米托蒽醌的脂质体制剂的制作方法
专利名称：米托蒽醌的脂质体制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及米托蒽醌的脂质体制剂及其制备方法和应用。
经批准Novantrone与皮质类固醇联用作为治疗患有晚期抗激素性前列腺癌相关疼痛的患者的早期化学疗法。Novantrone的推荐剂量为12-14mg/m2，作为短期静脉输注给药，每21天一次。
另外还批准Novantrone与其它经批准的药物联合用于急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)的早期疗法，所述的急性非淋巴细胞性白血病包括髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、单核细胞性白血病和红细胞系统急性白血病。推荐剂量为每日12mg/m2的Novantrone 1-3天时，其以静脉输注给予，并伴随1-7天时的作为连续24小时输注给药7天的100mg/m2的阿糖胞苷给予。
还批准Novantrone用于缓解神经残疾和/或缓解患有继发性(慢性)进行性、进行性复发性、或恶化复发型多发性硬化症患者中的临床复发频率。
认为盐酸米托蒽醌是对培养中的增殖和非增殖人体细胞都具有细胞毒性的DNA-反应剂。
米托蒽醌的毒性限制了可以给予患者的药物的剂量。此外，与米托蒽醌接触的细胞中的广谱抗药性的发生限制了其功效。因此，需要这样的米托蒽醌制剂，其足以溶解米托蒽醌而例如通过将治疗细胞中的毒性和广谱抗药性的发生降至最低限度来将其功效发挥至最高。
本发明提供了这类组合物和方法。本发明的这些和其它优点以及本发明的其它特征显然可以从本文提供的本发明说明书中得出。
在一种制备所述剂型的特别优选的方法中，将一定量药物上可接受赋形剂中的米托蒽醌(诸如Novantrone)加入到含有一定量预冻干脂质体的容器中，并使米托蒽醌与脂质体结合而得到所述药物剂型。所述的脂质体包含有米托蒽醌结合成分。发明详述本发明提供了用于哺乳动物宿主的组合物及其制备方法和对哺乳动物宿主的转运方法。该组合物和方法的特征在于避免了米托蒽醌的溶解问题、高米托蒽醌和脂质体稳定性、能够作为以高浓度快速浓注或短期输注方式给予米托蒽醌、米托蒽醌毒性降低、特别是米托蒽醌在心肌中的累积减少、米托蒽醌的治疗功效提高和调节癌细胞中的广谱抗药性。心磷脂在该制剂中的应用将米托蒽醌的包载改善到了令人惊奇的程度。
本发明的组合物是含有心磷脂的米托蒽醌的脂质体制剂。一般来说，可以通过公知技术制备脂质体制剂。例如，在一种优选的技术中，将米托蒽醌与心磷脂一起溶于疏水性溶剂并使心磷脂与米托蒽醌形成复合物。可以蒸发含心磷脂/米托蒽醌的混合物而形成薄膜以便有利于复合物形成。此后，可以将含有任意所需其它亲脂组分的溶液加入到该薄膜上并使米托蒽醌/心磷脂复合物溶于或充分分散于该溶液中。然后蒸发该溶液而形成第二脂质膜。随后可以将诸如含水溶剂这样的极性溶剂加入到所述脂质膜上并将所得混合物剧烈匀化成本发明的脂质体。
或者，可以将所有的亲脂组分溶于适宜溶剂，然后可以对该体系进行蒸发而形成亲脂膜。随后将诸如含水溶剂这样的极性溶剂加入到所述脂质膜上并将所得混合物剧烈匀化成本发明的脂质体。
如果如上所述将米托蒽醌溶于脂质膜，那么可以将该剂型便利地包装在可以加入合适的含水溶液以形成脂质体的单一小瓶中。或者，可以制备两瓶系统，其中将亲脂组分或预制的脂质体包含在一个小瓶中，而将含有米托蒽醌的含水组分装在第二个小瓶中。可以将含有米托蒽醌的含水组分转入含有脂质膜或预制脂质体的小瓶，并通过剧烈混合、涡旋和/或声波处理而形成米托蒽醌的脂质体制剂。
理想的情况是，一旦脂质体形成，则将其通过适宜滤膜过滤以控制其大小。合适的滤膜包括那些可以用于从滤液中获得所需范围大小的脂质体的滤膜。例如，可以形成脂质体且此后通过5微米滤膜过滤而得到具有约5微米或5微米以下直径的脂质体。或者，可以通过使用1μm、500nm、200nm、100nm或其它滤膜来获得具有相应大小(sozes)的脂质体。
为了制备米托蒽醌制剂，将米托蒽醌溶于适宜溶剂。合适的溶剂是那些米托蒽醌可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。例如，可以使用非极性溶剂、弱极性溶剂或极性溶剂，诸如乙醇、甲醇、氯仿、丙酮或盐水等。
可以将任意合适的心磷脂用于本发明。例如，心磷脂可以纯化自天然来源或可以以化学方式合成，诸如四肉豆蔻基心磷脂。可以将心磷脂溶于适宜溶剂，所述的溶剂包括心磷脂可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。可以将心磷脂溶液与米托蒽醌混合。或者，可以将心磷脂与米托蒽醌直接溶解。已经发现通过将心磷脂混入脂质体使脂质体对米托蒽醌的容量增加至令人惊奇的程度。因此，还可以将心磷脂衍生物用于本发明的脂质体制剂，只要所得的脂质体制剂对治疗应用而言足够稳定且对米托蒽醌具有适宜的容量。
可以将任意合适的脂质体形成物质用于本发明的脂质体制剂。合适的脂质体形成物质包括合成的、半合成的(天然改性的)或天然出现的具有亲水部分和疏水部分的化合物。这类化合物是两亲分子且可以带有净正、负或呈中性电荷。形成脂质体的化合物的疏水部分可以包括一个或多个非极性的脂族链，例如棕榈酰基。合适的形成脂质体的化合物的实例包括磷脂类、甾醇类、脂肪酸类等。优选的形成脂质体的化合物包括心磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和α-生育酚。
可以将脂质体形成物质溶于它在其中可以溶解的适宜溶剂，该溶剂可以是诸如氯仿这样的低极性溶剂或诸如正己烷这样的非极性溶剂。合适的溶剂仅包括脂质体形成物质可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。在该溶液中可以混有包括米托蒽醌在内的其它成分以形成溶液，其中所有组分在该溶液均是可溶的而且随后可以将该溶剂蒸发而得到一种均匀的脂质膜。可以通过保持米托蒽醌和其它亲脂组分稳定性的任意适宜方式来进行溶剂蒸发。
合适的脂质体可以是中性的、带负电荷或带正电荷，该电荷是脂质体成分电荷和脂质体溶液pH的函数。例如，在中性pH下，带正电荷的脂质体可以由磷脂酰胆碱、胆固醇和硬脂胺的混合物形成。带负电荷的脂质体例如可以由磷脂酰胆碱、胆固醇和磷脂酰丝氨酸形成。在一个优选的实施方案中，米托蒽醌的脂质体制剂含有四肉豆蔻酰基心磷脂、胆固醇和卵磷脂酰胆碱。
优选的米托蒽醌脂质体制剂含有适当相对摩尔量的米托蒽醌和脂质。米托蒽醌与脂质的合适的相对摩尔量范围约为1∶1-50、更优选约1∶2-40、更优选约1∶5-30、更优选约1∶10-20，且最优选约1∶15。该脂质体制剂还含有适当相对摩尔量的心磷脂、磷脂酰胆碱和胆固醇。合适的相对摩尔量包括约0.1-25∶1-99∶0.1-50的心磷脂∶磷脂酰胆碱∶胆固醇。更优选相对摩尔量范围在0.2-10∶2-50∶1-25、更优选0.5-5∶4-25∶2-15且更优选的用量范围在0.75-2∶5-15∶4-10、最优选的比例为1∶10∶6.8。优选的脂质体制剂还含有适量的诸如α-生育酚这样的抗氧化剂或其它合适的抗氧化剂。适量范围约为0.001或0.001以上到约5wt.％或5wt.％以下。
可以通过将极性溶液、优选水溶液诸如盐水溶液加入到脂质膜上并通过剧烈混合分散该膜而形成脂质体。优选所述的极性溶液中含有米托蒽醌。该溶液可以是纯水或者其可以含有盐、缓冲液或其它可溶性活性剂。可以使用任意混合方法，条件是所选择的方法诱导脂质膜与极性溶剂之间产生足够的剪切力以便剧烈匀化所述混合物并形成脂质体。例如，可以通过涡旋、磁性搅拌和/或声波处理来进行混合。可以单纯通过涡旋所述溶液而形成多层脂质体。如果需要单层脂质体，那么在该方法中可以包括声波处理和/或过滤步骤。
在制备米托蒽醌脂质体制剂的优选方法中，准备装有冻干脂质体的小瓶并加入Novantrone而形成米托蒽醌的脂质体制剂。如实施例7中更具体描述的那样，通过将脂质组分和D-α-生育酸溶于温丁醇来制备冻干的脂质体。将含有海藻糖二水合物的温水混入该溶液，直到该溶液澄清为止。将该溶液通过0.22μm滤膜无菌过滤入无菌小瓶并冻干。理想的情况是，该冻干产物是白色饼或粉末，其含有的水分约为12％或12％以下，而且其可以很容易地重新组成pH约为3-6的均匀脂质体溶液。
通过将诸如来自Novantrone小瓶的7.5ml米托蒽醌溶液(15mg)和7.5ml生理盐水(0.9％NaCl)加入到装有冻干脂质的小瓶中来制备最终的剂型。将该脂质体混合物在室温下水合30分钟并在室温下将其剧烈涡旋2分钟。使该混合物水合，同时在浴型声波处理器中以最大强度进行声波处理10分钟。在45分钟内将这种最终剂型配入注射器或标准输液器以便于在再溶解后8小时内使用。使用这种方法可以将约70wt.％或70wt.％以上的添加的米托蒽醌包载在脂质体制剂中。更优选包载约80wt.％或80wt.％以上的米托蒽醌。更优选在脂质体中包载约90wt.％或90wt.％以上乃至约95wt.％或95wt.％以上的米托蒽醌。
可以通过在水溶液中将所述脂质体制剂的等分部分透析过夜并随后将该脂质体溶于甲醇且通过使用高效液相层析(HPLC)的标准方法分析该样品来测定米托蒽醌的包载效率。或者，在用50,000xg离心1小时后收集脂质体，而后将其溶于甲醇用于HPLC分析。通常，米托蒽醌在脂质体中的包囊效率高于初始输入剂量的80％。
更一般的情况是，可以使用任意形成脂质体的适宜方法，只要此方法引起脂质体米托蒽醌产生。因此，可以使用不涉及干脂质膜形成的溶剂蒸发法。例如，可以通过在水和有机相中形成乳剂并蒸发有机溶剂来制备脂质体。本发明意图包括不管用何种方法制备的米托蒽醌的脂质体制剂。
本发明包括药物制剂，此制剂除了含有无毒性的、惰性的药物上适宜的赋形剂之外还含有米托蒽醌的脂质体制剂，本发明还包括这些制剂的生产方法。可以理解的是所谓药物上的适宜赋形剂指的是各类固体、半固体或液体稀释剂、填充剂和配制助剂。本发明还包括单位剂型的药物制剂。这意味着所述制剂是个体部分的形式，例如小瓶、注射器、胶囊、丸剂、栓剂或安瓿，在它们中的脂质体包载的米托蒽醌含量相当于一部分单位剂量或多个单位剂量。例如，该单位剂型可以含有1、2、3或4个单位剂量或1/2、1/3或1/4个单位剂量。单位剂量优选含有在一次给药中给予的米托蒽醌用量，而且其通常相当于全部每日剂量、半数每日剂量或每日剂量三分之一或四分之一的米托蒽醌用量。
片剂、锭剂、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、溶液、混悬剂和乳剂、糊剂、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂和喷雾剂可以是合适的药物制剂。栓剂除含有脂质体米托蒽醌外还含有合适的水溶性或水不溶性赋形剂。合适的赋形剂是那些本发明脂质体米托蒽醌在其中充分保持稳定以用于治疗应用的赋形剂，例如聚乙二醇、某些脂肪类和酯类或这些物质的混合物。软膏、糊剂、霜剂和凝胶也可以含有脂质体米托蒽醌在其中保持稳定的合适的赋形剂。
该米托蒽醌制剂优选应以上述药物制剂形式存在，其浓度约为总制剂干重的0.1-50wt.％、优选约0.5-25wt.％。
按照公知的方法、例如通过将脂质体米托蒽醌与赋形剂或多种赋形剂混合而以常规方式制备上述药物制剂。
将活性化合物和含有该活性化合物的药物制剂用于人和兽用药物，以预防、缓解和/或治愈任何哺乳动物诸如母牛、马、猪、狗或猫的疾病，特别是那些因细胞增殖导致的疾病，诸如癌症。例如，可以用本米托蒽醌制剂有效治疗狗的淋巴瘤。然而，本制剂特别优选用于治疗人体患者，特别是用于因细胞增殖导致的癌症和其它疾病。本发明的组合物特别用于治疗人多发性硬化症、淋巴瘤和前列腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌。
可以经局部、口服、非肠道、腹膜内和/或直肠、优选经非肠道给予所述的活性化合物或其药物制剂，不过，优选静脉内给药。
例如，在约70kg体重的人中，给予约0.5-100mg/m2米托蒽醌。优选给予约5.0或5.0以上-50mg/m2的米托蒽醌或更优选约10或10以上-约45mg/m2的米托蒽醌。可以更优选约25或25以上-约40mg/m2的米托蒽醌。然而，依据具体情况可以脱离所述的这些剂量范围，特别是依据受治疗者的特性和体重、疾病的性质和严重程度、所述制剂的性质和是否给予该药，以及进行给药的时间和间隔的函数，这是必需的。因此，在某些情况中，足以将用量控制在上述活性化合物的用量以下，而在其它情况中，可以超过上述活性化合物的用量。合适的用量是不具有过度毒性的治疗有效量，正如在经验和病例——病例研究中所测定的。
本发明的一个优点在于它提供了一种调节癌细胞中的广谱抗药性的方法，所述的癌细胞处于米托蒽醌治疗。特别是，本脂质体制剂缓解了用米托蒽醌进行化疗的癌细胞对其发生耐受性的倾向，并缓解了所治疗的细胞形成耐受其它治疗剂诸如喜树碱、太平洋紫杉素或阿霉素的倾向。因此，可以将其它活性剂有利地与本治疗方法或者以活性剂与米托蒽醌的联合用药物的形式联用或者以分别给药的方式使用。
实施例表明米托蒽醌给药对没有被脂质体制剂中的包含物所消弱的哺乳动物肿瘤产生了药理学功效。此外，当作为脂质体制剂给药时，动物可以耐受较高剂量的米托蒽醌，而且它们具有正如半数存活时间所测定的较好效果或者具有比给予常规米托蒽醌的动物更小的肿瘤体积。在小鼠和狗体内显示了较高的化合物血浆浓度且在小鼠体内显示了较长的化合物消除半衰期。在相差无几的剂量下，小鼠体内的峰值血浆浓度在50倍以上，而狗体内峰值血浆浓度在9倍以上。脂质体米托蒽醌于常规米托蒽醌相比，其在给药后的小鼠组织浓度方面在心脏、肺和肾脏中较低，而在肝脏和脾脏中的浓度较高。与单独给予常规米托蒽醌相比，毒性直至给予较高剂量的脂质体米托蒽醌为止也没有出现，不过，毒性分布看起来相似。在脂质体制剂中没有毒性出现，而这种情况在先前单独使用米托蒽醌时却没有观察到。在动物中，较高剂量的脂质体米托蒽醌更有较好的耐受，而且比目前的常用(非脂质体)制剂——常规米托蒽醌更为有效。
已经对本发明进行了描述，现在参照一些实施例进行描述，这些实施例仅用于解释目的而不是用来限定本发明。实施例1本实施例表示一种脂质体米托蒽醌制剂。将米托蒽醌(3μ摩尔)与心磷脂(3μ摩尔)一起溶于氯仿。向该米托蒽醌混合物中加入溶于己烷的磷脂酰胆碱(14μ摩尔)和溶于氯仿的10μ摩尔胆固醇，同时搅拌。在约30℃或30℃以下的真空中蒸发溶剂而得到薄的干脂质膜和药物的干脂质膜。通过加入2.5ml盐水溶液并如通过涡旋剧烈混合所述成分而形成脂质体。然后涡旋烧瓶而得到多层脂质体或进行声波处理而得到单层脂质体。实施例2
