抗孕激素在细胞中诱导编程性细胞死亡的应用的制作方法
专利名称：抗孕激素在细胞中诱导编程性细胞死亡的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗孕激素(antiprogestins)在细胞中诱导编程性细胞死亡的应用。本发明尤其涉及抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮或其药物学可接受的衍生物或类似物在细胞中诱导编程性细胞死亡的应用。本发明还提供了抗孕激素在制备治疗高风险指标是细胞周期S期的肿瘤细胞数量增加的一类癌症如乳癌的药物中的应用。
这种内分泌学治疗中的新策略基于抗孕激素在孕酮受体阳性人乳癌细胞系中的体外抗肿瘤活性，及在小鼠和大鼠的一些激素依赖性乳腺肿瘤中的体内抗肿瘤活性。特别地，所述抗孕激素奥那斯酮(onapristone)和米非司酮(RU 486)的抗肿瘤机制，已经使用小鼠激素依赖性MXT乳腺肿瘤模型以及大鼠的DMBA-和NMU-诱导的乳腺肿瘤模型加以研究(M.R.Schneider等，Eur.J.Cancer Clin.Oncol.，Vol.25，No.4，pp.691-701，1989；H.Michna等，乳癌研究与治疗14275-288，1989；H.Michna，类固醇生物化学杂志，Vol.34，Nos1-6，pp.447-453，1989)。然而，由于低活性和与例如米非司酮相关的不利副作用，所以不建议这种化合物作为单一制剂控制乳癌(D.Perraul等，临床癌症杂志，1996年10月，14(10)，pp.2709-2712)。另外，米非司酮呈现强抗糖皮质激素的副作用(参见L.M.Kettel等，Fertil.Steril.1991年9月，56(3)，pp.402-407；X.Bertagna，Psychotteuroeradoerinology 1997；22 Suppl.1，pp.51-55)。
细胞周期的各个时期中肿瘤细胞百分比的测定可以通过有效的DNA流式细胞计量术进行(参见G.M.Clark等，N.Engl.J.Med.320，1989，March，pp.627-633；L.G.Dresser等，癌症61(3)，1988，pp.420-427及所引用的文献)。因此已经示出肿瘤细胞的细胞周期阶段、特别是在所述周期某一阶段中肿瘤细胞的数目可以是疾病进程和治疗成功的重要临床预示。细胞周期S期中的细胞数目在这方面特别重要。
EP 0 495 825 B1揭示了抗孕激素(竞争性孕酮拮抗剂)在生产治疗乳腺癌的药物中的应用，所述乳腺癌在细胞周期S期肿瘤细胞含量增加，这据信是一种高风险因子。这一点基于观测到抗孕激素能阻断细胞周期G0G1期中肿瘤细胞进程，导致S期肿瘤细胞实质性减少。然而，这种作用在标准乳癌他莫昔芬治疗，雌激素治疗或卵巢切除术中未观测到。EP 0 495 825 B1中测试的抗孕激素是11β-[4-N，N-二甲基氨基]-苯基]-17α-羟基-17β-(3-羟基丙基)-13α-甲基-4，9(10)-gonadien-3-one和11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(丙炔-1-基)-4，9(10)-雌二烯-3-酮。
具有强抗孕激素活性的17α-氟烷基类固醇及其生产方法见于WO 98/34947所述。WO 98/34947未揭示或研究所揭示的17α-氟烷基类固醇在编程性细胞死亡或细胞周期停滞中的作用。
考虑到通过阻断G0G1期的进程而诱导细胞例如肿瘤细胞编程性细胞死亡的药剂的潜在价值，希望可以鉴别具有这种特异性作用的其它药剂，例如抗孕激素。这种药剂具有治疗和预防某些癌症如乳癌的潜在应用，这些癌症中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。
发明目的因此本发明的一个目的是进一步研究抗孕激素在抑制激素依赖性疾病如乳癌中的作用模式，及提供在细胞中定向诱导编程性细胞死亡的一种方法。
令人惊奇地，本发明人揭示了抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮(或其药物学可接受的衍生物或类似物)可以用于在细胞中诱导编程性细胞死亡。
因此，本发明提供了抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备在细胞中诱导编程性细胞死亡的药物中的应用。优选地，编程性细胞死亡的诱导通过起始终末分化而引发。所述细胞优选是哺乳动物细胞，更优选是人体细胞，其中所述肿瘤优选是乳癌。
本发明另一方面是抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备治疗以下类型癌症的药物中的应用，所述癌症类型中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。
本发明再一方面是抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在体外诱导细胞的编程性细胞死亡中的应用。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选是人体细胞，最优选是肿瘤细胞，其中所述肿瘤优选是乳癌。
本发明另一方面是通过给予细胞有效量的抗孕激素(I)而在细胞中诱导编程性细胞死亡的方法。这种方法可以在体外或体内应用。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选是人体细胞，最优选是肿瘤细胞，其中所述肿瘤是乳癌。
根据诱导编程性细胞死亡的能力，抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物可以用于治疗某些类型的癌症，如乳癌，这些癌症中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。根据其诱导编程性细胞死亡能力而可以通过抗孕激素(I)影响或治疗的其它类型癌症或激素依赖性疾病可以包括乳癌，卵巢癌，子宫内膜癌，骨髓瘤，无排卵不孕症，脑膜瘤，即主要源自或受存在激素受体和/或激素依赖性途径影响的疾病。
图2示出与对照组和卵巢切除术相对比，在大鼠NMU-诱导的乳腺癌中作为抗孕激素(I)诱导的编程性细胞死亡结果的对肿瘤生长的抑制作用。所述研究用日剂量为0.5和1.0mg/kg s.c.的抗孕激素(I)进行。
图3示出与对照组和卵巢切除术相对比，10mg/kg s.c.剂量的抗孕激素(I)在重度联合免疫缺陷(scid)小鼠中异体移植的人T47D肿瘤中的编程性细胞死亡诱导及因此的肿瘤生长抑制作用。
图4表明与对照组和卵巢切除术相对比，10mg/kg s.c.剂量的抗孕激素(I)在scid小鼠中MCF-7人乳癌模型中的编程性细胞死亡诱导及因此的肿瘤生长抑制作用。
图5A-5F示出与大鼠NMU诱导的乳癌模型中编程性细胞死亡诱导相关的组织学数据(参见实施例5)。特别地，图5A示出与对照组(图5B)相比，用抗孕激素(I)处理的肿瘤表现出小管和腺泡形成，其通常由分泌物填充。图5C示出与用抗孕激素(I)处理的NMU诱导的乳癌组织(图5D)相对比，具有高PCNA(增殖细胞核抗原)免疫反应性的未处理的NMU诱导的乳癌组织，处理的组织呈现低PCNA免疫反应性。图5E示出与对照组(图5E)相对比，抗孕激素(I)处理的NMU诱导的乳癌组织中出现编程性细胞死亡。
