一种治疗肝癌的中药的制作方法

专利名称：：一种治疗肝癌的中药的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药，特别是一种治疗肝癌的中药。二
背景技术：
：肝癌是常见多发的恶性肿瘤之一，世界上每年约有26万人死于肝癌，其中我国每年死于肝癌的人数约为11万，占全世界肝癌死亡病例的42.5%，并且随着社会的发展，肝癌的发生率呈现与日倶增之势。由于本病病程短(多为36个月)、进展快、死亡率高，严重危害了人民的健康和生命。祖国医学对肝癌的认识渊源已久，在《内经》中就已有类似肝癌的症状、体征和病因的记载。后经历代医家的补充，从而对肝癌病因和病机已有了更加深入地认识。肝癌作为一种全身性疾病，其发病是内、外因共同作用的结果。内有正气先虚，外有邪毒侵犯，致使肝失疏泄，造成气滞血瘀、热蕴痰凝，日久积而成块，聚于肝脏，形成肝癌。肝癌属于本虚标实之证本虚即气血不足，脏腑虚弱；标实即邪气留恋，促成痰凝血瘀火毒内蕴。在肝癌的发生发展过程中，还明显地呈现出阶段性发病之初多为肝郁脾虚、气血瘀滞，晚期由于邪毒耗气伤血、正气大损。目前治疗肝癌的中西药物很多，如维生素E、维生素C、氟尿嘧啶、多柔比星(阿霉素)、丝裂霉素(MMC)、消癌丸等，但由于种种原因，其使用和疗效并不尽人意，因此，治疗肝癌药物的创新是需要认真解决的技术问题。三
发明内容针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种治疗肝癌的中药，可有效解决肝癌的治疗问题，其解决的技术方案是，根据中医药学原理和肝癌发病机理，由前述肝癌是正气先虚，外有邪毒侵犯，致使肝失疏泄，造成气滞血瘀、热蕴痰凝，日久积而成块，聚于肝脏，形成肝癌，其治疗应以扶正祛邪、固本、解毒、活血化瘀为治疗根本原则，故本发明采用由重量份数计当归14-16份、延胡索9-11份、蚤休14-16份和白头翁14-16份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，每次加入药物重量和的15-20倍的水，煎沸后，文火煎煮40-60分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量的5-10倍的无水乙醇，浸泡7天，过滤，得滤液，两次浓縮，第一次浓縮至无水乙醇量的1/15后，再进行第二次浓縮成相对比重为1.2-1.6(或浓縮至原药液体积的40-70%)的稠膏，真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉，本发明组方简单，配伍合理科学，服用效果好，疗效高，是治疗肝癌中药上的创新。四具体实施例方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。实施例1本发明在具体实施时，可以下重量份数计当归14份、延胡索9份、蚤休14份和白头翁14份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，第一次加入药物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎50分钟，每二次加入药物重量和15倍的水，煎沸后，文火煎40分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量的5倍的无水乙醇，浸泡7天，滤纸过滤，得滤液，用旋转蒸发器5(TC浓縮，浓縮至无水乙醇量的1/15，再转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成相对比重为1.2的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。