三七及其提取物在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的用途的制作方法
专利名称：三七及其提取物在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及三七、三七提取物、三七总皂苷以及三七总皂苷组合物的新用途，特别
是在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物方面的新用途。
背景技术：
三七是五加科植物，具有活血、散瘀、消炎、镇痛的功效。除有上述作用外，还具有 降低人体凝血因子的特殊作用。fg是肝脏合成的一种血浆球蛋白。其主要功能为参与凝血 过程。fg升高可增高心、脑血管病发生率。口服生三七粉能降低fg水平，有利于控制心、 脑血管病的发生。《中草药》2008年05期刊登的中国澳门大学中华医药研究院的王楠、万 建波、李铭源、王一涛有关《三七治疗动脉粥样硬化的研究进展》一文指出动脉粥样硬化是 导致心脑血管事件发生的关键因素，为多种心脑血管疾病共同的病理生理基础。其症候、病 机等属于中医理论的"血瘀证"。而三七自古便是历代医家常用的活血化瘀之要药。换而言 之，三七在防治动脉粥样硬化方面有其神奇之处。 糖尿病的神经病变并发症常直接或间接参与动脉粥样硬化的发生和发展，因此， 利用三七防治动脉粥样硬化的作用来治疗糖尿病并发症是可行的。 三七总皂苷是从三七植物总提取的有效物质，三七药物植物的化学成分较多，主 要由四环三萜达玛烷型原人参二醇组皂苷和四环三萜达玛烷型原人参三醇组皂苷组成。 三七总皂苷对高脂血症、高粘血症、高血压、心肌缺血、心律失常、动脉粥样硬化等症状均有 一定疗效，而且还具有防止血栓形成、改善微循环、抗心脑缺血、促进造血细胞、抗纤维化、 对神经细胞损伤的保护作用。由上所述，使用三七总皂苷为原料做成的三七总皂苷注射制 剂是一种独具多功能的注射剂，而且这些功效都具有独立性，集若干重要生物活性，能发挥 若干种临床功能于一药。所有的这些功能里，有的功能是相对立的，矛盾的。由于三七总皂 苷中成份十分复杂，目前尚未能真正明确具体什么成份起主要治疗作用，成份之间的作用 机理也没有人作过全面的研究。
发明内容
三七提取物的有效成分主要为三七总皂苷，有活血祛瘀、通脉活络之功效，根据我 公司对三七总皂苷的临床研究和药效学研究，发现三七总皂苷具有预防和治疗糖尿病性神 经病变的明显疗效。 糖尿病是由多种病因引起以慢性高血粮为特征的代谢紊乱。久病可引起多系统损
害，导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织的慢性进行性病变，引起功能缺陷及衰竭。 糖尿病的慢性并发症可遍及全身各重要器官，与遗传易感性、高血糖、氧化应激、
非酶糖化和多元醇代谢旁路、蛋白激酶C等多方面因素的相互影响有关。这些并发症可单
独出现或以不同组合同时或先后出现。有时并发症有诊断糖尿病前已存在，有些患者因这
些并发症作为线索而发现糖尿病。
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神经病变是糖尿病的慢性并发症之一。糖尿病神经病变主要由微血管病变及山梨 醇旁路代谢增强以致山梨醇增多等所致。电生理检查可发现感觉和运动神经传导速度减 慢。 糖尿病周围神经病变是在长期血糖控制不理想的基础上发生的。发病机制尚不清 楚。比较公认的是与血管障碍、代谢紊乱，肌神经营养因子减少等多种因素有关。血管改变 有毛细血管内膜和细胞基底膜增生、血小板的聚集增加。纤维素的沉积等使微血管管腔狭 窄和闭塞。从而引起微循环供血不足、缺血、纤维素缺乏，使末梢神经轴突变性，发生脱髓鞘 改变，因而临床上出现一系列表现。 本发明专利从中药三七提取的三七总皂苷。临床生理研究证明其有阻止细胞的 钙离子内流、降低胞浆内钙离子浓度，扩张血管；改善组织的微循环，同时有提高血小板内 CAMP含量而抑制血小板聚集，并降低全血粘度。由此而有利于组织的供血供氧。此外，三七 总皂苷有镇定和镇痛作用。本发明专利用于治疗糖尿病周围神经病变患者显效率达89%。 其机制可能是既修复了损伤的神经又改善了滋养神经的微循环，加上有镇静、镇痛作用，所 以疗效较为显著。 本发明专利临床应用的安全性较高，在糖尿病性神经病变的药物治疗中不失为一 种好药，其拓宽了中药制剂治疗冠心病的新方法，在不能开展介入治疗的基层医院尤为适 用。 因此，申请人提供一种制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物方面的新用 途。 本发明公开了一种制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物方面的新用途，其 特征在于所述三七总皂苷组合物中含有活性成份，该活性成份由三七提取的三七总皂苷活 性成份组成，三七皂苷&含量大于8.0%、人参皂苷Rgl含量大于25 % 、人参皂苷Rl^含量 大于25%、人参皂苷Re含量大于4. 0%，且三七皂苷R"人参皂苷Rb^人参皂苷Rgl与人参 皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的75% 。
优选地，Rb! : Rg!为l.O : 0.5 2.0。 优选地，所述的有效成分组合物的含量是三七皂苷&含量大于8. 0%、人参皂苷 Rgi含量大于25X、人参皂苷Rbi含量大于25X、人参皂苷Re含量大于4.0X，且Rbi : Rgl
为i. o : i. o i. 8 ; 更优选地，所述的有效成分组合物的含量是三七皂苷&含量大于8. 0%、人参皂 苷R&含量大于25X、人参皂苷Rl^含量大于25X、人参皂苷Re含量大于4.0X，且Rl^ : Rgl 为1. 0 : 1. 4 1. 6 ; 优选地，三七皂苷Rp人参皂苷Rbp人参皂苷R^与人参皂苷Re的总重量大于活 性成份总重量的85% ; 更优选地，三七皂苷Rp人参皂苷Rbp人参皂苷Rgl与人参皂苷Re的总重量大于 活性成份总重量的90% ; 优选地，所述的有效成分组合物的含量是其中三七皂苷Ri含量为8X 15%、人 参皂苷Rg工含量为35X 52X、人参皂苷Re含量为4X 10X、人参皂苷Rbi含量为25X 40%。 本发明三七总皂苷活性成份组合物的剂型可以制成各种剂型，如制成注射液、注射用粉针剂，注射用冻干粉针剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、合剂、糖浆剂、胶囊剂、滴丸剂制 剂，优选制成注射液、注射用冻干粉针剂。
以下是本发明中药制剂的药材来源三七为五加科植物的干燥根。 申请人:还提供了一种制备所述的三七总皂苷活性成份组合物的方法，它包括如下
步骤 (1)取三七粉碎成粗粉1000g，加体积比为5-30倍的45_95%的乙醇提取0. 5 IO小时，收集提取液，过滤； (2)取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液； (3)溶液通过D型大孔树脂柱吸附，用乙醇_水的混合液进行梯度洗脱，流速按每
小时树脂体积的倍数计为4. 5BV/h，洗脱液中乙醇浓度逐步由5%调整至95%，收集含乙醇
浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，弃去含乙醇浓度在30%至70%以外的洗脱液，65t:
以下减压回收溶剂并浓縮至在6(TC下相对密度为1. 10 1. 20的清膏，低温干燥得三七总
皂苷组合物。 优选地，步骤(1)中加入7倍的乙醇；加入的乙醇浓度为65%;提取时间为7小时。
将三七总皂苷活性成份组合物根据制药领域中的常规方法，制成各种制剂。
上述过程获得的三七总皂苷活性成份组合物中各成份含量约为三七皂苷I^含量 大于8. 0%、人参皂苷Rgl含量大于25%、人参皂苷Rt^含量大于25%、人参皂苷Re含量大 于4.0X，且Rbi : Rg工为l.O : 0. 5 2.0，且三七皂苷Rp人参皂苷Rbp人参皂苷Rgi与 人参皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的75%。 基于上述三七总皂苷组合物，本发明的目的是提供该组合物的一种新用途，即在