图6表明与抗孕激素奥那斯酮和纯抗孕激素11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基)丙氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇(WO 98/07740)相对比，10-9至10-8mol/l有效阈值浓度的抗孕激素(I)在T47D乳癌细胞系(由雌二醇刺激的)中的肿瘤生长抑制作用。
发明详述抗孕激素(I)即11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮由下式(I)代表
抗孕激素(I)(或其药物学可接受的衍生物或类似物)是一种有价值的药剂，具有强抗孕激素活性。根据本发明抗孕激素(I)可以用于在细胞中诱导编程性细胞死亡。
本发明文中术语“抗孕激素”首先意在包括所有能竞争性抑制孕酮受体的化合物。然而，其还应涵盖能抑制孕酮生物合成的化合物。
本发明文中抗孕激素(I)的药物学可接受的衍生物或类似物可以包括例如在WO 98/34947中揭示的任一种化合物。
本发明中进行的研究示出抗孕激素(I)在各种激素依赖性肿瘤模型中的强大肿瘤抑制性质(见实施例1-6)。进一步表明由于诱导编程性细胞死亡所致的抗孕激素(I)的肿瘤抑制活性比常规抗肿瘤药剂如常规的抗雌激素他莫昔芬更强。根据本发明使用抗孕激素(I)治疗乳癌比卵巢切除术效果更出色。
如以下实施例表明，抗孕激素(I)在各种肿瘤模型中的应用表明在细胞周期G0G1期中肿瘤细胞积聚，在细胞周期的S和G2M期中肿瘤细胞的数目呈明显的生物学相关的降低。这些结果表明诱导了分化。早于其它干细胞系统先前已经提出分化特异性G1期停滞(见J.J.Wille Jr.，癌症研究1982，42(12)5139-46；R.E.Scott，细胞生物学杂志1982，94(2)400-405)。
在各种肿瘤模型中获得的实验结果表明用抗孕激素(I)处理似乎引发有丝分裂活性的多边形肿瘤细胞分化成隔离有大量分泌产物的腺体结构和腺泡以及朝向梭形渐进性坏死亚群(见实施例5、尤其图5A和5B)。而肿瘤大小，有丝分裂指数及恶性级别明显降低，肿瘤中腺体结构的容积率以及编程性细胞死亡的出现与对照组相比提高3倍(见实施例5，图5E和5F)。
不希望限于任何理论，这些结果表明抗孕激素(I)在测试模型中抗肿瘤作用的主要机制是通过诱导与最终细胞死亡相关的终末分化，在肿瘤细胞水平的孕酮受体介导的直接抗增殖作用。以此方式，抗孕激素(I)表现为能消除孕酮受体阳性肿瘤的恶性肿瘤细胞固有的终末分化中的内部阻断。抗孕激素(I)的这种抗增殖作用似乎与抗孕激素(I)的抗激素(抗孕激素)活性无关。
通过阻断G0G1期的进程而在细胞例如肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡的药剂如抗孕激素(I)，具有治疗及预防多种病变的潜力。这类药剂包括抗孕激素(I)可以用于治疗如下的癌症，即其中高风险指标是细胞周期S期肿瘤细胞数目增加，如在乳癌中。
因此本发明的一方面是抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备在细胞中诱导编程性细胞死亡的药物中的应用。在一个优选的实施方案中，抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物的应用涉及在人体肿瘤细胞优选乳癌细胞中诱导编程性细胞死亡的药物。这种药物有益于治疗激素依赖性疾病如乳癌，这些疾病中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。
所述药物的生产可以根据本领域已知方法进行。可以使用通常已知并利用的佐剂以及另外的适当载体或稀释剂。适当的载体和稀释剂可以是制药业，化妆品和相关领域推荐的那些材料Ullmaran′sEncyclopedia of Technical Chemistry，第4卷(1953)，pp.1-39；药物科学杂志，第52卷(1963)，p.918ff；H.v.Czetsch-Lindenwald，“Hilfsstoffe für Pharmazie und angrenzende Gebiete″；Pharm.Ind.2，1961，p.72ff；Dr.H.P.Fiedler，Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie，Kosmetik und astgrenzende Gebiete，Cantor KG，Aulendorf inWurttemberg，1971。
适于本发明目的的抗孕激素，优选抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物，根据制备口服或非肠道例如腹膜内，肌内，皮下或经皮应用药剂的方法，可以掺入药物组合物中。也可以将它们植入组织中。植入体可包括惰性材料例如可生物降解的聚合物或合成的硅氧烷如硅胶。
所述药剂可以以片剂，丸剂，糖衣丸，凝胶胶囊，颗粒，栓剂，植入体，可注射无菌水或油溶液，悬浮液或乳状液，药膏，乳液，凝胶形式，或通过阴道内(例如阴道环)或子宫内系统(例如隔膜，环)施用。
为制备口服给予的药物，适于上述本发明目的的抗孕激素可以与通常已知和使用的佐剂和载体混合，例如阿拉伯树胶，滑石，淀粉，糖如甘露糖，甲基纤维素，乳糖，凝胶，表面活性剂，硬脂酸镁，水或非水赋形剂，石蜡衍生物，交联剂，分散剂，乳化剂，润滑剂，防腐剂和香味剂(例如轻油)。在一种药物组合物中，所述抗孕激素可以以微粒分散于组合物中，例如纳米颗粒。
为进一步增强所述活性药剂的生物利用度，也可以根据PCT/EP95/02656所述方法，通过与α-，β-或γ-环糊精或其衍生物反应而将适于上述本发明目的的抗孕激素作为环糊精包合物(clathrates)配制。针对非肠道施用，可将适于上述本发明目的的抗孕激素溶解于或悬浮于生理学可接受的稀释剂中，如有或无增溶剂的油，表面活性剂，分散剂或乳化剂中。油例如但非限制性包括橄榄油，花生油，棉花子油，大豆油，蓖麻油和芝麻油。
给药量(即药物有效量)根据治疗的病变及施用模式在一定范围内可以加以变化。其可以包括对所进行的治疗有效的任何量。确定“药物有效量”在本领域技术人员的知识范围内。
一个剂量单位可代表大约0.1-100mg活性药剂。给予人时，活性药剂的日剂量为大约0.1-400mg，优选10-100mg，最优选50mg。
所述药物也可以通过贮存注射或植入而施用，任选持续施用所述活性药剂。
优选的施用模式是口服施用。根据本发明施用的抗孕激素，尤其抗孕激素(I)，特别适于口服施用。
根据本发明的所有方面，还可以将上述至少一种抗孕激素，尤其抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物，与至少一种抗雌激素组合，因为许多激素依赖性疾病，尤其乳癌，不仅存在孕酮受体，而且还存在雌激素受体。所述抗雌激素可以与抗孕激素，及尤其与抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物同时或相继施用。抗孕激素和抗雌激素的数量可以相等或者一种成分比另一种成分多，如抗孕激素抗雌激素为1∶50-50∶1，优选1∶30-30∶1，最优选为1∶15-15∶1。
