的普伐他汀钠。
通过本发明的方法制备的高纯度的普伐他汀钠可优选用于高胆固醇血症的治疗，且为此目的可将其通过任何一种给药途径对患病的哺乳动物给药。最优选的处方给药方法为每日口服的方式。对于具有正常的肝功能和中等体重的患者，每日内服10毫克以上量的普伐他汀钠可典型地观察到血清胆固醇水平的降低。所给予的高纯普伐他汀钠的量可以为任何有效量。优选的本发明的口服给药量包含约10毫克到约40毫克的普伐他汀钠。口服剂包括片剂，药丸，胶囊，药片，小袋，悬浮液，粉末，糖淀，酏剂等等。基本上纯的普伐他汀钠可通过任何途径给药，但最优选的给药途径为口服。
可以单独或与药物赋形剂的组合物形式给予高纯的普伐他汀钠。不论单独用药或以组合物形式给药，本发明的高纯普伐他汀钠都可以是以溶液的形式，或以固体例如粉末，颗粒剂，团粒或任何其它的固体形式。
本发明的组合物包括用于片剂的组合物。片剂组合物可以根据所使用的制片方法，所要求的释放速度及其它因素，而具有很少的或许多赋形剂。例如，本发明的组合物可以包含稀释剂例如衍生于纤维素的材料例如粉末纤维素，微晶纤维素，微细纤维素，甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素盐及其它取代和未取代的纤维素；淀粉；预胶凝淀粉；无机稀释剂例如碳酸钙和磷酸氢钙及其它制药工业已知的稀释剂。其它适合的稀释剂包括石蜡，糖和糖醇例如甘露糖醇和山梨糖醇，丙烯酸酯聚合物和共聚物，以及果胶，糊精和凝胶。
其它片剂赋形剂包括粘合剂，例如阿拉伯胶(acacia gum)，预胶凝淀粉，海藻酸钠，葡萄糖及其它用于湿法和干法造粒和直接压片方法的粘合剂。存在于新型普伐他汀钠固体组合物中的赋形剂还可以进一步包括崩解剂例如淀粉羟基乙酸钠，聚乙烯聚吡咯烷酮，低-取代的羟丙基纤维素及其它。其它赋形剂包括片剂润滑剂例如硬脂酸镁和硬脂酸钙和硬脂酰富马酸钠盐；矫味剂；甜味剂；防腐剂；药学可接受的染料和助流剂例如二氧化硅。
胶囊剂将包含在胶囊内的固体组合物，其由凝胶或其它包封物质制得。片剂和粉末可以是包衣的。片剂和粉末可以是涂有肠溶衣的。肠衣粉末形式可具有包括邻苯二甲酸醋酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，聚乙烯醇邻苯二甲酸酯，羧甲基乙基纤维素，苯乙烯和马来酸共聚物，甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，和类似材料的包衣，且如果需要的话，它们可以与适合的增塑剂和/或填充剂一起使用。包衣的片剂可能在片剂表面上具有包衣，或可以为包括带有肠道-包衣的粉末或颗粒剂的片剂。
还可以将高纯普伐他汀钠以在无菌溶液或悬浮液中的溶解物或悬浮固体的注射剂形式给药。适合无菌注射剂的载体包括水和油。
尽管下面的实施例举例说明了本发明在某些实施方案中的实现，但这些实施例将不会被看作是对于本发明范围的限制。考虑到说明书和实施例，其它实施方案对本领域技术人员是显而易见的。说明书，包括实施例仅仅是示范例的，而本发明范围和实质将通过所附的权利要求加以表示。
然后将氨气在快速搅拌下引入到溶液的液面上空间。过滤收集沉淀下来的普伐他汀羧酸铵盐结晶，用乙酸异丁酯洗涤，而后用丙酮洗涤，得到经HPLC与在λ＝238nm处测定出的UV吸光度联合测定，纯度约94％的普伐他汀铵盐。
可以将普伐他汀铵盐如下地进一步从饱和氯化铵溶液中结晶纯化。将包含162克活性物质的普伐他汀盐在大约35-40℃下溶于水(960毫升)，并用丙酮(96毫升)和异乙酸丁酯(96毫升)稀释。将溶液冷却至约30-32℃，并通过加入固体NH4Cl诱导普伐他汀铵结晶，直到进一步加入NH4Cl不再明显增加晶体的形成。加入氯化铵后，将溶液冷却至约0-26℃。过滤收集普伐他汀铵结晶，用乙酸异丁酯和丙酮洗涤，如前所述，而后在大约40℃下干燥。以约98％纯度得到普伐他汀铵盐结晶(155.5克)，纯度通过HPLC使用前述的条件测定。
可以将普伐他汀铵盐通过如下的另一次结晶进一步纯化。将普伐他汀铵盐(155.5克活性物质)溶于水(900毫升)。加入异丁醇(2毫升)，而后通过加入氢氧化钠浓溶液使pH值升至约pH10到约pH13.7，将溶液在环境温度下搅拌30分钟。通过加入硫酸中和溶液至pH值约7，并通过加入固体NH4Cl诱导普伐他汀铵的结晶。过滤收集结晶(150克)，并用丙酮洗涤。使用以上描述的条件通过HPLC检测普伐他汀铵为99.3％纯度。
然后将普伐他汀铵盐通过如下的方法置换为钠盐。将普伐他汀铵盐结晶溶于水(1800毫升)。加入乙酸异丁酯(10.5L)。然后将溶液通过精确的加入硫酸酸化至pH值约2到约4之间，将普伐他汀转化为游离酸。将包含普伐他汀的乙酸异丁酯相用水(5×10ml)洗涤。然后将普伐他汀转变为其钠盐，并通过在900-2700毫升之间的水上部涡旋乙酸异丁酯溶液反萃取其钠盐至另一水相，同时间歇的加入8M NaOH直到pH值在约pH7.4至约pH13之间。
然后将普伐他汀钠盐溶液用离子交换树脂处理以清除过量的钠阳离子。分离后，将水相用IRC 50在H+离子交换树脂中在环境温度下搅拌30分钟。继续搅拌，直到达到约pH7.4-约pH7.8之间的pH值。