制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用。它可以制成胶囊、注射剂、片剂、栓剂
或口服液等可使用的制剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 以下实验结果说明了该组合物的新药效，表明了本发明的有益效果。 根据上述三七总皂苷组合物制备的注射液对家兔糖尿病性神经病变的治疗和/
或预防作用实验。 1.实验材料 1. 1实验药物 根据本发明实施例1制备的样品；消渴丸(广州中一药业有限公司，国药准字 Z44020045，批号KY0111)。
1. 2试齐U 链脲霉素(str印tozotocin， STZ， sigma公司)；拧檬酸(北京市旭东化工厂，优 级纯，批号060706);柠檬酸钠(北京化学试剂公司，分析纯，批号20060606);戊巴比妥 钠(北京化学试剂公司，批号020919);葡萄糖测定试剂盒(中生北控生物科技股份有
限公司，批号060731);总胆固醇测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号
070471);甘油三酯测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号072011)。
1. 3实验仪器 离心机(LXJ-II，上海医用分析仪器厂)；多导生理记录仪(BIOPAC MP150，美国)； 半自动生化测定仪(Microlab 300， Vital Scientific Inc.)。
1. 4实验动物
Wistar大鼠，雄性，清洁级，体重180g-220g，来源中国医学科学院实验动物研究 所，许可证号SCXK(京)2005-0013。
2..实验方法
2. 1试剂配制 (l)20ml 0. 1M拧檬酸缓冲液(pH4. 4) :0. 1M拧檬酸11. 4ml+0. 1M拧檬酸钠8. 6ml ; (2)2% STZ :用0. 1M柠檬酸缓冲液配制，现配现用，置于冰浴中。
2. 2大鼠糖尿病模型的建立 大鼠禁食16h， 2 % STZ腹腔注射(50mg/kg ;0. 25ml/100g)，注射后72h尾静脉取 血，测定空腹血糖，空腹血糖水平> 300mg/dl(16. 7mM)为大鼠糖尿病模型造模成功。
2. 3实验分组剂量设置 (1)实施例1 :人的临床用药量为300mg/60kg/d， im。大鼠用药量为人临床用药量
的6倍。故而实验设置3个剂量组高剂量组(临床等效剂量的2倍)60mg/kg/d ;中剂量
组(临床等效剂量)30mg/kg/d ;低剂量组(临床等效剂量的1/2) 15mg/kg。 (2)消渴丸人的临床用法用量为，口服，一次3-10丸(2.5g/10丸)，2-3次/日。
选定人的临床用药量为5g/60kg/d。大鼠用药量为人临床用药量的6倍，故而消渴丸大鼠给
药量为500mg/kg/d。 2. 4实验分组及给药 大鼠按体重随机分组，确认糖尿病模型成功后，常规饮食饲喂12周，然后给予相 应药物干预如下
分组-v~ 动物数(只)剂量(mg/kg/d)给药途径给药时间(周)
正常对照组10等体积NSip12
模型组10等体积NSip12
消渴丸组10500ig12
实施例1低剂量组1015ip12
实施例1中剂量组1030ip12
实施例1高剂量组1060ip12 2. 5神经传导速度测定 末次给药后lh，大鼠戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉。分离大鼠坐骨神经，测定 电极两端距离(D)， Biopac多导生理记录仪测定剌激坐骨神经两点诱发腓肠肌动作电位的 M波潜伏期的差值(L)。根据及两剌激点间的距离(D)，计算出神经传导速度NCV，NCV二D/ L。 2. 6血糖、血脂测定 实验前禁食16h。腹主动脉采血，离心取血清，常规生化检测方法测定空腹血糖、
TC、TG水平。 3.实验结果 3. 1实施例1对糖尿病大鼠血脂及血糖的影响 表1实施例1对糖尿病大鼠血脂及血糖的影响(x士s)
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分组给药剂量 (mg/kg)NGlu (mmol/L)TC (mmol/L)TG (mmol/L)
空白对照组—103.05士0.78"'1.53±0.321.32±0.43
模型组—1028.99土4.84' 。 *1.53±0.492.38±1.40
消渴丸组5001022.44士9.00''''1.46±0.491.76±0.48
实施例1低剂 量组15928.78士4.06''。1.60±0.712.68±1.87
实施例1中剂 量组30624.78士4.06''41.60±0.192.84±1.92
实施例1高剂 量组60822.37士8.30' *''1.10±0.522.28±1.74 与空白组比较AP < 0. 05，AAP < 0. Ol，AAAP < 0. 001 ;与模型组比较*P < 0. 05，承承P < 0. 01，承承承P < 0. 001。 实验结果显示，经腹腔注射STZ后，模型组、消渴丸组及实施例l低、中、高组大鼠 血糖水平均显著高于空白对照组(P〈0.001)，表明大鼠糖尿病模型造模成功。连续给药 12周后，消渴丸(500mg/kg)与实施例1高剂量(60mg/kg)可以降低糖尿病大鼠血糖水平， 与模型组比较有显著性差异(p<0.05)。模型组与空白对照组比较，TC、TG水平未见显著 性差异(P>0. 05)，表明该糖尿病模型造模24周后，并未引起糖尿病大鼠血脂水平的变化。
以上结果表明，实施例1可降低糖尿大鼠血糖水平，对糖尿病大鼠的血糖水平具 有一定的调节作用。 3. 2实施例1对糖尿病大鼠神经传导的影响 表2实施例1对糖尿病大鼠神经传导速度的影响(x士s)
分组给药剂量(mg/kg)NNCV
空白对照组—636.47±10.23"'
模型组—918.94土4.88…
消渴丸组5001031.97士8.53"
实施例1低剂量组15720.74土6.86'4'
实施例1中剂量组30629.65±6.59'
实施例1高剂量组60832.73士10.95" 与空白组比较AAAP < 0.001 ;与模型组比较*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0. 001。 实验结果显示，腹腔注射STZ糖尿病造模后24周，模型组大鼠神经传导速度减慢， 与空白对照组比较有显著性差异(P < 0. 001)。消渴丸(500mg/kg)、实施例1中剂量(30mg/ kg)和实施例l大剂量(60mg/kg)均可提高糖尿病大鼠坐骨神经传导速度，与模型组比较有 显著性差异(P值分别为< 0. Ol，O. 05，0. 01)。 结果表明，实施例1可提高糖尿病大鼠神经传导速度，对糖尿病性神经传导功能具有一定的改善作用。
4.结论 本实验结果显示，经腹腔注射STZ后，糖尿病大鼠出现血糖水平升高、神经传导速 度减慢。经腹腔注射实施例1冻干粉针12周后，可降低糖尿病大鼠血糖水平、提高神经传 导速度；可改善大鼠糖尿病性视网膜小血管和神经纤维病变。
临床试验
—、对象 1999年WH0标准诊断的2型糖尿病患者共30例，全部来自住院病人。入选条件 为 四肢自发性疼痛或感觉障碍；肌电图示运动神经尤其是胫神经的感觉传导速度减 弱。排除其他原因所致的周围神经病变。 年龄62 85岁、血糖控制平稳(HbAlc < 7% );不合并使用治疗糖尿病神经病变 的药物2周以上。其中病程5 15年(糖尿病)，男性21例、女性9例。均无使用实施例
l(冻干粉针)的禁忌症。