根据本发明使用的适当抗雌激素是非类固醇抗雌激素，如他莫昔芬和萘福昔定以及雷洛昔芬，faslodex和EM800。
类固醇抗雌激素例如包括EP 0 348 341 A和WO 98/07740中揭示的那些，尤其11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5五氟戊硫基-丙基氨基)-戊基]-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇，或WO 99/33855中揭示的那些，特别是11β-氟-7α-{5-[甲基-(7，7，8，8，9，9，10，10，10-九氟癸基)-氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇，或其药物学可接受的衍生物或类似物。具有抗雌激素作用的芳香酶抑制剂如EP 0 495825 B1中第7-8页揭示的那些药剂也可以用作抗雌激素。
本发明的另一方面是抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备治疗癌症药物中的应用，所述癌症中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。S期中肿瘤细胞数目可以通过DNA流式细胞计量术测定，如Dresser等，“在1331例冷冻的乳癌样品中DNA流式细胞计量术和预测因子”，癌症Vol.61(3)，1988，pp.420-427；也见于McGuire & Dresser，“预测乳癌患者复发和存活的流式细胞计量术的计算机程序和操作”，JNCI，Vol.75(3)，1985，pp.405-409。S期中肿瘤细胞高风险数量表示一种针对本发明使用的特别适当候选物。在抗孕激素(I)情况中，从强抗肿瘤作用，这通过标准动物模型显示(见实施例1-4)，及诱导编程性细胞死亡(见实施例5)和细胞周期停滞的该药剂的作用机制而显示出优势。
在本发明的另一方面中，提供了在细胞中诱导编程性细胞死亡的一种方法。该细胞优选是哺乳动物细胞及最优选人体细胞，而且所述方法可以体外或体内应用。优选地，编程性细胞死亡通过起始终末分化的机制诱导，例如通过给予抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物。在该方法中，可以给予细胞有效量的抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物。例如在生长由给予雌二醇而刺激的T47D乳癌细胞系中，抗孕激素(I)导致细胞生长完全抑制，有效阈值浓度为10-9和10-8mol(见实施例6和图6)。尤其令人惊奇的是已知的抗孕激素奥那斯酮在这种肿瘤模型中没有降低细胞生长的作用。因此，抗孕激素(I)在强力和效力方面比其它抗孕激素如奥那斯酮及抗雌激素如他莫昔芬及甚至纯化的抗雌激素如11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基)-丙氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17p-二醇更出色(WO 98/07740)。
抗孕激素(I)在细胞中诱导编程性细胞死亡的作用表明该抗孕激素(或其药物学可接受的衍生物或类似物)可以用于特别需要诱导编程性细胞死亡的病变宿主中，尤其激素依赖性病变宿主中。特别地，其可以用于这类疾病的治疗，如乳癌，卵巢癌，子宫内膜癌，骨髓瘤，无排卵性不孕，脑膜瘤，即主要发生自或由存在激素受体和/或激素依赖性途径影响的疾病。
抗孕激素，如抗孕激素(I)，因此可以进一步用于制备诱导编程性细胞死亡或细胞死亡的药物，以治疗激素依赖性疾病如上述疾病。
在实施例中进一步例证了本发明。应理解以下实施例是非限制性的。
结果在完整的对照动物中，观测到肿瘤进一步生长，而卵巢切除术在90％的动物中引起明显的肿瘤抑制。用抗孕激素(I)在2mg/kg或之上的剂量引起编程性细胞死亡明显产生，与对照组相比抑制肿瘤生长(见图2)。这里明显存在一剂量应答关系。用0.5mg/kg抗孕激素(I)处理不明显阻止肿瘤生长，在2mg/kg观测到最大诱导编程性细胞死亡并因此导致的生长抑制。在这组中，在50％大鼠中观测到完全肿瘤抑制。在这个实验中测试的最高剂量的抗孕激素(I)的作用(10mg/kg)与2mg/kg作用相似。奥那斯酮(5mg/kg，s.c.)在相似剂量比抗孕激素(I)明显效力低下。
结论在大鼠中DMBA诱导的乳腺肿瘤模型中，抗孕激素(I)在肿瘤细胞中强力诱导编程性细胞死亡，并因此在完整动物中完全抑制肿瘤生长。发现2mg/kg抗孕激素(I)对肿瘤细胞具有最大编程性细胞死亡效力。抗孕激素(I)在抑制肿瘤生长方面比奥那斯酮明显出色。实施例2在大鼠NMU诱导的乳癌模型中的肿瘤生长抑制材料和方法通过单次静脉内注射NMU(亚硝基甲脲，50mg/kg)在雌性Sprague-Dawley大鼠(得自Tierzucht Schnwalde，50-55天龄)中诱导肿瘤。从10天后开始，将具有至少一个确定肿瘤的大鼠通过以下方式治疗4周1)溶剂对照，2)在治疗开始时行卵巢切除术，3)抗孕激素(I)，1.0mg/kg/天，4)抗孕激素(I)，0.5mg/kg/天，及5)奥那斯酮，5mg/kg/天。通过每周用测径器测定肿瘤面积的变化(与初始肿瘤大小的百分比)作为生长抑制参数。使用Kruskal Wallis-测试进行平均值组间差异的统计学分析。
结果在完整的对照动物中，观测到肿瘤进一步生长，而卵巢切除术引起完全肿瘤生长抑制。用抗孕激素(I)在0.5或1.0mg/kg剂量处理引起明显的肿瘤生长抑制，这是因为与对照组相比产生编程性细胞死亡(见图2)。奥那斯酮(5mg/kg)与低得多的剂量(0.5mg/kg)的抗孕激素(I)相比，效力也明显低下。
结论在大鼠NMU诱导的乳腺肿瘤模型中，因为抗孕激素(I)在肿瘤细胞中强力诱导编程性细胞死亡的能力，其完全抑制完整动物中肿瘤生长。两种剂量(1.0mg/kg和0.5mg/kg)的抗孕激素(I)对肿瘤细胞均具有明显的编程性细胞死亡作用。
实施例3在scid小鼠中人T47D乳癌异体移植材料和方法为雌性Fox Chase scid小鼠(M & B)补充雌二醇丸(InnovativeResearch of America)。将得自细胞培养物并悬浮于matrigel中的T47D乳癌细胞植入小鼠的腹股沟区。当肿瘤大小为大约25mm2时，开始治疗。持续治疗直至肿瘤被抑制。实验组为1)对照组(载体)，2)卵巢切除术，3)抗孕激素(I)，10mg/kg s.c。用测径器测定肿瘤大小。Kruskal Wallis-测试用于统计学分析平均值组间差异。
结果在T47D乳癌模型中，与对照组中肿瘤迅速生长相反，卵巢切除术引起肿瘤生长明显抑制。图3清晰示出s.c.应用10mg/kg抗孕激素(I)在肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡。抗孕激素(I)的作用与常规雌激素耗竭治疗(卵巢切除术)的作用几乎类似。
结论抗孕激素(I)在诱导编程性细胞死亡及因此抑制Fox Chasescid小鼠中人T47D乳癌异体移植物生长中的作用，可与据信为在这个模型中抑制乳癌生长的最有效方法的标准雌激素耗竭治疗(卵巢切除术)的作用相似。