然后过滤溶液以除去树脂，并在真空下部分浓缩至重量508克。然后加入乙腈(480毫升)，并将溶液与活性碳(5克)搅拌脱色。通过结晶得到结晶的普伐他汀钠，收率90％，进一步加入丙酮和乙腈后，形成水/丙酮/乙腈的1/3/12混合物(5.9L)，冷却至约-10到约0℃。得到从起始发酵活性物质算总收率65％，通过使用以上描述的HPLC条件测定纯度约99.8％的普伐他汀钠。
实施例2按照实施例1的方法，但省略从水/丙酮/乙腈混合物重结晶的步骤，冷冻干燥普伐他汀钠在水中的浓溶液，得到纯度约99％和收率约72％的普伐他汀钠。
实施例3按照实施例1的方法，但通过重复一次普伐他汀铵盐的结晶步骤进一步纯化普伐他汀铵盐，得到纯度99.8％和收率68.4％的普伐他汀钠。
实施例4按照实施例1的方法，但通过重复两次普伐他汀铵盐的结晶步骤进一步纯化普伐他汀铵盐，得到纯度99.6％和收率53％的普伐他汀钠。
实施例5按照实施例1的方法，通过加入硫酸将发酵肉汤(100L)酸化至pH值约2.5到约5.0。将酸化的发酵肉汤(broth)用乙酸异丁酯(3×50L)萃取。然后将合并的乙酸异丁酯相用水(35L)萃取，并通过加入浓氢氧化铵碱化至约pH7.5到约pH11.0的pH值。
代替实施例1中所进行的再次酸化水提取物和用乙酸异丁酯萃取得到进一步富集的有机溶液，将水提取物在真空下浓缩至140克/L。然后通过加入1M HCl将得到的浓溶液酸化到约pH4.0至约pH7.5的pH值。
然后向浓缩溶液中加入氯化铵结晶(405克)，使普伐他汀铵盐在环境温度下结晶。然后过滤分离结晶，并用氯化铵饱和溶液洗涤。然后将结晶加入到40℃下的水(1L)中。溶解后，将温度降至30℃，向溶液中加入氯化铵(330克)。然后在环境温度下搅拌溶液15小时，并过滤回收普伐他汀铵盐结晶，用乙酸异丁酯洗涤，然后用丙酮洗涤并干燥。然后将得到的结晶如实施例1所述，进一步重结晶纯化，置换成钠盐，并分离。得到纯度约99.9％且收率67.7％的普伐他汀钠。
实施例6按照实施例1的方法，但普伐他汀钠盐是在水/丙酮的1/15混合物中结晶的，从起始发酵的活性物质算总收率64％，用HPLC测定纯度99.8％。
实施例7按照实施例5头两段的方法，得到浓缩的水提取物(140克/L)。将浓缩的水提取物分成相等的部分。
实施例8按照实施例1中的方法，从发酵肉汤中分离普伐他汀铵盐，但将活性物质溶解并用氨气沉淀后结晶。
将富集的普伐他汀乙酸异丁酯溶液(6500L)用活性炭(6.5千克)脱色。然后将溶液过滤以除去活性炭，并转入装有进气口的容器。
溶液包含183.2千克活性物质。
按照实施例1中的方法用氨气沉淀普伐他汀铵盐。
通过向容器中在乙酸异丁酯母液的存在下加入水(1099L)将沉淀的普伐他汀铵盐溶解。
通过向容器中加入氯化铵(412千克)将普伐他汀铵盐结晶。将氯化铵以31份在30-32℃下于5小时的时间加入。将悬浮液在24-26℃下搅拌1小时。过滤结晶，悬浮在乙酸异丁酯中并过滤，然后悬浮在乙酸异丁酯∶丙酮(2∶1)中并过滤，然后悬浮在丙酮中并过滤。用丙酮洗涤后真空干燥结晶。
该方法得到纯度约93％的普伐他汀铵盐，纯度通过HPLC法在λ＝238nm处UV检测测定。结晶的活性物质为168.7千克。
实施例9按照实施例1中的方法，从发酵肉汤中分离普伐他汀铵盐，但使用结晶代替用氨气沉淀。
将富集的普伐他汀乙酸异丁酯溶液(4150毫升)用活性炭(4.15克)脱色。然后将溶液过滤以除去活性炭，并转入烧瓶中。
向乙酸异丁酯溶液中加入水(300毫升)。用浓氨溶液(27毫升)调节pH值至9.36。
通过向烧瓶中加入氯化铵(121.5克)将普伐他汀铵盐结晶。将氯化铵以多份在30-32℃下于5小时的时间加入。将悬浮液在24-26℃下搅拌15小时。过滤结晶，多次悬浮，洗涤并干燥。
该方法得到纯度约95％的普伐他汀铵盐，纯度通过HPLC法测定。结晶的活性物质为42.7克。
实施例10按照实施例8的方法，制备纯度约93％的普伐他汀铵盐。
将活性物质(10克)在35-40℃下溶于水(60毫升)∶丙酮(6毫升)∶乙酸异丁酯(6毫升)的混合物。将溶液冷却到30-32℃。将氯化铵(22克)以多份于5小时的时间加入到溶液中。
将悬浮液冷却至24-26℃，将其搅拌一小时，然后将普伐他汀铵盐过滤，用乙酸异丁酯洗涤，然后用丙酮洗涤。
将普伐他汀铵盐在40℃下干燥。收率为96％。纯度为97％。
实施例11按照实施例8的方法，制备纯度约93％的普伐他汀铵盐。
将活性物质(10克)在35-40℃下溶于水(60毫升)∶丙酮(6毫升)∶乙酸异丁酯(6毫升)的混合物。将溶液冷却到30-32℃。将氯化钠(11.4克)以多份于3小时的时间加入到溶液中。
将普伐他汀钠盐过滤，用乙酸异丁酯洗涤，然后用丙酮洗涤，然后在40℃下干燥。
收率为77％。纯度为97％。
实施例12按照实施例8的方法，制备纯度约93％的普伐他汀铵盐。
将活性物质(10克)在35-40℃下溶于水(60毫升)∶丙酮(6毫升)∶乙酸异丁酯(6毫升)的混合物。将溶液冷却到30-32℃。氯化锂(9.3克)被用来盐析结晶。
将过滤的普伐他汀锂盐用乙酸异丁酯洗涤，并干燥。
得到纯度96％且收率89％的普伐他汀锂盐。
权利要求
1.基本上纯的普伐他汀钠。
2.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.5％的普伐他汀内酯。
3.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.2％的表普伐他汀。
