用于治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病的集落刺激因子组合物的制作方法
专利名称：用于治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病的集落刺激因子组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及对局部细菌感染和细菌性相关疾病的治疗。尤其涉及一种集落刺激因子(CSF)组合物，用于治疗口腔和窦部细菌感染和细菌性相关疾病。
背景技术：
牙周疾病由牙菌斑内的细菌和毒素引起，牙菌斑是粘附的无色薄膜，它持续形成于牙齿表面。牙周疾病很常见；据估计其影响世界上70-90％的人群，并且是35岁以上人群牙齿缺失的主要原因。
牙周疾病具有多种形式。最常见的包括牙龈炎、侵蚀性牙周炎和慢性牙周炎。
牙龈炎是最轻微的牙周疾病，导致牙龈红肿，并且容易出血。如果不加治疗，牙龈炎将会发展为牙周炎。牙周炎表明感染已经发展到将牙齿固定在颚骨上的那些口腔组织。如果不加治疗，牙周炎最终将导致受影响的牙齿缺失。
侵蚀性牙周炎可能发生于那些其它临床方面健康的病人。其特点是快速的附着丧失、骨质破坏和家族性聚集。临床上，可观察到牙龈的慢性感染，牙周袋出血，牙槽骨吸收以及类似症状，并且已知牙齿的活动和移动是由于损坏提前发生，最终引起牙齿的自发性缺失或拔出。
慢性牙周炎是牙周炎最常见的形式，其结果是牙齿的支持组织内部发炎，附着逐渐丧失以及牙槽骨逐渐吸收。这种形式的牙周炎其特点是形成牙袋和/或牙龈萎缩。由于提前损坏，牙齿的活动和移动增多，最终引起牙齿的自发性缺失或拔出。
非外科手术治疗牙周包括刮治和根面平整，可任选随后附加治疗如局部给予抗菌剂，主要是四环素抗生素，其目的是消灭和牙周炎有关的细菌。然而，牙周疾病通常非常难治，中止治疗后潜在的病原体常常返回袋中。此外，外科手术或拔牙可能是最终的手段。
为了克服再次发生细菌性感染的问题，采用长期的抗菌治疗，但是这种形式的治疗可能产生耐药性菌株和更严重的感染。抗菌剂例如口腔清洗剂形式的洗必泰和季铵盐，但是当以液体形式给药时，这些药剂不能影响龈下菌群，因为它们不能渗透到产生疾病的袋中。因而，它们不能用作口腔清洗剂来治疗牙周疾病。
窦通常是鼻周围面部骨骼内存在的无菌空气空间，包括颧骨内的区域和眼上部的前额骨内的区域。牙齿和齿龈的感染可扩展到窦，这种感染因而被称为窦炎。窦炎可能是急性的(症状存在时间少于1个月左右)、亚急性的(症状存在时间大约1到4个月)或慢性的(症状存在时间大于4个月左右)。
涉及到窦炎的细菌通常有流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。在慢性窦炎中发现有更高比率的厌氧菌(例如，类杆菌属、类链球菌和梭杆菌)。
窦炎的症状包括鼻塞和大量浓稠、有色的鼻涕、滴鼻后味觉差、咳嗽、头部充血，伴随头痛、感觉面部肿胀、牙疼、持续疲劳以及偶尔发烧。感染可能波及面部骨骼或者脑膜(脑膜炎)。少数情况下，窦炎还可能发展到在眼窝、大脑或面部骨骼内形成脓袋(砂眼)。
镇痛药例如对乙酰氨基酚，有助于减轻疼痛和降温。解充血药例如假麻黄碱，可减轻鼻内肿胀并且使窦排液。然而，通常情况下，长期使用解充血药实际上会加剧鼻腔堵塞。同样，可以使用抗菌剂治疗，但是可能产生耐药性。最后，可能进行鼻内镜外科手术。
M.van Agtoyen等(Rhinology，40，69-74，2002)提到非中性粒细胞减少症课题的临床研究已经表明非格司亭(Filgrastim，一种重组粒细胞集落刺激因子)可能对非中性粒细胞减少病人的严重细菌和机会真菌感染的治疗过程的附加治疗中有益。根据作者报道，对患严重慢性细菌性窦炎的病人的治疗是通过每天给药两次环丙沙星500-750毫克和三次克林霉素450-600毫克，连续14天，最初14天同时皮下给药非格司亭300微克(或皮下给予安慰剂)每天一次，另外1O周交替地每天皮下给药非格司亭300微克或安慰剂。在这种情况下，白细胞的总数增加了，因而免疫力也增强了。
Brent Weston等人(Journal of laboratory and clinical medicine117(1991)4)和J.Goultchin等人在一个案例报告(J.Periodontol，2000年9月)中描述了G-CSF对几个先天性中性粒细胞减少病人牙齿疾病的治疗效果。他们静脉注射该物质以刺激骨髓，表明对牙周炎和口腔溃疡有改善作用。这被认为是由于增强了免疫力的缘故。和大多数病人进行对比很困难，因为患先天性中性粒细胞减少症的病人从幼年期开始牙齿发育就失调了。
Gamoual J.等人(J.Chin.Periodontology 2003；30；616-62)提到对慢性牙周炎病人的研究中考虑到中性粒细胞的凋亡。尽管健康人和牙周炎病人的牙龈样品中的GM-CSF总量没有显著差异，他们仍然提出一个新的机理，即中性粒细胞在成年牙周炎病人的牙周组织累积。结果他们发现GM-CSF减少了中性粒细胞的凋亡。他们没有治疗任何病人或讨论这种可能性。
