治疗肝病的药物的制作方法
专利名称：治疗肝病的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗肝病的新型药物，以及一种预防和/或治疗肝病的新方法。
单核细胞化学引诱蛋白质-1(MCP-1)(CC趋化因子中的一种)，本身作为一种蛋白质被首次报导，具体上与此同时，它的cDNA序列也被确定了(实验方法杂志(J.Exp.Med.)，169，1449-1459，1989；实验方法杂志(J.Exp.Med.)，169，1485-1490，1989；FEBSlett.，244，487-493，1989)。
识别MCP-1的受体已经被鉴别出来，它们的cDNA也被克隆出来(美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91，2752-2756，1994；生物化学·生物生理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，202，1156-1162，1994)。目前已经发现九种CC趋化因子的受体，并且把MCP-1的受体称作“CCR2”。
据Rollins等人报导，他们制备了多种MCP-1蛋白的氨基酸突变体，并且发现一些氨基酸突变体已经失去了细胞迁移活性(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，269，15918-15924，1994)。在这些突变体中，7ND-MCP-1是通过删除从N端数第2至第8位氨基酸获得的突变体，它具有连接CCR2的能力，但是却不能引起细胞迁移。从另一方面来说，做为显性失活剂，7ND-MCP-1与野生型的MCP-1形成二聚体从而抑制MCP-1的功能。此外，目前已知通过与趋化因子的相应内源单体形成杂二聚体，N端缺失的趋化因子是趋化因子-受体相互作用的有效显性失活抑制剂，而且这些抑制剂对于治疗炎症是有效的，如后血管成形术再狭窄，类风湿性关节炎，肠炎，多重硬化症，和如肺纤维化等慢性肺炎，自身免疫疾病以及诸如此类的病症(JP-A-11506005)。
肝纤维化是一种病态，它使正常的组织结构的破坏，纤维原细胞的增殖和胞外基质的积累加剧，而且纤维化后期的病症是硬化。目前，对于这些疾病还没有既有效又安全的治疗方法。例如，各种不同症状的治疗被应用于硬化，但硬化却发展为不可弥补性硬化，结果导致很差的预后改善。
本发明的目的是提供一种预防和/或治疗肝病如肝纤维化或肝硬化的新型药物，以及一种预防和/或治疗这种肝病的新方法。
具体地讲，本发明提供了一种预防和/或治疗肝病的药物，其含有作为活性成分的MCP-1功能抑制剂。
本发明还提供了一种预防和/或治疗肝病的方法，其包括将编码MCP-1拮抗物或者MCP-1显性失活剂施加给生物体。
本发明进一步提供了一种预防和/或治疗肝病的组合物，其含有MCP-1功能抑制剂和一种药物可接受的载体。
本发明更进一步提供了MCP-1功能抑制剂在制备预防和/或治疗肝病的药物中的用途。
例如，抗-MCP-1-抗体可以通过免疫学杂志(J.Immunology)，147，2229-2233，1991中公开的方法来获得，而MCP-1拮抗物和MCP-1显性失活剂已经在JP-A-11506005等文献中公开。
本发明中，引入编码MCP-1功能抑制剂的基因与将MCP-1功能抑制剂作为蛋白质施用于生物体相比，优选前者，因为前者可以使基因在生物体(血液)内保留的时间更长。
在本发明中，优选MCP-1拮抗物或者MCP-1显性失活剂，更优选7ND-MCP-1。进而，优选编码MCP-1拮抗物或MCP-1显性失活剂的基因，其中更优选编码7ND-MCP-1的基因。作为编码7ND-MCP-1的基因，可以使用具有由序列表中SEQ ID NO1所示碱基序列的DNA。这种DNA可通过本领域已知的基因工程方法制备。具体地说，按照编码野生型MCP-1的并且由序列表中SEQ ID NO2所示的DNA的碱基序列，所述DNA可以通过采用了合成引物的PCR制备。