4.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.5％的普伐他汀内酯和小于0.2％的表普伐他汀。
5.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.2％的普伐他汀内酯。
6.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.1％的表普伐他汀。
7.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.2％的普伐他汀内酯和小于0.1％的表普伐他汀。
8.通过以下方法制备的基本上纯的普伐他汀钠，该方法包括以下的步骤a)形成普伐他汀有机溶液b)得到固体普伐他汀作为普伐他汀盐；c)通过重结晶纯化普伐他汀盐；d)将普伐他汀盐的阳离子置换为普伐他汀钠；和e)分离出基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠。
9.权利要求8的方法，其中普伐他汀的有机溶液为富集的普伐他汀的有机溶液。
10.权利要求8的方法，其中普伐他汀盐的阳离子为胺。
11.权利要求10的方法，其中胺选自铵，伯胺，仲胺和叔胺。
12.权利要求8的方法，其中普伐他汀盐的阳离子为碱金属阳离子。
13.权利要求12的方法，其中碱金属阳离子选自锂，钠和钾。
14.权利要求8的方法，其中固体普伐他汀是呈结晶的形式。
15.权利要求8的方法，其中固体普伐他汀是呈无定形沉淀的形式。
16.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中普伐他汀的有机溶液是通过以下方法形成的用第一种有机溶剂萃取含水的发酵肉汤，用水溶液在pH值约8.0到约9.5下反萃取普伐他汀，酸化此碱性的水溶液至pH值约2.0到约3.7，并用第二种有机溶剂萃取酸化的水溶液以形成普伐他汀有机溶液。
17.权利要求16的基本上纯的普伐他汀钠，其中第一种和第二种有机溶剂为乙酸异丁酯。
18.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中铵盐是通过从水和反溶剂的混合物中至少一次结晶来纯化的。
19.权利要求18的基本上纯的普伐他汀钠，其中反溶剂选自乙酸异丁酯和丙酮。
20.权利要求18的基本上纯的普伐他汀钠，其中向水和反溶剂的混合物中加入氯化铵以诱导铵盐的结晶。
21.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中使用酸性或螯合离子交换树脂置换铵盐。
22.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中将普伐他汀钠通过重结晶分离。
23.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中将普伐他汀钠通过冷冻干燥分离。
24.包含普伐他汀钠和小于约0.5％的普伐他汀内酯的制剂。
25.包含权利要求1的基本上纯的普伐他汀钠的药物组合物。
26.包含权利要求25的药物组合物的药物剂型。
27.包含权利要求1的基本上纯的普伐他汀钠的药物剂型。
全文摘要
本发明提供了基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠，表普伐他汀为普伐他汀的C－6差向异构体。本发明进一步提供了从发酵肉汤中以高纯度回收普伐他汀钠的新方法。该方法包括通过萃取形成化合物的溶液，从溶液中得到普伐他汀铵盐，纯化该化合物的铵盐，并置换该化合物的盐至普伐他汀钠的步骤。
文档编号A61K31/22GK1468098SQ01816860
公开日2004年1月14日 申请日期2001年10月5日 优先权日2000年10月5日
发明者V·克里, L·德克, I·福尔加克斯, C·绍博, A·E·纳吉尼, V 克里, 涌怂, 纳吉尼 申请人:拜奥盖尔药厂有限公司
有关申请的交叉引用本申请根据35 U.S.C.119(e)要求以2000年10月5日申请的美国临时申请No.60/238,276为优先权，该申请在此引入作为参考。
普伐他汀为化合物[1S-[1α(β*，δ*)2α，6α，8β(R*)，8aα]]-1，2，6，7，8，8a-六氢-β，δ，6-三羟基-2-甲基-8-(2-甲基-1-氧代丁氧基)-1-萘-庚酸的普通药物名(CAS登记号为81093-370)。普伐他汀的分子结构由式(Ia)表示，其中R＝OH。内酯形式由式(Ib)表示，其中对原子加以标记以表示原子的编号。 普伐他汀，可杷汀(式Ia，R＝H)，洛伐他汀(式Ia，R＝CH3)，西伐他汀，氟伐他汀和阿托伐他汀各自具有一个以羧基为端基的烷基链，且在相对于羧酸基的β和δ位带有两个羟基。羧基和在δ位的羟基容易如式(Ib)所示内酯化。可内酯化的化合物例如抑制素可以以游离酸形式或内酯形式，或以两种形式的平衡混合物形式存在。内酯化作用导致抑制素药物制造中的加工困难，因为化合物的游离酸和内酯形式具有不同的极性。纯化一种形式的方法可能将另一种形式与杂质一起除去，而导致收率降低。因此，为了以高收率分离可内酯化的化合物，在处理时必须非常小心。