二、方法 1、用药方法所有病例均在严格控制饮食及口服降糖药物或胰岛素治疗的基础 上，用实施例1 (冻干粉针)450mg+生理盐水100ml静脉滴注，每日1次，2周为1疗程，共2 个疗程。
2、疗效判断显效自觉症状明显好转或消失，腱反射明显好转或恢复正常，肌电 图神经传导速度较前增加5m/s以上或恢复正常。有效自觉症状改善，膝踝反射有所改善。 无效自觉症状无改善，神经肌腱反射和肌电图神经传导速度无变化。
三、统计方法 数据以X±S表示，同组治疗前后数据比较以配对t检验。
四、结果 1、一般临床特征30例糖尿病患者在观察过程中空腹血糖治疗前8. 5±1. 62mo1/
L ;治疗后为7. 9±1. 4mol/L，两者之间无明显差异。全部病人均坚持完成观察。 2、周围神经病变症状的主要变化治疗前上、下肢自发疼痛，感觉减退、麻木、发热
和发冷的发生率分别为50%、34%、42%、68%、16%、17%。经静脉用药四周后，上肢和下肢
自发性疼痛、感觉减退、麻木、发热的感觉明显改善，改善率60%以上。在治疗前后膝反射、
踝反射降低的改善率分别为49%、51%。如图l所示。 3、神经肌电图的测试30例病人当中有20例进行神经肌电图检查。如表2所示。 治疗前、后正中神经、胫神经、腓总神经的运动神经传导速度和正中神经、腓浅神经的感觉 神经传导速度明显提高。 30例测定治疗前、后的血常规、尿常规和肝功能、肾功能等指标无名显差异。
表I用实施例1 (冻干粉针)剂治疗后病人主观症状的改善
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类别 例数轻度中度 重度明显改善率(％)
下肢自发性疼痛1554 6
治疗四周后1386.67 (13/15)
上肢自发性疼痛1274 1
治疗四周后975.00(9/12)
麻木感22116 5
治疗四周后2090.90(20/22)
发热、发冷感24147 3
治疗四周后2187.50(21/24)
感觉减退18124 2
治疗四周后1161.11(11/18)
表2实施例1治疗运动和感觉神经传导速度(m/s)变化
运动神经感觉神经
治疗时间 正中神经胫神经腓总神经正中神经腓前神经
治疗前 41.2 ±5.730.2±3.530.6±3.440.9±5.228.5±5.9
治疗后 43.1 ±6.3*32.1±5.1*32.1 ±3.7*31.6±6.1*31.4±5.2* 与治疗前比较卢P〈0. 05
五、讨论 糖尿病周围神经病变是在长期血糖控制不理想的基础上发生的。发病机制尚不清 楚。比较公认的是与血管障碍、代谢紊乱，肌神经营养因子减少等多种因素有关。血管改变 有毛细血管内膜和细胞基底膜增生、血小板的聚集增加。纤维素的沉积等使微血管管腔狭 窄和闭塞。从而引起微循环供血不足、缺血、纤维素缺乏，使末梢神经轴突变性，发生脱髓鞘 改变，因而临床上出现一系列表现。实施例1是从中药三七提取的三七总皂苷。临床生理 研究证明其有阻止细胞的钙离子内流、降低胞浆内钙离子浓度，扩张血管；改善组织的微 循环，同时有提高血小板内CAMP含量而抑制血小板聚集，并降低全血粘度。由此而有利于 组织的供血供氧。此外，三七总皂苷有镇定和镇痛作用。用本发明专利治疗30例糖尿病周 围神经病变患者显效率达89%。其机制可能是既修复了损伤的神经又改善了滋养神经的微 循环，加上有镇静、镇痛作用，所以疗效较为显著。加上本发明专利性能稳定，在整个疗程中 未见不良反应，故可认为是一种治疗糖尿病周围神经病变的好药物，值得临床推广。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明 本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明 要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数(乙醇为体积百分比)， BV/h表示以树脂体积为V计，B为倍数，溶液每小时的洗脱体积为树脂体积BXV。
实施例1 : 取三七粉碎成粗粉1000g，加65%乙醇7000ml提取7小时，收集提取液，过滤，取水制成每1ml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为12. 47%、人参皂苷Rgl为 45. 12%、人参皂苷Re为6. 04%、人参皂苷Rl^为29. 94%，以上四成份总量为93. 57%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 51。
实施例2 : 取三七粉碎成粗粉1000g，加50%乙醇10000ml提取6小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 4g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱(乙醇浓度在5. 5小时内由5%调整至95% )，流速5. OBV/h，弃去含乙醇浓度在 30 %至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减 压回收溶剂并浓縮至相对密度为1. 15(60°C )的清膏，干燥，得三七总皂苷活性成份，加注 射用水调节每lml含固形物50mg 55mg，超滤，灌装，制成实施例1注射液。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为11. 54%、人参皂苷Rgl为 45. 26X、人参皂苷Re为5. 06X、人参皂苷R^为31. 26%，以上四成份总量为93. 12%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 45。
实施例3: 取三七粉碎成粗粉1000g，加75%乙醇7500ml提取8小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 6g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱(乙醇浓度在6. 5小时内由5%调整至95% )，流速4. OBV/h，弃去含乙醇浓度在 30 %至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减 压回收溶剂并浓縮至相对密度为1. 16(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加针用活性 炭0. 30% (重量比)，80°C以下保温搅拌30分钟，滤过，加注射用水调节每lml含固形物 150mg，冷冻干燥，分装，制成实施例1粉针剂。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为13. 3%、人参皂苷Rgl为 49. lX、人参皂苷Re为5. lX、人参皂苷Rbi为30. 9%，以上四成份总量为98. 4%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 59。
实施例4: 取三七粉碎成粗粉1000g，加80%乙醇8000ml提取6小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节
10每1ml含固形物lOOmg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷^为10. 1 % 、人参皂苷Rgl为 37. 4X、人参皂苷Re为4. 7X、人参皂苷Rl^为36. 17%，以上四成份总量为88. 37%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 03。
实施例5: 取三七粉碎成粗粉1000g，加85%乙醇8000ml提取8小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为10. 4%、人参皂苷Rgl为 39. 6X、人参皂苷Re为5. 2X、人参皂苷Rl^为36. 0%，以上四成份总量为91.2%，且 Rbi : Rgl为1. 0 : 1. 10。