只要能起作用，对用于在生物体内表达基因的表达载体没有特别的限制。具有说明性质的是质粒载体，如pcDNA3，pEF-BOS和pXT1；和逆转录病毒载体，如腺病毒载体和仙台病毒载体。在构建表达载体时，也有可能用到启动子或增强子。只要在宿主(生物体)中能起作用，对于启动子或增强子没有特别的限制。启动子的例子包括SV40启动子，CMV启动子，HSV-TK，SRα和RSV。
为了使基因在宿主(生物体)中表达，还需要使用脂质体。在这种情况下，基因存在于脂质体内，或者存在于构成脂质体的脂质双分子层膜的内部或外部。已知多种脂质体组合物允许基因在宿主(生物体)中表达。
为了证实由所引入的7ND-MCP-1基因制备的7ND-MCP-1蛋白质，只需要通过ELISA来确定该蛋白质是否存在于血清中。
MCP-1功能抑制剂是一种本发明所述预防和/或治疗肝病的药物的活性成分，它可以通过口服或非肠道的方式给包括人在内的动物的机体用药。如果功能抑制剂是一种蛋白质，则需要非肠道用药。对于非肠道用药方式，可以采用注射。可以直接在病变部位(肝部)注射，也可以在除肝以外的其它部位注射，如动脉、静脉、肌肉、皮肤或皮下组织。作为注射MCP-1功能抑制剂的药物制剂(制剂形式)，可以采用注射剂。这种注射剂可以通过已知的药物制剂生产技术得到。制备注射剂时可向药物制剂中加入一种或多种添加剂。例如，等渗剂，缓冲剂，防腐剂，赋形剂和安抚剂。
每个病人使用的剂量可以根据他或她的病情，年龄，性别，体重等情况适度调整。例如2至4周内施用一次0.1至1000毫克(蛋白质)或0.01至100毫克(基因)。
(1)7ND-MCP-1的构建与表达以编码MCP-1的pcDNA3载体质粒为模板，通过PCR方法制备编码7ND-MCP-1的质粒载体。每个突变体都通过双向DNA序列分析来确定。得到的编码7ND-MCP-1的PCR产物被插入到pcDNA3载体质粒的多克隆位点中，将载体质粒转化到大肠杆菌中，然后，利用“Plasmid Giga Kit(QIAGEN GmbH)”将质粒DNA纯化。
(2)7ND-MCP-1对于大鼠的由二甲基亚硝胺诱导的肝纤维症的作用通过在雄性Wistar大鼠的腹内注入1％的二甲基亚硝胺(100μL/100g大鼠重)，每周连续三天共四周，制备肝纤维症的大鼠模型。在施用MCP-1突变基因(7ND-MCP-1基因)的前三天，在大鼠的右大腿部位肌内注射0.25％的麻卡因氢氯化物(100μL/100g大鼠重)，经过上述预处理是为了增加基因引入的效率。
在开始施用二甲基亚硝胺的当天，将突变MCP-1基因(7ND-MCP-1基因)肌内注射(100μg DNA[1μg/1μL]/100g大鼠重)到预处理部位。对照组中，载体DNA以同样数量施用。在施用二甲基亚硝胺的第12天，对大鼠的左大腿肌肉再次施用上述同样数量的突变MCP-1基因(7ND-MCP-1基因)。此外，在再次给药的前三天(施用二甲基亚硝胺的第12天)，与上述方法一样用麻卡因氢氯化物进行预处理。对照组中，载体DNA也进行类似的施用。
28天后，取出肝脏，测量它的重量，组织纤维化程度以及组织的羟脯氨酸浓度。按照Masson的毛状体染色法对纤维化部位染色以确定纤维化程度。用HPLC测定组织的羟脯氨酸浓度。
结果，在施用了MCP-1突变基因(7ND-MCP-1基因)组中，肝重为10.42±4.01g(根据Mann-Whitney的显著性试验p＜0.05)，而对照组中的肝重量为4.95±2.00g，以及纤维化程度为±，而对照组的纤维化程度为+++。从而观察到对肝纤维化的明显抑制效果。
在施用了MCP-1突变基因(7ND-MCP-1基因)组中，组织的羟脯氨酸浓度为28.2±9.12μmol/g大鼠肝重(根据Mann-Whitney的显著性试验p＜0.05)，而对照组重为186.75±130.78μmol/g大鼠肝重。因此又可观察到，通过施用MCP-1突变基因(7-ND-MCP-1)对肝组织中的羟脯氨酸浓度有显著的降低作用。
工业实用性从实施例可以明显的看出，MCP-1功能抑制剂对于预防和/或治疗肝病如肝纤维化和肝硬化是有效的。