实施例2本发明还可由以下重量份数计当归15份、延胡索10份、蚤休15份和白头翁15份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，第一次加入药物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎55分钟，每二次加入药物重量和16倍的水，煎沸后，文火煎45分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量的8倍的无水乙醇，浸泡7天，滤纸过滤，得滤液，用旋转蒸发器5(TC浓縮，浓縮至无水乙醇量的1/15，再转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成相对比重为1.3的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。实施例3本发明还可由以下重量份数计当归16份、延胡索11份、蚤休16份和白头翁16份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，第一次加入药物重量和20倍的水，煎沸后，文火煎60分钟，每二次加入药物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎50分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量10倍的无水乙醇，浸泡7天，滤纸过滤，得滤液，用旋转蒸发器5(TC浓縮，浓縮至无水乙醇量的1/15，再转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成相对比重为1.4的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。实施例4本发明还可由重量计的当归15g、延胡索10g、蚤休15g和白头翁15g制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，第一次加水990ml，煎沸后，文火煎55分钟，每二次加水880ml，煎沸后，文火煎45分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量8倍的无水乙醇(即当归15g加无水乙醇120g，延胡索10g加无水乙醇80g，蚤休15g加无水乙醇120g，白头翁15g加无水乙醇120g)，浸泡7天，滤纸过滤，得滤液，用旋转蒸发器5(TC浓縮，浓縮至无水乙醇量的1/15，再转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成相对比重为1.6的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。在上述药物中，其中当归补血活血，调经止痛，润肠通便；延胡索(又称元胡，玄胡)，活血、利气、止痛；蚤休(又称重楼)，清热、解毒、镇静；白头翁，清热解毒，凉血止痢。当归、延胡索组成养血活血方(B);蚤休、白头翁组成清热解毒方(H);两方组合为本发明养血活血、清热解毒合方(A)。上述药物的有效组合，互相支持，具有养血活血、清热解毒、消瘀血，解恶毒，益气养阴，扶正固本，有效用于治疗肝癌，并为试验资料和临床资料所证明，有关资料如下—、试验资料l实验对象H印G2细胞购自中国医学科院细胞中心。2实验方药和分组实验方药分养血活血方、清热解毒方和养血活血清热解毒合方。养血活血方(B):当归、延胡索；清热解毒方(H):蚤休、白头翁；养血活血清热解毒合方(A):当归、延胡索、蚤休和白头翁。上述中药均购于河南中医学院第三附属医院。3实验材料和方法3.1药物制备3.1.1试剂无水乙醇(分析纯)天津市科密欧化学试剂开发中心3.1.2主要仪器SHZ-D循环水式真空泵河南巩义市英峪华中仪器厂RE-3000B旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂DK-S24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司DZF-6050型真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司3.1.3药物提取方法按药物当归、延胡索、蚤休和白头翁各250g，分别加乙醇1500ml，冷浸一周后，滤纸过滤，旋转蒸发器5(TC浓縮至100ml，转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成稠膏状，5(rC真空干燥，所得提取物，称重，分装，置_201:冰箱保存，备用，使用时，再按相当于原生药物当归15g、延胡索10g、蚤休15g和白头翁15g为一剂份量的醇提物分别组成养血活血方(B)、清热解毒方(H)和本发明中药养血活血清热解毒合方(A)，并依此进行试验。