实施例6: 取三七粉碎成粗粉1000g，加75%乙醇8000ml提取7小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷I^为13. 1X、人参皂苷R^为 41. 21%、人参皂苷Re为4. 9%、人参皂苷Rl^为34. 23%，以上四成份总量为93. 44%，且 Rbi : Rgl为1. 0 : 1. 20。
实施例7: 取三七粉碎成粗粉1000g，加65%乙醇6000ml提取8小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 12(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为9. 77%、人参皂苷Rgl为 44. 89% 、人参皂苷Re为4. 41 % 、人参皂苷Rl^为26. 01 % ，以上四成份总量为88. 08 % ，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 73。
实施例8:取三七粉碎成粗粉1000g，加90%乙醇10000ml提取9小时，收集提取液，过滤，取
11滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 12(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为12. 3%、人参皂苷Rgl为 23. 12X、人参皂苷Re为5. 81X、人参皂苷Rbi为34. 96%，以上四成份总量为76. 19%，且 Rbi : Rgl为1. 0 : 0. 66。
实施例9: 取三七粉碎成粗粉1000g，加85X乙醇9000ml提取10小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 12(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例9粉针剂。检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为13. 6%、人参皂苷Rgl为 51.01X、人参皂苷Re为5. lX、人参皂苷Rbi为28. 2%，以上四成份总量为97. 91%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 81。
实施例10 : 取三七粉碎成粗粉1000g，加65%乙醇7500ml提取9小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例10粉针剂。 检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为10. 12%、人参皂苷Rgl为 51.67X、人参皂苷Re为4. 4X、人参皂苷Rl^为27. 1%，以上四成份总量为93. 29%，且 Rb! : Rgl为1. 0 : 1. 91。
权利要求
三七植物在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用。
2. 三七植物提取物在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用。
3. 三七总皂苷在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用。
4. 一种三七总皂苷组合物在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用，其特征在于所述三七总皂苷组合物中含有活性成份，该活性成份由三七提取的三七总皂苷活性成份组成，其中三七皂苷&含量大于8.0%、人参皂苷Rgl含量大于25% 、人参皂苷Rl^含量大于25%、人参皂苷Re含量大于4. 0%，且三七皂苷R"人参皂苷Rb^人参皂苷Rgl与人参皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的75%，所述组合物通过下述方法制备(1) 取三七粉碎成粗粉1000g，加体积比为5-30倍的45-95%的乙醇提取0. 5 10小时，收集提取液，过滤；(2) 取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液；(3) 溶液通过D型大孔树脂柱吸附，用乙醇_水的混合液进行梯度洗脱，流速按每小时树脂体积的倍数计为4. 5BV/h，洗脱液中乙醇浓度逐步由5%调整至95%，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，弃去含乙醇浓度在30%至70%以外的洗脱液，65t:以下减压回收溶剂并浓縮至在6(TC下相对密度为1. 10 1. 20的清膏，低温干燥得三七总皂苷组合物。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于Rbl : Rgl为l.O : 0. 5 2.0。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于Rbl : Rgl为l.O : 1.0 1.8。
7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于Rbl : Rgl为l.O : 1.4 1.6。
8. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于三七皂苷Rl、人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl与人参皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的85%。
9. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于三七皂苷Rl、人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl与人参皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的90%。
10. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于其中三七皂苷R1含量为8X 15%、人参皂苷Rgl含量为35% 52%、人参皂苷Re含量为4% 10%、人参皂苷Rbl含量为25% 40%。
11. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(1)中加入7倍的乙醇。
12. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(1)中加入的乙醇浓度为65%。
13. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(1)中提取时间为7小时。
14. 根据权利要求4-13所述的应用，其特征在于其中的组合物可被制成注射液、注射用粉针剂、注射用冻干粉针剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、合剂、糖浆剂、胶囊剂或滴丸剂制剂。
全文摘要
本发明涉及三七、三七提取物、三七总皂苷以及三七总皂苷组合物的新用途，即在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物方面的新用途。
文档编号A61P25/02GK101700264SQ20091022395
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者许淑清, 赵学伟, 陈明 申请人:许淑清