序列表序列表<110>EGASHIRA KENSUKE；DAIICHI PHARMACEUTICAL CO.，LTD<120>新的肝病治疗剂<130>P04841210<150>JP 2000-310604<151>2000-10-11<160>2<210>1<211>279<212>DNA<213>人<400>1atgaaagtct ctgccgccct tctgtgcctg ctgctcatag cagccacctt cattccccaa 60gggctcgctc aggtcacctg ctgttataac ttcaccaata ggaagatctc agtgcagagg 90ctcgcgagct atagaagaat caccagcagc aagtgtccca aagaagctgt gatcttcaag 120accattgtgg ccaaggagat ctgtgctgac cccaagcaga agtgggttca ggattccatg 180gaccacctgg acaagcaaac ccaaactccg aagacttga 279<210>2<211>300<212>DNA<213>人<300><301>Yoshimura，T.，Yuhki，N.，Moore，S.K.，Appella，E.，Lerman，M.I.，Leonard，E.J.<302>人单核细胞化学引诱蛋白质-1(MCP-1)全长DNA克隆，在受到连指手套刺激的血液单核白细胞中表达，和与小鼠感受态基因JE的序列相似性。<303>FEBS Letters<304>244<305>2<306>487-493<307>1989-02<400>2atgaaagtct ctgccgccct tctgtgcctg ctgctcatag cagccacctt cattccccaa 60gggctcgctc agccagatgc aatcaatgcc ccagtcacct gctgttataa cttcaccaat 120aggaagatct cagtgcagag gctcgcgagc tatagaagaa tcaccagcag caagtgtccc 180aaagaagctg tgatcttcaa gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag 240aagtgggttc aggattccat ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga 300
权利要求
1.一种预防和/或治疗肝病的药物，含有作为活性成分的单核细胞化学引诱蛋白质-1(MCP-1)功能抑制剂。
2.一种如权利要求1所述的预防和/或治疗肝病的药物，其中所述MCP-1功能抑制剂含有一种或多种选自抗MCP-1抗体，MCP-1拮抗物，MCP-1显性失活剂及其编码基因的抑制剂。
3.一种如权利要求2所述的预防和/或治疗肝病的药物，其中编码所述MCP-1显性失活剂的基因由序列表中SEQ ID NO1来表示。
4.一种预防和/或治疗肝病的方法，其包括对生物体施用编码MCP-1显性失活剂的基因。
5.一种如权利要求4所述的预防和/或治疗肝病的方法，其中所述基因由序列表中SEQ ID NO1来表示。
6.一种如权利要求5所述的预防和/或治疗肝病的方法，其中所述基因被施用于所述生物体的除肝以外的其它部位。
7.一种如权利要求6所述的预防和/或治疗肝病的方法，其中所述除肝以外的其它部位是肌肉。
8.一种预防和/或治疗肝病的组合物，含有一种MCP-1功能抑制剂和一种药学可接受的载体。
9.MCP-1功能抑制剂在制备预防和/或治疗肝病药物中的用途。
全文摘要
预防和/或治疗肝病的药物，其含有作为活性成分的单核细胞化学引诱蛋白质－1(MCP－1)功能抑制剂。施用MCP－1功能抑制剂带来了预防和/或治疗肝病的效果。
文档编号A61K38/19GK1469756SQ01817244
公开日2004年1月21日 申请日期2001年9月28日 优先权日2000年10月11日
发明者江头健辅, 孔, 竹下彰, 小柳雅孔, 诚, 一, 中牟田诚, 西田健一 申请人:江头健辅, 第一制药株式会社