临床上，CSF组合物已经用于治疗由癌症化疗或放疗引起的骨髓抑制。也提出了CSF的其它临床用途。因而，WO03/039444公开了使用各种趋化因子和细胞因子即CSF，治疗病毒和/或真菌性皮肤病。美国第6689351号专利公开了通过GM-CSF的局部给药，促进各种创伤病人的伤口加速愈合。
已经被研究过CSF的化学结构，并且采用技术方法进行了说明，例如X-射线晶体衍射和核磁共振，参见Hill C.P.，Osslund T.D.，Eisenberg D.The structure of granulocyte-colony-stimulatingfactor and its relationship to other growth factors.Proc Natl Acad SciA 90，pp.5167(1993)和Zink T.，Ross A.，Luers K.，Cieslar C.，Rudolph R.，Holak T.A.Structure and dynamics of the humangranulocyte colony-stimulating factor determined by NMRspectroscopy.Loop mobility in a four-helix-bundle protein.Biochemistry 33，pp.8453(1994)。
本发明最重要的方面是快速消除感染和细菌性相关疾病之后的牙齿再钙化。该目的是通过局部治疗来完成的，而不是传统的刺激骨髓的方式。
从再钙化可以得出一个结论，那就是该方法还可以用于治疗骨折。
似乎细菌性窦炎和牙周疾病都是局部的细菌感染和细菌性相关疾病，虽然程度不同，都可能倾向于转为慢性并最终不得不通过外科手术来治疗。很明显，这两种疾病都仍然需要有效的药物，以避免外科手术和化疗，例如抗生素治疗。优选地，这样的药物能够提供实质上的总体治疗，以降低再次发作的可能性。换句话说，如果能够在例如牙龈和牙齿患有从牙龈炎到牙周炎的各种牙周疾病期间，使疾病得到不仅短期的而且长期的改善，这样的药物将是非常有益的。尤其是，即使对晚期牙周炎也不需要进行外科手术介入的药物，将是极度有益的。
本发明的主要目的是提供这种药物。
发明内容
一方面，本发明涉及到至少一种集落刺激因子(CSF)或其实质上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物在制备治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病以及感染骨组织再钙化的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了一种包含至少一种CSF或其片段或衍生物的组合物，用于治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病。
又一方面，本发明涉及到一种治疗哺乳动物细菌感染和细菌性相关疾病的方法，给予有效治疗剂量的至少一种CSF或其实质上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物。在本发明中，CSF用于激发巨嗜细胞和粒细胞的产生，和通常使用的将骨髓作为靶标的静脉(i.v.)或皮下(s.c.)路线不同。
CSF可以是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)或多能集落刺激因子(multi-CSF)。
根据本发明的治疗方法，通过两个步骤来治愈牙周疾病1.根除细菌感染和细菌性相关疾病；和2.使牙齿长到骨骼上(再钙化)。
本发明的具体方面和内容如权利要求中的定义。
发明的详细描述本发明是基于惊人发现即至少一种有效治疗剂量的CSF局部给药能够明显改善局部细菌感染或细菌性相关疾病。的确，正如下文的一个实施例所述，通过对严重牙周炎、事实上正准备拔掉的牙齿附近牙龈组织注射仅仅一个剂量的GM-CSF制剂，牙齿就保住了；牙齿的病情很快得到改善并且没有复发。
另一方面，我们注意到注射GM-CSF不仅对病人的牙患有效，并且对病人的慢性窦炎也有效。确实，在注射之后，病人感到鼻窦堵塞有显著的好转，鼻内流出难闻的脓液，窦炎随之痊愈。
CSF局部治疗主要通过活化和趋化起作用。
不受制于任何理论，在低剂量给药情况下，CSF局部治疗激发局部的免疫防御能力而不产生任何显著的系统效果，另外，在牙周炎中牙槽骨被吸收的情况下，骨的再生能力被局部激发。
本发明一个很大的优点是，局部细菌感染和细菌性相关疾病可以通过身体有限部位的局部给药小剂量的本发明组合物进行治疗，而不产生任何对治疗主体的显著的系统效果。
因此，本发明涉及到一种治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病的药物和方法。所述“局部细菌感染和细菌性相关疾病”指的是实质上使哺乳动物的局部身体痛苦的细菌感染和细菌性相关疾病。因此，牙周疾病和窦炎属于局部细菌感染和细菌性相关疾病，例如败血病就不属于该疾病。
细胞因子是白细胞和其它几种类型的体细胞分泌的一种常规蛋白质。它们的多效性行为包括调节先天性和适应性免疫反应以及调节炎性反应。有各种各样的细胞因子如白细胞介素、干扰素、血小板活化因子和集落刺激因子(CSF)。CSF可以被细分为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及多能集落刺激因子(multi-CSF，也称为白细胞介素-3)。