技术领域：
本发明涉及三七、三七提取物、三七总皂苷以及三七总皂苷组合物的新用途，特别
是在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物方面的新用途。
背景技术：
三七是五加科植物，具有活血、散瘀、消炎、镇痛的功效。除有上述作用外，还具有 降低人体凝血因子的特殊作用。fg是肝脏合成的一种血浆球蛋白。其主要功能为参与凝血 过程。fg升高可增高心、脑血管病发生率。口服生三七粉能降低fg水平，有利于控制心、 脑血管病的发生。《中草药》2008年05期刊登的中国澳门大学中华医药研究院的王楠、万 建波、李铭源、王一涛有关《三七治疗动脉粥样硬化的研究进展》一文指出动脉粥样硬化是 导致心脑血管事件发生的关键因素，为多种心脑血管疾病共同的病理生理基础。其症候、病 机等属于中医理论的"血瘀证"。而三七自古便是历代医家常用的活血化瘀之要药。换而言 之，三七在防治动脉粥样硬化方面有其神奇之处。 糖尿病的神经病变并发症常直接或间接参与动脉粥样硬化的发生和发展，因此， 利用三七防治动脉粥样硬化的作用来治疗糖尿病并发症是可行的。 三七总皂苷是从三七植物总提取的有效物质，三七药物植物的化学成分较多，主 要由四环三萜达玛烷型原人参二醇组皂苷和四环三萜达玛烷型原人参三醇组皂苷组成。 三七总皂苷对高脂血症、高粘血症、高血压、心肌缺血、心律失常、动脉粥样硬化等症状均有 一定疗效，而且还具有防止血栓形成、改善微循环、抗心脑缺血、促进造血细胞、抗纤维化、 对神经细胞损伤的保护作用。由上所述，使用三七总皂苷为原料做成的三七总皂苷注射制 剂是一种独具多功能的注射剂，而且这些功效都具有独立性，集若干重要生物活性，能发挥 若干种临床功能于一药。所有的这些功能里，有的功能是相对立的，矛盾的。由于三七总皂 苷中成份十分复杂，目前尚未能真正明确具体什么成份起主要治疗作用，成份之间的作用 机理也没有人作过全面的研究。
发明内容
三七提取物的有效成分主要为三七总皂苷，有活血祛瘀、通脉活络之功效，根据我 公司对三七总皂苷的临床研究和药效学研究，发现三七总皂苷具有预防和治疗糖尿病性神 经病变的明显疗效。 糖尿病是由多种病因引起以慢性高血粮为特征的代谢紊乱。久病可引起多系统损
害，导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织的慢性进行性病变，引起功能缺陷及衰竭。 糖尿病的慢性并发症可遍及全身各重要器官，与遗传易感性、高血糖、氧化应激、
非酶糖化和多元醇代谢旁路、蛋白激酶C等多方面因素的相互影响有关。这些并发症可单
独出现或以不同组合同时或先后出现。有时并发症有诊断糖尿病前已存在，有些患者因这
些并发症作为线索而发现糖尿病。
3
神经病变是糖尿病的慢性并发症之一。糖尿病神经病变主要由微血管病变及山梨 醇旁路代谢增强以致山梨醇增多等所致。电生理检查可发现感觉和运动神经传导速度减 慢。 糖尿病周围神经病变是在长期血糖控制不理想的基础上发生的。发病机制尚不清 楚。比较公认的是与血管障碍、代谢紊乱，肌神经营养因子减少等多种因素有关。血管改变 有毛细血管内膜和细胞基底膜增生、血小板的聚集增加。纤维素的沉积等使微血管管腔狭 窄和闭塞。从而引起微循环供血不足、缺血、纤维素缺乏，使末梢神经轴突变性，发生脱髓鞘 改变，因而临床上出现一系列表现。 本发明专利从中药三七提取的三七总皂苷。临床生理研究证明其有阻止细胞的 钙离子内流、降低胞浆内钙离子浓度，扩张血管；改善组织的微循环，同时有提高血小板内 CAMP含量而抑制血小板聚集，并降低全血粘度。由此而有利于组织的供血供氧。此外，三七 总皂苷有镇定和镇痛作用。本发明专利用于治疗糖尿病周围神经病变患者显效率达89%。 其机制可能是既修复了损伤的神经又改善了滋养神经的微循环，加上有镇静、镇痛作用，所 以疗效较为显著。 本发明专利临床应用的安全性较高，在糖尿病性神经病变的药物治疗中不失为一 种好药，其拓宽了中药制剂治疗冠心病的新方法，在不能开展介入治疗的基层医院尤为适 用。 因此，申请人提供一种制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物方面的新用 途。 本发明公开了一种制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物方面的新用途，其 特征在于所述三七总皂苷组合物中含有活性成份，该活性成份由三七提取的三七总皂苷活 性成份组成，三七皂苷&含量大于8.0%、人参皂苷Rgl含量大于25 % 、人参皂苷Rl^含量 大于25%、人参皂苷Re含量大于4. 0%，且三七皂苷R"人参皂苷Rb^人参皂苷Rgl与人参 皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的75% 。
优选地，Rb! : Rg!为l.O : 0.5 2.0。 优选地，所述的有效成分组合物的含量是三七皂苷&含量大于8. 0%、人参皂苷 Rgi含量大于25X、人参皂苷Rbi含量大于25X、人参皂苷Re含量大于4.0X，且Rbi : Rgl
为i. o : i. o i. 8 ; 更优选地，所述的有效成分组合物的含量是三七皂苷&含量大于8. 0%、人参皂 苷R&含量大于25X、人参皂苷Rl^含量大于25X、人参皂苷Re含量大于4.0X，且Rl^ : Rgl 为1. 0 : 1. 4 1. 6 ; 优选地，三七皂苷Rp人参皂苷Rbp人参皂苷R^与人参皂苷Re的总重量大于活 性成份总重量的85% ; 更优选地，三七皂苷Rp人参皂苷Rbp人参皂苷Rgl与人参皂苷Re的总重量大于 活性成份总重量的90% ; 优选地，所述的有效成分组合物的含量是其中三七皂苷Ri含量为8X 15%、人 参皂苷Rg工含量为35X 52X、人参皂苷Re含量为4X 10X、人参皂苷Rbi含量为25X 40%。 本发明三七总皂苷活性成份组合物的剂型可以制成各种剂型，如制成注射液、注射用粉针剂，注射用冻干粉针剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、合剂、糖浆剂、胶囊剂、滴丸剂制 剂，优选制成注射液、注射用冻干粉针剂。
以下是本发明中药制剂的药材来源三七为五加科植物的干燥根。 申请人:还提供了一种制备所述的三七总皂苷活性成份组合物的方法，它包括如下
步骤 (1)取三七粉碎成粗粉1000g，加体积比为5-30倍的45_95%的乙醇提取0. 5 IO小时，收集提取液，过滤； (2)取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液； (3)溶液通过D型大孔树脂柱吸附，用乙醇_水的混合液进行梯度洗脱，流速按每
小时树脂体积的倍数计为4. 5BV/h，洗脱液中乙醇浓度逐步由5%调整至95%，收集含乙醇
浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，弃去含乙醇浓度在30%至70%以外的洗脱液，65t:
以下减压回收溶剂并浓縮至在6(TC下相对密度为1. 10 1. 20的清膏，低温干燥得三七总
皂苷组合物。 优选地，步骤(1)中加入7倍的乙醇；加入的乙醇浓度为65%;提取时间为7小时。
将三七总皂苷活性成份组合物根据制药领域中的常规方法，制成各种制剂。
上述过程获得的三七总皂苷活性成份组合物中各成份含量约为三七皂苷I^含量 大于8. 0%、人参皂苷Rgl含量大于25%、人参皂苷Rt^含量大于25%、人参皂苷Re含量大 于4.0X，且Rbi : Rg工为l.O : 0. 5 2.0，且三七皂苷Rp人参皂苷Rbp人参皂苷Rgi与 人参皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的75%。 基于上述三七总皂苷组合物，本发明的目的是提供该组合物的一种新用途，即在
制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用。它可以制成胶囊、注射剂、片剂、栓剂