本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌制剂的制备方法。在一种合适的溶剂中制备约6μM米托蒽醌、6μM心磷脂、28μM磷脂酰胆碱和20μM胆固醇的溶液，然后蒸发该溶剂。将干燥的脂质/药物膜分散于7％的海藻糖盐水溶液中。将该混合物涡旋并进行声波处理。如果需要，随后对该脂质体进行透析。正如通过HPLC所测定的，米托蒽醌的包囊率为80％或80％以上。实施例3本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌制剂的制备方法。通过在2.5ml体积中使用3μM药物、15μM二棕榈酰基磷脂酰胆碱、1μM心磷脂和9μM胆固醇而使米托蒽醌包载在脂质体中。在真空中蒸发药物和脂质混合物并将其重新悬浮于等体积的盐水溶液中。如实施例1中所述制备脂质体。在该体系中，米托蒽醌的包囊效率高于80％。实施例4本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌制剂的制备方法。在这种脂质体的制备过程中，将2μM米托蒽醌、2μM磷脂酰丝氨酸、11μM磷脂酰胆碱、2μM心磷脂和7μM胆固醇溶解成溶液。如实施例1中所述制备脂质体。预计米托蒽醌的包囊效率在80％以上。实施例5本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌的制剂。可以将米托蒽醌(3μ摩尔)溶于含有3μ摩尔心磷脂的氯仿中并使该混合物形成复合物。为了促进复合物形成，通过蒸发除去氯仿溶剂。可以向该所述干燥薄膜上加入溶于己烷的磷脂酰胆碱(14μ摩尔)和溶于氯仿的10μ摩尔胆固醇。缓慢搅拌该混合物并在低于30℃的真空中蒸发溶剂而形成脂质与药物的薄的干燥膜。然后通过加入2.5ml盐水溶液并通过涡旋剧烈混合所述成分而形成脂质体。然后涡旋烧瓶而得到多层脂质体并任选地在声波处理器中进行声波处理而得到小的单层脂质体。实施例6本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌的制剂。该方法一般包括下列步骤得到米托蒽醌溶液；将该米托蒽醌溶液加入到预制的脂质体中并使该混合物达到平衡，就这样形成了脂质体米托蒽醌。每个Novantrone小瓶含有相当于2mg/ml米托蒽醌游离碱的盐酸米托蒽醌、氯化钠(0.80％w/v)、乙酸钠(0.005％w/v)和乙酸(0.046％w/v)。Novantrone溶液具有的pH为3.0-4.5且每ml含有0.14mEq的钠。
通过向升温至约35-40℃的约10kg叔丁醇中加入约2g的D-α-生育酚酸琥珀酸酯来制备预制的脂质体。将该溶液混合约5分钟，直到生育酚溶解为止。向该溶液中加入约60g的四肉豆蔻酰基心磷脂并将该溶液混合约5分钟。向该溶液中加入约100g的胆固醇并将该溶液混合约5分钟以上，然后加入约300g卵磷脂酰胆碱并再混合5分钟。将含有约35℃-40℃下的2,000g水和约120g的海藻糖二水合物的第二水溶液混入脂质溶液，直到该混合物澄清为止。将该混合物通过0.22微米孔径大小的DuraporeMillipak 200滤器进行无菌过滤，并将约11g装入无菌小瓶且冻干。按照这种方式制备的脂质体是纯白色饼或粉末形式且易于再溶解。冻干脂质体的水分约为12％或12％以下。在使用前将冻干产物储存在4℃下。
为了制备脂质体米托蒽醌，将来自Novantrone小瓶的7.5ml米托蒽醌溶液(15mg)与7.5ml生理盐水(0.9％NaCl)一起加入到冻干脂质的小瓶中。将该小瓶缓慢涡旋、在室温下使之水合30分钟、剧烈涡旋2分钟并在浴型声波处理器中以最大强度进行声波处理10分钟。然后从小瓶中抽出剂量用于应用。可以经45分钟将该产物配入注射器或标准输液器。理想的情况是，将该脂质体米托蒽醌维持在室温下至应用并在再溶解的8小时内使用。实施例7本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌的制剂。制备含有1∶10∶6.8摩尔比的心磷脂∶磷脂酰胆碱∶胆固醇的冻干脂质组合物。进行29次试验，其中改变米托蒽醌与脂质的摩尔比、水合和声波处理时间。用生理盐水过夜透析该制剂并确定保留在各制剂中的米托蒽醌的量。
本研究证实摩尔比为1∶15的米托蒽醌与脂质(2mg的1，1，2，2-四肉豆蔻酰基心磷脂、12mg磷脂酰胆碱和约4mg胆固醇/mg米托蒽醌)水合2小时且进行声波处理10分钟的步骤对1mg/ml米托蒽醌溶液而言产生94±3％保留的脂质体米托蒽醌、对2mg/ml米托蒽醌溶液而言产生95±6％保留的脂质体米托蒽醌且对1.5mg/ml米托蒽醌溶液而言产生97％保留的米托蒽醌。水合时间减少至30分钟看起来不会显著影响1mg/ml米托蒽醌浓度的制剂中保留的米托蒽醌的量。除非另有说明，在下列实施例中使用1∶15的米托蒽醌与脂质的摩尔比、2小时的水合时间和10分钟的声波处理时间来制备1mgl/ml米托蒽醌制剂。实施例8如下实施例证实上述脂质体制剂中的米托蒽醌与相同浓度的非脂质体(常规)米托蒽醌相比具有较低的毒性且脂质体制剂中给予的至少15mg/kg米托蒽醌对小鼠而言是无毒性的。使称重为20-22g的80只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成8组，每组各10只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的天数时对记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。如表1中所示进行注射。表1组药物制剂剂量1 常规米托蒽醌 15mg/kg2 常规米托蒽醌 10mg/kg3 常规米托蒽醌 5mg/kg4 脂质体米托蒽醌15mg/kg5 脂质体米托蒽醌10g/kg6 脂质体米托蒽醌5mg/kg7 空白脂质体15mg/kg8 生理盐水溶液在前5天中，对任何动物而言没有显示出不良的临床副作用。在第6-10天的过程中，所有的第1组中的只动物濒临死亡。1只这类动物在第9天时死亡且在第10天时处死剩余的第1组的动物。有意识地处死来自第4、7和8组的各4只动物并研究血液学和临床化学。另外将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液并研究。在非1组的任何组中没有明显的毒性临床征兆。在研究后处死所有剩余的动物并研究血液学和临床化学且将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液并研究。
在各组中观察到的体重比较对使用常规米托蒽醌(15mg/kg剂量)除1组外的所有组而言在临床上均显示了中度或不明显的改变。第1组动物体重在截至到第10天时逐步下降到约35％。第2组动物最初在第10天时体重显著下降了20％，而在本研究的剩余阶段中逐步恢复。在本研究中剩余组体重均稳定增加。
在本实施例和下面的实施例中，对血液分析胆红素、血尿氮(BUN)、肌酸酐、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血红蛋白、血细胞比容、白细胞计数、红细胞计数、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCII)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板、中性白细胞、带状中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱粒细胞。在第10天时，注意到大部分第1组小鼠和第7组中的一只小鼠的ALT有临床上显著地升高。另外观察到AST类似的升高。2只第1组小鼠还显示出适度的BUN升高，但肌酸酐并不升高，从而提示了可能因脱水或血浓度导致的肾前作用。在这些研究中没有观察到其它药物相关的作用。
病理组织学证明了化合物对用常规米托蒽醌和脂质体米托蒽醌治疗的小鼠脾和骨髓的造血和淋巴样组织的作用。在第67天时的脂质体米托蒽醌治疗的动物中观察到在全部剂量水平下均完全恢复，从而提示脂质体米托蒽醌毒性较低。
总之，在使用任意对照品和高达5mg/kg米托蒽醌的脂质体制剂的本研究中没有观察到发病率或死亡率，而在使用15mg/kg剂量的常规HCl米托蒽醌过程中观察到了100％的发病率。实施例9如下实施例证实，实施例7中所述的脂质体制剂中的米托蒽醌与相同浓度的常规HCl米托蒽醌相比具有较低的毒性且可以对小鼠给予达35mg/kg米托蒽醌而没有明显的毒性。使称重为20-22g的20只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成4组，每组各5只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的的天数时记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。如表2中所示进行注射。表2组药物制剂剂量1 脂质体米托蒽醌35mg/kg2 脂质体米托蒽醌25mg/kg3 常规米托蒽醌 25mg/kg4 空白脂质体35mg/kg在前5天中，对任何动物而言没有显示出不良的临床副作用。在第6-7天的过程中，所有的第3组中的动物濒临死亡。1只这类动物在第6天时死亡且在第7天时处死剩余第3组的动物。在任何其它组中没有明显的毒性临床征兆。在研究后处死所有剩余的动物并如实施例8所述研究血液学和临床化学。将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液并在所有死亡动物中研究。
在各组中观察到的体重比较除对接受25mg/kg剂量常规米托蒽醌的第3组外的所有组而言在临床上均显示了中度或不明显的改变。第3组动物体重截至到第7天时逐步下降到约30％。第1组动物最初在第10天时体重显著下降了20％，而在本研究的剩余阶段中逐步恢复。在本研究中剩余组体重均稳定增加。
总之，在使用载体对照品和米托蒽醌的脂质体制剂的本研究中没有观察到发病率或死亡率，而在25mg/kg常规米托蒽醌中观察到了100％的发病率。实施例10如下实施例证实，实施例7中所述的脂质体制剂中的米托蒽醌与相同浓度的常规HCl米托蒽醌相比具有较低的毒性且可以对小鼠给予至少35mg/kg米托蒽醌而没有毒性。使称重为20-22g的70只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成7组，每组各10只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的的天数时记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。如表3中所示进行注射。表3组药物制剂剂量1 常规米托蒽醌10mg/kg2 常规米托蒽醌25mg/kg3 脂质体米托蒽醌 10mg/kg4 脂质体米托蒽醌 25mg/kg5 脂质体米托蒽醌 35mg/kg6 空白脂质体 35mg/kg7 生理盐水溶液在前2天中，对任何动物而言没有显示出不良的临床副作用。在第3天的过程中，所有的第2组中的2只动物濒临死亡且处死3只动物。另外在第3天时有意识地处死来自第1、3、4、5、6和7组的各3只动物并研究血液学和临床化学。在第7天时来自第2组的另外3只动物濒临死亡且也处死来自第1、3、4、5、6和7组的另3只动物。在第10天时第2组余下的动物已经死亡。到第60天时没有观察到其它临床毒性征兆。在除第2组外的任意组中没有明显的临床毒性征兆。在本研究后，处死所有剩余的动物并如实施例8中所述进行血液学和临床化学检测。将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液并在所有死亡动物中研究。
在各组中观察到的体重比较除对接受25mg/kg剂量常规米托蒽醌的第2组外的所有组而言在临床上均显示了中度或不明显的改变。第2组动物体重截至到第7天时逐步下降约27％。第1组和第5组动物最初表现出体重显著下降(分别为13％和8％)，而在本研究的剩余阶段逐步恢复。在本研究中剩余组体重均稳定增加。
第3天时，在临床化学数据中没有注意到一致的化合物作用，不过给予25mg/kg常规米托蒽醌(第2组)的1只小鼠和给予35mg/kg脂质体米托蒽醌(第5组)的1只小鼠在ALT活性方面具有适度的增加。在大部分给予米托蒽醌而不是在给予空白脂质体的小鼠中没有注意到对白细胞的细胞毒性作用。
在第7天时，临床化学数据不确定，不过，AST和ALT活性更为广泛地改变且趋向于较高水平，这一结果与在某些动物中出现的某些肝损伤一致。在第67天当用空白脂质体治疗几只小鼠(第6组)时，小鼠显示出相似的不一致的增加。
总之，在使用任意载体对照品和米托蒽醌的脂质体制剂的本研究中没有观察到发病率或死亡率，而在接受25mg/kg常规米托蒽醌的第2组动物中观察到了100％的发病率。实施例11如下实施例证实，给予如实施例7中制备的多剂量米托蒽醌，在使用脂质体制剂时的耐受性优于相同浓度的常规HCl米托蒽醌，而且在连续5天重复给予至少10mg/kg米托蒽醌对小鼠没有毒性。使称重为20-22g的40只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成8组，每组各5只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照，且此后每日一次持续5天的期限。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的的天数时记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。注射剂量如表4中所示。表4组药物制剂剂量1 常规米托蒽醌2.5mg/kg2 常规米托蒽醌5.0mg/kg3 常规米托蒽醌7.5mg/kg4 脂质体米托蒽醌 2.5mg/kg5 脂质体米托蒽醌 5.0mg/kg6 脂质体米托蒽醌 7.5mg/kg7 空白脂质体 7.5mg/kg8 生理盐水溶液在前5天的任意小鼠中没有观察到不良的临床作用。在第6天时第1、2、3和6组的中的动物表现出毛皮起皱和驼背特性。第2和第3组中的2只动物濒临死亡。处死来自剩余各组中的2只动物用于分析。在第7天时来自第2组中的3只动物和来自第3组中的2只动物均濒临死亡，发现来自第3组中的另外1只动物已经死亡并处死来自第6、7和8组中的1只动物用于血液学和临床化学分析。截至到第60天时在任意剩余的动物中没有观察到临床毒性适应征，此时处死全部动物。采集血样如实施例8中所述进行血液学和临床化学检测并将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液。