CSF为骨髓前身存活、再生和分化所必须，以形成成熟的中性粒细胞、单核细胞和成熟的巨嗜细胞，以控制白血球的产生。例如，G-CSF刺激优势中性粒细胞集落的产生。另一方面，M-CSF仅仅对巨嗜细胞前身有用。M-CSF出现在胚胎形成的早期，对该多肽具有潜在的促进作用。GM-CSF控制巨嗜细胞和粒细胞前身细胞的不可逆行为。尽管GM-CSF和G-CSF作用于同一前身细胞世系，它也刺激巨嗜细胞的产生。
GM-CSF对成熟骨髓细胞的功能也具有重大的影响，包括增强抗体的产生、噬菌作用和细胞毒性。在较低浓度下，例如本发明所述的，骨髓细胞的这种活性主要是局部效果。
CSF可以通过例如本领域技术人员熟知的重组技术来制备(rCSFs)。例如欧洲第0188479号专利，公开了通过培养被含有编码灵长类GM-CSF蛋白的基因的载体转染的宿主细胞，来制备重组GM-CSF(rGM-CSF)。重组的人类GM-CSF的生产程序也已经被Burgess等人描述过[(1987)Blood，Vol.69，No.143-51]。重组G-CSF(rG-CSF)的生产方法已经在美国第4810643号专利中描述过。
CSF也可以通过商业途径得到。例如Molgramostim，一种重组GM-CSF，Schering-Plough出品，商品名Leucomax。另一种重组GM-CSF是Sargramostim，德国Schering AG出品，商品名Leukine。非格司亭(Filgrastim)是一种重组G-CSF，Amgen出品，商品名Neupogen和Granulokine。
任何CSF类似物或衍生物，只要具有可比的或增强的体内生物活性就可用于本发明。CSF类似物可通过消去、引入、或取代天然存在的糖蛋白主结构中的氨基酸或通过对糖蛋白进行化学修饰而产生。
优选地，CSF以药剂或由有效治疗剂量的CSF和一种或多种药学上可接受的载体和/或辅料组成的组合物的方式给药。使用的载体必须和制剂中的所有成分配伍。任意配制方法包括将生物活性成分引入载体和/或辅料，例如将CSF溶解或悬浮在液体或半液体赋形剂或载体中。
根据本发明，合适的局部给药制剂包括有效治疗剂量的治疗剂和一种或多种药物可接受载体和/或辅料。优选水作为载体。
例如，CSF制剂可以是小瓶装的消毒注射液。它也可以是冻干灭菌的粉剂，用灭菌水或抑菌水重新构成注射液。
本发明的药剂也可以是多种CSF的混合物，例如GM-CSF与G-CSF和/或M-CSF结合。这种药剂可以和仅有一种CSF作为活性成分的组合物以同样的方式制备和给药。
关于药物制剂和制备药物制剂的方法的一般信息，可以参考Remington的著作The Science and Practice of Pharmacy，19th ed.，Mack Printing Company，Easton，Pennsylvania(1995)。
本发明的制剂在哺乳动物、优选人的鼻腔和/或口腔局部给药，使药剂穿透粘膜。当治疗牙周疾病时，优选在患病区域附近例如在牙周裂缝中或其附近注射。注射剂可以局部注射到牙槽骨周围的牙周组织中，也即牙龈、牙槽粘膜、舌下粘膜、上腭部等部位中。可以合适地采用美国第6,682,718号专利讨论的“牙槽粘膜注射方法”。在该方法中，在牙龈附近柔软的口腔粘膜区不是垂直而是平铺的位置插入一根针，将药液注射到牙槽骨膜和牙槽粘膜之间。
本发明药剂也可以在鼻腔和口腔通过喷射方式给药。给药次数可以一天一次或一天数次。
局部注射的CSF制剂可包含无菌水或非水溶液，以及悬浮剂或乳化剂。水溶液的例子包括注射用蒸馏水和生理盐水。制剂可进一步包括助剂例如抗菌剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、助溶剂和等渗剂。通过能滞留细菌的过滤器过滤制剂，通过杀菌剂或辐射方式来灭菌。制剂可以在灭菌条件下制备或通过首先制备无菌固体组合物，然后在使用之前将其溶解在无菌水或无菌溶剂中得到注射液。
也可通过凝胶的方式给药，或通过任何其它具有类似流变性能的药物载体，例如包含一种缓释剂，直接施用于牙龈或牙周裂缝中，或通过灌输装置，将适量的CSF以合适的速度给药。美国第5,023,082号专利描述了治疗牙周疾病所使用的灌输装置。美国第6,274,175号专利公开了GM-CSF缓释剂。
对于窦炎的治疗，CSF注射剂优选在上腭进行，CSF制剂也可以通过喷入鼻孔或吸入鼻孔的方式给药。
CSF的给药剂量每次5-800μg，更优选每次20-400μg，最优选每次50-100μg之间。给药频率可以从每天一次至每三周一次，例如每周给药一至三次。总疗期可以从偶尔给药一次至三周。主治医生能够决定合适的给药剂量、给药频率以及给药期限。
还可以对治疗对象给药至少一种有效治疗剂量的其它活性成分。这种活性成分的选择取决于治疗对象的具体情况。例如，为有效对抗疾病涉及到的细菌，组合物可以包含抗菌剂。例如当该疾病是牙周炎时，很可能涉及到厌氧菌，适合的抗菌化合物可以是抗菌甲硝哒唑。这种抗菌剂可以配合CSF一起给药或单独给药，例如牙胶Elyzol。当然，同样可以使用其它的抗菌剂。