或口服液等可使用的制剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 以下实验结果说明了该组合物的新药效，表明了本发明的有益效果。 根据上述三七总皂苷组合物制备的注射液对家兔糖尿病性神经病变的治疗和/
或预防作用实验。 1.实验材料 1. 1实验药物 根据本发明实施例1制备的样品；消渴丸(广州中一药业有限公司，国药准字 Z44020045，批号KY0111)。
1. 2试齐U 链脲霉素(str印tozotocin， STZ， sigma公司)；拧檬酸(北京市旭东化工厂，优 级纯，批号060706);柠檬酸钠(北京化学试剂公司，分析纯，批号20060606);戊巴比妥 钠(北京化学试剂公司，批号020919);葡萄糖测定试剂盒(中生北控生物科技股份有
限公司，批号060731);总胆固醇测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号
070471);甘油三酯测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号072011)。
1. 3实验仪器 离心机(LXJ-II，上海医用分析仪器厂)；多导生理记录仪(BIOPAC MP150，美国)； 半自动生化测定仪(Microlab 300， Vital Scientific Inc.)。
1. 4实验动物
Wistar大鼠，雄性，清洁级，体重180g-220g，来源中国医学科学院实验动物研究 所，许可证号SCXK(京)2005-0013。
2..实验方法
2. 1试剂配制 (l)20ml 0. 1M拧檬酸缓冲液(pH4. 4) :0. 1M拧檬酸11. 4ml+0. 1M拧檬酸钠8. 6ml ; (2)2% STZ :用0. 1M柠檬酸缓冲液配制，现配现用，置于冰浴中。
2. 2大鼠糖尿病模型的建立 大鼠禁食16h， 2 % STZ腹腔注射(50mg/kg ;0. 25ml/100g)，注射后72h尾静脉取 血，测定空腹血糖，空腹血糖水平> 300mg/dl(16. 7mM)为大鼠糖尿病模型造模成功。
2. 3实验分组剂量设置 (1)实施例1 :人的临床用药量为300mg/60kg/d， im。大鼠用药量为人临床用药量
的6倍。故而实验设置3个剂量组高剂量组(临床等效剂量的2倍)60mg/kg/d ;中剂量
组(临床等效剂量)30mg/kg/d ;低剂量组(临床等效剂量的1/2) 15mg/kg。 (2)消渴丸人的临床用法用量为，口服，一次3-10丸(2.5g/10丸)，2-3次/日。
选定人的临床用药量为5g/60kg/d。大鼠用药量为人临床用药量的6倍，故而消渴丸大鼠给
药量为500mg/kg/d。 2. 4实验分组及给药 大鼠按体重随机分组，确认糖尿病模型成功后，常规饮食饲喂12周，然后给予相 应药物干预如下
分组-v~ 动物数(只)剂量(mg/kg/d)给药途径给药时间(周)
正常对照组10等体积NSip12
模型组10等体积NSip12
消渴丸组10500ig12
实施例1低剂量组1015ip12
实施例1中剂量组1030ip12
实施例1高剂量组1060ip12 2. 5神经传导速度测定 末次给药后lh，大鼠戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉。分离大鼠坐骨神经，测定 电极两端距离(D)， Biopac多导生理记录仪测定剌激坐骨神经两点诱发腓肠肌动作电位的 M波潜伏期的差值(L)。根据及两剌激点间的距离(D)，计算出神经传导速度NCV，NCV二D/ L。 2. 6血糖、血脂测定 实验前禁食16h。腹主动脉采血，离心取血清，常规生化检测方法测定空腹血糖、
TC、TG水平。 3.实验结果 3. 1实施例1对糖尿病大鼠血脂及血糖的影响 表1实施例1对糖尿病大鼠血脂及血糖的影响(x士s)
6
分组给药剂量 (mg/kg)NGlu (mmol/L)TC (mmol/L)TG (mmol/L)
空白对照组—103.05士0.78"'1.53±0.321.32±0.43
模型组—1028.99土4.84' 。 *1.53±0.492.38±1.40
消渴丸组5001022.44士9.00''''1.46±0.491.76±0.48
实施例1低剂 量组15928.78士4.06''。1.60±0.712.68±1.87
实施例1中剂 量组30624.78士4.06''41.60±0.192.84±1.92
实施例1高剂 量组60822.37士8.30' *''1.10±0.522.28±1.74 与空白组比较AP < 0. 05，AAP < 0. Ol，AAAP < 0. 001 ;与模型组比较*P < 0. 05，承承P < 0. 01，承承承P < 0. 001。 实验结果显示，经腹腔注射STZ后，模型组、消渴丸组及实施例l低、中、高组大鼠 血糖水平均显著高于空白对照组(P〈0.001)，表明大鼠糖尿病模型造模成功。连续给药 12周后，消渴丸(500mg/kg)与实施例1高剂量(60mg/kg)可以降低糖尿病大鼠血糖水平， 与模型组比较有显著性差异(p<0.05)。模型组与空白对照组比较，TC、TG水平未见显著 性差异(P>0. 05)，表明该糖尿病模型造模24周后，并未引起糖尿病大鼠血脂水平的变化。
以上结果表明，实施例1可降低糖尿大鼠血糖水平，对糖尿病大鼠的血糖水平具 有一定的调节作用。 3. 2实施例1对糖尿病大鼠神经传导的影响 表2实施例1对糖尿病大鼠神经传导速度的影响(x士s)
分组给药剂量(mg/kg)NNCV
空白对照组—636.47±10.23"'
模型组—918.94土4.88…
消渴丸组5001031.97士8.53"
实施例1低剂量组15720.74土6.86'4'
实施例1中剂量组30629.65±6.59'
实施例1高剂量组60832.73士10.95" 与空白组比较AAAP < 0.001 ;与模型组比较*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0. 001。 实验结果显示，腹腔注射STZ糖尿病造模后24周，模型组大鼠神经传导速度减慢， 与空白对照组比较有显著性差异(P < 0. 001)。消渴丸(500mg/kg)、实施例1中剂量(30mg/ kg)和实施例l大剂量(60mg/kg)均可提高糖尿病大鼠坐骨神经传导速度，与模型组比较有 显著性差异(P值分别为< 0. Ol，O. 05，0. 01)。 结果表明，实施例1可提高糖尿病大鼠神经传导速度，对糖尿病性神经传导功能具有一定的改善作用。
4.结论 本实验结果显示，经腹腔注射STZ后，糖尿病大鼠出现血糖水平升高、神经传导速 度减慢。经腹腔注射实施例1冻干粉针12周后，可降低糖尿病大鼠血糖水平、提高神经传 导速度；可改善大鼠糖尿病性视网膜小血管和神经纤维病变。
临床试验
—、对象 1999年WH0标准诊断的2型糖尿病患者共30例，全部来自住院病人。入选条件 为 四肢自发性疼痛或感觉障碍；肌电图示运动神经尤其是胫神经的感觉传导速度减 弱。排除其他原因所致的周围神经病变。 年龄62 85岁、血糖控制平稳(HbAlc < 7% );不合并使用治疗糖尿病神经病变 的药物2周以上。其中病程5 15年(糖尿病)，男性21例、女性9例。均无使用实施例
l(冻干粉针)的禁忌症。
二、方法 1、用药方法所有病例均在严格控制饮食及口服降糖药物或胰岛素治疗的基础 上，用实施例1 (冻干粉针)450mg+生理盐水100ml静脉滴注，每日1次，2周为1疗程，共2 个疗程。
2、疗效判断显效自觉症状明显好转或消失，腱反射明显好转或恢复正常，肌电 图神经传导速度较前增加5m/s以上或恢复正常。有效自觉症状改善，膝踝反射有所改善。 无效自觉症状无改善，神经肌腱反射和肌电图神经传导速度无变化。
三、统计方法 数据以X±S表示，同组治疗前后数据比较以配对t检验。