3.2细胞培养3.2.1试剂①MEM培养基(GIBC0产品)；②胰蛋白酶(SABC产品)；③特级胎牛血清(Hyclone产品)；MTT染料(Sigma产品)3.2.2主要仪器Heraeus细胞培养箱(德国Kendro公司)；倒置显微镜(Zeiss公司)；紫外分光光度计(Thermo公司)；SG_603生物安全柜(Bake公司)；ELx800型酶标仪(Bio-Tek公司)；蛋白电泳系统(Bio-Rad公司)；高速低温台式离心机(Sigma公司)。3.2.3细胞培养方法(1)复苏液氮中保存的H印G2细胞；(2)用含10%胎牛血清的MEM培养液，接种于培养瓶中置37°C、5%C02培养箱内培养；(3)镜下观察培养瓶内细胞汇合率达到瓶底面积的80%时，吸去旧培养液，加入适量O.25%胰蛋白酶，37°〇消化35分钟，使其脱壁(4)加入MEM洗涤培养液洗涤细胞2次；(5)用10X胎牛血清的MEM培养液制成细胞悬液，按1X107皿的细胞密度接种于新的培养皿中继续扩大培养。3.3MTT方法检测细胞生长抑制率3.3.1试剂MTTSigma公司DMS0Amresco公司3.3.2仪器ELx800型酶标仪BIO-TEK公司其他仪器同细胞培养3.3.3主要试剂配制(l)5mg/mlMTT溶液配制0.5gMTT，加100mlPBS缓冲液，混匀，过滤除菌，4。C冰箱保存备用。(2)其他试剂同细胞培养3.3.4MTT测定方法(1)以IX104细胞/孔接种96孔平面培养板，在37°C、5%C02及饱和湿度的C02培养箱中培养24小时；(2)分为对照组(C)，养血活血方组(B)，清热解毒方组(H)，合方组(A)，(？)每组设3个复孔。每味药物的浓度梯度均为1.25iig/ml、12.5iig/ml、25iig/ml、50iig/ml、100iig/ml、200iig/ml、400yg/ml、800yg/ml;合方为养血活血方和清热解毒方剂量之和。(3)继续培养48小时，吸去培养上清，每孔加入0.5mg/ml的MTT100ml，继续培养2小时，小心吸去上清，并加入100ii1/孔的DMSO，稍稍振荡，用酶标仪在波长570nm处，测定OD值。(4)用SPSS11.0统计软件绘制剂量_效应曲线，由此曲线拟合公式计算细胞生长半数抑制量(IC5。)。3.4.Westernblot测定mtp53、PKCa蛋白的表达以1X106细胞/皿接种①100mm细胞培养皿，在37t:、5XC02及饱和湿度的C02培养箱中培养24小时。分为对照组(C)，养血活血方组(B)，清热解毒方组(H)，合方组(A)，()其中养血活血组、清热解毒组药物剂量为其1/2IC50，合方为养血活血和清热解毒剂量之和。继续培养48小时后，去除培养上清，加入10mlPBS，用细胞刮刀收集细胞到15ml离心管中，1000rpm离心10分钟，收集细胞沉淀。加入0.5ml预冷的裂解缓冲液裂解细胞。超声破碎。力口入100,1/LPMSF5ii1，10iig/mlleup印tin1iil，冰浴1小时。15000rpm离心15分钟。取上清，用Bradford法测蛋白浓度，10yg/孔上样，SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维素膜，封闭、洗涤30min，加入一抗反应4h、洗涤30min，加入二抗反应2h，洗涤30min，用增强化学发光(ECL)试剂曝光、显影、定影、洗片，重复3次。3.5ELISA方法检测AFP的含量3.5.1试剂甲胎蛋白定量检测试剂盒郑州博赛生物工程有限公司3.5.2仪器如同前面MTT测定所用仪器3.5.3ELISA方法检测AFP含量6(1)在96孔细胞培养板中接种每孔1X104个细胞；(2)24小时后，分组加药，分组及用药情况如同MTT实验；(3)继续培养细胞6小时，收集上清加入酶标板；(4)加入一抗反应4小时，洗板5次；[OO72](5)加入显色剂；(6)在酶标仪上以450nm的波长读取0D，绘制标准曲线，计算样本含量。4统计学处理应用联想奔IV计算机，SPSS11.0统计软件进行曲线拟合，F检验。