其它活性成分还可以是例如磷酸盐离子释放制剂和/或钙和维生素D3的组合。例如，在治疗期或临床主治医师决定的给药期中，给予0.5至2克钙和20-100μg维生素D3。
其它的活性成分还可以选自镁、萤石和维生素C和D，或它们的混合物，或任何上述提到的其它活性成分，例如钙。
在窦炎的治疗中，抗菌剂、解充血药或甾族化合物也可独立于CSF制剂或和CSF一起给药。适合的解充血药例子是Rinexin，适合的甾体制剂的例子是Nasonex喷雾剂。
可以使用CSF冻干制剂来制备本发明药物。例如，这种制剂可以即时溶解在一种合适的液体载体中。如果不是立即使用，可以将这种CSF液体制剂保存在冰箱或冷库中，或者通过添加本领域技术人员熟知的防腐剂以延长其保存期限。适合的防腐剂可以是苯甲醇，添加量占CSF水溶液制剂的重量百分比1-2％。
也可使用两室注射器，装有CSF冻干制剂和适合的液体载体，在室温下保存。
另一种使用方式是使用单剂量的凝胶弹性小瓶并配备小针头，用于感染牙齿周围的袋中。
目前，本发明优选的CSF是GM-CSF，采用液体注射液进行给药，每剂0.05-0.2ml液体，含有50-100μg。
以下提供的实施例是为了更好地说明本发明，而不是意图限制其范围。
具体实施例方式
注射剂配方GM-CSF(Molgramostim)50μg注射用水适量(qs)100μl将Molgramostim溶解到注射用水中，并在室温下缓慢搅拌。
牙周炎的治疗实施例1男性病人，年龄47，患有严重的牙周炎。主治牙医认为，尤其是一颗上牙无法补救，计划将其拔掉。在该病人牙周裂缝附近注射单剂80μg GM-CSF，每周一次，连续三周。牙周感染和细菌性相关疾病痊愈，并且恢复了牙齿和腭骨的连接。
该病人也患有慢性窦炎。在接受GM-CSF注射之后，该病人的窦炎有显著好转并且在治疗期间内窦炎彻底痊愈。三年之后，此人仍未患过牙周炎。
实施例2女性病人，年龄59，患严重的牙周炎。牙齿的射线照相表明在几颗牙齿周围存在深的裂缝。在该病人牙周裂缝附近注射单剂50μg GM-CSF。病人有显著好转。注射三个月后在牙齿的同一部位射线照相。可以明显地观察到牙齿状况显著改善——深的牙周裂缝消失了。
一年之内没有复发。
权利要求
1.至少一种集落刺激因子(CSF)、其实质上具有CSF生物功能和活性的片段或它们的衍生物在制备局部治疗哺乳动物局部细菌感染和细菌性相关疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中的细菌感染和细菌性相关疾病是牙周疾病或窦炎。
3.根据权利要求2的用途，其中的牙周疾病是龈炎或牙周炎。
4.根据权利要求1-3任一项的用途，其中的CSF选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)和多能集落刺激因子(multi-CSF)。
5.根据权利要求4的用途，其中的CSF是GM-CSF。
6.根据权利要求1-5任一项的用途，其中的药物形式适于注射到牙龈粘膜中或应用于牙周袋中进行给药。
7.根据权利要求1-6任一项的用途，其中CSF、其片段或其衍生物在药物中的量是例如单位剂量5μg-800μg。
8.根据权利要求7的用途，其中单位剂量是50μg-100μg。
9.根据权利要求1-8任一项的用途，其中给药间隔是从一天一次至三周一次。
10.根据权利要求9的用途，其中一周给药一至三次。
11.根据权利要求1-10任一项的用途，其中的药物包括至少一种有效治疗剂量的并且生理上可接受量的其它活性成分。
12.根据权利要求1-10任一项的用途，其中的CSF、其片段或其衍生物通过载体和宿主细胞来制备，所述载体含有编码CSF的基因，所述宿主细胞能够表达该基因。
13.一种用于局部治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病的组合物，包含至少一种CSF或其片段或衍生物。
14.根据权利要求13的组合物，其中的CSF是GM-CSF。
15.一种治疗哺乳动物局部细菌感染和细菌性相关疾病的方法，给药有效治疗剂量和生理上可接受量的至少一种CSF或其实质上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物。
全文摘要
本发明提供包含至少一种CSF或其片段或衍生物的组合物，用于治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病。同时，提供至少一种集落刺激因子(CSF)或其实质上具有CSF生物学功能和活性的片段或其衍生物在制备治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病的药物中的用途。该CSF选自粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子和多能集落刺激因子。同时提供治疗哺乳动物局部细菌感染和细菌性相关疾病的方法。局部细菌感染和细菌性相关疾病可以是牙周疾病或窦炎。
文档编号A61K38/19GK1956705SQ200580016492