实施例4在scid小鼠中人MCF-7乳癌异体移植材料和方法为雌性Fox Chase scid小鼠(M & B)补充雌二醇丸(InnovativeResearch of America)。将得自细胞培养物并悬浮于matrigel中的MCF7乳癌细胞植入小鼠的腹股沟区。当肿瘤大小为大约25mm2时，开始治疗。持续治疗直至肿瘤被抑制。实验组为1)对照组(载体)，2)卵巢切除术，3)抗孕激素(I)，10mg/kg s.c。用测径器测定肿瘤大小。Kruskal Wallis-测试用于统计学分析平均值组间差异。
结果在MCF7乳癌模型中，与对照组中肿瘤迅速生长相反，卵巢切除术引起肿瘤生长明显抑制。图4清晰示出s.c.应用10mg/kg抗孕激素(I)在肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡。抗孕激素(I)的作用与常规雌激素耗竭治疗(卵巢切除术)的作用几乎类似。
结论抗孕激素(I)在诱导编程性细胞死亡及因此抑制Fox Chasescid小鼠中人MCF7乳癌异体移植物生长中的作用，可与标准雌激素耗竭治疗(卵巢切除术)的作用相似。
实施例5大鼠中NMU诱导的乳癌(组织学，增殖指数和TUNEL分析)材料和方法通过单次静脉内注射NMU(亚硝基甲脲，50mg/kg)，在雌性Sprague-Dawley大鼠(得自Tierzucht Schnwalde，50-55天龄)中诱导肿瘤。将具有至少一个大小大于150mm2的确定肿瘤的大鼠通过以下方式治疗7天1)溶剂对照，2)在治疗开始时行卵巢切除术，3)抗孕激素(I)，3mg/kg s.c.，每日。在治疗结束时切下肿瘤，在福尔马林中固定，并包埋于石蜡中。对这些切除的肿瘤进行组织学，增殖指数和编程性细胞死亡诱导分析。
组织学针对组织学分析，将组织玻片HE染色并通过显微镜分析。
增殖指数为确定增殖指数，确定PCNA的表达。增殖细胞核抗原(PCNA)是与细胞周期相关的36kD核蛋白。在正常组织的增殖区室中发现核PCNA免疫反应性。使用一种识别固定和加工抗性表位的单克隆抗体研究其组织分布情况。
TUNEL(编程性细胞死亡测试)编程性细胞死亡的生物化学特征是基因组DNA降解，这是一种不可逆的事件，导致细胞死亡。这种特有的DNA片段化是核内切核酸酶激活的结果，其在位于核小体单位之间的位点选择性裂解DNA。这些DNA链断裂通过使用末端转脱氧核苷酰酶(TUNEL)用荧光素-dUTP酶标记3’-OH末端而检测(TUNEL代表末端转脱氧核苷酰酶介导的dUTP缺口末端标记，参见Gavrieli等，细胞生物学杂志119，493，1992)。掺入的荧光素使用抗荧光素抗体碱性磷酸酶缀合物随后通过碱性磷酸酶底物反应而检测。
结果组织学在用抗孕激素(I)治疗后，得自NMU肿瘤的组织切片出现通常由分泌物填充的导管和腺泡形成(图5A)。另外，肿瘤中腺体结构的容积率与对照组相比提高(图5B)。另外，抗孕激素(I)治疗的动物的乳腺肿瘤示出分化的形态学特征。
增殖指数在未治疗的NMU诱导的乳癌组织中PCNA免疫反应性较高(图5C未治疗的对照组)。具有PCNA免疫反应性的细胞数目通过在得自用抗孕激素(I)治疗的大鼠NMU诱导乳癌组织中诱导分化而降低(图5D)。这些数据表明在乳癌中，用抗孕激素治疗通过产生分化而降低增殖指数。
TUNEL(编程性细胞死亡)图5E表明与未治疗的对照组相比(图5F)，NMU诱导的乳癌组织中出现由抗孕激素(I)诱导的编程性细胞死亡。显而易见，单独的抗孕激素(I)就能在NMU诱导的乳癌组织中诱导编程性细胞死亡并因此抑制这些肿瘤生长。实施例6在T47D细胞系中抗孕激素(I)的体外抗增殖活性材料和方法将T47D细胞在补加0.1nM E2(雌二醇)加抗孕激素(I)的活性炭处理的血清中生长6天，更换一次培养基。在固定及随后用结晶紫染色后，记录吸光度，数值以未治疗对照组的吸光度为标准，如R.B.Lichtner，类固醇生物化学分子生物学杂志1999，71；181-189。与上述实施例5相似地进行TUNEL分析，唯一不同是代替组织切片，在此分析中使用在显微镜玻片上培养的细胞。
结果在这个T47D细胞系的体外测试中，抗孕激素(I)表现强力的肿瘤生长抑制活性，有效阈值浓度低如10-9至10-8mol/l，而抗孕激素奥那斯酮未示出任何抑制效应。即使纯化的抗雌激素11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基)丙氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇(WO 98/07740)的效力也明显低于抗孕激素(I)(见图6)。
结论本发明的抗孕激素(I)在非常低的浓度水平也诱导T47D细胞刺激的细胞生长完全抑制，并因此在强力和效力方面比其它测试的抗孕激素如奥那斯酮及纯化的抗雌激素11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基)丙氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇更优异。
权利要求
1.抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮或其药物学可接受的衍生物或类似物在细胞中诱导编程性细胞死亡的应用。
2.权利要求1的应用，其中编程性细胞死亡的诱导由起始终末分化而引起。
3.前述任一权利要求的应用，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
4.权利要求3的应用，其中所述哺乳动物细胞是人体细胞。
5.前述任一权利要求的应用，其中所述细胞是肿瘤细胞。
6.权利要求5的应用，其中所述肿瘤是乳癌。
7.前述任一权利要求的应用，其中所述药物还包含一种抗雌激素。
8.抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备治疗一种类型癌症的药物中的应用，所述癌症类型中高风险指标是细胞周期S期的肿瘤细胞数目增加。
9.权利要求8的应用，其中所述疾病是乳癌。
10.在细胞中诱导编程性细胞死亡的方法，包括在体外给予细胞以有效量的抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮或其药物学可接受的衍生物或类似物。
11.权利要求10的方法，其中所述细胞是哺乳动物肿瘤细胞。
12.权利要求10或11的方法，其中所述细胞是乳癌细胞。
全文摘要
本发明涉及通过给予抗孕激素尤其抗孕激素11β－(4－乙酰苯基)－17β－羟基－17α－(1，1，2，2，2－五氟乙基)－雌－4，9－二烯－3－酮或其药物学可接受的衍生物或类似物在细胞尤其在乳癌细胞中诱导编程性细胞死亡的方法和应用。本发明还涉及高风险指标是细胞周期S期的肿瘤细胞数目增加的癌症的治疗，所述治疗包括一种抗孕激素，尤其抗孕激素11β－(4－乙酰苯基)－17β－羟基－17α－(1，1，2，2，2－五氟乙基)－雌－4，9－二烯－3－酮或其药物学可接受的衍生物或类似物。
文档编号A61P35/00GK1469749SQ01817569
公开日2004年1月21日 申请日期2001年10月17日 优先权日2000年10月18日
发明者延斯·霍夫曼, 罗斯玛丽·利希特纳, 格哈德·西迈斯特, 梅尔廷·施奈德, 乌尔丽克·富尔曼, 施奈德, 西迈斯特, 丽 利希特纳, 克 富尔曼, 延斯 霍夫曼 申请人:舍林股份公司