目前最经济可行的普伐他汀制造方法是通过在可杷汀的C-6位的微生物羟化进行的。尽管酶催化工艺是高度立体选择性的，但对于所获得的普伐他汀钠常见的是，在从发酵肉汤中分离后被大量的普伐他汀C-6差向异构体(″表普伐他汀(epiprava)″)所污染。C-6位为双烯丙基，因此C-6位原子易于差向异构化。为了将差向异构作用减到最少，需要小心地控制普伐他汀分离期间的pH值及其它条件。由发酵肉汤分离普伐他汀的已知方法既不合适于以普伐他汀钠盐的形式分离普伐他汀，也不合适于制造被大量普伐他汀内酯和/或表普伐他汀(epiprava)污染的普伐他汀钠。本发明满足本领域的需要，提供了一种由发酵肉汤以高纯度、高收率、在制备级规模以及无需色谱纯化来分离普伐他汀钠的有效方法。
该方法的一种优选实施方案包括由含水的发酵肉汤中将普伐他汀萃取到有机溶剂中，反萃取普伐他汀至碱性水溶液中，并再萃取至有机溶剂中，得到相对于发酵肉汤中普伐他汀的起始浓度被富集了的普伐他汀有机溶液。普伐他汀可以从富集了的溶液中通过以其铵盐形式沉淀而后通过重结晶提纯该铵盐来获得。然后将重结晶的盐置换成普伐他汀钠盐的形式，并用离子交换树脂清除过量的钠离子。然后可以将普伐他汀钠盐通过重结晶，冷冻干燥或其它方式从溶液中以高纯态分离出来。发明的详细说明本发明提供了基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠，和由发酵肉汤中以高纯度分离普伐他汀钠的后续方法。可杷汀的酶催化羟化用于分离普伐他汀的酶催化羟化的肉汤可以为任何已知的工业规模发酵的可杷汀肉汤水溶液，例如美国专利5,942,423和4,346,227中所述方法的肉汤。优选，酶催化羟化可用Steptomyces的活培养物与可杷汀和葡萄糖的营养混合物进行。如果肉汤在发酵完成后为中性或碱性，那么向其加入酸将肉汤pH值调至约1到6之间，优选1和5.5之间，且更优选在2到4之间。可以使用的酸包括盐酸，硫酸，三氟乙酸或任何其它质子酸，优选具有小于1的pH值的酸，以1M水溶液的形式。发酵肉汤的酸化将肉汤中的任何普伐他汀羧酸酯盐转化为游离酸和/或内酯。基本上纯的普伐他汀钠的分离普伐他汀首先从在相对高浓缩的有机溶液中的含水发酵肉汤通过一系列萃取和反萃取步骤获得。
在第一步中，从发酵肉汤中提取普伐他汀。C2-C4烷基甲酸和C2-C4羧酸的C1-C4烷基酯能够有效地从含水发酵肉汤中提取出普伐他汀。烷基基团可以是直链、支链或环状的。优选的酯包括甲酸乙酯，甲酸正丙酯，甲酸异丙酯，甲酸正丁酯，甲酸仲丁酯，甲酸异丁酯，甲酸叔丁酯，乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸正丙酯，乙酸异丙酯，乙酸正丁酯，乙酸仲丁酯，乙酸异丁酯，乙酸叔丁酯，丙酸甲酯，丙酸乙酯，丙酸正丙酯，丙酸异丙酯，丙酸丁酯，丁酸甲酯，丁酸乙酯，丁酸正丙酯，丁酸异丙酯，丁酸丁酯，异丁酸甲酯，异丁酸乙酯，异丁酸丙酯和异丁酸丁酯。在这些优选的有机溶剂中我们发现乙酸乙酯，乙酸异丁酯，乙酸丙酯和甲酸乙酯是特别适合的。最优选的萃取溶剂为乙酸异丁酯。可以用其它有机溶剂代替酯。可以使用卤代的卤化烃，芳香化合物，酮和醚，例如二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，1，2-二氯乙烷，苯，丁基甲基酮，乙醚和甲基叔丁基醚。
将普伐他汀任选地反萃取到pH值约8.0到约9.5的碱性水溶液中。优选碱为NaOH，NH4OH或KOH，最优选NaOH。最好将萃取溶剂与碱性水溶液接触，直到普伐他汀在有机相中的量已经基本上耗尽，可通过薄层色谱法测定或任何其它方法确定，包括主观判断完全萃取时已经发生了足够的接触。为了得到最佳收率可以进行多次反萃取。然而，当有机相为乙酸异丁酯时一次反萃取就是高效的。反萃取可通过使用小于有机萃取液的体积的碱水溶液用于浓缩普伐他汀。优选，用小于三分之一有机萃取液体积的碱性水溶液体积来进行反萃取，更优选，用小于四分之一有机萃取液体积的碱性水溶液，且最优选用约小于五分之一有机萃取液体积的碱性水溶液体积来进行反萃取。
优选将水溶液用酸酸化，优选用三氟乙酸，盐酸，硫酸，乙酸，或磷酸，更优选硫酸，酸化至pH值约1.0到约6.5，更优选约2.0到约3.7。
优选将普伐他汀再萃取至先前所描述的适合于从发酵肉汤中萃取普伐他汀的有机溶剂的一种之中。有机溶剂可以是，但不必是，与从发酵肉汤中萃取普伐他汀所使用的相同溶剂。在此再萃取中，普伐他汀的进一步富集可以通过再萃取至优选小于约50％(v/v)水提取物的量的有机溶剂，更优选约33％(v/v)到约20％(v/v)，且更加优选约25％(v/v)水提取物的量的有机溶剂中来实现。普伐他汀可以从100L发酵肉汤中以89％的收率从初始的有机萃取液中浓缩至8L富集的有机溶液。本领域技术人员将完全了解可以通过进行多次提取来获得较高收率的纯化普伐他汀，其中已经在实际应用本发明的优选方式中描述了只有单次萃取的情况。该优选的方式实现了节约溶剂和高产品产率的平衡。离开此优选的方式而进一步通过反复进行萃取来进一步提高收率，其中仅仅有一次萃取已经如以上所描述，未必是背离了本发明的实质。在通过“盐析”从富集的有机溶液中得到普伐他汀之前，优选将富集的有机溶液干燥，干燥可使用常规的干燥剂例如MgSO4，Na2SO4，CaSO4，二氧化硅，珍珠岩等等进行，且任选地用活性碳脱色。然后优选将干燥和/或脱色了的富集的有机溶液常规分离，例如通过过滤或倾析。