技术领域：
本发明涉及一种治疗肝病的新型药物，以及一种预防和/或治疗肝病的新方法。
单核细胞化学引诱蛋白质-1(MCP-1)(CC趋化因子中的一种)，本身作为一种蛋白质被首次报导，具体上与此同时，它的cDNA序列也被确定了(实验方法杂志(J.Exp.Med.)，169，1449-1459，1989；实验方法杂志(J.Exp.Med.)，169，1485-1490，1989；FEBSlett.，244，487-493，1989)。
识别MCP-1的受体已经被鉴别出来，它们的cDNA也被克隆出来(美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91，2752-2756，1994；生物化学·生物生理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，202，1156-1162，1994)。目前已经发现九种CC趋化因子的受体，并且把MCP-1的受体称作“CCR2”。
据Rollins等人报导，他们制备了多种MCP-1蛋白的氨基酸突变体，并且发现一些氨基酸突变体已经失去了细胞迁移活性(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，269，15918-15924，1994)。在这些突变体中，7ND-MCP-1是通过删除从N端数第2至第8位氨基酸获得的突变体，它具有连接CCR2的能力，但是却不能引起细胞迁移。从另一方面来说，做为显性失活剂，7ND-MCP-1与野生型的MCP-1形成二聚体从而抑制MCP-1的功能。此外，目前已知通过与趋化因子的相应内源单体形成杂二聚体，N端缺失的趋化因子是趋化因子-受体相互作用的有效显性失活抑制剂，而且这些抑制剂对于治疗炎症是有效的，如后血管成形术再狭窄，类风湿性关节炎，肠炎，多重硬化症，和如肺纤维化等慢性肺炎，自身免疫疾病以及诸如此类的病症(JP-A-11506005)。
肝纤维化是一种病态，它使正常的组织结构的破坏，纤维原细胞的增殖和胞外基质的积累加剧，而且纤维化后期的病症是硬化。目前，对于这些疾病还没有既有效又安全的治疗方法。例如，各种不同症状的治疗被应用于硬化，但硬化却发展为不可弥补性硬化，结果导致很差的预后改善。
本发明的目的是提供一种预防和/或治疗肝病如肝纤维化或肝硬化的新型药物，以及一种预防和/或治疗这种肝病的新方法。
具体地讲，本发明提供了一种预防和/或治疗肝病的药物，其含有作为活性成分的MCP-1功能抑制剂。
本发明还提供了一种预防和/或治疗肝病的方法，其包括将编码MCP-1拮抗物或者MCP-1显性失活剂施加给生物体。
本发明进一步提供了一种预防和/或治疗肝病的组合物，其含有MCP-1功能抑制剂和一种药物可接受的载体。
本发明更进一步提供了MCP-1功能抑制剂在制备预防和/或治疗肝病的药物中的用途。
例如，抗-MCP-1-抗体可以通过免疫学杂志(J.Immunology)，147，2229-2233，1991中公开的方法来获得，而MCP-1拮抗物和MCP-1显性失活剂已经在JP-A-11506005等文献中公开。
本发明中，引入编码MCP-1功能抑制剂的基因与将MCP-1功能抑制剂作为蛋白质施用于生物体相比，优选前者，因为前者可以使基因在生物体(血液)内保留的时间更长。
在本发明中，优选MCP-1拮抗物或者MCP-1显性失活剂，更优选7ND-MCP-1。进而，优选编码MCP-1拮抗物或MCP-1显性失活剂的基因，其中更优选编码7ND-MCP-1的基因。作为编码7ND-MCP-1的基因，可以使用具有由序列表中SEQ ID NO1所示碱基序列的DNA。这种DNA可通过本领域已知的基因工程方法制备。具体地说，按照编码野生型MCP-1的并且由序列表中SEQ ID NO2所示的DNA的碱基序列，所述DNA可以通过采用了合成引物的PCR制备。