将各组中的动物质量比较解释为中度、轻度或不明显，但除外第2组(5mg/kg常规米托蒽醌)和第5组(7.5mg/kg常规米托蒽醌)。这些动物在第7天时表现出体重逐步下降了约25％。第1组(2.5mg/kg常规米托蒽醌)和第6组(7.5mg/kg脂质体米托蒽醌)动物最初的质量下降了约28％，而到本研究结束时逐步恢复。其它治疗组在本研究过程中没有显示质量上的改变。
第7天时，从第6、7和8组中处死的小鼠表现出适度的AST升高。另外来自第8组中的小鼠的碱性磷酸酶活性也增加且来自第6和第7中的小鼠具有减少的的肌酸酐和碱性磷酸酶。来自第2、3和6组中濒临死亡的小鼠表现出明显的临床显著的、与化合物相关的、伴随中性白细胞和淋巴细胞计数下降的白细胞减少症和血小板计数适度下降，在第64天时分析来自第1、4、6和7组的小鼠且它们表现出适度的碱性磷酸酶和AST升高，而其中其它值正常。
组织病理学检查证实在全部治疗组中脾脏和骨髓的造血和淋巴样细胞衰竭且在肠中出现绒毛状和/或隐窝萎缩。看起来脂质体米托蒽醌对脾脏的毒性低于常规的米托蒽醌且对肠上皮的细胞毒性远低于常规的米托蒽醌。在给予了5mg/kg或7.5mg/kg的常规米托蒽醌的几只小鼠的肝脏中观察到了一定程度的肝细胞空泡变性。与之相比，在给予了5mg/kg脂质体米托蒽醌的1只小鼠体内观察到了最小的肝细胞空泡变性程度且在给予了7.5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠中没有1只可观察到最小的肝细胞空泡变性程度。常规米托蒽醌和脂质体米托蒽醌给药均导致足以影响许多小鼠中骨纵向生长的常规细胞和破骨细胞消耗。到第64天时在给予了常规米托蒽醌的全部存活小鼠中和在给予了2.5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠体内均观察到所有作用显著恢复。在第64天时使用7.5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠在造血和淋巴样组织内仍然具有最低程度的组织学作用。
脂质体米托蒽醌对脾脏的细胞毒性看起来略低于常规米托蒽醌且对肠上皮的细胞毒性远低于常规米托蒽醌，不过，组织分布发现显示米托蒽醌的组织浓度显著升高。在给予5mg/kg或7.5mg/kg常规米托蒽醌的几只小鼠肝脏中观察到了一定程度的肝细胞空泡变性。仅在1只给予了5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠体内观察到了最低程度的肝细胞空泡变性且使用7.5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠没有1只显示肝细胞空泡变性。
总之，在接受脂质体米托蒽醌的任意组或接受2.5mg/kg脂质体米托蒽醌的组中均没有观察到发病率或死亡率。相反，第2组(5mg/kg常规米托蒽醌)和第3组(7.5mg/kg常规米托蒽醌)中的所有动物均死亡。实施例12如下实施例证实，如实施例7中所述的脂质体制剂中的米托蒽醌具有低于相同浓度的常规HCl米托蒽醌的毒性且脂质体制剂中给予的至少35mg/kg米托蒽醌对小鼠没有毒性。使称重为20-22g的30只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成6组，每组各5只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照，而且此后每日一次地给药，持续5天的期限。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的的天数时记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。注射剂量如表5中所示。表5组药物制剂剂量1 常规米托蒽醌2.5mg/kg2 常规米托蒽醌5.0mg/kg3 脂质体米托蒽醌 5mg/kg4 脂质体米托蒽醌 7.5mg/kg5 脂质体米托蒽醌 10mg/kg6 生理盐水在前5天的任意小鼠中没有观察到不良的临床作用。第1、2和5组的中的动物表现出毛皮起皱和驼背特性。在第8天时，来自第2和第5组中的3只动物濒临死亡且来自第5组的1只动物已经死亡。在第8天时处死来自第6组中的3只动物用于血液学和临床化学。在第10天时来自第2组中的1只动物濒临死亡且1只动物已经死亡。在第10天时来自第5组中的1只动物濒临死亡。到第12天时来自第1组中的3只动物已经死亡。第18天时第4组中的1只动物已经死亡。截至到第60天时在任意剩余的动物中没有观察到临床毒性适应征，此时处死全部动物。采集血样如实施例8中所述进行血液学和临床化学检测并将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液。
各组中的动物体重的变化为中度、轻度或不明显，但除外第2组(5mg/kg常规米托蒽醌)和第5组(10mg/kg脂质体米托蒽醌)。这些动物到第9天时表现出体重分别逐步下降了约35％和25％。到第13天时，第1组(2.5mg/kg常规米托蒽醌)、第3组(5mg/kg脂质体米托蒽醌)和第4组(7.5mg/kg脂质体米托蒽醌)动物最初的体重分别下降了约30％、7％和30％。其体重在本研究的过程中逐步恢复。其它治疗组在本已经过程中没有表现出质量上的改变在载体对照组或接受达5mg/kg(在连续5天时1次)的脂质体米托蒽醌的组中没有观察到发病率或死亡率。在用2.5mg/kg常规米托蒽醌治疗的动物中观察到了60％的发病率。在用7.5mg/kg脂质体米托蒽醌治疗的动物中观察到了20％的发病率。用10mg/kg脂质体米托蒽醌或5mg/kg常规米托蒽醌治疗使测试小鼠的致死率达100％。
来自第2组(5mg/kg常规米托蒽醌)和第5组(10mg/kg脂质体米托蒽醌)的濒临死亡的动物表现出显著的AST和ALT升高。此外，第2组中4只小鼠中的3只小鼠和第5组中5只小鼠中的1只小鼠所测得的胆红素浓度均高于对照组小鼠。濒临死亡的动物表现出带有中性白细胞和淋巴细胞降低的显著白细胞减少症。还观察到了血小板计数的适度可变的下降。也观察到了红细胞计数出现最低程度的增加。其它参数没有受到显著影响。在第70天时处死的小鼠表现出正常的临床化学指标，但具有低白细胞计数。在这些小鼠体内淋巴细胞和中性白细胞较低。其它参数正常。
在实施例8的单剂量实验中，15mg/kg剂量的常规米托蒽醌而非脂质体米托蒽醌诱发象征急性肝损伤的ALT显著升高，而实施例10中的较高剂量不会产生这种结果。由于考虑到多剂量数据，所以显然常规米托蒽醌具有导致显著肝损伤的可能性。来自最终处死动物的数据提示发生显著的恢复，而几乎没有毒性或细胞毒性的迹象。
来自较高剂量组的小鼠显示出对白细胞和血小板的细胞毒性作用，其中中性白细胞和淋巴细胞明显降低且血小板适度下降。在较低剂量组中，这种作用明显较少。数据证明5mg/kg/天常规米托蒽醌和10mg/kg/天脂质体米托蒽醌诱发几乎相同的急性肝损伤，正如到第8天ALT、AST和胆红素升高所证实的。
总之，来自这些研究的临床病理学数据显示，以10mg/kg/天给予的脂质体米托蒽醌并不比以5mg/kg/天给予常规米托蒽醌更具有毒性，而且显然从毒性和细胞毒性作用中显著恢复。该数据证明可以以高于考虑常规米托蒽醌安全性2倍的用量安全地给予脂质体米托蒽醌。实施例13如下实施例证实，实施例7中所述的脂质体米托蒽醌制剂在哺乳动物血液中达到了高于常规制剂中给予的米托蒽醌的血浆浓度，而且具有比常规制剂中给予的米托蒽醌更长的半衰期和低于常规制剂中给予的米托蒽醌清除率。在静脉内给予5mg/kg单剂量的常规和脂质体米托蒽醌后在雄性CD2F1小鼠中进行药代动力学评价。在给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时和48小时时处死各组的4只小鼠并采集其血液和器官且用于分析米托蒽醌含量。
通过反相HPLC分析血浆和组织样品中的米托蒽醌。将血浆样品(0.25m1)与作为内标的0.5ml的0.01mg/ml己磺酸、0.5mg/ml抗坏血酸和0.25μg阿美蒽醌的溶液混合。在涡旋30秒后，加入0.5ml的0.1M硼酸盐缓冲液(pH9.5)和150μl的1M氢氧化钠并将该溶液再涡旋30秒。在水平振荡器上用10ml二氯甲烷提取样品1小时并以3,000rpm离心15分钟。分离有机层(9ml)并在氮气中蒸发。用10μl流动相将样品再溶解，此后进行HLPC分析。在1ml含有20％抗坏血酸、pH3.0的0.1M柠檬酸盐缓冲液中匀化组织样品并如上所述进行提取。通过反相层析法(Waters μBondapakc-18)分离米托蒽醌，其中使用的流动相为33％乙腈和pH2.7的67％0.16M富马酸铵缓冲液、以1ml/分钟的流速转运。在600nm下检测米托蒽醌。灵敏度极限为10ng/ml。
通过标准方法评价血浆药动学参数。根据对血浆浓度-时间曲线的线性回归分析计算消除率常数(K)。使用线性梯形法与末端期至无限(C最终/K)的外推法计算曲线下的面积(AUC0→∞)，其中C最终是最后测定的浓度。所计算的其它参数是作为剂量/AUC的总体清除率(Cl)；分布体积(V面积)＝Cl/K；消除半衰期(t1/2)＝0.693/K面积。
总之，在静脉内给药后，脂质体米托蒽醌与常规米托蒽醌相比产生了显著较高的峰值(50倍)。血浆浓度的下降伴随一级动力学参数出现，其中常规和脂质体制剂的消除半衰期分别为6.6分钟和1小时。AUC值和末端消除半衰期为Cmax、AUC和t1/2值，给予常规米托蒽醌后分别为0.41μg/ml、0.14μg·小时/ml和0.11小时，而在给予脂质体米托蒽醌后对这些相同参数而言这些数值分别约为21μg/ml、28μg·小时/ml和1小时。根据化合物的清除率和分布体积可以解释这些数值的增加。经计算的总米托蒽醌清除率结果是脂质体米托蒽醌米托蒽醌(3ml/分钟/kg)基本上低于常规常规米托蒽醌(600ml/分钟/kg)。经计算的分布体积为脂质体米托蒽醌(0.31/kg)，其与常规米托蒽醌(5.51/kg)相比也明显降低。
对在肺和肾脏中分别使用约20和40μg/g常规米托蒽醌组织浓度的肺和肾脏分别观察到了相似模式的从这些组织中的清除率，而且在给予脂质体米托蒽醌后在这些相同组织中的脂质体米托蒽醌组织浓度为13和16μg/g。在肝脏中，给予常规米托蒽醌后米托蒽醌浓度从约19μg/g逐步下降至2μg/g，而在给予脂质体米托蒽醌后4小时时肝脏浓度从约25μg/g增加至37μg/g，此后在48小时时逐步下降至30μg/g。在给药后5分钟时在心脏中检测到的米托蒽醌峰值浓度的为脂质体制剂(5.6μg/g组织)低于常规米托蒽醌(11μg/g组织)。在给药后达48小时时这种差异至少保持2倍。
在所有检查的时间点处，常规米托蒽醌治疗的小鼠的心脏、肺和肾脏中的常规米托蒽醌浓度均高于脂质体米托蒽醌治疗的小鼠。在所有检查的时间点处，脂质体米托蒽醌治疗的小鼠的脾脏和肝脏中的浓度均高于常规米托蒽醌治疗的小鼠，从而证明脂质体制剂使化合物的分布发生移动。给予常规的米托蒽醌在给予该化合物后5分钟和15分钟时导致心脏组织浓度约为10μg/g，其中该浓度在24小时和48小时时逐步下降至5-6μg/g。在给予脂质体米托蒽醌后，5分钟时的心脏米托蒽醌浓度约为6μg/g且在24-48小时时该浓度逐步下降至约2μg/g。这些数据提示脂质体米托蒽醌的心脏毒性下降的可能性。实施例14本实施例证实，如实施例7中制备的脂质体米托蒽醌对人白血病细胞的功效并证明该脂质体制剂与常规的米托蒽醌制剂相比功效提高。通过连续三次接种(腹膜内)使鼠白血病细胞L1210白血病细胞在CD2F1小鼠的腹膜中生长。在下列实验后使用最后接种的8天内产生的腹水。测定脂质体和常规米托蒽醌对L1210腹水型白血病的抑制细胞活性。每周测定3次动物组的体重并以人道方式处死临床上濒临死亡的动物。每天观察存活的小鼠，持续60天。使用单剂量或多剂量的所述药物静脉内治疗后的组存活时间，表明了脂质体和常规米托蒽醌的相对抗肿瘤效力。
将雌性CD2F1小鼠分成8组，每组各10只动物，且给它们静脉内接种10,000个L1210细胞。此后进行24小时给药。以5mg/kg和10mg/kg的剂量给予常规米托蒽醌。以作为单剂量注射的5、10、20或35mg/kg剂量静脉内给予脂质体米托蒽醌并对各组测定半数存活时间。在本实验的第60天时处死存活动物。另外给予相当于35mg/kg剂量的空白脂质体和生理盐水作为对照。
未治疗动物的半数存活时间为7天。用5mg/kg常规米托蒽醌和脂质体米托蒽醌治疗的动物的半数存活时间分别为12天和13天。给予10mg/kg常规米托蒽醌的动物的半数存活时间为20天，其中2/10动物在第60天时仍然存活。使用10mg/kg脂质体米托蒽醌治疗的动物的半数存活时间为27天，其中4/10小鼠存活至第60天。以20mg/kg脂质体米托蒽醌治疗的所有动物均存活至第60天。在测试的35mg/kg最高脂质体米托蒽醌剂量下，9/10动物存活至第60天，其中在第18天时发现1只动物死亡，可能是由于化合物的毒性导致的。
这些单剂量研究提示可以以高于常规米托蒽醌的剂量给予脂质体米托蒽醌而获得改善的临床效果。在鼠白血病模型中，脂质体米托蒽醌以相差无几的剂量比常规米托蒽醌改善了动物的半数存活时间且在相同或较高剂量下与化合物相关的死亡率下降。这些结果提示能够在脂质体米托蒽醌制剂中给予较高剂量的米托蒽醌而不会增加毒性的危害。小鼠耐受的脂质体米托蒽醌剂量达20mg/kg(60mg/m2)且直到35mg/kg(105mg/m2)的脂质体米托蒽醌剂量下也没有表现出显著的毒性。实施例15本实施例证实，如实施例7中制备的脂质体米托蒽醌在以多剂量给药时的功效。将40只雌性CD2F1小鼠分成4组，每组10只动物且如实施例14中所述给它们接种L1210细胞。以2.5mg/kg常规米托蒽醌或以2.5mg/kg或5mg/kg脂质体米托蒽醌每隔24小时治疗1次小鼠，从接种后24小时开始持续4天。