在下一步中，可以从富集的有机溶液中用氨或胺以盐析出普伐他汀。胺可以是伯、仲或叔胺。可以使用任何烷基或芳基胺，只要其位阻不是太大以至于阻止了胺中的氮与普伐他汀的羧基的离子相互作用就可以。胺包括，但不局限于，甲基，二甲基，三甲基，乙基，二乙基，三乙基及其它C1-C6伯、仲和叔胺；且进一步包括吗啉，N-甲基吗啉，异丙基环己基胺，哌啶等等。无论在氮上没有、存在或有多重取代，由氨或胺反应形成的盐在下文中都被称为铵盐。其含义是意图包括胺的盐以及氨的盐。
普伐他汀的铵盐沉淀还可以通过单独添加铵盐或与氨或胺结合一起加入铵盐来诱导。优选的铵盐为下面的氨的盐NH4Cl，NH4Br，NH4I，(NH4)2SO4，NH4NO3，(NH4)3PO4，(NH4)2S2O4和NH4OAc，最优选NH4Cl。可以通过常规方法加入铵盐和高沸点液体和固体胺，优选在具有良好通风的地方，或者以固体，纯的液体或者以在水中或有机溶剂中的溶液的形式加入。气态氨的加入需要用来处理腐蚀性气体的特殊设备。这样的设备包括压力容器，控制器，阀门和管线是可普遍得到的。在特别优选的实施方案中，普伐他汀是从富集的有机溶液中通过向富集的有机溶液中加入气态氨和NH4Cl以普伐他汀氨盐的形式获得的。
加入氨，胺和/或铵盐的温度可通过常规实验确定，即通过进行小规模地反应并监测反应的放热性来确定。优选溶液温度不能超过40℃。尽管在高达80℃的温度下经验没有发现普伐他汀显著的分解，但本发明的许多有机溶剂将在较低的温度下沸腾。当使用氨时，适宜的温度范围在约-10℃到约40℃。
优选，一旦看起来沉淀已经停止或一旦通过用其它方法测定普伐他汀的消耗基本上完成，就应该停止加入。当使用氨或挥发性胺时，优选容器是可排气的以将过剩量的烟分散。然后可以将结晶通过过滤、溶剂的倾析、溶剂的蒸发或其它诸如此类的方法分离，优选通过过滤分离。然后将结晶洗涤，优选用乙酸异丁酯和丙酮洗涤。
在任选地洗涤沉淀结晶后，将普伐他汀铵盐优选通过一或多次，或最优选通过三次重结晶纯化。为纯化普伐他汀铵盐，优选将盐溶于水中。优选通过加入反溶剂(anti-solvent)减少溶液的极性。反溶剂优选为水溶性的有机溶剂或溶剂混合物，普伐他汀盐在其中是几乎不可溶的，优选乙酸异丁酯和丙酮。
可以将普伐他汀盐自然地重结晶，或可以通过进行进一步的加入共同离子的步骤而被诱导重结晶。根据其中普伐他汀以铵盐的形式被纯化的优选方法，可加入NH4Cl诱导铵盐的重结晶。
重结晶可以在约-10℃到约40℃下进行，优选在约0℃到约40℃下进行。当普伐他汀盐已经基本上从溶液中重结晶出来后，分离结晶，并可以用例如1∶1的乙酸异丁酯和丙酮的混合物洗涤，而后干燥。干燥可以在环境温度下进行，但优选在适度地升温至小于45℃且优选约40℃的温度下进行。可以任选地反复重结晶以得到好的效果，如实施例3和4所示。每次重复的收率约9 2％。
提纯普伐他汀铵盐后，优选将普伐他汀铵盐置换为普伐他汀钠。优选通过溶解在含水溶剂中，用任何一种质子酸但优选硫酸酸化至pH值约2到约4，更优选约pH3.1，并用有机溶剂萃取普伐他汀，将普伐他汀从铵盐中释放出来。可将有机溶剂，其可以是以上所列的任何有机溶剂，但优选为乙酸异丁酯，任选地与酸化的溶液接触，直到普伐他汀基本上完全转入有机相。优选将有机相与水相分离，并在任选地用水洗涤以除去铵残余物后，优选用氢氧化钠水溶液在pH值约7.4至约13.0下反萃取普伐他汀。反萃取优选在降温至约8到约10℃下进行。
萃取至氢氧化钠水溶液中后，使用水不溶性的离子交换树脂清除过量的钠阳离子以获得接近1∶1当量的钠阳离子和普伐他汀。适合离子交换树脂为阳离子的和螯合物类型的树脂，优选强和弱酸性离子交换树脂。
在强酸性阳离子交换树脂中，可以使用具有磺酸(SO3-H+)基团的阳离子交换树脂。这些包括商业产品AmberliteIR-118，IR-120252H；Amberlyst15，36；Amberjet 1200(H)(Rohm & Haas公司)；Dowex50WX系列，Dowex HCR-W2，Dowex 650C，Dowex Marathon C，DowexDR-2030，和Dowex HCR-S，离子交换树脂(道化学公司)；DIAION SK102至DIAION SK 116树脂系列和Lewatit SP 120(Bayer)。优选的强酸性阳离子交换树脂为Amberlite120，Dowex 50WX和DIAION SK系列。
弱酸性阳离子交换树脂包括具有羧酸基团侧基的那些树脂。弱酸性阳离子交换树脂包括商业产品Amberlite CG-50，IRP-64，IRC 50和C67，Dowex CCR系列，Lewatit CNP系列(Bayer)和DIAION WK系列(Mitsubishi)，在这些中最优选AmberliteIRC50，Lewatit CNP80和DIAION WK 10。较少优选螯合物类型离子交换树脂。一些商业可得到的品种包括AmberliteIRC-718和IRC-467。
可将包含普伐他汀钠盐和过量的钠阳离子的溶液与离子交换树脂通过任何本领域已知的方法接触，包括将溶液通过树脂柱或床，或通过将足够量的树脂在烧瓶中与溶液搅拌。接触的方式不是关键的。清除过量的钠离子后，普伐他汀钠溶液的pH值应该在约7到约10的范围内，优选在约7.4到约7.8的范围内，尽管pH值将随稀释度而变化。将普伐他汀钠溶液的pH值从较高pH值降低至较低的pH值，而后在较低水平下pH值的稳定表明已经实质上完成了过量的Na离子的清除。基本上完成钠的清除后，优选将普伐他汀钠溶液与树脂以常规的方式分离。可将其或者以洗脱液的形式从柱或床上收集，或者可通过过滤，倾析等等加以分离。