技术领域：
本发明涉及抗孕激素(antiprogestins)在细胞中诱导编程性细胞死亡的应用。本发明尤其涉及抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮或其药物学可接受的衍生物或类似物在细胞中诱导编程性细胞死亡的应用。本发明还提供了抗孕激素在制备治疗高风险指标是细胞周期S期的肿瘤细胞数量增加的一类癌症如乳癌的药物中的应用。
这种内分泌学治疗中的新策略基于抗孕激素在孕酮受体阳性人乳癌细胞系中的体外抗肿瘤活性，及在小鼠和大鼠的一些激素依赖性乳腺肿瘤中的体内抗肿瘤活性。特别地，所述抗孕激素奥那斯酮(onapristone)和米非司酮(RU 486)的抗肿瘤机制，已经使用小鼠激素依赖性MXT乳腺肿瘤模型以及大鼠的DMBA-和NMU-诱导的乳腺肿瘤模型加以研究(M.R.Schneider等，Eur.J.Cancer Clin.Oncol.，Vol.25，No.4，pp.691-701，1989；H.Michna等，乳癌研究与治疗14275-288，1989；H.Michna，类固醇生物化学杂志，Vol.34，Nos1-6，pp.447-453，1989)。然而，由于低活性和与例如米非司酮相关的不利副作用，所以不建议这种化合物作为单一制剂控制乳癌(D.Perraul等，临床癌症杂志，1996年10月，14(10)，pp.2709-2712)。另外，米非司酮呈现强抗糖皮质激素的副作用(参见L.M.Kettel等，Fertil.Steril.1991年9月，56(3)，pp.402-407；X.Bertagna，Psychotteuroeradoerinology 1997；22 Suppl.1，pp.51-55)。
细胞周期的各个时期中肿瘤细胞百分比的测定可以通过有效的DNA流式细胞计量术进行(参见G.M.Clark等，N.Engl.J.Med.320，1989，March，pp.627-633；L.G.Dresser等，癌症61(3)，1988，pp.420-427及所引用的文献)。因此已经示出肿瘤细胞的细胞周期阶段、特别是在所述周期某一阶段中肿瘤细胞的数目可以是疾病进程和治疗成功的重要临床预示。细胞周期S期中的细胞数目在这方面特别重要。
EP 0 495 825 B1揭示了抗孕激素(竞争性孕酮拮抗剂)在生产治疗乳腺癌的药物中的应用，所述乳腺癌在细胞周期S期肿瘤细胞含量增加，这据信是一种高风险因子。这一点基于观测到抗孕激素能阻断细胞周期G0G1期中肿瘤细胞进程，导致S期肿瘤细胞实质性减少。然而，这种作用在标准乳癌他莫昔芬治疗，雌激素治疗或卵巢切除术中未观测到。EP 0 495 825 B1中测试的抗孕激素是11β-[4-N，N-二甲基氨基]-苯基]-17α-羟基-17β-(3-羟基丙基)-13α-甲基-4，9(10)-gonadien-3-one和11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(丙炔-1-基)-4，9(10)-雌二烯-3-酮。
具有强抗孕激素活性的17α-氟烷基类固醇及其生产方法见于WO 98/34947所述。WO 98/34947未揭示或研究所揭示的17α-氟烷基类固醇在编程性细胞死亡或细胞周期停滞中的作用。
考虑到通过阻断G0G1期的进程而诱导细胞例如肿瘤细胞编程性细胞死亡的药剂的潜在价值，希望可以鉴别具有这种特异性作用的其它药剂，例如抗孕激素。这种药剂具有治疗和预防某些癌症如乳癌的潜在应用，这些癌症中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。
发明目的因此本发明的一个目的是进一步研究抗孕激素在抑制激素依赖性疾病如乳癌中的作用模式，及提供在细胞中定向诱导编程性细胞死亡的一种方法。
令人惊奇地，本发明人揭示了抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮(或其药物学可接受的衍生物或类似物)可以用于在细胞中诱导编程性细胞死亡。
因此，本发明提供了抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备在细胞中诱导编程性细胞死亡的药物中的应用。优选地，编程性细胞死亡的诱导通过起始终末分化而引发。所述细胞优选是哺乳动物细胞，更优选是人体细胞，其中所述肿瘤优选是乳癌。
本发明另一方面是抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备治疗以下类型癌症的药物中的应用，所述癌症类型中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。
本发明再一方面是抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在体外诱导细胞的编程性细胞死亡中的应用。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选是人体细胞，最优选是肿瘤细胞，其中所述肿瘤优选是乳癌。
本发明另一方面是通过给予细胞有效量的抗孕激素(I)而在细胞中诱导编程性细胞死亡的方法。这种方法可以在体外或体内应用。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选是人体细胞，最优选是肿瘤细胞，其中所述肿瘤是乳癌。
根据诱导编程性细胞死亡的能力，抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物可以用于治疗某些类型的癌症，如乳癌，这些癌症中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。根据其诱导编程性细胞死亡能力而可以通过抗孕激素(I)影响或治疗的其它类型癌症或激素依赖性疾病可以包括乳癌，卵巢癌，子宫内膜癌，骨髓瘤，无排卵不孕症，脑膜瘤，即主要源自或受存在激素受体和/或激素依赖性途径影响的疾病。
图2示出与对照组和卵巢切除术相对比，在大鼠NMU-诱导的乳腺癌中作为抗孕激素(I)诱导的编程性细胞死亡结果的对肿瘤生长的抑制作用。所述研究用日剂量为0.5和1.0mg/kg s.c.的抗孕激素(I)进行。
图3示出与对照组和卵巢切除术相对比，10mg/kg s.c.剂量的抗孕激素(I)在重度联合免疫缺陷(scid)小鼠中异体移植的人T47D肿瘤中的编程性细胞死亡诱导及因此的肿瘤生长抑制作用。
图4表明与对照组和卵巢切除术相对比，10mg/kg s.c.剂量的抗孕激素(I)在scid小鼠中MCF-7人乳癌模型中的编程性细胞死亡诱导及因此的肿瘤生长抑制作用。
图5A-5F示出与大鼠NMU诱导的乳癌模型中编程性细胞死亡诱导相关的组织学数据(参见实施例5)。特别地，图5A示出与对照组(图5B)相比，用抗孕激素(I)处理的肿瘤表现出小管和腺泡形成，其通常由分泌物填充。图5C示出与用抗孕激素(I)处理的NMU诱导的乳癌组织(图5D)相对比，具有高PCNA(增殖细胞核抗原)免疫反应性的未处理的NMU诱导的乳癌组织，处理的组织呈现低PCNA免疫反应性。图5E示出与对照组(图5E)相对比，抗孕激素(I)处理的NMU诱导的乳癌组织中出现编程性细胞死亡。