结果1养血活血、清热解毒及其合方对H印G2细胞形态的影响倒置显微镜下观察对照组细胞较大，形态似上皮细胞，多边形，境界清，核大圆形，细胞浆中未见透明颗粒，可检出双核、巨核和不规则形态核的细胞，能见到不对称分裂现象；细胞间相互连接，密集成片生长。养血活血组细胞存在较多的圆形细胞，细胞核固縮；而清热解毒组细胞，浆内充满圆形、透明折光强的颗粒，悬浮细胞增多，并且体积縮小变圆，细胞散在生长，细胞间隙加大；合方组的细胞形态改变为前两者兼而有之。2养血活血、清热解毒及其合方对H印G2细胞生长的影响养血活血、清热解毒及其合方均可抑制H印G2细胞的生长，并且随药物浓度的增加，细胞抑制率逐渐上升，呈现剂量_效应依赖关系，以合方抑制作用最强。由药物对肝癌细胞的抑制作用经SPSS拟合曲线回归公式如下养血活血方Y=-0.8068+0.26481n(x)其中Rsq=0.948，F=72.62，Sigf=0.001清热解毒方Y=-0.5397+0.2406ln(x)其中Rsq=0.797，F=15.66，Sigf=0.017合方Y=-0.4725+0.23761n(x)其中Rsq=0.796，F=15.65，Sigf=0.017由上述拟合曲线分别得到养血活血方对H印G2细胞的IC5。为139.08yg/ml，清热解毒方对H印G2细胞的IC5。为75.28yg/ml，合方对H印G2细胞的IC5。为59.92yg/ml(见表1)。表1养血活血、清热解毒及合方对H印G2细胞生长的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3养血活血方(B)、清热解毒方(H)及其合方(A)对H印G2细胞mtp53蛋白表达的影响养血活血方、清热解毒方及其合方分别对H印G2细胞mtp53蛋白的表达有明显抑制作用，而合方作用最强。这显示养血活血方及清热解毒方具有协同作用。4养血活血方(B)、清热解毒方(H)及其合方(A)对H印G2细胞PKCa蛋白表达的影响同对照组(C)相比，养血活血方、清热解毒方及其合方分别对H印G2细胞PKCa蛋白的表达有明显抑制作用，而合方作用最强。这显示养血活血方及清热解毒方具有协同作用。5养血活血、清热解毒及其合方对H印G2细胞AFP蛋白表达的影响各药物组对H印G2细胞AFP蛋白表达有明显抑制作用，随药物浓度的增加，抑制率逐渐上升，呈现剂量-效应依赖关系。(见表2)表2各药物组对H印G2细胞AFP蛋白表达抑制作用表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上述情况表明PKCa、p53和AFP在肝癌病变中的作用1.lp53与肝癌发生的关系p53基因是一种肿瘤抑制基因，全长20kb，位于人染色体17p13.1，由11个外显子和间隔的10个内含子组成，编码393个氨基酸组成的53kD的核内磷酸化蛋白，具有蛋白质-DNA和蛋白质_蛋白质结合的功能[11]。现已明确，p53基因是一个比较特殊的基因，野生型p53(wtp53)基因作为抑癌基因行使功能，成为细胞生长周期的负调控因子，与细胞周期的调控、基因组的稳定、DNA的修复、细胞分化和细胞凋亡等重要的生物学功能密切相关[12]。作为一种肿瘤抑制基因，人类各种组织中均有wtp53mRNA的表达，尽管在正常细胞中其表达产物水平很低，但扮演着一个十分重要的角色一方面，p53基因与DNA相结合，起转录因子作用，能活化CDK抑制剂、p21WAFl和GADD45基因的转录，使细胞生长停滞在^关卡，可以和TATA结合蛋白(TBP)结合，抑制c-fos、c-j皿、RB、PCNA及p53基因自身的转录，还可以与复制因子A(RPA)相互作用，参与DNA的复制及修复，抑制细胞增殖；另一方面，它作为"基因卫士"监视着细胞基因组的完整性，在细胞受到某种射线或药物的作用而发生DNA损伤的情况下，能使细胞分裂终止在G乂S期，以便细胞有足够的时间修复损伤以恢复正常状态，若损伤不能修复就启动细胞的凋亡。大量研究表明p53基因在许多肿瘤中都有很高的突变率，是迄今为止发现的突变率最高、涉及范围最广泛并被广泛研究的抑癌基因之一[14]。对于突变p53蛋白的功能，目前有两种解释一是显性失活机制，当p53等位基因位点有一个发生突变时，p53突变体(mtp53)可通过干扰wtp53蛋白的功能而影响细胞的生长，为细胞的癌变提供了条件，但并不直接致癌。