用2.5mg/kg常规米托蒽醌和脂质体米托蒽醌治疗的小鼠的半数存活时间分别为13天和14天。这一存活时间与实施例14的单剂量研究中以相同浓度描述的结果相似。在这些治疗组中的该剂量水平下没有动物存活至第60天。以5mg/kg脂质体米托蒽醌治疗的小鼠的半数存活时间为37天，其中4/10动物存活至第60天。这些数据提示在以多剂量给药时，脂质体米托蒽醌具有超过常规米托蒽醌的临床有益效果。实施例16本实施例证实，在带有异种移植的人前列腺癌细胞的小鼠中，给予如实施例7的单剂量脂质体米托蒽醌后，存活增加；且与常规米托蒽醌治疗的动物相比，给予多剂量脂质体米托蒽醌后平均肿瘤体积减小。给雄性Balb/c、nu/nu、6-8周龄小鼠接种5×106人激素顽固性前列腺肿瘤细胞(PC-3)。每周监测2次肿瘤生长情况，直到肿瘤体积在60-100mm2的范围为止。然后将动物分成数组并通过在尾静脉中进行静脉内注射0.625、1.25、2.5和5mg/kg剂量的常规米托蒽醌来进行治疗，隔天一次，持续4天。配制成脂质体中的米托蒽醌剂量为2.5、5、7.5和10mg/kg。对照组动物接受生理盐水或空白脂质体。计算平均存活时间并在第34天时处死所有存活的动物。
以0.625和1.25mg/kg常规米托蒽醌治疗的动物到第34天时表现出100％存活；然而，用2.5和5mg/kg治疗的动物没有1只存活。使用脂质体米托蒽醌的存活率在2.5mg/kg剂量下为100％、在5mg/kg剂量下为91％、在7.5mg/ml剂量下为43％且在10mg/kg剂量下为0％。
遵循相同的给药方案，使用0.625和1.25mg/kg剂量的常规米托蒽醌和2.5和5mg/kg剂量的脂质体米托蒽醌的重复本治疗实验。在这些实验中，每周通过对三个长轴进行1次或2次测定来测量肿瘤的体积。
使用两种剂量的脂质体米托蒽醌进行治疗，导致肿瘤体积比对照组和用常规米托蒽醌治疗组的肿瘤体积明显减小。在使用PC-3异种移植物时注意到了肿瘤生长明显延缓。在较高剂量的常规米托蒽醌下，严重的毒性限制了其临床应用。看起来脂质体米托蒽醌是比常规米托蒽醌更为安全和更为有效的抗肿瘤药。实施例17本实施例证实脂质体米托蒽醌制剂在对狗给药后在血浆中具有高于常规米托蒽醌的浓度、清除较常规米托蒽醌缓慢。通过反相HPLC、使用阿美蒽醌作为内标分析来自静脉内给予0.13或0.26mg/kg常规米托蒽醌或静脉内给予0.26、0.58或0.87mg/kg脂质体米托蒽醌的狗(3条/性别/组)的血浆样品中的米托蒽醌水平。分析的时间点为0、5和30分钟和单剂量给药后1、2、4、8和24小时。
在5分钟的时间点处不能对低剂量测出接受常规米托蒽醌的动物体内的血浆浓度，而且在30分钟的时间点处不能对高剂量测出接受常规米托蒽醌的动物体内的血浆浓度。可以在1小时的时间点处测出接受0.258mg/kg的1条雄性动物。相反，大部分接受脂质体米托蒽醌的动物对低剂量而言具有的米托蒽醌血浆浓度达2小时而对中等剂量和高剂量而言具有的米托蒽醌血浆浓度达4小时。
当给予常规米托蒽醌时，米托蒽醌的浓度远低于给予作为Cmax和AUC值(表6)中所反映的脂质体米托蒽醌。另外，就清除率而言，常规米托蒽醌高于脂质体米托蒽醌。Cmax和AUC值均随脂质体米托蒽醌的剂量增加而增加，而清除率、分布体积和消除半衰期在该剂量范围内保持恒定。在性别之间的这些参数上没有差异。将结果概括在下面的表6中，该表列出了各参数的平均值。表中所示的其它参数包括米托蒽醌半衰期(t1/2)、分布体积(V)和清除率(Cl)。表6米托蒽醌 剂量(mg/kg)Cmax(μg/ml)AUC0→∞(μgt1/2(小时)Cl(ml/分钟V(L/kg)制剂·小时/ml)/kg)常规-Ma0.13 0.027 NCbNC NC NC常规-F0.13 0.016 NC NC NC NC常规-M0.26 0.084 0.05c0.3689 2.8常规-F0.26 0.06 NC NC NC NC脂质体-M 0.26 0.43 0.32NC 17 1.2脂质体-F 0.26 0.77 0.420.2515 0.9脂质体-M 0.58 1.5 0.840.3 13 0.6脂质体-F 0.58 1.9 1.7 NC 6.8 0.6脂质体-M 0.87 2.41 1.84NC 90.8脂质体-F 0.87 2.33 1.77NC 11 1aM＝雄性；F＝雌性bNC＝未计算c仅检测常规米托蒽醌至30分钟取样时间为止本实施例表明给予脂质体米托蒽醌的狗产生比相同剂量的常规米托蒽醌提高9倍峰值的米托蒽醌血浆浓度。该脂质体制剂还表现出增加的AUC值和降低的清除率。Cmax和AUC值以线性方式随剂量的增加而增加。Cmax值在0.26、0.58和0.87mg/kg(5、12和17mg/m2)下约为0.5、1.7和2.4μg/ml。实施例18本实施例证实当将药物配制成脂质体时，狗可以耐受的米托蒽醌剂量高于常规的米托蒽醌制剂。在第1、23、43和65天以0(盐水)、0.129或0.258mg/kg(2.6或5mg/m2)的静脉内剂量对小猎犬(3条/性别/组)给予常规米托蒽醌。在这些相同的天数时，小猎犬(3/性别/组)接受0(空白脂质体)、0.258、0.580或0.869mg/kg(5、12或17mg/m2)的脂质体米托蒽醌。基于临床观察结果、体重、食物消耗、眼科学和ECG检查、临床病理学、血药浓度、器官重量和宏观和显微镜尸检评价与化合物相关的作用。
在给予一个剂量的脂质体米托蒽醌后的第12天，因器官损害、左肢肿胀、活动减退、苍白、脱水和腹泻处死0.869mg/kg脂质体米托蒽醌组中的1条雄性狗。
1只空白脂质体米托蒽醌治疗的雌性狗出现脱毛，而第2条狗在本研究的前29天中出现过度的唾液分泌。来自0.869脂质体米托蒽醌组的1条雌性狗的左侧腿在第31、32和36天时出现跛行，此时它的左后足表现出炎症和肿胀且该足上存在疮或溃疡。
在本研究过程中没有1条动物体重受到影响，但体重降低的0.258常规米托蒽醌组的雄性动物除外。在任意组中食物消耗没有发生改变。
ECG参数在任何检查时间处都没有发生改变。
给予0.129和0.258常规米托蒽醌的动物在各剂量周期后4天或10天出现白细胞减少和血小板减少且严重程度与剂量相关。在3周给药周期的后半程中白细胞计数趋向于重新回到正常值。不同白细胞数据揭示了在各剂量给药后第10天时最严重的、与剂量相关的中性白细胞计数的下降。随着各给药周期还出现了与剂量相关的淋巴细胞减少且看起来随各连续剂量而恶化。贫血在使用常规米托蒽醌的动物中没有发生，但观察到了如网织红细胞计数下降所证实的细胞胞类毒性的迹象。网织红细胞计数在第10、32和46天时迅速重新回到正常值或稍高于正常值。
给予脂质体米托蒽醌的动物在血液学参数上具有类似于在常规米托蒽醌治疗的动物中观察到的改变，但在本研究过程中(0.869mg/kg脂质体米托蒽醌)处死的具有白细胞减少、血小板减少和贫血的动物除外。在雌性狗中观察到了轻度贫血且在雄性和雌性狗中均观察到了网织红细胞计数下降。网织红细胞计数在雌性狗中的重新恢复没有雄性狗中快。
对任意剂量组中的动物没有观察到凝固或临床化学参数上的改变。
在尸检时，脂质体米托蒽醌0.869mg/kg组中的1条雄性动物的胸腔中充满了液体且存在心脏增厚和胃肠道损害。这些发现看起来与化合物相关。在该剂量下1条动物的各种淋巴结变色。脂质体米托蒽醌0.580和0.869组中总计3条动物在注射部位出现蓝色。没有其它发现归因于化合物的给药。
总之，给予单独的脂质体的6条狗中的1条和给予脂质体米托蒽醌的18条动物中的1条，其肢体疼痛并伴有跛行，这一结果可能是因给予脂质体本身所导致的。本研究证实了当将药物配制成脂质体时，狗可以耐受较高剂量的米托蒽醌。实施例19本实施例表示将脂质体米托蒽醌给予癌症患者的方法和给予安全和有效量的脂质体米托蒽醌制剂的方法。选择组织学记录有实体瘤的患者进行治疗。在本研究中，可以测定静脉内给药后米托蒽醌的最大耐受剂量(MTD)、剂量限制毒性和血药动力学参数。还观察到了脂质体米托蒽醌的抗肿瘤作用。通过每隔3周静脉内给予一次脂质体米托蒽醌来治疗患者，直到观察到疾病发展或者出现需要终止早期治疗的毒性为止。还确定了治疗的安全性和耐受性。在治疗的第一阶段中评价药代动力学参数。在每个第二阶段评价心功能状态。通过适宜方式在每个第二阶段后评价疾病状态。评价6种剂量水平。
在本研究中使用商品Novantrone。如实施例7中所述制备米托蒽醌的脂质体制剂。以下表7中所示的剂量经45分钟静脉给予脂质体米托蒽醌。表7脂质体米托蒽醌剂量水平(mg/m2)1 92 123 154 205 256 30
在各剂量水平下研究3位患者。每隔3周在疾病没有发展或没有不可接受的毒性出现的情况下重复给药。
按照NCI/CTC标准对不良事件进行分级。将剂量限制毒性(DLT)定义为第一个疗程(即21天)内不可接受的毒性发生、定义为包括超敏反应在内的非恶心/呕吐或脱发的3级或4级非血液毒性、或非中性白细胞减少的4级血液学毒性、或持续3天以上的4级中性白细胞减少、或定义为体温超过38.5℃的3级或4级中性白细胞减少的发热性白细胞减少、或4级呕吐或4级转氨酶(AST或ALT)升高、或2级(或2级以上)MUGA扫描后LVEF下降。
将最大耐受剂量(MTD)定义为6位治疗的患者无1人以上在该剂量水平上引起DLT的最高剂量水平。如果以指定剂量水平治疗的最初3位患者中无1人出现剂量限制毒性(DLT)，那么继续扩大剂量。如果最初治疗的3位患者之一出现DLT，那么使另3位患者进入相同的剂量水平。如果另3位患者中无1人出现DLT，那么继续扩大剂量。如果以一种剂量水平治疗的另3位患者中1位或多位发生DLT，那么终止扩大剂量。如果以一种剂量水平治疗的最初3位患者中2位或3位发生DLT，那么终止扩大剂量。以可能的MTD治疗6位患者以确保在剂量与MTD平齐之前满足标准。
在给予先前的脂质体米托蒽醌剂量后21天或21天以上，且当绝对中性白细胞计数(ANC)为1,500m/m3或1,500m/m3以上时，且当血小板计数为100,000/mm3时，且从任意其它与治疗相关的毒性(除脱发外)的恢复达到基线等级或低于1级时，可以给予随后的疗程，无论哪种情况限制均较少。
将治疗延缓1周以使毒性消退。如果在延缓1周后毒性仍不消退，那么将治疗再延缓1周，其剂量减少与延缓1周后出现的剂量减少相同。如果必须将治疗保持2周以上，那么将该患者从本研究中排除。
权利要求
1.哺乳动物疾病的治疗方法，该方法包括对哺乳动物给予一种药物组合物，其包括治疗有效量的、含有心磷脂的脂质体制剂中的米托蒽醌和药物上可接受的赋形剂。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体制剂进一步包括磷脂。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体制剂进一步包括生育酚。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体制剂进一步包括磷脂酰胆碱、胆固醇和生育酚。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的心磷脂选自天然心磷脂和合成心磷脂。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体带负电荷。
8.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体带正电荷。
9.权利要求1所述的方法，其中至少90％的米托蒽醌与脂质体结合。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的米托蒽醌浓度在约0.5-约2mg/ml的范围。
11.治疗性米托蒽醌组合物，其包括含有米托蒽醌和脂质成分的脂质体，其中所述的脂质成分包含心磷脂。
12.权利要求11所述的组合物，其中米托蒽醌与脂质成分的摩尔比在约1∶10-约1∶20的范围。
13.权利要求11所述的组合物，其中包载米托蒽醌的脂质体包含具有约5μm或5μm以下大小的囊泡。
14.权利要求11所述的组合物，其中所述的包载米托蒽醌的脂质体包含具有约1μm或1μm以下大小的囊泡。
15.权利要求11所述的组合物，其中所述的包载米托蒽醌的脂质体包含具有约0.5μm或0.5μm以下大小的囊泡。
16.权利要求11所述的组合物，其中所述的包载米托蒽醌的脂质体包含具有约0.1μm或0.1μm以下大小的囊泡。
17.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质成分进一步包括选自磷脂酰胆碱、胆固醇、α-生育酚、二棕榈酰基磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的化合物。
18.权利要求11所述的组合物，其中所述的心磷脂选自天然心磷脂和合成心磷脂。
19.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质体带有负电荷。
20.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质体带有正电荷。
21.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质体是中性的。
22.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质体是多层脂质体和单层脂质体的混合物。
23.治疗性米托蒽醌组合物，其包括脂质成分和米托蒽醌，其中米托蒽醌与脂质成分的摩尔比在约1∶10-约1∶20的范围。
24.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分包括磷脂。
25.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分包括磷脂酰胆碱。
26.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分包括卵磷脂酰胆碱。
27.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分包括胆固醇。
28.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分进一步包括磷脂、胆固醇、心磷脂和生育酚。
29.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的米托蒽醌浓度在约0.5-约2mg/ml的范围。
30.米托蒽醌药物剂型的制备方法，该方法包括下列步骤获得含有一定量预制脂质体的容器，所述的脂质体包括结合米托蒽醌的成分；获得含有一定量药物上可接受赋形剂中的米托蒽醌的容器；将一部分药物上可接受赋形剂中的米托蒽醌与所述脂质体混合；和使米托蒽醌结合到脂质体而得到米托蒽醌的药物剂型。
31.权利要求30所述的方法，其中所述预制的脂质体是冻干的。
全文摘要