图6表明与抗孕激素奥那斯酮和纯抗孕激素11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基)丙氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇(WO 98/07740)相对比，10-9至10-8mol/l有效阈值浓度的抗孕激素(I)在T47D乳癌细胞系(由雌二醇刺激的)中的肿瘤生长抑制作用。
发明详述抗孕激素(I)即11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮由下式(I)代表
抗孕激素(I)(或其药物学可接受的衍生物或类似物)是一种有价值的药剂，具有强抗孕激素活性。根据本发明抗孕激素(I)可以用于在细胞中诱导编程性细胞死亡。
本发明文中术语“抗孕激素”首先意在包括所有能竞争性抑制孕酮受体的化合物。然而，其还应涵盖能抑制孕酮生物合成的化合物。
本发明文中抗孕激素(I)的药物学可接受的衍生物或类似物可以包括例如在WO 98/34947中揭示的任一种化合物。
本发明中进行的研究示出抗孕激素(I)在各种激素依赖性肿瘤模型中的强大肿瘤抑制性质(见实施例1-6)。进一步表明由于诱导编程性细胞死亡所致的抗孕激素(I)的肿瘤抑制活性比常规抗肿瘤药剂如常规的抗雌激素他莫昔芬更强。根据本发明使用抗孕激素(I)治疗乳癌比卵巢切除术效果更出色。
如以下实施例表明，抗孕激素(I)在各种肿瘤模型中的应用表明在细胞周期G0G1期中肿瘤细胞积聚，在细胞周期的S和G2M期中肿瘤细胞的数目呈明显的生物学相关的降低。这些结果表明诱导了分化。早于其它干细胞系统先前已经提出分化特异性G1期停滞(见J.J.Wille Jr.，癌症研究1982，42(12)5139-46；R.E.Scott，细胞生物学杂志1982，94(2)400-405)。
在各种肿瘤模型中获得的实验结果表明用抗孕激素(I)处理似乎引发有丝分裂活性的多边形肿瘤细胞分化成隔离有大量分泌产物的腺体结构和腺泡以及朝向梭形渐进性坏死亚群(见实施例5、尤其图5A和5B)。而肿瘤大小，有丝分裂指数及恶性级别明显降低，肿瘤中腺体结构的容积率以及编程性细胞死亡的出现与对照组相比提高3倍(见实施例5，图5E和5F)。
不希望限于任何理论，这些结果表明抗孕激素(I)在测试模型中抗肿瘤作用的主要机制是通过诱导与最终细胞死亡相关的终末分化，在肿瘤细胞水平的孕酮受体介导的直接抗增殖作用。以此方式，抗孕激素(I)表现为能消除孕酮受体阳性肿瘤的恶性肿瘤细胞固有的终末分化中的内部阻断。抗孕激素(I)的这种抗增殖作用似乎与抗孕激素(I)的抗激素(抗孕激素)活性无关。
通过阻断G0G1期的进程而在细胞例如肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡的药剂如抗孕激素(I)，具有治疗及预防多种病变的潜力。这类药剂包括抗孕激素(I)可以用于治疗如下的癌症，即其中高风险指标是细胞周期S期肿瘤细胞数目增加，如在乳癌中。
因此本发明的一方面是抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备在细胞中诱导编程性细胞死亡的药物中的应用。在一个优选的实施方案中，抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物的应用涉及在人体肿瘤细胞优选乳癌细胞中诱导编程性细胞死亡的药物。这种药物有益于治疗激素依赖性疾病如乳癌，这些疾病中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。
所述药物的生产可以根据本领域已知方法进行。可以使用通常已知并利用的佐剂以及另外的适当载体或稀释剂。适当的载体和稀释剂可以是制药业，化妆品和相关领域推荐的那些材料Ullmaran′sEncyclopedia of Technical Chemistry，第4卷(1953)，pp.1-39；药物科学杂志，第52卷(1963)，p.918ff；H.v.Czetsch-Lindenwald，“Hilfsstoffe für Pharmazie und angrenzende Gebiete″；Pharm.Ind.2，1961，p.72ff；Dr.H.P.Fiedler，Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie，Kosmetik und astgrenzende Gebiete，Cantor KG，Aulendorf inWurttemberg，1971。
适于本发明目的的抗孕激素，优选抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物，根据制备口服或非肠道例如腹膜内，肌内，皮下或经皮应用药剂的方法，可以掺入药物组合物中。也可以将它们植入组织中。植入体可包括惰性材料例如可生物降解的聚合物或合成的硅氧烷如硅胶。
所述药剂可以以片剂，丸剂，糖衣丸，凝胶胶囊，颗粒，栓剂，植入体，可注射无菌水或油溶液，悬浮液或乳状液，药膏，乳液，凝胶形式，或通过阴道内(例如阴道环)或子宫内系统(例如隔膜，环)施用。
为制备口服给予的药物，适于上述本发明目的的抗孕激素可以与通常已知和使用的佐剂和载体混合，例如阿拉伯树胶，滑石，淀粉，糖如甘露糖，甲基纤维素，乳糖，凝胶，表面活性剂，硬脂酸镁，水或非水赋形剂，石蜡衍生物，交联剂，分散剂，乳化剂，润滑剂，防腐剂和香味剂(例如轻油)。在一种药物组合物中，所述抗孕激素可以以微粒分散于组合物中，例如纳米颗粒。
为进一步增强所述活性药剂的生物利用度，也可以根据PCT/EP95/02656所述方法，通过与α-，β-或γ-环糊精或其衍生物反应而将适于上述本发明目的的抗孕激素作为环糊精包合物(clathrates)配制。针对非肠道施用，可将适于上述本发明目的的抗孕激素溶解于或悬浮于生理学可接受的稀释剂中，如有或无增溶剂的油，表面活性剂，分散剂或乳化剂中。油例如但非限制性包括橄榄油，花生油，棉花子油，大豆油，蓖麻油和芝麻油。
给药量(即药物有效量)根据治疗的病变及施用模式在一定范围内可以加以变化。其可以包括对所进行的治疗有效的任何量。确定“药物有效量”在本领域技术人员的知识范围内。
一个剂量单位可代表大约0.1-100mg活性药剂。给予人时，活性药剂的日剂量为大约0.1-400mg，优选10-100mg，最优选50mg。
所述药物也可以通过贮存注射或植入而施用，任选持续施用所述活性药剂。
优选的施用模式是口服施用。根据本发明施用的抗孕激素，尤其抗孕激素(I)，特别适于口服施用。
根据本发明的所有方面，还可以将上述至少一种抗孕激素，尤其抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物，与至少一种抗雌激素组合，因为许多激素依赖性疾病，尤其乳癌，不仅存在孕酮受体，而且还存在雌激素受体。所述抗雌激素可以与抗孕激素，及尤其与抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物同时或相继施用。抗孕激素和抗雌激素的数量可以相等或者一种成分比另一种成分多，如抗孕激素抗雌激素为1∶50-50∶1，优选1∶30-30∶1，最优选为1∶15-15∶1。
