一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用的制作方法
专利名称：一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其
构建和应用。
背景技术：
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)为水产养殖生物重要病原菌，能够感染多种水产养殖 动物，包括鱼、虾、贝等。目前对于哈氏弧菌的防控依赖抗生素和免疫防治。由于抗生素对 环境以及人类健康的潜在危害性，其使用已逐渐在国际上受到限制。针对哈氏弧菌的疫苗 主要为简单的灭活疫苗，分泌型疫苗的应用尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 —种哈氏弧菌分泌型疫苗序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。
哈氏弧菌分泌型疫苗的构建 1)质粒pBSVhPl的构建以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩 增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5后在 含有安卡青霉素(Ap) 、5-溴-4-氯-3-吲哚-13 -D-乳糖苷和异丙基_ 13 -D-硫代半乳糖苷 的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，质粒为pBSVhPl ;
所述弓I物为Fl 1 5， -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGA TATCACTGGTTGCGCGCT-3，； 2)哈氏弧菌分泌型疫苗的构建将质粒pBSVhPl用Ndel/Xhol双酶切回收1. 2kb， 同时将质粒pBT3用Ndel/Xhol双酶切回收4. 3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温 连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小 时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No. l中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗 DH5 a /pTVPlM。 哈氏弧菌分泌型疫苗的应用将表达上述所得的序列表SEQ ID No. 1中的碱基序 列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养 至0D6。。为0. 8-l，而后离心收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4X 108cfu/ml，即为疫 苗菌悬液，所得疫苗菌悬液具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。 所述质粒DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至0D6。。为 0. 8-1为首先将DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；而后取 0. 1ml过夜培养后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap的LB液体培养基中，于28。C摇动 培养至OD,为O. 8-1。 将所述疫苗菌悬液lOOul腹腔注射于牙鲆体内，20天后再次将lOOul疫苗菌悬液 液腹腔注射于牙鲆。
本发明具有如下优点 1.高保护率。本发明的疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达90%。 2.制备简单。本发明的疫苗制备过程简单，只需常规的细菌培养，无需灭活处理等步骤。 3.无需佐剂。本发明的疫苗应用时不需如弗氏佐剂等有副作用的免疫剌激剂。
4.本发明构建的分泌型疫苗是将疫苗抗原基因通过一种载体菌表达并且以可溶 性重组蛋白的形式分泌至胞外，从而被免疫系统识别并产生相应的保护性免疫应答。本发 明疫苗相对灭活疫苗而言，转基因载体菌为基础的分泌型疫苗具有免疫效应强、重复性好、 操作简单、造价低廉。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法 1.质粒提取、DNA(PGR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆
使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相应试剂盒。 2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell : Molecular Cloning :A Laboratory Man皿al. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001); 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"北京，纽英伦生物技术有限公司"。
实施例1 哈氏弧菌分泌型疫苗为序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。序列表SEQ ID Nol
(a)序列特征 參长度1593bp 參类型碱基序列 參链型单链 參拓扑结构线性 (b)分子类型双链DNA (C)假设否 (d)反义否 (e)最初来源哈氏弧菌T4 (f)特异性名称Vhpl 哈氏弧菌分泌型疫苗的构建 1)质粒pBSVhPl的构建以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩 增，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s，51。C 60s，72。C 60s，5个循环后 改为94°C 40s，62°C 60s，72°C 60s，25个循环后再在72"C延伸反应10min。 PCR产物用天 根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自于"天根生化科技有限公司"，北 京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 a后在含有100ug/ml安卡青霉素 (Ap) 、40ug/ml Xgal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P _D_乳糖苷)和24ug/ml异丙基-P _D_硫代 半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒 pBSVhPl ; 2)哈氏弧菌分泌型疫苗的构建将质粒pBSVhPl用Ndel/Xhol双酶切回收 1. 