本发明涉及米托蒽醌的脂质体制剂及其制备方法和应用。本发明的组合物包括米托蒽醌的脂质体制剂，其中所述的脂质体含有任意不同的中性或带电荷的脂质体形成物质以及认为结合米托蒽醌的化合物，诸如心磷脂。可以将该脂质体组合物有利地与不同于米托蒽醌的第二种治疗剂一起联用，所述的第二种治疗剂包括抗肿瘤药、抗真菌药、抗生素以及其它活性剂。本发明提供了对诸如人这样的哺乳动物给予治疗有效量的所述制剂的方法。
文档编号A61K45/06GK1469735SQ01817424
公开日2004年1月21日 申请日期2001年10月16日 优先权日2000年10月16日
发明者伊姆兰·艾哈迈德, 阿奎鲁尔·拉赫曼, 伊姆兰 艾哈迈德, 尔 拉赫曼 申请人:新药物公司
技术领域：
本发明涉及米托蒽醌的脂质体制剂及其制备方法和应用。
经批准Novantrone与皮质类固醇联用作为治疗患有晚期抗激素性前列腺癌相关疼痛的患者的早期化学疗法。Novantrone的推荐剂量为12-14mg/m2，作为短期静脉输注给药，每21天一次。
另外还批准Novantrone与其它经批准的药物联合用于急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)的早期疗法，所述的急性非淋巴细胞性白血病包括髓细胞性白血病、前髓细胞性白血病、单核细胞性白血病和红细胞系统急性白血病。推荐剂量为每日12mg/m2的Novantrone 1-3天时，其以静脉输注给予，并伴随1-7天时的作为连续24小时输注给药7天的100mg/m2的阿糖胞苷给予。
还批准Novantrone用于缓解神经残疾和/或缓解患有继发性(慢性)进行性、进行性复发性、或恶化复发型多发性硬化症患者中的临床复发频率。
认为盐酸米托蒽醌是对培养中的增殖和非增殖人体细胞都具有细胞毒性的DNA-反应剂。
米托蒽醌的毒性限制了可以给予患者的药物的剂量。此外，与米托蒽醌接触的细胞中的广谱抗药性的发生限制了其功效。因此，需要这样的米托蒽醌制剂，其足以溶解米托蒽醌而例如通过将治疗细胞中的毒性和广谱抗药性的发生降至最低限度来将其功效发挥至最高。
本发明提供了这类组合物和方法。本发明的这些和其它优点以及本发明的其它特征显然可以从本文提供的本发明说明书中得出。
在一种制备所述剂型的特别优选的方法中，将一定量药物上可接受赋形剂中的米托蒽醌(诸如Novantrone)加入到含有一定量预冻干脂质体的容器中，并使米托蒽醌与脂质体结合而得到所述药物剂型。所述的脂质体包含有米托蒽醌结合成分。发明详述本发明提供了用于哺乳动物宿主的组合物及其制备方法和对哺乳动物宿主的转运方法。该组合物和方法的特征在于避免了米托蒽醌的溶解问题、高米托蒽醌和脂质体稳定性、能够作为以高浓度快速浓注或短期输注方式给予米托蒽醌、米托蒽醌毒性降低、特别是米托蒽醌在心肌中的累积减少、米托蒽醌的治疗功效提高和调节癌细胞中的广谱抗药性。心磷脂在该制剂中的应用将米托蒽醌的包载改善到了令人惊奇的程度。
本发明的组合物是含有心磷脂的米托蒽醌的脂质体制剂。一般来说，可以通过公知技术制备脂质体制剂。例如，在一种优选的技术中，将米托蒽醌与心磷脂一起溶于疏水性溶剂并使心磷脂与米托蒽醌形成复合物。可以蒸发含心磷脂/米托蒽醌的混合物而形成薄膜以便有利于复合物形成。此后，可以将含有任意所需其它亲脂组分的溶液加入到该薄膜上并使米托蒽醌/心磷脂复合物溶于或充分分散于该溶液中。然后蒸发该溶液而形成第二脂质膜。随后可以将诸如含水溶剂这样的极性溶剂加入到所述脂质膜上并将所得混合物剧烈匀化成本发明的脂质体。
或者，可以将所有的亲脂组分溶于适宜溶剂，然后可以对该体系进行蒸发而形成亲脂膜。随后将诸如含水溶剂这样的极性溶剂加入到所述脂质膜上并将所得混合物剧烈匀化成本发明的脂质体。
如果如上所述将米托蒽醌溶于脂质膜，那么可以将该剂型便利地包装在可以加入合适的含水溶液以形成脂质体的单一小瓶中。或者，可以制备两瓶系统，其中将亲脂组分或预制的脂质体包含在一个小瓶中，而将含有米托蒽醌的含水组分装在第二个小瓶中。可以将含有米托蒽醌的含水组分转入含有脂质膜或预制脂质体的小瓶，并通过剧烈混合、涡旋和/或声波处理而形成米托蒽醌的脂质体制剂。
理想的情况是，一旦脂质体形成，则将其通过适宜滤膜过滤以控制其大小。合适的滤膜包括那些可以用于从滤液中获得所需范围大小的脂质体的滤膜。例如，可以形成脂质体且此后通过5微米滤膜过滤而得到具有约5微米或5微米以下直径的脂质体。或者，可以通过使用1μm、500nm、200nm、100nm或其它滤膜来获得具有相应大小(sozes)的脂质体。
为了制备米托蒽醌制剂，将米托蒽醌溶于适宜溶剂。合适的溶剂是那些米托蒽醌可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。例如，可以使用非极性溶剂、弱极性溶剂或极性溶剂，诸如乙醇、甲醇、氯仿、丙酮或盐水等。
可以将任意合适的心磷脂用于本发明。例如，心磷脂可以纯化自天然来源或可以以化学方式合成，诸如四肉豆蔻基心磷脂。可以将心磷脂溶于适宜溶剂，所述的溶剂包括心磷脂可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。可以将心磷脂溶液与米托蒽醌混合。或者，可以将心磷脂与米托蒽醌直接溶解。已经发现通过将心磷脂混入脂质体使脂质体对米托蒽醌的容量增加至令人惊奇的程度。因此，还可以将心磷脂衍生物用于本发明的脂质体制剂，只要所得的脂质体制剂对治疗应用而言足够稳定且对米托蒽醌具有适宜的容量。
可以将任意合适的脂质体形成物质用于本发明的脂质体制剂。合适的脂质体形成物质包括合成的、半合成的(天然改性的)或天然出现的具有亲水部分和疏水部分的化合物。这类化合物是两亲分子且可以带有净正、负或呈中性电荷。形成脂质体的化合物的疏水部分可以包括一个或多个非极性的脂族链，例如棕榈酰基。合适的形成脂质体的化合物的实例包括磷脂类、甾醇类、脂肪酸类等。优选的形成脂质体的化合物包括心磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和α-生育酚。
可以将脂质体形成物质溶于它在其中可以溶解的适宜溶剂，该溶剂可以是诸如氯仿这样的低极性溶剂或诸如正己烷这样的非极性溶剂。合适的溶剂仅包括脂质体形成物质可以在其中溶解且可以蒸发而不会遗留药物上不可接受量的药物上不可接受残余物的溶剂。在该溶液中可以混有包括米托蒽醌在内的其它成分以形成溶液，其中所有组分在该溶液均是可溶的而且随后可以将该溶剂蒸发而得到一种均匀的脂质膜。可以通过保持米托蒽醌和其它亲脂组分稳定性的任意适宜方式来进行溶剂蒸发。
合适的脂质体可以是中性的、带负电荷或带正电荷，该电荷是脂质体成分电荷和脂质体溶液pH的函数。例如，在中性pH下，带正电荷的脂质体可以由磷脂酰胆碱、胆固醇和硬脂胺的混合物形成。带负电荷的脂质体例如可以由磷脂酰胆碱、胆固醇和磷脂酰丝氨酸形成。在一个优选的实施方案中，米托蒽醌的脂质体制剂含有四肉豆蔻酰基心磷脂、胆固醇和卵磷脂酰胆碱。
优选的米托蒽醌脂质体制剂含有适当相对摩尔量的米托蒽醌和脂质。米托蒽醌与脂质的合适的相对摩尔量范围约为1∶1-50、更优选约1∶2-40、更优选约1∶5-30、更优选约1∶10-20，且最优选约1∶15。该脂质体制剂还含有适当相对摩尔量的心磷脂、磷脂酰胆碱和胆固醇。合适的相对摩尔量包括约0.1-25∶1-99∶0.1-50的心磷脂∶磷脂酰胆碱∶胆固醇。更优选相对摩尔量范围在0.2-10∶2-50∶1-25、更优选0.5-5∶4-25∶2-15且更优选的用量范围在0.75-2∶5-15∶4-10、最优选的比例为1∶10∶6.8。优选的脂质体制剂还含有适量的诸如α-生育酚这样的抗氧化剂或其它合适的抗氧化剂。适量范围约为0.001或0.001以上到约5wt.％或5wt.％以下。
可以通过将极性溶液、优选水溶液诸如盐水溶液加入到脂质膜上并通过剧烈混合分散该膜而形成脂质体。优选所述的极性溶液中含有米托蒽醌。该溶液可以是纯水或者其可以含有盐、缓冲液或其它可溶性活性剂。可以使用任意混合方法，条件是所选择的方法诱导脂质膜与极性溶剂之间产生足够的剪切力以便剧烈匀化所述混合物并形成脂质体。例如，可以通过涡旋、磁性搅拌和/或声波处理来进行混合。可以单纯通过涡旋所述溶液而形成多层脂质体。如果需要单层脂质体，那么在该方法中可以包括声波处理和/或过滤步骤。
在制备米托蒽醌脂质体制剂的优选方法中，准备装有冻干脂质体的小瓶并加入Novantrone而形成米托蒽醌的脂质体制剂。如实施例7中更具体描述的那样，通过将脂质组分和D-α-生育酸溶于温丁醇来制备冻干的脂质体。将含有海藻糖二水合物的温水混入该溶液，直到该溶液澄清为止。将该溶液通过0.22μm滤膜无菌过滤入无菌小瓶并冻干。理想的情况是，该冻干产物是白色饼或粉末，其含有的水分约为12％或12％以下，而且其可以很容易地重新组成pH约为3-6的均匀脂质体溶液。
通过将诸如来自Novantrone小瓶的7.5ml米托蒽醌溶液(15mg)和7.5ml生理盐水(0.9％NaCl)加入到装有冻干脂质的小瓶中来制备最终的剂型。将该脂质体混合物在室温下水合30分钟并在室温下将其剧烈涡旋2分钟。使该混合物水合，同时在浴型声波处理器中以最大强度进行声波处理10分钟。在45分钟内将这种最终剂型配入注射器或标准输液器以便于在再溶解后8小时内使用。使用这种方法可以将约70wt.％或70wt.％以上的添加的米托蒽醌包载在脂质体制剂中。更优选包载约80wt.％或80wt.％以上的米托蒽醌。更优选在脂质体中包载约90wt.％或90wt.％以上乃至约95wt.％或95wt.％以上的米托蒽醌。
可以通过在水溶液中将所述脂质体制剂的等分部分透析过夜并随后将该脂质体溶于甲醇且通过使用高效液相层析(HPLC)的标准方法分析该样品来测定米托蒽醌的包载效率。或者，在用50,000xg离心1小时后收集脂质体，而后将其溶于甲醇用于HPLC分析。通常，米托蒽醌在脂质体中的包囊效率高于初始输入剂量的80％。
更一般的情况是，可以使用任意形成脂质体的适宜方法，只要此方法引起脂质体米托蒽醌产生。因此，可以使用不涉及干脂质膜形成的溶剂蒸发法。例如，可以通过在水和有机相中形成乳剂并蒸发有机溶剂来制备脂质体。本发明意图包括不管用何种方法制备的米托蒽醌的脂质体制剂。
本发明包括药物制剂，此制剂除了含有无毒性的、惰性的药物上适宜的赋形剂之外还含有米托蒽醌的脂质体制剂，本发明还包括这些制剂的生产方法。可以理解的是所谓药物上的适宜赋形剂指的是各类固体、半固体或液体稀释剂、填充剂和配制助剂。本发明还包括单位剂型的药物制剂。这意味着所述制剂是个体部分的形式，例如小瓶、注射器、胶囊、丸剂、栓剂或安瓿，在它们中的脂质体包载的米托蒽醌含量相当于一部分单位剂量或多个单位剂量。例如，该单位剂型可以含有1、2、3或4个单位剂量或1/2、1/3或1/4个单位剂量。单位剂量优选含有在一次给药中给予的米托蒽醌用量，而且其通常相当于全部每日剂量、半数每日剂量或每日剂量三分之一或四分之一的米托蒽醌用量。
片剂、锭剂、胶囊、丸剂、颗粒、栓剂、溶液、混悬剂和乳剂、糊剂、软膏、凝胶、霜剂、洗剂、粉剂和喷雾剂可以是合适的药物制剂。栓剂除含有脂质体米托蒽醌外还含有合适的水溶性或水不溶性赋形剂。合适的赋形剂是那些本发明脂质体米托蒽醌在其中充分保持稳定以用于治疗应用的赋形剂，例如聚乙二醇、某些脂肪类和酯类或这些物质的混合物。软膏、糊剂、霜剂和凝胶也可以含有脂质体米托蒽醌在其中保持稳定的合适的赋形剂。
该米托蒽醌制剂优选应以上述药物制剂形式存在，其浓度约为总制剂干重的0.1-50wt.％、优选约0.5-25wt.％。
按照公知的方法、例如通过将脂质体米托蒽醌与赋形剂或多种赋形剂混合而以常规方式制备上述药物制剂。
将活性化合物和含有该活性化合物的药物制剂用于人和兽用药物，以预防、缓解和/或治愈任何哺乳动物诸如母牛、马、猪、狗或猫的疾病，特别是那些因细胞增殖导致的疾病，诸如癌症。例如，可以用本米托蒽醌制剂有效治疗狗的淋巴瘤。然而，本制剂特别优选用于治疗人体患者，特别是用于因细胞增殖导致的癌症和其它疾病。本发明的组合物特别用于治疗人多发性硬化症、淋巴瘤和前列腺癌、肝癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌。
可以经局部、口服、非肠道、腹膜内和/或直肠、优选经非肠道给予所述的活性化合物或其药物制剂，不过，优选静脉内给药。
例如，在约70kg体重的人中，给予约0.5-100mg/m2米托蒽醌。优选给予约5.0或5.0以上-50mg/m2的米托蒽醌或更优选约10或10以上-约45mg/m2的米托蒽醌。可以更优选约25或25以上-约40mg/m2的米托蒽醌。然而，依据具体情况可以脱离所述的这些剂量范围，特别是依据受治疗者的特性和体重、疾病的性质和严重程度、所述制剂的性质和是否给予该药，以及进行给药的时间和间隔的函数，这是必需的。因此，在某些情况中，足以将用量控制在上述活性化合物的用量以下，而在其它情况中，可以超过上述活性化合物的用量。合适的用量是不具有过度毒性的治疗有效量，正如在经验和病例——病例研究中所测定的。
本发明的一个优点在于它提供了一种调节癌细胞中的广谱抗药性的方法，所述的癌细胞处于米托蒽醌治疗。特别是，本脂质体制剂缓解了用米托蒽醌进行化疗的癌细胞对其发生耐受性的倾向，并缓解了所治疗的细胞形成耐受其它治疗剂诸如喜树碱、太平洋紫杉素或阿霉素的倾向。因此，可以将其它活性剂有利地与本治疗方法或者以活性剂与米托蒽醌的联合用药物的形式联用或者以分别给药的方式使用。
实施例表明米托蒽醌给药对没有被脂质体制剂中的包含物所消弱的哺乳动物肿瘤产生了药理学功效。此外，当作为脂质体制剂给药时，动物可以耐受较高剂量的米托蒽醌，而且它们具有正如半数存活时间所测定的较好效果或者具有比给予常规米托蒽醌的动物更小的肿瘤体积。在小鼠和狗体内显示了较高的化合物血浆浓度且在小鼠体内显示了较长的化合物消除半衰期。在相差无几的剂量下，小鼠体内的峰值血浆浓度在50倍以上，而狗体内峰值血浆浓度在9倍以上。脂质体米托蒽醌于常规米托蒽醌相比，其在给药后的小鼠组织浓度方面在心脏、肺和肾脏中较低，而在肝脏和脾脏中的浓度较高。与单独给予常规米托蒽醌相比，毒性直至给予较高剂量的脂质体米托蒽醌为止也没有出现，不过，毒性分布看起来相似。在脂质体制剂中没有毒性出现，而这种情况在先前单独使用米托蒽醌时却没有观察到。在动物中，较高剂量的脂质体米托蒽醌更有较好的耐受，而且比目前的常用(非脂质体)制剂——常规米托蒽醌更为有效。
已经对本发明进行了描述，现在参照一些实施例进行描述，这些实施例仅用于解释目的而不是用来限定本发明。实施例1本实施例表示一种脂质体米托蒽醌制剂。将米托蒽醌(3μ摩尔)与心磷脂(3μ摩尔)一起溶于氯仿。向该米托蒽醌混合物中加入溶于己烷的磷脂酰胆碱(14μ摩尔)和溶于氯仿的10μ摩尔胆固醇，同时搅拌。在约30℃或30℃以下的真空中蒸发溶剂而得到薄的干脂质膜和药物的干脂质膜。通过加入2.5ml盐水溶液并如通过涡旋剧烈混合所述成分而形成脂质体。然后涡旋烧瓶而得到多层脂质体或进行声波处理而得到单层脂质体。实施例2