根据本发明使用的适当抗雌激素是非类固醇抗雌激素，如他莫昔芬和萘福昔定以及雷洛昔芬，faslodex和EM800。
类固醇抗雌激素例如包括EP 0 348 341 A和WO 98/07740中揭示的那些，尤其11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5五氟戊硫基-丙基氨基)-戊基]-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇，或WO 99/33855中揭示的那些，特别是11β-氟-7α-{5-[甲基-(7，7，8，8，9，9，10，10，10-九氟癸基)-氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇，或其药物学可接受的衍生物或类似物。具有抗雌激素作用的芳香酶抑制剂如EP 0 495825 B1中第7-8页揭示的那些药剂也可以用作抗雌激素。
本发明的另一方面是抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备治疗癌症药物中的应用，所述癌症中高风险指标是细胞周期S期中肿瘤细胞数目增加。S期中肿瘤细胞数目可以通过DNA流式细胞计量术测定，如Dresser等，“在1331例冷冻的乳癌样品中DNA流式细胞计量术和预测因子”，癌症Vol.61(3)，1988，pp.420-427；也见于McGuire & Dresser，“预测乳癌患者复发和存活的流式细胞计量术的计算机程序和操作”，JNCI，Vol.75(3)，1985，pp.405-409。S期中肿瘤细胞高风险数量表示一种针对本发明使用的特别适当候选物。在抗孕激素(I)情况中，从强抗肿瘤作用，这通过标准动物模型显示(见实施例1-4)，及诱导编程性细胞死亡(见实施例5)和细胞周期停滞的该药剂的作用机制而显示出优势。
在本发明的另一方面中，提供了在细胞中诱导编程性细胞死亡的一种方法。该细胞优选是哺乳动物细胞及最优选人体细胞，而且所述方法可以体外或体内应用。优选地，编程性细胞死亡通过起始终末分化的机制诱导，例如通过给予抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物。在该方法中，可以给予细胞有效量的抗孕激素(I)或其药物学可接受的衍生物或类似物。例如在生长由给予雌二醇而刺激的T47D乳癌细胞系中，抗孕激素(I)导致细胞生长完全抑制，有效阈值浓度为10-9和10-8mol(见实施例6和图6)。尤其令人惊奇的是已知的抗孕激素奥那斯酮在这种肿瘤模型中没有降低细胞生长的作用。因此，抗孕激素(I)在强力和效力方面比其它抗孕激素如奥那斯酮及抗雌激素如他莫昔芬及甚至纯化的抗雌激素如11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基)-丙氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17p-二醇更出色(WO 98/07740)。
抗孕激素(I)在细胞中诱导编程性细胞死亡的作用表明该抗孕激素(或其药物学可接受的衍生物或类似物)可以用于特别需要诱导编程性细胞死亡的病变宿主中，尤其激素依赖性病变宿主中。特别地，其可以用于这类疾病的治疗，如乳癌，卵巢癌，子宫内膜癌，骨髓瘤，无排卵性不孕，脑膜瘤，即主要发生自或由存在激素受体和/或激素依赖性途径影响的疾病。
抗孕激素，如抗孕激素(I)，因此可以进一步用于制备诱导编程性细胞死亡或细胞死亡的药物，以治疗激素依赖性疾病如上述疾病。
在实施例中进一步例证了本发明。应理解以下实施例是非限制性的。
结果在完整的对照动物中，观测到肿瘤进一步生长，而卵巢切除术在90％的动物中引起明显的肿瘤抑制。用抗孕激素(I)在2mg/kg或之上的剂量引起编程性细胞死亡明显产生，与对照组相比抑制肿瘤生长(见图2)。这里明显存在一剂量应答关系。用0.5mg/kg抗孕激素(I)处理不明显阻止肿瘤生长，在2mg/kg观测到最大诱导编程性细胞死亡并因此导致的生长抑制。在这组中，在50％大鼠中观测到完全肿瘤抑制。在这个实验中测试的最高剂量的抗孕激素(I)的作用(10mg/kg)与2mg/kg作用相似。奥那斯酮(5mg/kg，s.c.)在相似剂量比抗孕激素(I)明显效力低下。
结论在大鼠中DMBA诱导的乳腺肿瘤模型中，抗孕激素(I)在肿瘤细胞中强力诱导编程性细胞死亡，并因此在完整动物中完全抑制肿瘤生长。发现2mg/kg抗孕激素(I)对肿瘤细胞具有最大编程性细胞死亡效力。抗孕激素(I)在抑制肿瘤生长方面比奥那斯酮明显出色。实施例2在大鼠NMU诱导的乳癌模型中的肿瘤生长抑制材料和方法通过单次静脉内注射NMU(亚硝基甲脲，50mg/kg)在雌性Sprague-Dawley大鼠(得自Tierzucht Schnwalde，50-55天龄)中诱导肿瘤。从10天后开始，将具有至少一个确定肿瘤的大鼠通过以下方式治疗4周1)溶剂对照，2)在治疗开始时行卵巢切除术，3)抗孕激素(I)，1.0mg/kg/天，4)抗孕激素(I)，0.5mg/kg/天，及5)奥那斯酮，5mg/kg/天。通过每周用测径器测定肿瘤面积的变化(与初始肿瘤大小的百分比)作为生长抑制参数。使用Kruskal Wallis-测试进行平均值组间差异的统计学分析。
结果在完整的对照动物中，观测到肿瘤进一步生长，而卵巢切除术引起完全肿瘤生长抑制。用抗孕激素(I)在0.5或1.0mg/kg剂量处理引起明显的肿瘤生长抑制，这是因为与对照组相比产生编程性细胞死亡(见图2)。奥那斯酮(5mg/kg)与低得多的剂量(0.5mg/kg)的抗孕激素(I)相比，效力也明显低下。
结论在大鼠NMU诱导的乳腺肿瘤模型中，因为抗孕激素(I)在肿瘤细胞中强力诱导编程性细胞死亡的能力，其完全抑制完整动物中肿瘤生长。两种剂量(1.0mg/kg和0.5mg/kg)的抗孕激素(I)对肿瘤细胞均具有明显的编程性细胞死亡作用。
实施例3在scid小鼠中人T47D乳癌异体移植材料和方法为雌性Fox Chase scid小鼠(M & B)补充雌二醇丸(InnovativeResearch of America)。将得自细胞培养物并悬浮于matrigel中的T47D乳癌细胞植入小鼠的腹股沟区。当肿瘤大小为大约25mm2时，开始治疗。持续治疗直至肿瘤被抑制。实验组为1)对照组(载体)，2)卵巢切除术，3)抗孕激素(I)，10mg/kg s.c。用测径器测定肿瘤大小。Kruskal Wallis-测试用于统计学分析平均值组间差异。
结果在T47D乳癌模型中，与对照组中肿瘤迅速生长相反，卵巢切除术引起肿瘤生长明显抑制。图3清晰示出s.c.应用10mg/kg抗孕激素(I)在肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡。抗孕激素(I)的作用与常规雌激素耗竭治疗(卵巢切除术)的作用几乎类似。
结论抗孕激素(I)在诱导编程性细胞死亡及因此抑制Fox Chasescid小鼠中人T47D乳癌异体移植物生长中的作用，可与据信为在这个模型中抑制乳癌生长的最有效方法的标准雌激素耗竭治疗(卵巢切除术)的作用相似。