可以将普伐他汀钠从普伐他汀溶液中通过结晶的方法分离。有效的结晶首先需要部分除去水，可以通过真空蒸馏或微过滤进行水的除去。优选，在结晶之前将普伐他汀钠盐水溶液从约20w/v％浓缩至约50w/v％。如果必要的话，浓缩后可以将普伐他汀钠水溶液用处于H+形式下的离子交换树脂调节pH值至约7到约10之间。
向普伐他汀钠溶液中加入水溶性的有机溶剂或有机溶剂混合物将有助于结晶。特别可提及的是丙酮，和丙酮/乙腈，乙醇/乙腈和乙醇/乙酸乙酯混合物。为了结晶普伐他汀钠，最优选的一种溶剂体系为1/3/12水/丙酮/乙腈混合物，是通过浓缩普伐他汀钠溶液至约30w/v％，而后加入合适体积的1/4丙酮/乙腈混合物而形成的。最优选的结晶溶剂混合物为水-丙酮(1∶15)。
还可以将普伐他汀钠通过冷冻干燥普伐他汀钠水溶液的方法来分离。
不论通过冷冻干燥或结晶，或其它方法分离，都不会减少产品的纯度，在本发明的实际应用中分离的普伐他汀钠都基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀。如以下的实施例所证明，可以分离出带有小于0.5％(w/w)普伐他汀内酯杂质和小于0.2％(w/w)表普伐他汀杂质的普伐他汀钠。根据本发明的优选实施方案，其中两个以实施例1和3所举例说明，可以进一步分离出带有小于0.2％(w/w)普伐他汀内酯和0.1％表普伐他汀的普伐他汀钠。
通过本发明的方法制备的高纯度的普伐他汀钠可优选用于高胆固醇血症的治疗，且为此目的可将其通过任何一种给药途径对患病的哺乳动物给药。最优选的处方给药方法为每日口服的方式。对于具有正常的肝功能和中等体重的患者，每日内服10毫克以上量的普伐他汀钠可典型地观察到血清胆固醇水平的降低。所给予的高纯普伐他汀钠的量可以为任何有效量。优选的本发明的口服给药量包含约10毫克到约40毫克的普伐他汀钠。口服剂包括片剂，药丸，胶囊，药片，小袋，悬浮液，粉末，糖淀，酏剂等等。基本上纯的普伐他汀钠可通过任何途径给药，但最优选的给药途径为口服。
可以单独或与药物赋形剂的组合物形式给予高纯的普伐他汀钠。不论单独用药或以组合物形式给药，本发明的高纯普伐他汀钠都可以是以溶液的形式，或以固体例如粉末，颗粒剂，团粒或任何其它的固体形式。
本发明的组合物包括用于片剂的组合物。片剂组合物可以根据所使用的制片方法，所要求的释放速度及其它因素，而具有很少的或许多赋形剂。例如，本发明的组合物可以包含稀释剂例如衍生于纤维素的材料例如粉末纤维素，微晶纤维素，微细纤维素，甲基纤维素，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素盐及其它取代和未取代的纤维素；淀粉；预胶凝淀粉；无机稀释剂例如碳酸钙和磷酸氢钙及其它制药工业已知的稀释剂。其它适合的稀释剂包括石蜡，糖和糖醇例如甘露糖醇和山梨糖醇，丙烯酸酯聚合物和共聚物，以及果胶，糊精和凝胶。
其它片剂赋形剂包括粘合剂，例如阿拉伯胶(acacia gum)，预胶凝淀粉，海藻酸钠，葡萄糖及其它用于湿法和干法造粒和直接压片方法的粘合剂。存在于新型普伐他汀钠固体组合物中的赋形剂还可以进一步包括崩解剂例如淀粉羟基乙酸钠，聚乙烯聚吡咯烷酮，低-取代的羟丙基纤维素及其它。其它赋形剂包括片剂润滑剂例如硬脂酸镁和硬脂酸钙和硬脂酰富马酸钠盐；矫味剂；甜味剂；防腐剂；药学可接受的染料和助流剂例如二氧化硅。
胶囊剂将包含在胶囊内的固体组合物，其由凝胶或其它包封物质制得。片剂和粉末可以是包衣的。片剂和粉末可以是涂有肠溶衣的。肠衣粉末形式可具有包括邻苯二甲酸醋酸纤维素，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，聚乙烯醇邻苯二甲酸酯，羧甲基乙基纤维素，苯乙烯和马来酸共聚物，甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的共聚物，和类似材料的包衣，且如果需要的话，它们可以与适合的增塑剂和/或填充剂一起使用。包衣的片剂可能在片剂表面上具有包衣，或可以为包括带有肠道-包衣的粉末或颗粒剂的片剂。
还可以将高纯普伐他汀钠以在无菌溶液或悬浮液中的溶解物或悬浮固体的注射剂形式给药。适合无菌注射剂的载体包括水和油。
尽管下面的实施例举例说明了本发明在某些实施方案中的实现，但这些实施例将不会被看作是对于本发明范围的限制。考虑到说明书和实施例，其它实施方案对本领域技术人员是显而易见的。说明书，包括实施例仅仅是示范例的，而本发明范围和实质将通过所附的权利要求加以表示。
然后将氨气在快速搅拌下引入到溶液的液面上空间。过滤收集沉淀下来的普伐他汀羧酸铵盐结晶，用乙酸异丁酯洗涤，而后用丙酮洗涤，得到经HPLC与在λ＝238nm处测定出的UV吸光度联合测定，纯度约94％的普伐他汀铵盐。
可以将普伐他汀铵盐如下地进一步从饱和氯化铵溶液中结晶纯化。将包含162克活性物质的普伐他汀盐在大约35-40℃下溶于水(960毫升)，并用丙酮(96毫升)和异乙酸丁酯(96毫升)稀释。将溶液冷却至约30-32℃，并通过加入固体NH4Cl诱导普伐他汀铵结晶，直到进一步加入NH4Cl不再明显增加晶体的形成。加入氯化铵后，将溶液冷却至约0-26℃。过滤收集普伐他汀铵结晶，用乙酸异丁酯和丙酮洗涤，如前所述，而后在大约40℃下干燥。以约98％纯度得到普伐他汀铵盐结晶(155.5克)，纯度通过HPLC使用前述的条件测定。