本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌制剂的制备方法。在一种合适的溶剂中制备约6μM米托蒽醌、6μM心磷脂、28μM磷脂酰胆碱和20μM胆固醇的溶液，然后蒸发该溶剂。将干燥的脂质/药物膜分散于7％的海藻糖盐水溶液中。将该混合物涡旋并进行声波处理。如果需要，随后对该脂质体进行透析。正如通过HPLC所测定的，米托蒽醌的包囊率为80％或80％以上。实施例3本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌制剂的制备方法。通过在2.5ml体积中使用3μM药物、15μM二棕榈酰基磷脂酰胆碱、1μM心磷脂和9μM胆固醇而使米托蒽醌包载在脂质体中。在真空中蒸发药物和脂质混合物并将其重新悬浮于等体积的盐水溶液中。如实施例1中所述制备脂质体。在该体系中，米托蒽醌的包囊效率高于80％。实施例4本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌制剂的制备方法。在这种脂质体的制备过程中，将2μM米托蒽醌、2μM磷脂酰丝氨酸、11μM磷脂酰胆碱、2μM心磷脂和7μM胆固醇溶解成溶液。如实施例1中所述制备脂质体。预计米托蒽醌的包囊效率在80％以上。实施例5本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌的制剂。可以将米托蒽醌(3μ摩尔)溶于含有3μ摩尔心磷脂的氯仿中并使该混合物形成复合物。为了促进复合物形成，通过蒸发除去氯仿溶剂。可以向该所述干燥薄膜上加入溶于己烷的磷脂酰胆碱(14μ摩尔)和溶于氯仿的10μ摩尔胆固醇。缓慢搅拌该混合物并在低于30℃的真空中蒸发溶剂而形成脂质与药物的薄的干燥膜。然后通过加入2.5ml盐水溶液并通过涡旋剧烈混合所述成分而形成脂质体。然后涡旋烧瓶而得到多层脂质体并任选地在声波处理器中进行声波处理而得到小的单层脂质体。实施例6本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌的制剂。该方法一般包括下列步骤得到米托蒽醌溶液；将该米托蒽醌溶液加入到预制的脂质体中并使该混合物达到平衡，就这样形成了脂质体米托蒽醌。每个Novantrone小瓶含有相当于2mg/ml米托蒽醌游离碱的盐酸米托蒽醌、氯化钠(0.80％w/v)、乙酸钠(0.005％w/v)和乙酸(0.046％w/v)。Novantrone溶液具有的pH为3.0-4.5且每ml含有0.14mEq的钠。
通过向升温至约35-40℃的约10kg叔丁醇中加入约2g的D-α-生育酚酸琥珀酸酯来制备预制的脂质体。将该溶液混合约5分钟，直到生育酚溶解为止。向该溶液中加入约60g的四肉豆蔻酰基心磷脂并将该溶液混合约5分钟。向该溶液中加入约100g的胆固醇并将该溶液混合约5分钟以上，然后加入约300g卵磷脂酰胆碱并再混合5分钟。将含有约35℃-40℃下的2,000g水和约120g的海藻糖二水合物的第二水溶液混入脂质溶液，直到该混合物澄清为止。将该混合物通过0.22微米孔径大小的DuraporeMillipak 200滤器进行无菌过滤，并将约11g装入无菌小瓶且冻干。按照这种方式制备的脂质体是纯白色饼或粉末形式且易于再溶解。冻干脂质体的水分约为12％或12％以下。在使用前将冻干产物储存在4℃下。
为了制备脂质体米托蒽醌，将来自Novantrone小瓶的7.5ml米托蒽醌溶液(15mg)与7.5ml生理盐水(0.9％NaCl)一起加入到冻干脂质的小瓶中。将该小瓶缓慢涡旋、在室温下使之水合30分钟、剧烈涡旋2分钟并在浴型声波处理器中以最大强度进行声波处理10分钟。然后从小瓶中抽出剂量用于应用。可以经45分钟将该产物配入注射器或标准输液器。理想的情况是，将该脂质体米托蒽醌维持在室温下至应用并在再溶解的8小时内使用。实施例7本实施例表示另一种脂质体米托蒽醌的制剂。制备含有1∶10∶6.8摩尔比的心磷脂∶磷脂酰胆碱∶胆固醇的冻干脂质组合物。进行29次试验，其中改变米托蒽醌与脂质的摩尔比、水合和声波处理时间。用生理盐水过夜透析该制剂并确定保留在各制剂中的米托蒽醌的量。
本研究证实摩尔比为1∶15的米托蒽醌与脂质(2mg的1，1，2，2-四肉豆蔻酰基心磷脂、12mg磷脂酰胆碱和约4mg胆固醇/mg米托蒽醌)水合2小时且进行声波处理10分钟的步骤对1mg/ml米托蒽醌溶液而言产生94±3％保留的脂质体米托蒽醌、对2mg/ml米托蒽醌溶液而言产生95±6％保留的脂质体米托蒽醌且对1.5mg/ml米托蒽醌溶液而言产生97％保留的米托蒽醌。水合时间减少至30分钟看起来不会显著影响1mg/ml米托蒽醌浓度的制剂中保留的米托蒽醌的量。除非另有说明，在下列实施例中使用1∶15的米托蒽醌与脂质的摩尔比、2小时的水合时间和10分钟的声波处理时间来制备1mgl/ml米托蒽醌制剂。实施例8如下实施例证实上述脂质体制剂中的米托蒽醌与相同浓度的非脂质体(常规)米托蒽醌相比具有较低的毒性且脂质体制剂中给予的至少15mg/kg米托蒽醌对小鼠而言是无毒性的。使称重为20-22g的80只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成8组，每组各10只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的天数时对记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。如表1中所示进行注射。表1组药物制剂剂量1 常规米托蒽醌 15mg/kg2 常规米托蒽醌 10mg/kg3 常规米托蒽醌 5mg/kg4 脂质体米托蒽醌15mg/kg5 脂质体米托蒽醌10g/kg6 脂质体米托蒽醌5mg/kg7 空白脂质体15mg/kg8 生理盐水溶液在前5天中，对任何动物而言没有显示出不良的临床副作用。在第6-10天的过程中，所有的第1组中的只动物濒临死亡。1只这类动物在第9天时死亡且在第10天时处死剩余的第1组的动物。有意识地处死来自第4、7和8组的各4只动物并研究血液学和临床化学。另外将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液并研究。在非1组的任何组中没有明显的毒性临床征兆。在研究后处死所有剩余的动物并研究血液学和临床化学且将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液并研究。
在各组中观察到的体重比较对使用常规米托蒽醌(15mg/kg剂量)除1组外的所有组而言在临床上均显示了中度或不明显的改变。第1组动物体重在截至到第10天时逐步下降到约35％。第2组动物最初在第10天时体重显著下降了20％，而在本研究的剩余阶段中逐步恢复。在本研究中剩余组体重均稳定增加。
在本实施例和下面的实施例中，对血液分析胆红素、血尿氮(BUN)、肌酸酐、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血红蛋白、血细胞比容、白细胞计数、红细胞计数、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCII)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板、中性白细胞、带状中性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱粒细胞。在第10天时，注意到大部分第1组小鼠和第7组中的一只小鼠的ALT有临床上显著地升高。另外观察到AST类似的升高。2只第1组小鼠还显示出适度的BUN升高，但肌酸酐并不升高，从而提示了可能因脱水或血浓度导致的肾前作用。在这些研究中没有观察到其它药物相关的作用。
病理组织学证明了化合物对用常规米托蒽醌和脂质体米托蒽醌治疗的小鼠脾和骨髓的造血和淋巴样组织的作用。在第67天时的脂质体米托蒽醌治疗的动物中观察到在全部剂量水平下均完全恢复，从而提示脂质体米托蒽醌毒性较低。
总之，在使用任意对照品和高达5mg/kg米托蒽醌的脂质体制剂的本研究中没有观察到发病率或死亡率，而在使用15mg/kg剂量的常规HCl米托蒽醌过程中观察到了100％的发病率。实施例9如下实施例证实，实施例7中所述的脂质体制剂中的米托蒽醌与相同浓度的常规HCl米托蒽醌相比具有较低的毒性且可以对小鼠给予达35mg/kg米托蒽醌而没有明显的毒性。使称重为20-22g的20只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成4组，每组各5只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的的天数时记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。如表2中所示进行注射。表2组药物制剂剂量1 脂质体米托蒽醌35mg/kg2 脂质体米托蒽醌25mg/kg3 常规米托蒽醌 25mg/kg4 空白脂质体35mg/kg在前5天中，对任何动物而言没有显示出不良的临床副作用。在第6-7天的过程中，所有的第3组中的动物濒临死亡。1只这类动物在第6天时死亡且在第7天时处死剩余第3组的动物。在任何其它组中没有明显的毒性临床征兆。在研究后处死所有剩余的动物并如实施例8所述研究血液学和临床化学。将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液并在所有死亡动物中研究。
在各组中观察到的体重比较除对接受25mg/kg剂量常规米托蒽醌的第3组外的所有组而言在临床上均显示了中度或不明显的改变。第3组动物体重截至到第7天时逐步下降到约30％。第1组动物最初在第10天时体重显著下降了20％，而在本研究的剩余阶段中逐步恢复。在本研究中剩余组体重均稳定增加。
总之，在使用载体对照品和米托蒽醌的脂质体制剂的本研究中没有观察到发病率或死亡率，而在25mg/kg常规米托蒽醌中观察到了100％的发病率。实施例10如下实施例证实，实施例7中所述的脂质体制剂中的米托蒽醌与相同浓度的常规HCl米托蒽醌相比具有较低的毒性且可以对小鼠给予至少35mg/kg米托蒽醌而没有毒性。使称重为20-22g的70只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成7组，每组各10只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的的天数时记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。如表3中所示进行注射。表3组药物制剂剂量1 常规米托蒽醌10mg/kg2 常规米托蒽醌25mg/kg3 脂质体米托蒽醌 10mg/kg4 脂质体米托蒽醌 25mg/kg5 脂质体米托蒽醌 35mg/kg6 空白脂质体 35mg/kg7 生理盐水溶液在前2天中，对任何动物而言没有显示出不良的临床副作用。在第3天的过程中，所有的第2组中的2只动物濒临死亡且处死3只动物。另外在第3天时有意识地处死来自第1、3、4、5、6和7组的各3只动物并研究血液学和临床化学。在第7天时来自第2组的另外3只动物濒临死亡且也处死来自第1、3、4、5、6和7组的另3只动物。在第10天时第2组余下的动物已经死亡。到第60天时没有观察到其它临床毒性征兆。在除第2组外的任意组中没有明显的临床毒性征兆。在本研究后，处死所有剩余的动物并如实施例8中所述进行血液学和临床化学检测。将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液并在所有死亡动物中研究。
在各组中观察到的体重比较除对接受25mg/kg剂量常规米托蒽醌的第2组外的所有组而言在临床上均显示了中度或不明显的改变。第2组动物体重截至到第7天时逐步下降约27％。第1组和第5组动物最初表现出体重显著下降(分别为13％和8％)，而在本研究的剩余阶段逐步恢复。在本研究中剩余组体重均稳定增加。
第3天时，在临床化学数据中没有注意到一致的化合物作用，不过给予25mg/kg常规米托蒽醌(第2组)的1只小鼠和给予35mg/kg脂质体米托蒽醌(第5组)的1只小鼠在ALT活性方面具有适度的增加。在大部分给予米托蒽醌而不是在给予空白脂质体的小鼠中没有注意到对白细胞的细胞毒性作用。
在第7天时，临床化学数据不确定，不过，AST和ALT活性更为广泛地改变且趋向于较高水平，这一结果与在某些动物中出现的某些肝损伤一致。在第67天当用空白脂质体治疗几只小鼠(第6组)时，小鼠显示出相似的不一致的增加。
总之，在使用任意载体对照品和米托蒽醌的脂质体制剂的本研究中没有观察到发病率或死亡率，而在接受25mg/kg常规米托蒽醌的第2组动物中观察到了100％的发病率。实施例11如下实施例证实，给予如实施例7中制备的多剂量米托蒽醌，在使用脂质体制剂时的耐受性优于相同浓度的常规HCl米托蒽醌，而且在连续5天重复给予至少10mg/kg米托蒽醌对小鼠没有毒性。使称重为20-22g的40只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成8组，每组各5只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照，且此后每日一次持续5天的期限。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的的天数时记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。注射剂量如表4中所示。表4组药物制剂剂量1 常规米托蒽醌2.5mg/kg2 常规米托蒽醌5.0mg/kg3 常规米托蒽醌7.5mg/kg4 脂质体米托蒽醌 2.5mg/kg5 脂质体米托蒽醌 5.0mg/kg6 脂质体米托蒽醌 7.5mg/kg7 空白脂质体 7.5mg/kg8 生理盐水溶液在前5天的任意小鼠中没有观察到不良的临床作用。在第6天时第1、2、3和6组的中的动物表现出毛皮起皱和驼背特性。第2和第3组中的2只动物濒临死亡。处死来自剩余各组中的2只动物用于分析。在第7天时来自第2组中的3只动物和来自第3组中的2只动物均濒临死亡，发现来自第3组中的另外1只动物已经死亡并处死来自第6、7和8组中的1只动物用于血液学和临床化学分析。截至到第60天时在任意剩余的动物中没有观察到临床毒性适应征，此时处死全部动物。采集血样如实施例8中所述进行血液学和临床化学检测并将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液。