公开日2007年5月2日 申请日期2005年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者汉瑞克·阿尔恩博格 申请人:因诺文图斯设计有限公司
技术领域：
本发明涉及对局部细菌感染和细菌性相关疾病的治疗。尤其涉及一种集落刺激因子(CSF)组合物，用于治疗口腔和窦部细菌感染和细菌性相关疾病。
背景技术：
牙周疾病由牙菌斑内的细菌和毒素引起，牙菌斑是粘附的无色薄膜，它持续形成于牙齿表面。牙周疾病很常见；据估计其影响世界上70-90％的人群，并且是35岁以上人群牙齿缺失的主要原因。
牙周疾病具有多种形式。最常见的包括牙龈炎、侵蚀性牙周炎和慢性牙周炎。
牙龈炎是最轻微的牙周疾病，导致牙龈红肿，并且容易出血。如果不加治疗，牙龈炎将会发展为牙周炎。牙周炎表明感染已经发展到将牙齿固定在颚骨上的那些口腔组织。如果不加治疗，牙周炎最终将导致受影响的牙齿缺失。
侵蚀性牙周炎可能发生于那些其它临床方面健康的病人。其特点是快速的附着丧失、骨质破坏和家族性聚集。临床上，可观察到牙龈的慢性感染，牙周袋出血，牙槽骨吸收以及类似症状，并且已知牙齿的活动和移动是由于损坏提前发生，最终引起牙齿的自发性缺失或拔出。
慢性牙周炎是牙周炎最常见的形式，其结果是牙齿的支持组织内部发炎，附着逐渐丧失以及牙槽骨逐渐吸收。这种形式的牙周炎其特点是形成牙袋和/或牙龈萎缩。由于提前损坏，牙齿的活动和移动增多，最终引起牙齿的自发性缺失或拔出。
非外科手术治疗牙周包括刮治和根面平整，可任选随后附加治疗如局部给予抗菌剂，主要是四环素抗生素，其目的是消灭和牙周炎有关的细菌。然而，牙周疾病通常非常难治，中止治疗后潜在的病原体常常返回袋中。此外，外科手术或拔牙可能是最终的手段。
为了克服再次发生细菌性感染的问题，采用长期的抗菌治疗，但是这种形式的治疗可能产生耐药性菌株和更严重的感染。抗菌剂例如口腔清洗剂形式的洗必泰和季铵盐，但是当以液体形式给药时，这些药剂不能影响龈下菌群，因为它们不能渗透到产生疾病的袋中。因而，它们不能用作口腔清洗剂来治疗牙周疾病。
窦通常是鼻周围面部骨骼内存在的无菌空气空间，包括颧骨内的区域和眼上部的前额骨内的区域。牙齿和齿龈的感染可扩展到窦，这种感染因而被称为窦炎。窦炎可能是急性的(症状存在时间少于1个月左右)、亚急性的(症状存在时间大约1到4个月)或慢性的(症状存在时间大于4个月左右)。
涉及到窦炎的细菌通常有流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。在慢性窦炎中发现有更高比率的厌氧菌(例如，类杆菌属、类链球菌和梭杆菌)。
窦炎的症状包括鼻塞和大量浓稠、有色的鼻涕、滴鼻后味觉差、咳嗽、头部充血，伴随头痛、感觉面部肿胀、牙疼、持续疲劳以及偶尔发烧。感染可能波及面部骨骼或者脑膜(脑膜炎)。少数情况下，窦炎还可能发展到在眼窝、大脑或面部骨骼内形成脓袋(砂眼)。
镇痛药例如对乙酰氨基酚，有助于减轻疼痛和降温。解充血药例如假麻黄碱，可减轻鼻内肿胀并且使窦排液。然而，通常情况下，长期使用解充血药实际上会加剧鼻腔堵塞。同样，可以使用抗菌剂治疗，但是可能产生耐药性。最后，可能进行鼻内镜外科手术。
M.van Agtoyen等(Rhinology，40，69-74，2002)提到非中性粒细胞减少症课题的临床研究已经表明非格司亭(Filgrastim，一种重组粒细胞集落刺激因子)可能对非中性粒细胞减少病人的严重细菌和机会真菌感染的治疗过程的附加治疗中有益。根据作者报道，对患严重慢性细菌性窦炎的病人的治疗是通过每天给药两次环丙沙星500-750毫克和三次克林霉素450-600毫克，连续14天，最初14天同时皮下给药非格司亭300微克(或皮下给予安慰剂)每天一次，另外1O周交替地每天皮下给药非格司亭300微克或安慰剂。在这种情况下，白细胞的总数增加了，因而免疫力也增强了。
Brent Weston等人(Journal of laboratory and clinical medicine117(1991)4)和J.Goultchin等人在一个案例报告(J.Periodontol，2000年9月)中描述了G-CSF对几个先天性中性粒细胞减少病人牙齿疾病的治疗效果。他们静脉注射该物质以刺激骨髓，表明对牙周炎和口腔溃疡有改善作用。这被认为是由于增强了免疫力的缘故。和大多数病人进行对比很困难，因为患先天性中性粒细胞减少症的病人从幼年期开始牙齿发育就失调了。
Gamoual J.等人(J.Chin.Periodontology 2003；30；616-62)提到对慢性牙周炎病人的研究中考虑到中性粒细胞的凋亡。尽管健康人和牙周炎病人的牙龈样品中的GM-CSF总量没有显著差异，他们仍然提出一个新的机理，即中性粒细胞在成年牙周炎病人的牙周组织累积。结果他们发现GM-CSF减少了中性粒细胞的凋亡。他们没有治疗任何病人或讨论这种可能性。
临床上，CSF组合物已经用于治疗由癌症化疗或放疗引起的骨髓抑制。也提出了CSF的其它临床用途。因而，WO03/039444公开了使用各种趋化因子和细胞因子即CSF，治疗病毒和/或真菌性皮肤病。美国第6689351号专利公开了通过GM-CSF的局部给药，促进各种创伤病人的伤口加速愈合。