二是功能获得机制，即mtp53蛋白不仅失去负调控能力，而且获得了转化能力，具有癌蛋白的功能，能与细胞内wtp53相结合，抑制其正常功能，并可竞争性结合p53的正常底物而起到干扰作用，从而剌激细胞异常增殖，最终导致细胞的恶性转化形成癌[15]。另外，DNA肿瘤病毒蛋白还可以和wtp53蛋白相结合形成复合物，使wtp53蛋白抗癌功能的丧失及半衰期的延长而在细胞内大量积聚，增强了细胞的分裂和增殖能力。对中国南部地区的70例HCC患者的嗜肝病毒感染和病理资料与p53基因变化的关系分析的结果显示，p53基因的密码子249的突变与AFP阳性、HCC分化程度、HCC高度流行区、嗜肝病毒感染以及HBVDNA在癌组织中存在等因素密切相关^。尽管流行病学研究表明肝癌的发生是多因素、多阶段和多个基因改变协同作用的结果，但是环境因素(如HBV感染、黄曲霉毒素B工摄入以及饮用水污染等)较遗传因素更为重要，它可以引起p53的变异而促进肝癌的发生。(1)黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)，尤其是AFBjAF的一种，它在薄层层析中显示蓝色荧光，故名)作为肝癌的致癌物已经确认，但其确切机制尚未明了。在ShenHM的研究报告中，p53基因突变主要发生在第249密码子的的第三碱基G:T—T:A颠换，导致精氨酸一丝氨酸的变化，并认为这可能是AFB工的攻击靶点，其后的大量研究也支持这一结果来自于欧美、中东及其他AFB工低含量区的肝癌，虽然也存在较高的突变频率，但是第249位密码子的突变率却非常低，这表明p53基因的突变差异与不同的致癌因素作用有关^。同时由AFB工引起实验动物的p53基因突变位置也发生在第249密码子，这也间接地支持了AFB1的致癌作用[19]。(2)乙型肝炎病毒(HBV)是肝癌的另一个主要的环境致癌因子，它与肝癌的密切关系早已被流行病学资料所证实。实验研究发现，绝大多数源于HBV感染的肝癌存在HBVDNA的整合^。据推测第17号染色体长臂由较多的HBVDNA的整合，其中有些靠近p53基因的位置，而HBVDNA的整合则有可能直接引起p53基因结构的改变。另外，也有研究表明HBVX蛋白可能与野生型p53蛋白结合形成复合物，不仅阻遏了wtp53的功能，而且使p53蛋白在细胞内地积聚，并可激活HBV在细胞内的复制，形成恶性循环，导致肝癌的发生。1.2PKCa和肝癌发生的关系蛋白激酶C(PKC)是一组磷脂依赖性&2+激活的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶。它由单一多肽链组成，相对分子质量为7783KD，包括两个功能区，即与磷脂、二酰甘油(DAG)及TPA(佛波脂)结合的疏水性调节区和与ATP及底物相结合的亲水性催化区。9PKC广泛分布在机体的各种组织中，主要以无活性的形式存在于胞质中，在无剌激条件下对Ca2+不敏感，当外界剌激引起4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)分解使细胞内甘油二酯(DG)和IP3增加以及继发的Ca2+的水平升高时，PKC则从胞质移位结合到质膜上而被激活。PKC的激活方式有两种途径一是靠调节催化区而实现的。某些因子，如磷脂、Ca2+、TPA等，与调节区结合则可诱发其构象变化，启动催化区从而活化PKC;另一种途径是通过某些受体激动剂或激素来增强磷脂酰肌醇代谢周转率，不断产生DAG和三磷酸肌醇(IP3)而活化PKC。PKC被激活后，可以将细胞质中的某些结合有基因表达调控因子的抑制蛋白磷酸化，使抑制蛋白释放出基因表达调控蛋白，进入细胞核促进特异基因的表达；或者激活一个级联系统的蛋白激酶，让激活的蛋白激酶再通过磷酸化的方式激活下游特定基因表达的调控蛋白，从而影响细胞的生长、分化、增殖甚至癌变等。PKC不仅是细胞信号传导系统中的一个关键酶，而且它还一直被认为有促癌作用。近年研究发现，PKCa的表达参与细胞的恶性转化及肿瘤细胞多药耐药性的形成。在肝癌组织中，PKCa的蛋白表达水平明显高于正常组织及良性病变；并且，癌组织和边缘癌组织PKCa表达的阳性率明显高于其相应的癌旁组织和非肝癌组织，中心癌组织则又明显高于边缘癌组织[27]。