可以将普伐他汀铵盐通过如下的另一次结晶进一步纯化。将普伐他汀铵盐(155.5克活性物质)溶于水(900毫升)。加入异丁醇(2毫升)，而后通过加入氢氧化钠浓溶液使pH值升至约pH10到约pH13.7，将溶液在环境温度下搅拌30分钟。通过加入硫酸中和溶液至pH值约7，并通过加入固体NH4Cl诱导普伐他汀铵的结晶。过滤收集结晶(150克)，并用丙酮洗涤。使用以上描述的条件通过HPLC检测普伐他汀铵为99.3％纯度。
然后将普伐他汀铵盐通过如下的方法置换为钠盐。将普伐他汀铵盐结晶溶于水(1800毫升)。加入乙酸异丁酯(10.5L)。然后将溶液通过精确的加入硫酸酸化至pH值约2到约4之间，将普伐他汀转化为游离酸。将包含普伐他汀的乙酸异丁酯相用水(5×10ml)洗涤。然后将普伐他汀转变为其钠盐，并通过在900-2700毫升之间的水上部涡旋乙酸异丁酯溶液反萃取其钠盐至另一水相，同时间歇的加入8M NaOH直到pH值在约pH7.4至约pH13之间。
然后将普伐他汀钠盐溶液用离子交换树脂处理以清除过量的钠阳离子。分离后，将水相用IRC 50在H+离子交换树脂中在环境温度下搅拌30分钟。继续搅拌，直到达到约pH7.4-约pH7.8之间的pH值。
然后过滤溶液以除去树脂，并在真空下部分浓缩至重量508克。然后加入乙腈(480毫升)，并将溶液与活性碳(5克)搅拌脱色。通过结晶得到结晶的普伐他汀钠，收率90％，进一步加入丙酮和乙腈后，形成水/丙酮/乙腈的1/3/12混合物(5.9L)，冷却至约-10到约0℃。得到从起始发酵活性物质算总收率65％，通过使用以上描述的HPLC条件测定纯度约99.8％的普伐他汀钠。
实施例2按照实施例1的方法，但省略从水/丙酮/乙腈混合物重结晶的步骤，冷冻干燥普伐他汀钠在水中的浓溶液，得到纯度约99％和收率约72％的普伐他汀钠。
实施例3按照实施例1的方法，但通过重复一次普伐他汀铵盐的结晶步骤进一步纯化普伐他汀铵盐，得到纯度99.8％和收率68.4％的普伐他汀钠。
实施例4按照实施例1的方法，但通过重复两次普伐他汀铵盐的结晶步骤进一步纯化普伐他汀铵盐，得到纯度99.6％和收率53％的普伐他汀钠。
实施例5按照实施例1的方法，通过加入硫酸将发酵肉汤(100L)酸化至pH值约2.5到约5.0。将酸化的发酵肉汤(broth)用乙酸异丁酯(3×50L)萃取。然后将合并的乙酸异丁酯相用水(35L)萃取，并通过加入浓氢氧化铵碱化至约pH7.5到约pH11.0的pH值。
代替实施例1中所进行的再次酸化水提取物和用乙酸异丁酯萃取得到进一步富集的有机溶液，将水提取物在真空下浓缩至140克/L。然后通过加入1M HCl将得到的浓溶液酸化到约pH4.0至约pH7.5的pH值。
然后向浓缩溶液中加入氯化铵结晶(405克)，使普伐他汀铵盐在环境温度下结晶。然后过滤分离结晶，并用氯化铵饱和溶液洗涤。然后将结晶加入到40℃下的水(1L)中。溶解后，将温度降至30℃，向溶液中加入氯化铵(330克)。然后在环境温度下搅拌溶液15小时，并过滤回收普伐他汀铵盐结晶，用乙酸异丁酯洗涤，然后用丙酮洗涤并干燥。然后将得到的结晶如实施例1所述，进一步重结晶纯化，置换成钠盐，并分离。得到纯度约99.9％且收率67.7％的普伐他汀钠。
实施例6按照实施例1的方法，但普伐他汀钠盐是在水/丙酮的1/15混合物中结晶的，从起始发酵的活性物质算总收率64％，用HPLC测定纯度99.8％。
实施例7按照实施例5头两段的方法，得到浓缩的水提取物(140克/L)。将浓缩的水提取物分成相等的部分。
实施例8按照实施例1中的方法，从发酵肉汤中分离普伐他汀铵盐，但将活性物质溶解并用氨气沉淀后结晶。
将富集的普伐他汀乙酸异丁酯溶液(6500L)用活性炭(6.5千克)脱色。然后将溶液过滤以除去活性炭，并转入装有进气口的容器。
溶液包含183.2千克活性物质。
按照实施例1中的方法用氨气沉淀普伐他汀铵盐。
通过向容器中在乙酸异丁酯母液的存在下加入水(1099L)将沉淀的普伐他汀铵盐溶解。
通过向容器中加入氯化铵(412千克)将普伐他汀铵盐结晶。将氯化铵以31份在30-32℃下于5小时的时间加入。将悬浮液在24-26℃下搅拌1小时。过滤结晶，悬浮在乙酸异丁酯中并过滤，然后悬浮在乙酸异丁酯∶丙酮(2∶1)中并过滤，然后悬浮在丙酮中并过滤。用丙酮洗涤后真空干燥结晶。
该方法得到纯度约93％的普伐他汀铵盐，纯度通过HPLC法在λ＝238nm处UV检测测定。结晶的活性物质为168.7千克。
实施例9按照实施例1中的方法，从发酵肉汤中分离普伐他汀铵盐，但使用结晶代替用氨气沉淀。
将富集的普伐他汀乙酸异丁酯溶液(4150毫升)用活性炭(4.15克)脱色。然后将溶液过滤以除去活性炭，并转入烧瓶中。
向乙酸异丁酯溶液中加入水(300毫升)。用浓氨溶液(27毫升)调节pH值至9.36。
通过向烧瓶中加入氯化铵(121.5克)将普伐他汀铵盐结晶。将氯化铵以多份在30-32℃下于5小时的时间加入。将悬浮液在24-26℃下搅拌15小时。过滤结晶，多次悬浮，洗涤并干燥。
该方法得到纯度约95％的普伐他汀铵盐，纯度通过HPLC法测定。结晶的活性物质为42.7克。
实施例10按照实施例8的方法，制备纯度约93％的普伐他汀铵盐。