已经被研究过CSF的化学结构，并且采用技术方法进行了说明，例如X-射线晶体衍射和核磁共振，参见Hill C.P.，Osslund T.D.，Eisenberg D.The structure of granulocyte-colony-stimulatingfactor and its relationship to other growth factors.Proc Natl Acad SciA 90，pp.5167(1993)和Zink T.，Ross A.，Luers K.，Cieslar C.，Rudolph R.，Holak T.A.Structure and dynamics of the humangranulocyte colony-stimulating factor determined by NMRspectroscopy.Loop mobility in a four-helix-bundle protein.Biochemistry 33，pp.8453(1994)。
本发明最重要的方面是快速消除感染和细菌性相关疾病之后的牙齿再钙化。该目的是通过局部治疗来完成的，而不是传统的刺激骨髓的方式。
从再钙化可以得出一个结论，那就是该方法还可以用于治疗骨折。
似乎细菌性窦炎和牙周疾病都是局部的细菌感染和细菌性相关疾病，虽然程度不同，都可能倾向于转为慢性并最终不得不通过外科手术来治疗。很明显，这两种疾病都仍然需要有效的药物，以避免外科手术和化疗，例如抗生素治疗。优选地，这样的药物能够提供实质上的总体治疗，以降低再次发作的可能性。换句话说，如果能够在例如牙龈和牙齿患有从牙龈炎到牙周炎的各种牙周疾病期间，使疾病得到不仅短期的而且长期的改善，这样的药物将是非常有益的。尤其是，即使对晚期牙周炎也不需要进行外科手术介入的药物，将是极度有益的。
本发明的主要目的是提供这种药物。
发明内容
一方面，本发明涉及到至少一种集落刺激因子(CSF)或其实质上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物在制备治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病以及感染骨组织再钙化的药物中的用途。
另一方面，本发明提供了一种包含至少一种CSF或其片段或衍生物的组合物，用于治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病。
又一方面，本发明涉及到一种治疗哺乳动物细菌感染和细菌性相关疾病的方法，给予有效治疗剂量的至少一种CSF或其实质上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物。在本发明中，CSF用于激发巨嗜细胞和粒细胞的产生，和通常使用的将骨髓作为靶标的静脉(i.v.)或皮下(s.c.)路线不同。
CSF可以是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)或多能集落刺激因子(multi-CSF)。
根据本发明的治疗方法，通过两个步骤来治愈牙周疾病1.根除细菌感染和细菌性相关疾病；和2.使牙齿长到骨骼上(再钙化)。
本发明的具体方面和内容如权利要求中的定义。
发明的详细描述本发明是基于惊人发现即至少一种有效治疗剂量的CSF局部给药能够明显改善局部细菌感染或细菌性相关疾病。的确，正如下文的一个实施例所述，通过对严重牙周炎、事实上正准备拔掉的牙齿附近牙龈组织注射仅仅一个剂量的GM-CSF制剂，牙齿就保住了；牙齿的病情很快得到改善并且没有复发。
另一方面，我们注意到注射GM-CSF不仅对病人的牙患有效，并且对病人的慢性窦炎也有效。确实，在注射之后，病人感到鼻窦堵塞有显著的好转，鼻内流出难闻的脓液，窦炎随之痊愈。
CSF局部治疗主要通过活化和趋化起作用。
不受制于任何理论，在低剂量给药情况下，CSF局部治疗激发局部的免疫防御能力而不产生任何显著的系统效果，另外，在牙周炎中牙槽骨被吸收的情况下，骨的再生能力被局部激发。
本发明一个很大的优点是，局部细菌感染和细菌性相关疾病可以通过身体有限部位的局部给药小剂量的本发明组合物进行治疗，而不产生任何对治疗主体的显著的系统效果。
因此，本发明涉及到一种治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病的药物和方法。所述“局部细菌感染和细菌性相关疾病”指的是实质上使哺乳动物的局部身体痛苦的细菌感染和细菌性相关疾病。因此，牙周疾病和窦炎属于局部细菌感染和细菌性相关疾病，例如败血病就不属于该疾病。
细胞因子是白细胞和其它几种类型的体细胞分泌的一种常规蛋白质。它们的多效性行为包括调节先天性和适应性免疫反应以及调节炎性反应。有各种各样的细胞因子如白细胞介素、干扰素、血小板活化因子和集落刺激因子(CSF)。CSF可以被细分为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及多能集落刺激因子(multi-CSF，也称为白细胞介素-3)。