只要能起作用，对用于在生物体内表达基因的表达载体没有特别的限制。具有说明性质的是质粒载体，如pcDNA3，pEF-BOS和pXT1；和逆转录病毒载体，如腺病毒载体和仙台病毒载体。在构建表达载体时，也有可能用到启动子或增强子。只要在宿主(生物体)中能起作用，对于启动子或增强子没有特别的限制。启动子的例子包括SV40启动子，CMV启动子，HSV-TK，SRα和RSV。
为了使基因在宿主(生物体)中表达，还需要使用脂质体。在这种情况下，基因存在于脂质体内，或者存在于构成脂质体的脂质双分子层膜的内部或外部。已知多种脂质体组合物允许基因在宿主(生物体)中表达。
为了证实由所引入的7ND-MCP-1基因制备的7ND-MCP-1蛋白质，只需要通过ELISA来确定该蛋白质是否存在于血清中。
MCP-1功能抑制剂是一种本发明所述预防和/或治疗肝病的药物的活性成分，它可以通过口服或非肠道的方式给包括人在内的动物的机体用药。如果功能抑制剂是一种蛋白质，则需要非肠道用药。对于非肠道用药方式，可以采用注射。可以直接在病变部位(肝部)注射，也可以在除肝以外的其它部位注射，如动脉、静脉、肌肉、皮肤或皮下组织。作为注射MCP-1功能抑制剂的药物制剂(制剂形式)，可以采用注射剂。这种注射剂可以通过已知的药物制剂生产技术得到。制备注射剂时可向药物制剂中加入一种或多种添加剂。例如，等渗剂，缓冲剂，防腐剂，赋形剂和安抚剂。
每个病人使用的剂量可以根据他或她的病情，年龄，性别，体重等情况适度调整。例如2至4周内施用一次0.1至1000毫克(蛋白质)或0.01至100毫克(基因)。
(1)7ND-MCP-1的构建与表达以编码MCP-1的pcDNA3载体质粒为模板，通过PCR方法制备编码7ND-MCP-1的质粒载体。每个突变体都通过双向DNA序列分析来确定。得到的编码7ND-MCP-1的PCR产物被插入到pcDNA3载体质粒的多克隆位点中，将载体质粒转化到大肠杆菌中，然后，利用“Plasmid Giga Kit(QIAGEN GmbH)”将质粒DNA纯化。
(2)7ND-MCP-1对于大鼠的由二甲基亚硝胺诱导的肝纤维症的作用通过在雄性Wistar大鼠的腹内注入1％的二甲基亚硝胺(100μL/100g大鼠重)，每周连续三天共四周，制备肝纤维症的大鼠模型。在施用MCP-1突变基因(7ND-MCP-1基因)的前三天，在大鼠的右大腿部位肌内注射0.25％的麻卡因氢氯化物(100μL/100g大鼠重)，经过上述预处理是为了增加基因引入的效率。
在开始施用二甲基亚硝胺的当天，将突变MCP-1基因(7ND-MCP-1基因)肌内注射(100μg DNA[1μg/1μL]/100g大鼠重)到预处理部位。对照组中，载体DNA以同样数量施用。在施用二甲基亚硝胺的第12天，对大鼠的左大腿肌肉再次施用上述同样数量的突变MCP-1基因(7ND-MCP-1基因)。此外，在再次给药的前三天(施用二甲基亚硝胺的第12天)，与上述方法一样用麻卡因氢氯化物进行预处理。对照组中，载体DNA也进行类似的施用。
28天后，取出肝脏，测量它的重量，组织纤维化程度以及组织的羟脯氨酸浓度。按照Masson的毛状体染色法对纤维化部位染色以确定纤维化程度。用HPLC测定组织的羟脯氨酸浓度。
结果，在施用了MCP-1突变基因(7ND-MCP-1基因)组中，肝重为10.42±4.01g(根据Mann-Whitney的显著性试验p＜0.05)，而对照组中的肝重量为4.95±2.00g，以及纤维化程度为±，而对照组的纤维化程度为+++。从而观察到对肝纤维化的明显抑制效果。
在施用了MCP-1突变基因(7ND-MCP-1基因)组中，组织的羟脯氨酸浓度为28.2±9.12μmol/g大鼠肝重(根据Mann-Whitney的显著性试验p＜0.05)，而对照组重为186.75±130.78μmol/g大鼠肝重。因此又可观察到，通过施用MCP-1突变基因(7-ND-MCP-1)对肝组织中的羟脯氨酸浓度有显著的降低作用。
工业实用性从实施例可以明显的看出，MCP-1功能抑制剂对于预防和/或治疗肝病如肝纤维化和肝硬化是有效的。