这提示肝癌细胞内PKCa蛋白表达量的上升，提高了它在细胞信息传递中的反应性，从而促进细胞的增殖与或恶性病变。1.3AFP与肝癌发生的关系甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是第一个用于诊断肝癌的肿瘤标志物，其诊断阳性率为6070%。研究发现，人AFP基因位于第四号染色体短臂4ql112区，和血清白蛋白及维生素D结构蛋白基因都位于相同染色体区，AFP基因大约有20kb，含有15个外显子，14个内含子，在转录起始点的上游有44个核苷酸的5端帽子结构，具有2个ALU家族序列和2个Poly(dT-dG)重复序列。AFP基因编码一分子量约为69kD的糖蛋白，通过相应的mRNA推测其大约含591个氨基酸残基，并与血清白蛋白在遗传特征和结构上相近，在氨基酸顺序上也广泛同源。AFP是一种癌胚蛋白。在胚胎早期，AFP是胎儿血液循环中的主要蛋白之一，约为白蛋白水平的1/10;而在婴儿出生后18个月后其血清中的AFP含量就已接近正常成年人的水平(<20ug/L)。研究发现，[28]在胚胎发育过程中，AFP的增强子始终处于激活状态，而沉默子则处于抑制状态，因此增强子的信号可以顺利到达启动子区而启动AFP基因的大量表达。胎儿出生后，沉默子活化，阻碍了增强子的启动效应，使AFP表达受到抑制。当HCC发生时，沉默子再次受到抑制，得以使AFP的基因转录又一次被激活并在HCC中大量表达。研究表明，肝癌细胞所表达的AFP具有既能抑制机体免疫系统使肝癌细胞能避开机体的免疫攻击、又能反过来直接促进肝癌细胞生长的双重作用。1.4肝癌的发生和发展过程中，mtp53、PKCa及AFP三者之间的关系早已发现PKCa氨基酸序列中的绞链区(C3)可转位进入核内而发挥其对核基因及转录因子表达的调节能力。研究发现，人癌细胞在PKC抑制剂Staurosporine和Sphingsine或大剂量TPA(佛波酯)作用降低PKCa含量后，p53蛋白的表达明显降低，这表明PKCa可调节p53蛋白含量^。而且p53的DNA结合位点和启动位点与PKCa磷酸化位点非常相似，在p53蛋白的357381位氨基酸序列上存在能被PKCa结合并磷酸化的多个丝氨酸和苏氨酸残基^^，这提示p53可能是PKCa的底物。NakamuraK研究认为，wtp53的磷酸化依赖于PKCa的激活^，而wtp53蛋白的磷酸化作用就是其作为转录因子的前提。wtp53蛋白可使受损细胞阻滞于Gl期，让细胞有足够时间得以修复受损DNA或阻止不能修复的细胞进入G2/M期而出现凋亡，从而起到抗肿瘤作用，但当wtp53突变为mtp53而在细胞内大量积聚，继而被PKCa的磷酸化作用而激活后就会通过多种机制促进细胞的恶性增殖。李孟森等研究表明，在一定剂量范围(0.0lmg/L0.08mg/L)，AFP能够促使胞外Ca2+内流和胞内&2+池的Ca2+外溢，引起胞浆Ca2+升高，这为PKCa的活化提供了条件；同时检测细胞周期、细胞DNA合成等指标，均证明AFP能加快细胞从Gl期进入S期，显著促进了DNA的合成，并发现AFP作用于细胞后也能促进p53、c-fos、c-j皿、N-ras等原癌基因的表达而引起细胞的恶性增殖。可见，AFP，mtp53及PKCa三者之间相互影响，相互作用，共同导致了肝癌的发生和发展。2养血活血、清热解毒方对H印G2细胞生长mtp53、PKCa和AFP的抑制作用从中医药角度出发，结合mtp53、PKCa及AFP的基因表达情况来研究肝癌的发生与发展，国内尚未有过报道。本研究中我们通过观察肝癌细胞中mtp53、PKCa及AFP三者在药物作用前后表达情况的变化，探求肝癌的发展规律及中医药的作用机理，进而根据药效反证探讨肿瘤病机。我们已对古今文献中治疗肿瘤的方药进行了系统整理和分析，初步从300余种中药中筛选出一些能有效抑制肝癌细胞生长的中药，并根据祖国医学对肝癌的病因病机的认识，通过一系列的实验研究组建了治疗肝癌的养血活血、清热解毒方。养血活血清热解毒方由当归、延胡索、蚤休、白头翁等四味中药组成。其中，当归，甘温质润，功专补血、活血、调经、止痛，为补血之要药；延胡索辛散温通，具有活血、行气和止痛的作用；蚤休具有清热解毒、消肿止痛和凉肝定惊之功效，为治痈肿疔毒的要药；白头翁具有清热解毒和凉血止痢的功效，尤善于清理胃肠的湿热和血分热毒等。