实施例4在scid小鼠中人MCF-7乳癌异体移植材料和方法为雌性Fox Chase scid小鼠(M & B)补充雌二醇丸(InnovativeResearch of America)。将得自细胞培养物并悬浮于matrigel中的MCF7乳癌细胞植入小鼠的腹股沟区。当肿瘤大小为大约25mm2时，开始治疗。持续治疗直至肿瘤被抑制。实验组为1)对照组(载体)，2)卵巢切除术，3)抗孕激素(I)，10mg/kg s.c。用测径器测定肿瘤大小。Kruskal Wallis-测试用于统计学分析平均值组间差异。
结果在MCF7乳癌模型中，与对照组中肿瘤迅速生长相反，卵巢切除术引起肿瘤生长明显抑制。图4清晰示出s.c.应用10mg/kg抗孕激素(I)在肿瘤细胞中诱导编程性细胞死亡。抗孕激素(I)的作用与常规雌激素耗竭治疗(卵巢切除术)的作用几乎类似。
结论抗孕激素(I)在诱导编程性细胞死亡及因此抑制Fox Chasescid小鼠中人MCF7乳癌异体移植物生长中的作用，可与标准雌激素耗竭治疗(卵巢切除术)的作用相似。
实施例5大鼠中NMU诱导的乳癌(组织学，增殖指数和TUNEL分析)材料和方法通过单次静脉内注射NMU(亚硝基甲脲，50mg/kg)，在雌性Sprague-Dawley大鼠(得自Tierzucht Schnwalde，50-55天龄)中诱导肿瘤。将具有至少一个大小大于150mm2的确定肿瘤的大鼠通过以下方式治疗7天1)溶剂对照，2)在治疗开始时行卵巢切除术，3)抗孕激素(I)，3mg/kg s.c.，每日。在治疗结束时切下肿瘤，在福尔马林中固定，并包埋于石蜡中。对这些切除的肿瘤进行组织学，增殖指数和编程性细胞死亡诱导分析。
组织学针对组织学分析，将组织玻片HE染色并通过显微镜分析。
增殖指数为确定增殖指数，确定PCNA的表达。增殖细胞核抗原(PCNA)是与细胞周期相关的36kD核蛋白。在正常组织的增殖区室中发现核PCNA免疫反应性。使用一种识别固定和加工抗性表位的单克隆抗体研究其组织分布情况。
TUNEL(编程性细胞死亡测试)编程性细胞死亡的生物化学特征是基因组DNA降解，这是一种不可逆的事件，导致细胞死亡。这种特有的DNA片段化是核内切核酸酶激活的结果，其在位于核小体单位之间的位点选择性裂解DNA。这些DNA链断裂通过使用末端转脱氧核苷酰酶(TUNEL)用荧光素-dUTP酶标记3’-OH末端而检测(TUNEL代表末端转脱氧核苷酰酶介导的dUTP缺口末端标记，参见Gavrieli等，细胞生物学杂志119，493，1992)。掺入的荧光素使用抗荧光素抗体碱性磷酸酶缀合物随后通过碱性磷酸酶底物反应而检测。
结果组织学在用抗孕激素(I)治疗后，得自NMU肿瘤的组织切片出现通常由分泌物填充的导管和腺泡形成(图5A)。另外，肿瘤中腺体结构的容积率与对照组相比提高(图5B)。另外，抗孕激素(I)治疗的动物的乳腺肿瘤示出分化的形态学特征。
增殖指数在未治疗的NMU诱导的乳癌组织中PCNA免疫反应性较高(图5C未治疗的对照组)。具有PCNA免疫反应性的细胞数目通过在得自用抗孕激素(I)治疗的大鼠NMU诱导乳癌组织中诱导分化而降低(图5D)。这些数据表明在乳癌中，用抗孕激素治疗通过产生分化而降低增殖指数。
TUNEL(编程性细胞死亡)图5E表明与未治疗的对照组相比(图5F)，NMU诱导的乳癌组织中出现由抗孕激素(I)诱导的编程性细胞死亡。显而易见，单独的抗孕激素(I)就能在NMU诱导的乳癌组织中诱导编程性细胞死亡并因此抑制这些肿瘤生长。实施例6在T47D细胞系中抗孕激素(I)的体外抗增殖活性材料和方法将T47D细胞在补加0.1nM E2(雌二醇)加抗孕激素(I)的活性炭处理的血清中生长6天，更换一次培养基。在固定及随后用结晶紫染色后，记录吸光度，数值以未治疗对照组的吸光度为标准，如R.B.Lichtner，类固醇生物化学分子生物学杂志1999，71；181-189。与上述实施例5相似地进行TUNEL分析，唯一不同是代替组织切片，在此分析中使用在显微镜玻片上培养的细胞。
结果在这个T47D细胞系的体外测试中，抗孕激素(I)表现强力的肿瘤生长抑制活性，有效阈值浓度低如10-9至10-8mol/l，而抗孕激素奥那斯酮未示出任何抑制效应。即使纯化的抗雌激素11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基)丙氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇(WO 98/07740)的效力也明显低于抗孕激素(I)(见图6)。
结论本发明的抗孕激素(I)在非常低的浓度水平也诱导T47D细胞刺激的细胞生长完全抑制，并因此在强力和效力方面比其它测试的抗孕激素如奥那斯酮及纯化的抗雌激素11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基)丙氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)-三烯-3，17β-二醇更优异。
权利要求
1.抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮或其药物学可接受的衍生物或类似物在细胞中诱导编程性细胞死亡的应用。
2.权利要求1的应用，其中编程性细胞死亡的诱导由起始终末分化而引起。
3.前述任一权利要求的应用，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
4.权利要求3的应用，其中所述哺乳动物细胞是人体细胞。
5.前述任一权利要求的应用，其中所述细胞是肿瘤细胞。
6.权利要求5的应用，其中所述肿瘤是乳癌。
7.前述任一权利要求的应用，其中所述药物还包含一种抗雌激素。
8.抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮或其药物学可接受的衍生物或类似物在制备治疗一种类型癌症的药物中的应用，所述癌症类型中高风险指标是细胞周期S期的肿瘤细胞数目增加。
9.权利要求8的应用，其中所述疾病是乳癌。
10.在细胞中诱导编程性细胞死亡的方法，包括在体外给予细胞以有效量的抗孕激素11β-(4-乙酰苯基)-17β-羟基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮或其药物学可接受的衍生物或类似物。
11.权利要求10的方法，其中所述细胞是哺乳动物肿瘤细胞。
12.权利要求10或11的方法，其中所述细胞是乳癌细胞。
全文摘要
本发明涉及通过给予抗孕激素尤其抗孕激素11β－(4－乙酰苯基)－17β－羟基－17α－(1，1，2，2，2－五氟乙基)－雌－4，9－二烯－3－酮或其药物学可接受的衍生物或类似物在细胞尤其在乳癌细胞中诱导编程性细胞死亡的方法和应用。本发明还涉及高风险指标是细胞周期S期的肿瘤细胞数目增加的癌症的治疗，所述治疗包括一种抗孕激素，尤其抗孕激素11β－(4－乙酰苯基)－17β－羟基－17α－(1，1，2，2，2－五氟乙基)－雌－4，9－二烯－3－酮或其药物学可接受的衍生物或类似物。
文档编号A61P35/00GK1469749SQ01817569
公开日2004年1月21日 申请日期2001年10月17日 优先权日2000年10月18日
发明者延斯·霍夫曼, 罗斯玛丽·利希特纳, 格哈德·西迈斯特, 梅尔廷·施奈德, 乌尔丽克·富尔曼, 施奈德, 西迈斯特, 丽 利希特纳, 克 富尔曼, 延斯 霍夫曼 申请人:舍林股份公司
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