序列表序列表<110>EGASHIRA KENSUKE；DAIICHI PHARMACEUTICAL CO.，LTD<120>新的肝病治疗剂<130>P04841210<150>JP 2000-310604<151>2000-10-11<160>2<210>1<211>279<212>DNA<213>人<400>1atgaaagtct ctgccgccct tctgtgcctg ctgctcatag cagccacctt cattccccaa 60gggctcgctc aggtcacctg ctgttataac ttcaccaata ggaagatctc agtgcagagg 90ctcgcgagct atagaagaat caccagcagc aagtgtccca aagaagctgt gatcttcaag 120accattgtgg ccaaggagat ctgtgctgac cccaagcaga agtgggttca ggattccatg 180gaccacctgg acaagcaaac ccaaactccg aagacttga 279<210>2<211>300<212>DNA<213>人<300><301>Yoshimura，T.，Yuhki，N.，Moore，S.K.，Appella，E.，Lerman，M.I.，Leonard，E.J.<302>人单核细胞化学引诱蛋白质-1(MCP-1)全长DNA克隆，在受到连指手套刺激的血液单核白细胞中表达，和与小鼠感受态基因JE的序列相似性。<303>FEBS Letters<304>244<305>2<306>487-493<307>1989-02<400>2atgaaagtct ctgccgccct tctgtgcctg ctgctcatag cagccacctt cattccccaa 60gggctcgctc agccagatgc aatcaatgcc ccagtcacct gctgttataa cttcaccaat 120aggaagatct cagtgcagag gctcgcgagc tatagaagaa tcaccagcag caagtgtccc 180aaagaagctg tgatcttcaa gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag 240aagtgggttc aggattccat ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga 300
权利要求
1.一种预防和/或治疗肝病的药物，含有作为活性成分的单核细胞化学引诱蛋白质-1(MCP-1)功能抑制剂。
2.一种如权利要求1所述的预防和/或治疗肝病的药物，其中所述MCP-1功能抑制剂含有一种或多种选自抗MCP-1抗体，MCP-1拮抗物，MCP-1显性失活剂及其编码基因的抑制剂。
3.一种如权利要求2所述的预防和/或治疗肝病的药物，其中编码所述MCP-1显性失活剂的基因由序列表中SEQ ID NO1来表示。
4.一种预防和/或治疗肝病的方法，其包括对生物体施用编码MCP-1显性失活剂的基因。
5.一种如权利要求4所述的预防和/或治疗肝病的方法，其中所述基因由序列表中SEQ ID NO1来表示。
6.一种如权利要求5所述的预防和/或治疗肝病的方法，其中所述基因被施用于所述生物体的除肝以外的其它部位。
7.一种如权利要求6所述的预防和/或治疗肝病的方法，其中所述除肝以外的其它部位是肌肉。
8.一种预防和/或治疗肝病的组合物，含有一种MCP-1功能抑制剂和一种药学可接受的载体。
9.MCP-1功能抑制剂在制备预防和/或治疗肝病药物中的用途。
全文摘要
预防和/或治疗肝病的药物，其含有作为活性成分的单核细胞化学引诱蛋白质－1(MCP－1)功能抑制剂。施用MCP－1功能抑制剂带来了预防和/或治疗肝病的效果。
文档编号A61K38/19GK1469756SQ01817244
公开日2004年1月21日 申请日期2001年9月28日 优先权日2000年10月11日
发明者江头健辅, 孔, 竹下彰, 小柳雅孔, 诚, 一, 中牟田诚, 西田健一 申请人:江头健辅, 第一制药株式会社
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