CSF为骨髓前身存活、再生和分化所必须，以形成成熟的中性粒细胞、单核细胞和成熟的巨嗜细胞，以控制白血球的产生。例如，G-CSF刺激优势中性粒细胞集落的产生。另一方面，M-CSF仅仅对巨嗜细胞前身有用。M-CSF出现在胚胎形成的早期，对该多肽具有潜在的促进作用。GM-CSF控制巨嗜细胞和粒细胞前身细胞的不可逆行为。尽管GM-CSF和G-CSF作用于同一前身细胞世系，它也刺激巨嗜细胞的产生。
GM-CSF对成熟骨髓细胞的功能也具有重大的影响，包括增强抗体的产生、噬菌作用和细胞毒性。在较低浓度下，例如本发明所述的，骨髓细胞的这种活性主要是局部效果。
CSF可以通过例如本领域技术人员熟知的重组技术来制备(rCSFs)。例如欧洲第0188479号专利，公开了通过培养被含有编码灵长类GM-CSF蛋白的基因的载体转染的宿主细胞，来制备重组GM-CSF(rGM-CSF)。重组的人类GM-CSF的生产程序也已经被Burgess等人描述过[(1987)Blood，Vol.69，No.143-51]。重组G-CSF(rG-CSF)的生产方法已经在美国第4810643号专利中描述过。
CSF也可以通过商业途径得到。例如Molgramostim，一种重组GM-CSF，Schering-Plough出品，商品名Leucomax。另一种重组GM-CSF是Sargramostim，德国Schering AG出品，商品名Leukine。非格司亭(Filgrastim)是一种重组G-CSF，Amgen出品，商品名Neupogen和Granulokine。
任何CSF类似物或衍生物，只要具有可比的或增强的体内生物活性就可用于本发明。CSF类似物可通过消去、引入、或取代天然存在的糖蛋白主结构中的氨基酸或通过对糖蛋白进行化学修饰而产生。
优选地，CSF以药剂或由有效治疗剂量的CSF和一种或多种药学上可接受的载体和/或辅料组成的组合物的方式给药。使用的载体必须和制剂中的所有成分配伍。任意配制方法包括将生物活性成分引入载体和/或辅料，例如将CSF溶解或悬浮在液体或半液体赋形剂或载体中。
根据本发明，合适的局部给药制剂包括有效治疗剂量的治疗剂和一种或多种药物可接受载体和/或辅料。优选水作为载体。
例如，CSF制剂可以是小瓶装的消毒注射液。它也可以是冻干灭菌的粉剂，用灭菌水或抑菌水重新构成注射液。
本发明的药剂也可以是多种CSF的混合物，例如GM-CSF与G-CSF和/或M-CSF结合。这种药剂可以和仅有一种CSF作为活性成分的组合物以同样的方式制备和给药。
关于药物制剂和制备药物制剂的方法的一般信息，可以参考Remington的著作The Science and Practice of Pharmacy，19th ed.，Mack Printing Company，Easton，Pennsylvania(1995)。
本发明的制剂在哺乳动物、优选人的鼻腔和/或口腔局部给药，使药剂穿透粘膜。当治疗牙周疾病时，优选在患病区域附近例如在牙周裂缝中或其附近注射。注射剂可以局部注射到牙槽骨周围的牙周组织中，也即牙龈、牙槽粘膜、舌下粘膜、上腭部等部位中。可以合适地采用美国第6,682,718号专利讨论的“牙槽粘膜注射方法”。在该方法中，在牙龈附近柔软的口腔粘膜区不是垂直而是平铺的位置插入一根针，将药液注射到牙槽骨膜和牙槽粘膜之间。
本发明药剂也可以在鼻腔和口腔通过喷射方式给药。给药次数可以一天一次或一天数次。
局部注射的CSF制剂可包含无菌水或非水溶液，以及悬浮剂或乳化剂。水溶液的例子包括注射用蒸馏水和生理盐水。制剂可进一步包括助剂例如抗菌剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、助溶剂和等渗剂。通过能滞留细菌的过滤器过滤制剂，通过杀菌剂或辐射方式来灭菌。制剂可以在灭菌条件下制备或通过首先制备无菌固体组合物，然后在使用之前将其溶解在无菌水或无菌溶剂中得到注射液。
也可通过凝胶的方式给药，或通过任何其它具有类似流变性能的药物载体，例如包含一种缓释剂，直接施用于牙龈或牙周裂缝中，或通过灌输装置，将适量的CSF以合适的速度给药。美国第5,023,082号专利描述了治疗牙周疾病所使用的灌输装置。美国第6,274,175号专利公开了GM-CSF缓释剂。
对于窦炎的治疗，CSF注射剂优选在上腭进行，CSF制剂也可以通过喷入鼻孔或吸入鼻孔的方式给药。
CSF的给药剂量每次5-800μg，更优选每次20-400μg，最优选每次50-100μg之间。给药频率可以从每天一次至每三周一次，例如每周给药一至三次。总疗期可以从偶尔给药一次至三周。主治医生能够决定合适的给药剂量、给药频率以及给药期限。
还可以对治疗对象给药至少一种有效治疗剂量的其它活性成分。这种活性成分的选择取决于治疗对象的具体情况。例如，为有效对抗疾病涉及到的细菌，组合物可以包含抗菌剂。例如当该疾病是牙周炎时，很可能涉及到厌氧菌，适合的抗菌化合物可以是抗菌甲硝哒唑。这种抗菌剂可以配合CSF一起给药或单独给药，例如牙胶Elyzol。当然，同样可以使用其它的抗菌剂。
其它活性成分还可以是例如磷酸盐离子释放制剂和/或钙和维生素D3的组合。例如，在治疗期或临床主治医师决定的给药期中，给予0.5至2克钙和20-100μg维生素D3。