以上诸药合用，共奏养血活血、清热解毒之功，以达到治疗肝癌的目的。实验结果显示，养血活血清热解毒方对肝癌细胞H印G2的生长具有一定的抑制作用，并且随药物浓度的增加，对肝癌细胞的生长抑制率逐渐升高，呈现出剂量-效应依赖关系。养血活血方和清热解毒方与合方相比，以合方的作用最强，表明养血活血方和清热解毒方之间具有协同作用，根据药效反证说明在肝癌的发生发展过程中，具有血虚、血瘀和热毒等多因素并存的复杂的病机。在本项研究中，我们用Westernblot及ELISA技术检测了用药前后肝癌细胞中mtp53、PKCa及AFP蛋白表达的变化。发现与对照组相比，养血活血、清热解毒方及合方能明显下调mtp53、PKCa及AFP蛋白的表达，提示养血活血、清热解毒方可通过抑制mtp53、PKCa及AFP蛋白的表达来抑制肝癌细胞增殖，也说明中医肝癌血虚、血瘀和热毒病机与mtp53、PKCa及AFP蛋白的表达异常密切相关。3.血虚、血瘀及热毒内蕴和肝癌发生的关系血虚、血瘀及热毒蕴结是肝癌发生发展的重要病理机制。血虚不濡脉道，可致血流不畅，瘀血又可致新血不生；瘀血日久化为热毒、血虚也易生热，反之热毒又使阴血耗伤，灼血为瘀，三者相互促进，互为影响，共同导致了肝癌的发生和发展。我们的研究表明，在肝癌的发生和发展过程中，存在着mtp53、PKCa和AFP蛋白表达的异常。应用养血活血、清热解毒方可以抑制肝癌细胞的生长和mtp53、PKCa和AFP蛋白表达，这提示mtp53、PKCa和AFP蛋白的异常表达可能就是肝癌发生过程中血虚、血瘀和热毒内蕴状态的分子机理。结论1、养血活血方、清热解毒方及其合方能抑制肝癌细胞H印G2的生长，其中养血活血药和清热解毒药的配伍具有协同作用。2、养血活血方、清热解毒方及合方均能通过抑制AFP、wtp53及PKCa蛋白的表达而抑制细胞的增殖。3、通过药效反证反映在肝癌发生发展过程中，血虚、血瘀、热毒内蕴与mtp53、、PKCa及AFP蛋白过度表达密切相关。二、临床资料除上述试验证明本发明具有防止肝癌的发生和发展，抑制肝癌的机理外，并经临床资料得到了有治疗肝癌作用的充分证明，有关临床资料如下在临床中，对118人原发性肝癌进行治疗，在减轻症状、改善生活质量和延长生存期方面有显著效果，对肝癌产生一定作用，具体情况见下列各表临床组服用本发明中药，对照组60例服用西药氟尿嘧啶、阿霉素、丝裂霉素。治后生存期(生存率)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>生活质量改善情况，采用Karnofsky评分标准<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>病灶客观指标改善情况<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由上述资料可以看出，本发明是治疗肝癌的有效药物，可大大延长患者的生命，特别是缓解症状方面比其它药物有绝对的优势，临床意义是中药上的一大创造。权利要求一种治疗肝癌的中药，其特征在于，重量份数计当归14-16份、延胡索9-11份、蚤休14-16份和白头翁14-16份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，每次加入药物重量和的15-20倍的水，煎沸后，文火煎煮40-60分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量的5-10倍的无水乙醇，浸泡7天，过滤，得滤液，两次浓缩，第一次浓缩至无水乙醇量的1/15后，再进行第二次浓缩成相对比重为1.2-1.6的稠膏，真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。2.