四、结果 1、一般临床特征30例糖尿病患者在观察过程中空腹血糖治疗前8. 5±1. 62mo1/
L ;治疗后为7. 9±1. 4mol/L，两者之间无明显差异。全部病人均坚持完成观察。 2、周围神经病变症状的主要变化治疗前上、下肢自发疼痛，感觉减退、麻木、发热
和发冷的发生率分别为50%、34%、42%、68%、16%、17%。经静脉用药四周后，上肢和下肢
自发性疼痛、感觉减退、麻木、发热的感觉明显改善，改善率60%以上。在治疗前后膝反射、
踝反射降低的改善率分别为49%、51%。如图l所示。 3、神经肌电图的测试30例病人当中有20例进行神经肌电图检查。如表2所示。 治疗前、后正中神经、胫神经、腓总神经的运动神经传导速度和正中神经、腓浅神经的感觉 神经传导速度明显提高。 30例测定治疗前、后的血常规、尿常规和肝功能、肾功能等指标无名显差异。
表I用实施例1 (冻干粉针)剂治疗后病人主观症状的改善
8
类别 例数轻度中度 重度明显改善率(％)
下肢自发性疼痛1554 6
治疗四周后1386.67 (13/15)
上肢自发性疼痛1274 1
治疗四周后975.00(9/12)
麻木感22116 5
治疗四周后2090.90(20/22)
发热、发冷感24147 3
治疗四周后2187.50(21/24)
感觉减退18124 2
治疗四周后1161.11(11/18)
表2实施例1治疗运动和感觉神经传导速度(m/s)变化
运动神经感觉神经
治疗时间 正中神经胫神经腓总神经正中神经腓前神经
治疗前 41.2 ±5.730.2±3.530.6±3.440.9±5.228.5±5.9
治疗后 43.1 ±6.3*32.1±5.1*32.1 ±3.7*31.6±6.1*31.4±5.2* 与治疗前比较卢P〈0. 05
五、讨论 糖尿病周围神经病变是在长期血糖控制不理想的基础上发生的。发病机制尚不清 楚。比较公认的是与血管障碍、代谢紊乱，肌神经营养因子减少等多种因素有关。血管改变 有毛细血管内膜和细胞基底膜增生、血小板的聚集增加。纤维素的沉积等使微血管管腔狭 窄和闭塞。从而引起微循环供血不足、缺血、纤维素缺乏，使末梢神经轴突变性，发生脱髓鞘 改变，因而临床上出现一系列表现。实施例1是从中药三七提取的三七总皂苷。临床生理 研究证明其有阻止细胞的钙离子内流、降低胞浆内钙离子浓度，扩张血管；改善组织的微 循环，同时有提高血小板内CAMP含量而抑制血小板聚集，并降低全血粘度。由此而有利于 组织的供血供氧。此外，三七总皂苷有镇定和镇痛作用。用本发明专利治疗30例糖尿病周 围神经病变患者显效率达89%。其机制可能是既修复了损伤的神经又改善了滋养神经的微 循环，加上有镇静、镇痛作用，所以疗效较为显著。加上本发明专利性能稳定，在整个疗程中 未见不良反应，故可认为是一种治疗糖尿病周围神经病变的好药物，值得临床推广。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明 本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明 要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数(乙醇为体积百分比)， BV/h表示以树脂体积为V计，B为倍数，溶液每小时的洗脱体积为树脂体积BXV。
实施例1 : 取三七粉碎成粗粉1000g，加65%乙醇7000ml提取7小时，收集提取液，过滤，取水制成每1ml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为12. 47%、人参皂苷Rgl为 45. 12%、人参皂苷Re为6. 04%、人参皂苷Rl^为29. 94%，以上四成份总量为93. 57%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 51。
实施例2 : 取三七粉碎成粗粉1000g，加50%乙醇10000ml提取6小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 4g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱(乙醇浓度在5. 5小时内由5%调整至95% )，流速5. OBV/h，弃去含乙醇浓度在 30 %至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减 压回收溶剂并浓縮至相对密度为1. 15(60°C )的清膏，干燥，得三七总皂苷活性成份，加注 射用水调节每lml含固形物50mg 55mg，超滤，灌装，制成实施例1注射液。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为11. 54%、人参皂苷Rgl为 45. 26X、人参皂苷Re为5. 06X、人参皂苷R^为31. 26%，以上四成份总量为93. 12%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 45。
实施例3: 取三七粉碎成粗粉1000g，加75%乙醇7500ml提取8小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 6g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱(乙醇浓度在6. 5小时内由5%调整至95% )，流速4. OBV/h，弃去含乙醇浓度在 30 %至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减 压回收溶剂并浓縮至相对密度为1. 16(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加针用活性 炭0. 30% (重量比)，80°C以下保温搅拌30分钟，滤过，加注射用水调节每lml含固形物 150mg，冷冻干燥，分装，制成实施例1粉针剂。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为13. 3%、人参皂苷Rgl为 49. lX、人参皂苷Re为5. lX、人参皂苷Rbi为30. 9%，以上四成份总量为98. 4%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 59。
实施例4: 取三七粉碎成粗粉1000g，加80%乙醇8000ml提取6小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节
10每1ml含固形物lOOmg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷^为10. 1 % 、人参皂苷Rgl为 37. 4X、人参皂苷Re为4. 7X、人参皂苷Rl^为36. 17%，以上四成份总量为88. 37%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 03。
实施例5: 取三七粉碎成粗粉1000g，加85%乙醇8000ml提取8小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。
检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为10. 4%、人参皂苷Rgl为 39. 6X、人参皂苷Re为5. 2X、人参皂苷Rl^为36. 0%，以上四成份总量为91.2%，且 Rbi : Rgl为1. 0 : 1. 10。
实施例6: 取三七粉碎成粗粉1000g，加75%乙醇8000ml提取7小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷I^为13. 1X、人参皂苷R^为 41. 21%、人参皂苷Re为4. 9%、人参皂苷Rl^为34. 23%，以上四成份总量为93. 44%，且 Rbi : Rgl为1. 0 : 1. 20。