将活性物质(10克)在35-40℃下溶于水(60毫升)∶丙酮(6毫升)∶乙酸异丁酯(6毫升)的混合物。将溶液冷却到30-32℃。将氯化铵(22克)以多份于5小时的时间加入到溶液中。
将悬浮液冷却至24-26℃，将其搅拌一小时，然后将普伐他汀铵盐过滤，用乙酸异丁酯洗涤，然后用丙酮洗涤。
将普伐他汀铵盐在40℃下干燥。收率为96％。纯度为97％。
实施例11按照实施例8的方法，制备纯度约93％的普伐他汀铵盐。
将活性物质(10克)在35-40℃下溶于水(60毫升)∶丙酮(6毫升)∶乙酸异丁酯(6毫升)的混合物。将溶液冷却到30-32℃。将氯化钠(11.4克)以多份于3小时的时间加入到溶液中。
将普伐他汀钠盐过滤，用乙酸异丁酯洗涤，然后用丙酮洗涤，然后在40℃下干燥。
收率为77％。纯度为97％。
实施例12按照实施例8的方法，制备纯度约93％的普伐他汀铵盐。
将活性物质(10克)在35-40℃下溶于水(60毫升)∶丙酮(6毫升)∶乙酸异丁酯(6毫升)的混合物。将溶液冷却到30-32℃。氯化锂(9.3克)被用来盐析结晶。
将过滤的普伐他汀锂盐用乙酸异丁酯洗涤，并干燥。
得到纯度96％且收率89％的普伐他汀锂盐。
权利要求
1.基本上纯的普伐他汀钠。
2.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.5％的普伐他汀内酯。
3.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.2％的表普伐他汀。
4.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.5％的普伐他汀内酯和小于0.2％的表普伐他汀。
5.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.2％的普伐他汀内酯。
6.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.1％的表普伐他汀。
7.权利要求1的普伐他汀钠，包含小于0.2％的普伐他汀内酯和小于0.1％的表普伐他汀。
8.通过以下方法制备的基本上纯的普伐他汀钠，该方法包括以下的步骤a)形成普伐他汀有机溶液b)得到固体普伐他汀作为普伐他汀盐；c)通过重结晶纯化普伐他汀盐；d)将普伐他汀盐的阳离子置换为普伐他汀钠；和e)分离出基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠。
9.权利要求8的方法，其中普伐他汀的有机溶液为富集的普伐他汀的有机溶液。
10.权利要求8的方法，其中普伐他汀盐的阳离子为胺。
11.权利要求10的方法，其中胺选自铵，伯胺，仲胺和叔胺。
12.权利要求8的方法，其中普伐他汀盐的阳离子为碱金属阳离子。
13.权利要求12的方法，其中碱金属阳离子选自锂，钠和钾。
14.权利要求8的方法，其中固体普伐他汀是呈结晶的形式。
15.权利要求8的方法，其中固体普伐他汀是呈无定形沉淀的形式。
16.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中普伐他汀的有机溶液是通过以下方法形成的用第一种有机溶剂萃取含水的发酵肉汤，用水溶液在pH值约8.0到约9.5下反萃取普伐他汀，酸化此碱性的水溶液至pH值约2.0到约3.7，并用第二种有机溶剂萃取酸化的水溶液以形成普伐他汀有机溶液。
17.权利要求16的基本上纯的普伐他汀钠，其中第一种和第二种有机溶剂为乙酸异丁酯。
18.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中铵盐是通过从水和反溶剂的混合物中至少一次结晶来纯化的。
19.权利要求18的基本上纯的普伐他汀钠，其中反溶剂选自乙酸异丁酯和丙酮。
20.权利要求18的基本上纯的普伐他汀钠，其中向水和反溶剂的混合物中加入氯化铵以诱导铵盐的结晶。
21.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中使用酸性或螯合离子交换树脂置换铵盐。
22.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中将普伐他汀钠通过重结晶分离。
23.权利要求8的基本上纯的普伐他汀钠，其中将普伐他汀钠通过冷冻干燥分离。
24.包含普伐他汀钠和小于约0.5％的普伐他汀内酯的制剂。
25.包含权利要求1的基本上纯的普伐他汀钠的药物组合物。
26.包含权利要求25的药物组合物的药物剂型。
27.包含权利要求1的基本上纯的普伐他汀钠的药物剂型。
全文摘要
本发明提供了基本上无普伐他汀内酯和表普伐他汀的普伐他汀钠，表普伐他汀为普伐他汀的C－6差向异构体。本发明进一步提供了从发酵肉汤中以高纯度回收普伐他汀钠的新方法。该方法包括通过萃取形成化合物的溶液，从溶液中得到普伐他汀铵盐，纯化该化合物的铵盐，并置换该化合物的盐至普伐他汀钠的步骤。
文档编号A61K31/22GK1468098SQ01816860
公开日2004年1月14日 申请日期2001年10月5日 优先权日2000年10月5日
发明者V·克里, L·德克, I·福尔加克斯, C·绍博, A·E·纳吉尼, V 克里, 涌怂, 纳吉尼 申请人:拜奥盖尔药厂有限公司
最新回复(0)