根据权利要求l所述的治疗肝癌的中药，其特征在于，由以下重量份数计当归14份、延胡索9份、蚤休14份和白头翁14份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，第一次加入药物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎50分钟，每二次加入药物重量和15倍的水，煎沸后，文火煎40分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量的5倍的无水乙醇，浸泡7天，滤纸过滤，得滤液，用旋转蒸发器5(TC浓縮，浓縮至无水乙醇量的1/15，再转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成相对比重为1.2的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。3.根据权利要求l所述的治疗肝癌的中药，其特征在于，由以下重量份数计当归15份、延胡索10份、蚤休15份和白头翁15份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，第一次加入药物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎55分钟，每二次加入药物重量和16倍的水，煎沸后，文火煎45分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量的8倍的无水乙醇，浸泡7天，滤纸过滤，得滤液，用旋转蒸发器5(TC浓縮，浓縮至无水乙醇量的1/15，再转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成相对比重为1.3的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。4.根据权利要求1所述的治疗肝癌的中药，其特征在于，由以下重量份数计当归16份、延胡索11份、蚤休16份和白头翁16份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，第一次加入药物重量和20倍的水，煎沸后，文火煎60分钟，每二次加入药物重量和18倍的水，煎沸后，文火煎50分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量10倍的无水乙醇，浸泡7天，滤纸过滤，得滤液，用旋转蒸发器5(TC浓縮，浓縮至无水乙醇量的1/15，再转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成相对比重为1.4的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。5.根据权利要求1所述的治疗肝癌的中药，其特征在于，由重量计的当归15g、延胡索10g、蚤休15g和白头翁15g制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，煎煮两次，第一次加水990ml，煎沸后，文火煎55分钟，每二次加水880ml，煎沸后，文火煎45分钟，合并滤液，即成；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量8倍的无水乙醇，浸泡7天，滤纸过滤，得滤液，用旋转蒸发器5(TC浓縮，浓縮至无水乙醇量的1/15，再转移至蒸发皿，8(TC水浴浓縮成相对比重为1.6的稠膏，5(TC真空干燥，得醇提物，将醇提物混合在一起，粉碎成醇提物中药粉。全文摘要本发明涉及治疗肝癌的中药，可有效解决肝癌的治疗问题，其解决的技术方案是，由重量份数计当归14-16份、延胡索9-11份、蚤休14-16份和白头翁14-16份制成的汤剂或醇提粉剂，所说的汤剂是将当归、延胡索、蚤休和白头翁混合在一起，加入药物重量和15-20倍的水煎煮两次，煎沸后，文火煎煮40-60分钟，合并滤液；所说的醇提粉剂是分别将当归、延胡索、蚤休和白头翁置于醇提罐内，加入每份药物重量的5-10倍的无水乙醇，浸泡7天，过滤，得滤液，两次浓缩，第一次浓缩至无水乙醇量的1/15后，再进行第二次浓缩成相对比重为1.2-1.6的稠膏，真空干燥，得醇提物，粉碎成醇提物中药粉，本发明组方简单，配伍合理科学，服用效果好，疗效高，是治疗肝癌中药上的创新。文档编号A61K36/896GK101708272SQ20091022775公开日2010年5月19日申请日期2009年12月30日优先权日2009年12月30日发明者司富春申请人:河南中医学院