将各组中的动物质量比较解释为中度、轻度或不明显，但除外第2组(5mg/kg常规米托蒽醌)和第5组(7.5mg/kg常规米托蒽醌)。这些动物在第7天时表现出体重逐步下降了约25％。第1组(2.5mg/kg常规米托蒽醌)和第6组(7.5mg/kg脂质体米托蒽醌)动物最初的质量下降了约28％，而到本研究结束时逐步恢复。其它治疗组在本研究过程中没有显示质量上的改变。
第7天时，从第6、7和8组中处死的小鼠表现出适度的AST升高。另外来自第8组中的小鼠的碱性磷酸酶活性也增加且来自第6和第7中的小鼠具有减少的的肌酸酐和碱性磷酸酶。来自第2、3和6组中濒临死亡的小鼠表现出明显的临床显著的、与化合物相关的、伴随中性白细胞和淋巴细胞计数下降的白细胞减少症和血小板计数适度下降，在第64天时分析来自第1、4、6和7组的小鼠且它们表现出适度的碱性磷酸酶和AST升高，而其中其它值正常。
组织病理学检查证实在全部治疗组中脾脏和骨髓的造血和淋巴样细胞衰竭且在肠中出现绒毛状和/或隐窝萎缩。看起来脂质体米托蒽醌对脾脏的毒性低于常规的米托蒽醌且对肠上皮的细胞毒性远低于常规的米托蒽醌。在给予了5mg/kg或7.5mg/kg的常规米托蒽醌的几只小鼠的肝脏中观察到了一定程度的肝细胞空泡变性。与之相比，在给予了5mg/kg脂质体米托蒽醌的1只小鼠体内观察到了最小的肝细胞空泡变性程度且在给予了7.5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠中没有1只可观察到最小的肝细胞空泡变性程度。常规米托蒽醌和脂质体米托蒽醌给药均导致足以影响许多小鼠中骨纵向生长的常规细胞和破骨细胞消耗。到第64天时在给予了常规米托蒽醌的全部存活小鼠中和在给予了2.5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠体内均观察到所有作用显著恢复。在第64天时使用7.5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠在造血和淋巴样组织内仍然具有最低程度的组织学作用。
脂质体米托蒽醌对脾脏的细胞毒性看起来略低于常规米托蒽醌且对肠上皮的细胞毒性远低于常规米托蒽醌，不过，组织分布发现显示米托蒽醌的组织浓度显著升高。在给予5mg/kg或7.5mg/kg常规米托蒽醌的几只小鼠肝脏中观察到了一定程度的肝细胞空泡变性。仅在1只给予了5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠体内观察到了最低程度的肝细胞空泡变性且使用7.5mg/kg脂质体米托蒽醌的小鼠没有1只显示肝细胞空泡变性。
总之，在接受脂质体米托蒽醌的任意组或接受2.5mg/kg脂质体米托蒽醌的组中均没有观察到发病率或死亡率。相反，第2组(5mg/kg常规米托蒽醌)和第3组(7.5mg/kg常规米托蒽醌)中的所有动物均死亡。实施例12如下实施例证实，如实施例7中所述的脂质体制剂中的米托蒽醌具有低于相同浓度的常规HCl米托蒽醌的毒性且脂质体制剂中给予的至少35mg/kg米托蒽醌对小鼠没有毒性。使称重为20-22g的30只雄性CD2F1小鼠适应1周并随机分成6组，每组各5只动物，每个笼中有5只动物。在第0天时，给全部组的动物在尾静脉中静脉内注入所述药物或载体对照，而且此后每日一次地给药，持续5天的期限。基于各动物体重改变给予的体积。在注射后交替的的天数时记录每只小鼠的体重并至少每日记录对临床疾病的观察结果。注射剂量如表5中所示。表5组药物制剂剂量1 常规米托蒽醌2.5mg/kg2 常规米托蒽醌5.0mg/kg3 脂质体米托蒽醌 5mg/kg4 脂质体米托蒽醌 7.5mg/kg5 脂质体米托蒽醌 10mg/kg6 生理盐水在前5天的任意小鼠中没有观察到不良的临床作用。第1、2和5组的中的动物表现出毛皮起皱和驼背特性。在第8天时，来自第2和第5组中的3只动物濒临死亡且来自第5组的1只动物已经死亡。在第8天时处死来自第6组中的3只动物用于血液学和临床化学。在第10天时来自第2组中的1只动物濒临死亡且1只动物已经死亡。在第10天时来自第5组中的1只动物濒临死亡。到第12天时来自第1组中的3只动物已经死亡。第18天时第4组中的1只动物已经死亡。截至到第60天时在任意剩余的动物中没有观察到临床毒性适应征，此时处死全部动物。采集血样如实施例8中所述进行血液学和临床化学检测并将主要器官固定入10％的福尔马林缓冲液。
各组中的动物体重的变化为中度、轻度或不明显，但除外第2组(5mg/kg常规米托蒽醌)和第5组(10mg/kg脂质体米托蒽醌)。这些动物到第9天时表现出体重分别逐步下降了约35％和25％。到第13天时，第1组(2.5mg/kg常规米托蒽醌)、第3组(5mg/kg脂质体米托蒽醌)和第4组(7.5mg/kg脂质体米托蒽醌)动物最初的体重分别下降了约30％、7％和30％。其体重在本研究的过程中逐步恢复。其它治疗组在本已经过程中没有表现出质量上的改变在载体对照组或接受达5mg/kg(在连续5天时1次)的脂质体米托蒽醌的组中没有观察到发病率或死亡率。在用2.5mg/kg常规米托蒽醌治疗的动物中观察到了60％的发病率。在用7.5mg/kg脂质体米托蒽醌治疗的动物中观察到了20％的发病率。用10mg/kg脂质体米托蒽醌或5mg/kg常规米托蒽醌治疗使测试小鼠的致死率达100％。
来自第2组(5mg/kg常规米托蒽醌)和第5组(10mg/kg脂质体米托蒽醌)的濒临死亡的动物表现出显著的AST和ALT升高。此外，第2组中4只小鼠中的3只小鼠和第5组中5只小鼠中的1只小鼠所测得的胆红素浓度均高于对照组小鼠。濒临死亡的动物表现出带有中性白细胞和淋巴细胞降低的显著白细胞减少症。还观察到了血小板计数的适度可变的下降。也观察到了红细胞计数出现最低程度的增加。其它参数没有受到显著影响。在第70天时处死的小鼠表现出正常的临床化学指标，但具有低白细胞计数。在这些小鼠体内淋巴细胞和中性白细胞较低。其它参数正常。
在实施例8的单剂量实验中，15mg/kg剂量的常规米托蒽醌而非脂质体米托蒽醌诱发象征急性肝损伤的ALT显著升高，而实施例10中的较高剂量不会产生这种结果。由于考虑到多剂量数据，所以显然常规米托蒽醌具有导致显著肝损伤的可能性。来自最终处死动物的数据提示发生显著的恢复，而几乎没有毒性或细胞毒性的迹象。
来自较高剂量组的小鼠显示出对白细胞和血小板的细胞毒性作用，其中中性白细胞和淋巴细胞明显降低且血小板适度下降。在较低剂量组中，这种作用明显较少。数据证明5mg/kg/天常规米托蒽醌和10mg/kg/天脂质体米托蒽醌诱发几乎相同的急性肝损伤，正如到第8天ALT、AST和胆红素升高所证实的。
总之，来自这些研究的临床病理学数据显示，以10mg/kg/天给予的脂质体米托蒽醌并不比以5mg/kg/天给予常规米托蒽醌更具有毒性，而且显然从毒性和细胞毒性作用中显著恢复。该数据证明可以以高于考虑常规米托蒽醌安全性2倍的用量安全地给予脂质体米托蒽醌。实施例13如下实施例证实，实施例7中所述的脂质体米托蒽醌制剂在哺乳动物血液中达到了高于常规制剂中给予的米托蒽醌的血浆浓度，而且具有比常规制剂中给予的米托蒽醌更长的半衰期和低于常规制剂中给予的米托蒽醌清除率。在静脉内给予5mg/kg单剂量的常规和脂质体米托蒽醌后在雄性CD2F1小鼠中进行药代动力学评价。在给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时和48小时时处死各组的4只小鼠并采集其血液和器官且用于分析米托蒽醌含量。
通过反相HPLC分析血浆和组织样品中的米托蒽醌。将血浆样品(0.25m1)与作为内标的0.5ml的0.01mg/ml己磺酸、0.5mg/ml抗坏血酸和0.25μg阿美蒽醌的溶液混合。在涡旋30秒后，加入0.5ml的0.1M硼酸盐缓冲液(pH9.5)和150μl的1M氢氧化钠并将该溶液再涡旋30秒。在水平振荡器上用10ml二氯甲烷提取样品1小时并以3,000rpm离心15分钟。分离有机层(9ml)并在氮气中蒸发。用10μl流动相将样品再溶解，此后进行HLPC分析。在1ml含有20％抗坏血酸、pH3.0的0.1M柠檬酸盐缓冲液中匀化组织样品并如上所述进行提取。通过反相层析法(Waters μBondapakc-18)分离米托蒽醌，其中使用的流动相为33％乙腈和pH2.7的67％0.16M富马酸铵缓冲液、以1ml/分钟的流速转运。在600nm下检测米托蒽醌。灵敏度极限为10ng/ml。
通过标准方法评价血浆药动学参数。根据对血浆浓度-时间曲线的线性回归分析计算消除率常数(K)。使用线性梯形法与末端期至无限(C最终/K)的外推法计算曲线下的面积(AUC0→∞)，其中C最终是最后测定的浓度。所计算的其它参数是作为剂量/AUC的总体清除率(Cl)；分布体积(V面积)＝Cl/K；消除半衰期(t1/2)＝0.693/K面积。
总之，在静脉内给药后，脂质体米托蒽醌与常规米托蒽醌相比产生了显著较高的峰值(50倍)。血浆浓度的下降伴随一级动力学参数出现，其中常规和脂质体制剂的消除半衰期分别为6.6分钟和1小时。AUC值和末端消除半衰期为Cmax、AUC和t1/2值，给予常规米托蒽醌后分别为0.41μg/ml、0.14μg·小时/ml和0.11小时，而在给予脂质体米托蒽醌后对这些相同参数而言这些数值分别约为21μg/ml、28μg·小时/ml和1小时。根据化合物的清除率和分布体积可以解释这些数值的增加。经计算的总米托蒽醌清除率结果是脂质体米托蒽醌米托蒽醌(3ml/分钟/kg)基本上低于常规常规米托蒽醌(600ml/分钟/kg)。经计算的分布体积为脂质体米托蒽醌(0.31/kg)，其与常规米托蒽醌(5.51/kg)相比也明显降低。
对在肺和肾脏中分别使用约20和40μg/g常规米托蒽醌组织浓度的肺和肾脏分别观察到了相似模式的从这些组织中的清除率，而且在给予脂质体米托蒽醌后在这些相同组织中的脂质体米托蒽醌组织浓度为13和16μg/g。在肝脏中，给予常规米托蒽醌后米托蒽醌浓度从约19μg/g逐步下降至2μg/g，而在给予脂质体米托蒽醌后4小时时肝脏浓度从约25μg/g增加至37μg/g，此后在48小时时逐步下降至30μg/g。在给药后5分钟时在心脏中检测到的米托蒽醌峰值浓度的为脂质体制剂(5.6μg/g组织)低于常规米托蒽醌(11μg/g组织)。在给药后达48小时时这种差异至少保持2倍。
在所有检查的时间点处，常规米托蒽醌治疗的小鼠的心脏、肺和肾脏中的常规米托蒽醌浓度均高于脂质体米托蒽醌治疗的小鼠。在所有检查的时间点处，脂质体米托蒽醌治疗的小鼠的脾脏和肝脏中的浓度均高于常规米托蒽醌治疗的小鼠，从而证明脂质体制剂使化合物的分布发生移动。给予常规的米托蒽醌在给予该化合物后5分钟和15分钟时导致心脏组织浓度约为10μg/g，其中该浓度在24小时和48小时时逐步下降至5-6μg/g。在给予脂质体米托蒽醌后，5分钟时的心脏米托蒽醌浓度约为6μg/g且在24-48小时时该浓度逐步下降至约2μg/g。这些数据提示脂质体米托蒽醌的心脏毒性下降的可能性。实施例14本实施例证实，如实施例7中制备的脂质体米托蒽醌对人白血病细胞的功效并证明该脂质体制剂与常规的米托蒽醌制剂相比功效提高。通过连续三次接种(腹膜内)使鼠白血病细胞L1210白血病细胞在CD2F1小鼠的腹膜中生长。在下列实验后使用最后接种的8天内产生的腹水。测定脂质体和常规米托蒽醌对L1210腹水型白血病的抑制细胞活性。每周测定3次动物组的体重并以人道方式处死临床上濒临死亡的动物。每天观察存活的小鼠，持续60天。使用单剂量或多剂量的所述药物静脉内治疗后的组存活时间，表明了脂质体和常规米托蒽醌的相对抗肿瘤效力。
将雌性CD2F1小鼠分成8组，每组各10只动物，且给它们静脉内接种10,000个L1210细胞。此后进行24小时给药。以5mg/kg和10mg/kg的剂量给予常规米托蒽醌。以作为单剂量注射的5、10、20或35mg/kg剂量静脉内给予脂质体米托蒽醌并对各组测定半数存活时间。在本实验的第60天时处死存活动物。另外给予相当于35mg/kg剂量的空白脂质体和生理盐水作为对照。
未治疗动物的半数存活时间为7天。用5mg/kg常规米托蒽醌和脂质体米托蒽醌治疗的动物的半数存活时间分别为12天和13天。给予10mg/kg常规米托蒽醌的动物的半数存活时间为20天，其中2/10动物在第60天时仍然存活。使用10mg/kg脂质体米托蒽醌治疗的动物的半数存活时间为27天，其中4/10小鼠存活至第60天。以20mg/kg脂质体米托蒽醌治疗的所有动物均存活至第60天。在测试的35mg/kg最高脂质体米托蒽醌剂量下，9/10动物存活至第60天，其中在第18天时发现1只动物死亡，可能是由于化合物的毒性导致的。
这些单剂量研究提示可以以高于常规米托蒽醌的剂量给予脂质体米托蒽醌而获得改善的临床效果。在鼠白血病模型中，脂质体米托蒽醌以相差无几的剂量比常规米托蒽醌改善了动物的半数存活时间且在相同或较高剂量下与化合物相关的死亡率下降。这些结果提示能够在脂质体米托蒽醌制剂中给予较高剂量的米托蒽醌而不会增加毒性的危害。小鼠耐受的脂质体米托蒽醌剂量达20mg/kg(60mg/m2)且直到35mg/kg(105mg/m2)的脂质体米托蒽醌剂量下也没有表现出显著的毒性。实施例15本实施例证实，如实施例7中制备的脂质体米托蒽醌在以多剂量给药时的功效。将40只雌性CD2F1小鼠分成4组，每组10只动物且如实施例14中所述给它们接种L1210细胞。以2.5mg/kg常规米托蒽醌或以2.5mg/kg或5mg/kg脂质体米托蒽醌每隔24小时治疗1次小鼠，从接种后24小时开始持续4天。
用2.5mg/kg常规米托蒽醌和脂质体米托蒽醌治疗的小鼠的半数存活时间分别为13天和14天。这一存活时间与实施例14的单剂量研究中以相同浓度描述的结果相似。在这些治疗组中的该剂量水平下没有动物存活至第60天。以5mg/kg脂质体米托蒽醌治疗的小鼠的半数存活时间为37天，其中4/10动物存活至第60天。这些数据提示在以多剂量给药时，脂质体米托蒽醌具有超过常规米托蒽醌的临床有益效果。实施例16本实施例证实，在带有异种移植的人前列腺癌细胞的小鼠中，给予如实施例7的单剂量脂质体米托蒽醌后，存活增加；且与常规米托蒽醌治疗的动物相比，给予多剂量脂质体米托蒽醌后平均肿瘤体积减小。给雄性Balb/c、nu/nu、6-8周龄小鼠接种5×106人激素顽固性前列腺肿瘤细胞(PC-3)。每周监测2次肿瘤生长情况，直到肿瘤体积在60-100mm2的范围为止。然后将动物分成数组并通过在尾静脉中进行静脉内注射0.625、1.25、2.5和5mg/kg剂量的常规米托蒽醌来进行治疗，隔天一次，持续4天。配制成脂质体中的米托蒽醌剂量为2.5、5、7.5和10mg/kg。对照组动物接受生理盐水或空白脂质体。计算平均存活时间并在第34天时处死所有存活的动物。