其它的活性成分还可以选自镁、萤石和维生素C和D，或它们的混合物，或任何上述提到的其它活性成分，例如钙。
在窦炎的治疗中，抗菌剂、解充血药或甾族化合物也可独立于CSF制剂或和CSF一起给药。适合的解充血药例子是Rinexin，适合的甾体制剂的例子是Nasonex喷雾剂。
可以使用CSF冻干制剂来制备本发明药物。例如，这种制剂可以即时溶解在一种合适的液体载体中。如果不是立即使用，可以将这种CSF液体制剂保存在冰箱或冷库中，或者通过添加本领域技术人员熟知的防腐剂以延长其保存期限。适合的防腐剂可以是苯甲醇，添加量占CSF水溶液制剂的重量百分比1-2％。
也可使用两室注射器，装有CSF冻干制剂和适合的液体载体，在室温下保存。
另一种使用方式是使用单剂量的凝胶弹性小瓶并配备小针头，用于感染牙齿周围的袋中。
目前，本发明优选的CSF是GM-CSF，采用液体注射液进行给药，每剂0.05-0.2ml液体，含有50-100μg。
以下提供的实施例是为了更好地说明本发明，而不是意图限制其范围。
具体实施例方式
注射剂配方GM-CSF(Molgramostim)50μg注射用水适量(qs)100μl将Molgramostim溶解到注射用水中，并在室温下缓慢搅拌。
牙周炎的治疗实施例1男性病人，年龄47，患有严重的牙周炎。主治牙医认为，尤其是一颗上牙无法补救，计划将其拔掉。在该病人牙周裂缝附近注射单剂80μg GM-CSF，每周一次，连续三周。牙周感染和细菌性相关疾病痊愈，并且恢复了牙齿和腭骨的连接。
该病人也患有慢性窦炎。在接受GM-CSF注射之后，该病人的窦炎有显著好转并且在治疗期间内窦炎彻底痊愈。三年之后，此人仍未患过牙周炎。
实施例2女性病人，年龄59，患严重的牙周炎。牙齿的射线照相表明在几颗牙齿周围存在深的裂缝。在该病人牙周裂缝附近注射单剂50μg GM-CSF。病人有显著好转。注射三个月后在牙齿的同一部位射线照相。可以明显地观察到牙齿状况显著改善——深的牙周裂缝消失了。
一年之内没有复发。
权利要求
1.至少一种集落刺激因子(CSF)、其实质上具有CSF生物功能和活性的片段或它们的衍生物在制备局部治疗哺乳动物局部细菌感染和细菌性相关疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中的细菌感染和细菌性相关疾病是牙周疾病或窦炎。
3.根据权利要求2的用途，其中的牙周疾病是龈炎或牙周炎。
4.根据权利要求1-3任一项的用途，其中的CSF选自粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨嗜细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)和多能集落刺激因子(multi-CSF)。
5.根据权利要求4的用途，其中的CSF是GM-CSF。
6.根据权利要求1-5任一项的用途，其中的药物形式适于注射到牙龈粘膜中或应用于牙周袋中进行给药。
7.根据权利要求1-6任一项的用途，其中CSF、其片段或其衍生物在药物中的量是例如单位剂量5μg-800μg。
8.根据权利要求7的用途，其中单位剂量是50μg-100μg。
9.根据权利要求1-8任一项的用途，其中给药间隔是从一天一次至三周一次。
10.根据权利要求9的用途，其中一周给药一至三次。
11.根据权利要求1-10任一项的用途，其中的药物包括至少一种有效治疗剂量的并且生理上可接受量的其它活性成分。
12.根据权利要求1-10任一项的用途，其中的CSF、其片段或其衍生物通过载体和宿主细胞来制备，所述载体含有编码CSF的基因，所述宿主细胞能够表达该基因。
13.一种用于局部治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病的组合物，包含至少一种CSF或其片段或衍生物。
14.根据权利要求13的组合物，其中的CSF是GM-CSF。
15.一种治疗哺乳动物局部细菌感染和细菌性相关疾病的方法，给药有效治疗剂量和生理上可接受量的至少一种CSF或其实质上具有CSF生物功能和活性的片段或其衍生物。
全文摘要
本发明提供包含至少一种CSF或其片段或衍生物的组合物，用于治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病。同时，提供至少一种集落刺激因子(CSF)或其实质上具有CSF生物学功能和活性的片段或其衍生物在制备治疗局部细菌感染和细菌性相关疾病的药物中的用途。该CSF选自粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子和多能集落刺激因子。同时提供治疗哺乳动物局部细菌感染和细菌性相关疾病的方法。局部细菌感染和细菌性相关疾病可以是牙周疾病或窦炎。
文档编号A61K38/19GK1956705SQ200580016492
公开日2007年5月2日 申请日期2005年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者汉瑞克·阿尔恩博格 申请人:因诺文图斯设计有限公司
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