实施例7: 取三七粉碎成粗粉1000g，加65%乙醇6000ml提取8小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 12(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为9. 77%、人参皂苷Rgl为 44. 89% 、人参皂苷Re为4. 41 % 、人参皂苷Rl^为26. 01 % ，以上四成份总量为88. 08 % ，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 73。
实施例8:取三七粉碎成粗粉1000g，加90%乙醇10000ml提取9小时，收集提取液，过滤，取
11滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 12(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例1粉针剂。检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为12. 3%、人参皂苷Rgl为 23. 12X、人参皂苷Re为5. 81X、人参皂苷Rbi为34. 96%，以上四成份总量为76. 19%，且 Rbi : Rgl为1. 0 : 0. 66。
实施例9: 取三七粉碎成粗粉1000g，加85X乙醇9000ml提取10小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 12(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例9粉针剂。检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为13. 6%、人参皂苷Rgl为 51.01X、人参皂苷Re为5. lX、人参皂苷Rbi为28. 2%，以上四成份总量为97. 91%，且 Rb丄:Rgl为1. 0 : 1. 81。
实施例10 : 取三七粉碎成粗粉1000g，加65%乙醇7500ml提取9小时，收集提取液，过滤，取 滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液，用大孔树脂柱(D类大孔树 脂、树脂体积3000ml，树脂床高与直径比约为8)及氧化铝吸附，用不同浓度的乙醇液进行 梯度洗脱，乙醇浓度在6小时内由5%调整至95%，流速4. 5BV/h，弃去含乙醇浓度在30% 至70%以外的洗脱液，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，65t:以下减压回 收溶剂并浓縮至相对密度为1. 13(60°C )的清膏，得三七总皂苷活性成份，加注射用水调节 每lml含固形物100mg，超滤，灌装，冷冻干燥，制成实施例10粉针剂。 检验结果上述提取物中各成份含量三七皂苷&为10. 12%、人参皂苷Rgl为 51.67X、人参皂苷Re为4. 4X、人参皂苷Rl^为27. 1%，以上四成份总量为93. 29%，且 Rb! : Rgl为1. 0 : 1. 91。
权利要求
三七植物在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用。
2. 三七植物提取物在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用。
3. 三七总皂苷在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用。
4. 一种三七总皂苷组合物在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物的应用，其特征在于所述三七总皂苷组合物中含有活性成份，该活性成份由三七提取的三七总皂苷活性成份组成，其中三七皂苷&含量大于8.0%、人参皂苷Rgl含量大于25% 、人参皂苷Rl^含量大于25%、人参皂苷Re含量大于4. 0%，且三七皂苷R"人参皂苷Rb^人参皂苷Rgl与人参皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的75%，所述组合物通过下述方法制备(1) 取三七粉碎成粗粉1000g，加体积比为5-30倍的45-95%的乙醇提取0. 5 10小时，收集提取液，过滤；(2) 取滤液回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0. 5g生药的溶液；(3) 溶液通过D型大孔树脂柱吸附，用乙醇_水的混合液进行梯度洗脱，流速按每小时树脂体积的倍数计为4. 5BV/h，洗脱液中乙醇浓度逐步由5%调整至95%，收集含乙醇浓度在30%以上至70%以下的洗脱液，弃去含乙醇浓度在30%至70%以外的洗脱液，65t:以下减压回收溶剂并浓縮至在6(TC下相对密度为1. 10 1. 20的清膏，低温干燥得三七总皂苷组合物。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于Rbl : Rgl为l.O : 0. 5 2.0。
6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于Rbl : Rgl为l.O : 1.0 1.8。
7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于Rbl : Rgl为l.O : 1.4 1.6。
8. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于三七皂苷Rl、人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl与人参皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的85%。
9. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于三七皂苷Rl、人参皂苷Rbl、人参皂苷Rgl与人参皂苷Re的总重量大于活性成份总重量的90%。
10. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于其中三七皂苷R1含量为8X 15%、人参皂苷Rgl含量为35% 52%、人参皂苷Re含量为4% 10%、人参皂苷Rbl含量为25% 40%。
11. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(1)中加入7倍的乙醇。
12. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(1)中加入的乙醇浓度为65%。
13. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(1)中提取时间为7小时。
14. 根据权利要求4-13所述的应用，其特征在于其中的组合物可被制成注射液、注射用粉针剂、注射用冻干粉针剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、合剂、糖浆剂、胶囊剂或滴丸剂制剂。
全文摘要
本发明涉及三七、三七提取物、三七总皂苷以及三七总皂苷组合物的新用途，即在制备治疗和/或预防糖尿病性神经病变药物方面的新用途。
文档编号A61P25/02GK101700264SQ20091022395
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者许淑清, 赵学伟, 陈明 申请人:许淑清
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