以0.625和1.25mg/kg常规米托蒽醌治疗的动物到第34天时表现出100％存活；然而，用2.5和5mg/kg治疗的动物没有1只存活。使用脂质体米托蒽醌的存活率在2.5mg/kg剂量下为100％、在5mg/kg剂量下为91％、在7.5mg/ml剂量下为43％且在10mg/kg剂量下为0％。
遵循相同的给药方案，使用0.625和1.25mg/kg剂量的常规米托蒽醌和2.5和5mg/kg剂量的脂质体米托蒽醌的重复本治疗实验。在这些实验中，每周通过对三个长轴进行1次或2次测定来测量肿瘤的体积。
使用两种剂量的脂质体米托蒽醌进行治疗，导致肿瘤体积比对照组和用常规米托蒽醌治疗组的肿瘤体积明显减小。在使用PC-3异种移植物时注意到了肿瘤生长明显延缓。在较高剂量的常规米托蒽醌下，严重的毒性限制了其临床应用。看起来脂质体米托蒽醌是比常规米托蒽醌更为安全和更为有效的抗肿瘤药。实施例17本实施例证实脂质体米托蒽醌制剂在对狗给药后在血浆中具有高于常规米托蒽醌的浓度、清除较常规米托蒽醌缓慢。通过反相HPLC、使用阿美蒽醌作为内标分析来自静脉内给予0.13或0.26mg/kg常规米托蒽醌或静脉内给予0.26、0.58或0.87mg/kg脂质体米托蒽醌的狗(3条/性别/组)的血浆样品中的米托蒽醌水平。分析的时间点为0、5和30分钟和单剂量给药后1、2、4、8和24小时。
在5分钟的时间点处不能对低剂量测出接受常规米托蒽醌的动物体内的血浆浓度，而且在30分钟的时间点处不能对高剂量测出接受常规米托蒽醌的动物体内的血浆浓度。可以在1小时的时间点处测出接受0.258mg/kg的1条雄性动物。相反，大部分接受脂质体米托蒽醌的动物对低剂量而言具有的米托蒽醌血浆浓度达2小时而对中等剂量和高剂量而言具有的米托蒽醌血浆浓度达4小时。
当给予常规米托蒽醌时，米托蒽醌的浓度远低于给予作为Cmax和AUC值(表6)中所反映的脂质体米托蒽醌。另外，就清除率而言，常规米托蒽醌高于脂质体米托蒽醌。Cmax和AUC值均随脂质体米托蒽醌的剂量增加而增加，而清除率、分布体积和消除半衰期在该剂量范围内保持恒定。在性别之间的这些参数上没有差异。将结果概括在下面的表6中，该表列出了各参数的平均值。表中所示的其它参数包括米托蒽醌半衰期(t1/2)、分布体积(V)和清除率(Cl)。表6米托蒽醌 剂量(mg/kg)Cmax(μg/ml)AUC0→∞(μgt1/2(小时)Cl(ml/分钟V(L/kg)制剂·小时/ml)/kg)常规-Ma0.13 0.027 NCbNC NC NC常规-F0.13 0.016 NC NC NC NC常规-M0.26 0.084 0.05c0.3689 2.8常规-F0.26 0.06 NC NC NC NC脂质体-M 0.26 0.43 0.32NC 17 1.2脂质体-F 0.26 0.77 0.420.2515 0.9脂质体-M 0.58 1.5 0.840.3 13 0.6脂质体-F 0.58 1.9 1.7 NC 6.8 0.6脂质体-M 0.87 2.41 1.84NC 90.8脂质体-F 0.87 2.33 1.77NC 11 1aM＝雄性；F＝雌性bNC＝未计算c仅检测常规米托蒽醌至30分钟取样时间为止本实施例表明给予脂质体米托蒽醌的狗产生比相同剂量的常规米托蒽醌提高9倍峰值的米托蒽醌血浆浓度。该脂质体制剂还表现出增加的AUC值和降低的清除率。Cmax和AUC值以线性方式随剂量的增加而增加。Cmax值在0.26、0.58和0.87mg/kg(5、12和17mg/m2)下约为0.5、1.7和2.4μg/ml。实施例18本实施例证实当将药物配制成脂质体时，狗可以耐受的米托蒽醌剂量高于常规的米托蒽醌制剂。在第1、23、43和65天以0(盐水)、0.129或0.258mg/kg(2.6或5mg/m2)的静脉内剂量对小猎犬(3条/性别/组)给予常规米托蒽醌。在这些相同的天数时，小猎犬(3/性别/组)接受0(空白脂质体)、0.258、0.580或0.869mg/kg(5、12或17mg/m2)的脂质体米托蒽醌。基于临床观察结果、体重、食物消耗、眼科学和ECG检查、临床病理学、血药浓度、器官重量和宏观和显微镜尸检评价与化合物相关的作用。
在给予一个剂量的脂质体米托蒽醌后的第12天，因器官损害、左肢肿胀、活动减退、苍白、脱水和腹泻处死0.869mg/kg脂质体米托蒽醌组中的1条雄性狗。
1只空白脂质体米托蒽醌治疗的雌性狗出现脱毛，而第2条狗在本研究的前29天中出现过度的唾液分泌。来自0.869脂质体米托蒽醌组的1条雌性狗的左侧腿在第31、32和36天时出现跛行，此时它的左后足表现出炎症和肿胀且该足上存在疮或溃疡。
在本研究过程中没有1条动物体重受到影响，但体重降低的0.258常规米托蒽醌组的雄性动物除外。在任意组中食物消耗没有发生改变。
ECG参数在任何检查时间处都没有发生改变。
给予0.129和0.258常规米托蒽醌的动物在各剂量周期后4天或10天出现白细胞减少和血小板减少且严重程度与剂量相关。在3周给药周期的后半程中白细胞计数趋向于重新回到正常值。不同白细胞数据揭示了在各剂量给药后第10天时最严重的、与剂量相关的中性白细胞计数的下降。随着各给药周期还出现了与剂量相关的淋巴细胞减少且看起来随各连续剂量而恶化。贫血在使用常规米托蒽醌的动物中没有发生，但观察到了如网织红细胞计数下降所证实的细胞胞类毒性的迹象。网织红细胞计数在第10、32和46天时迅速重新回到正常值或稍高于正常值。
给予脂质体米托蒽醌的动物在血液学参数上具有类似于在常规米托蒽醌治疗的动物中观察到的改变，但在本研究过程中(0.869mg/kg脂质体米托蒽醌)处死的具有白细胞减少、血小板减少和贫血的动物除外。在雌性狗中观察到了轻度贫血且在雄性和雌性狗中均观察到了网织红细胞计数下降。网织红细胞计数在雌性狗中的重新恢复没有雄性狗中快。
对任意剂量组中的动物没有观察到凝固或临床化学参数上的改变。
在尸检时，脂质体米托蒽醌0.869mg/kg组中的1条雄性动物的胸腔中充满了液体且存在心脏增厚和胃肠道损害。这些发现看起来与化合物相关。在该剂量下1条动物的各种淋巴结变色。脂质体米托蒽醌0.580和0.869组中总计3条动物在注射部位出现蓝色。没有其它发现归因于化合物的给药。
总之，给予单独的脂质体的6条狗中的1条和给予脂质体米托蒽醌的18条动物中的1条，其肢体疼痛并伴有跛行，这一结果可能是因给予脂质体本身所导致的。本研究证实了当将药物配制成脂质体时，狗可以耐受较高剂量的米托蒽醌。实施例19本实施例表示将脂质体米托蒽醌给予癌症患者的方法和给予安全和有效量的脂质体米托蒽醌制剂的方法。选择组织学记录有实体瘤的患者进行治疗。在本研究中，可以测定静脉内给药后米托蒽醌的最大耐受剂量(MTD)、剂量限制毒性和血药动力学参数。还观察到了脂质体米托蒽醌的抗肿瘤作用。通过每隔3周静脉内给予一次脂质体米托蒽醌来治疗患者，直到观察到疾病发展或者出现需要终止早期治疗的毒性为止。还确定了治疗的安全性和耐受性。在治疗的第一阶段中评价药代动力学参数。在每个第二阶段评价心功能状态。通过适宜方式在每个第二阶段后评价疾病状态。评价6种剂量水平。
在本研究中使用商品Novantrone。如实施例7中所述制备米托蒽醌的脂质体制剂。以下表7中所示的剂量经45分钟静脉给予脂质体米托蒽醌。表7脂质体米托蒽醌剂量水平(mg/m2)1 92 123 154 205 256 30
在各剂量水平下研究3位患者。每隔3周在疾病没有发展或没有不可接受的毒性出现的情况下重复给药。
按照NCI/CTC标准对不良事件进行分级。将剂量限制毒性(DLT)定义为第一个疗程(即21天)内不可接受的毒性发生、定义为包括超敏反应在内的非恶心/呕吐或脱发的3级或4级非血液毒性、或非中性白细胞减少的4级血液学毒性、或持续3天以上的4级中性白细胞减少、或定义为体温超过38.5℃的3级或4级中性白细胞减少的发热性白细胞减少、或4级呕吐或4级转氨酶(AST或ALT)升高、或2级(或2级以上)MUGA扫描后LVEF下降。
将最大耐受剂量(MTD)定义为6位治疗的患者无1人以上在该剂量水平上引起DLT的最高剂量水平。如果以指定剂量水平治疗的最初3位患者中无1人出现剂量限制毒性(DLT)，那么继续扩大剂量。如果最初治疗的3位患者之一出现DLT，那么使另3位患者进入相同的剂量水平。如果另3位患者中无1人出现DLT，那么继续扩大剂量。如果以一种剂量水平治疗的另3位患者中1位或多位发生DLT，那么终止扩大剂量。如果以一种剂量水平治疗的最初3位患者中2位或3位发生DLT，那么终止扩大剂量。以可能的MTD治疗6位患者以确保在剂量与MTD平齐之前满足标准。
在给予先前的脂质体米托蒽醌剂量后21天或21天以上，且当绝对中性白细胞计数(ANC)为1,500m/m3或1,500m/m3以上时，且当血小板计数为100,000/mm3时，且从任意其它与治疗相关的毒性(除脱发外)的恢复达到基线等级或低于1级时，可以给予随后的疗程，无论哪种情况限制均较少。
将治疗延缓1周以使毒性消退。如果在延缓1周后毒性仍不消退，那么将治疗再延缓1周，其剂量减少与延缓1周后出现的剂量减少相同。如果必须将治疗保持2周以上，那么将该患者从本研究中排除。
权利要求
1.哺乳动物疾病的治疗方法，该方法包括对哺乳动物给予一种药物组合物，其包括治疗有效量的、含有心磷脂的脂质体制剂中的米托蒽醌和药物上可接受的赋形剂。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体制剂进一步包括磷脂。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体制剂进一步包括生育酚。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体制剂进一步包括磷脂酰胆碱、胆固醇和生育酚。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的心磷脂选自天然心磷脂和合成心磷脂。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体带负电荷。
8.权利要求1所述的方法，其中所述的脂质体带正电荷。
9.权利要求1所述的方法，其中至少90％的米托蒽醌与脂质体结合。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的米托蒽醌浓度在约0.5-约2mg/ml的范围。
11.治疗性米托蒽醌组合物，其包括含有米托蒽醌和脂质成分的脂质体，其中所述的脂质成分包含心磷脂。
12.权利要求11所述的组合物，其中米托蒽醌与脂质成分的摩尔比在约1∶10-约1∶20的范围。
13.权利要求11所述的组合物，其中包载米托蒽醌的脂质体包含具有约5μm或5μm以下大小的囊泡。
14.权利要求11所述的组合物，其中所述的包载米托蒽醌的脂质体包含具有约1μm或1μm以下大小的囊泡。
15.权利要求11所述的组合物，其中所述的包载米托蒽醌的脂质体包含具有约0.5μm或0.5μm以下大小的囊泡。
16.权利要求11所述的组合物，其中所述的包载米托蒽醌的脂质体包含具有约0.1μm或0.1μm以下大小的囊泡。
17.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质成分进一步包括选自磷脂酰胆碱、胆固醇、α-生育酚、二棕榈酰基磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的化合物。
18.权利要求11所述的组合物，其中所述的心磷脂选自天然心磷脂和合成心磷脂。
19.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质体带有负电荷。
20.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质体带有正电荷。
21.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质体是中性的。
22.权利要求11所述的组合物，其中所述的脂质体是多层脂质体和单层脂质体的混合物。
23.治疗性米托蒽醌组合物，其包括脂质成分和米托蒽醌，其中米托蒽醌与脂质成分的摩尔比在约1∶10-约1∶20的范围。
24.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分包括磷脂。
25.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分包括磷脂酰胆碱。
26.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分包括卵磷脂酰胆碱。
27.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分包括胆固醇。
28.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的脂质成分进一步包括磷脂、胆固醇、心磷脂和生育酚。
29.权利要求23所述的治疗性米托蒽醌组合物，其中所述的米托蒽醌浓度在约0.5-约2mg/ml的范围。
30.米托蒽醌药物剂型的制备方法，该方法包括下列步骤获得含有一定量预制脂质体的容器，所述的脂质体包括结合米托蒽醌的成分；获得含有一定量药物上可接受赋形剂中的米托蒽醌的容器；将一部分药物上可接受赋形剂中的米托蒽醌与所述脂质体混合；和使米托蒽醌结合到脂质体而得到米托蒽醌的药物剂型。
31.权利要求30所述的方法，其中所述预制的脂质体是冻干的。
全文摘要
本发明涉及米托蒽醌的脂质体制剂及其制备方法和应用。本发明的组合物包括米托蒽醌的脂质体制剂，其中所述的脂质体含有任意不同的中性或带电荷的脂质体形成物质以及认为结合米托蒽醌的化合物，诸如心磷脂。可以将该脂质体组合物有利地与不同于米托蒽醌的第二种治疗剂一起联用，所述的第二种治疗剂包括抗肿瘤药、抗真菌药、抗生素以及其它活性剂。本发明提供了对诸如人这样的哺乳动物给予治疗有效量的所述制剂的方法。
文档编号A61K45/06GK1469735SQ01817424
公开日2004年1月21日 申请日期2001年10月16日 优先权日2000年10月16日
发明者伊姆兰·艾哈迈德, 阿奎鲁尔·拉赫曼, 伊姆兰 艾哈迈德, 尔 拉赫曼 申请人:新药物公司
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