2kb片段，同时将质粒pBT3(可按照此文献进行构建，Zhang W， Sun K， Cheng S， Sun L Characterization of DegQvh，a serine protease and a protective immimogenfrom a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl Environ Microbiol 2008 ;74 :6254 62.并也 可由公众在市面购得)用Ndel/XhoI双酶切回收4. 3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于 室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有Ap (100ug/ml)的LB固体培养 基上培养24小时，挑取1个转化子，命名为DH5 a /pTVPlM。将DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ ml Ap的LB培养基中过夜培养，提取质粒，用引物BRF2(5 '-ATAGGGGTTCCGCGCACA-3')测 序，测序结果证明DH5 a /pTVPlM确实含有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列。
所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97.5%蒸馏水；其中所述菌株T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 1985，分类命名为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。
所述弓I物为Fl 1 5， -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGA TATCACTGGTTGCGCGCT-3，。
实施例2 疫苗菌悬液将上述所得的表达序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的哈氏弧菌分
5泌型疫苗菌株DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0. 1ml过 夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap(50ug/ml)的LB液体培养基中，于28。C下转速 160rpm摇动培养至0D6。。为0. 8_1，而后将细菌培养液离心(5000g， 4°C ， 10min)，收集菌体， 将其悬浮于PBS中至终浓度为4X 108cfu/ml，即为疫苗制备液。 疫苗对照液将质粒pBT3用Hanahan方法转化入DH5 a ，得转化子DH5 a /pBT3。 将DH5 a /pBT3在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0. 1ml过夜后的培养 液，将其加入10ml新鲜的含Ap(50ug/ml)的LB液体培养基中，于28。C下转速160rpm摇动 培养至0D6。。为0. 8-1，而后将细菌培养液离心(同上)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终 浓度为4X 108cfu/ml，即为疫苗对照液。 所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl，O. 02 % KCl，O. 358 % Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04。
实施例3 将上述疫苗菌悬液免疫注射将80条牙鲆(每条重约10g)随机分为2组，每组
40条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul疫苗菌悬液，将
B组的每条鱼分别腹腔注射lOOul疫苗对照液。20天后，再次将A组的每条鱼分别腹腔注
射lOOul疫苗菌悬液，将B组的每条鱼分别腹腔注射lOOul疫苗对照液。 哈氏弧菌悬液的制备在LB培养基中分别培养哈氏弧菌T4至0D6。。为0. 6，然后离
心(5000g，4°C，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为8X 107cfu/ml，即为哈氏
弧菌悬液。 疫苗的免疫保护效应检测将上述免疫注射后的牙鲆第35天，用上述的哈氏弧菌 悬液腹腔注射于上述的A和B组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察 并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，3条；B组，30条。利 用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS): RPS = 100X (l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故DH5 a / pTVPlM针对哈氏弧菌的免疫保护效率为90%。 由此得出DH5 a /pTVPlM能够高效地保护牙鲆抵御哈氏弧菌侵染。 序列表 SEQUENCE LISTING 〈110〉中国科学院海洋研究所 〈120〉 一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用 〈130〉 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1 〈210>1 〈211>1593 〈212>DNA 〈213〉哈氏弧菌T4 〈220〉 〈221>CDS
6
〈22:》(1〕..(1593)〈223〉〈400>13tgtta朋getaetaElgttgttgtateacc tcg gca etc tgtttc48MetLeuLysLysLeuLeuSerCysCyslieThr Ser Ala Leu CysPhe151015cattcttctetcgetttttcgc朋tcgg朋etc CC3朋t gatgcg96HisSerSerLeuAlaPheSerGinSerThrGlu Leu Pro Asn AspAla202530gatttagcgCElgcctgcgteactgEltgctt gcg cct gaa gacgtc144AspLeuAlaGinThrProAlaSerLeuMetLeu Ala Pro Glu AspVal354045gccategetgatcgttatategttgt￡ltttcat caa cct caa atgEltg192AlalieAlaAspArgTyrlieValValPheHis Gin Pro Gin MetMet505560Eltg朋t朋tteacttg朋ttaCElgCElgttcc朋c朋tct gtgg￡lC240MetAsnAsnSerLeuGluLeuGinGinPheThr Gin Gin Ser ValAsp65707580Cg￡lEltgtctggtttgtacteaateg朋gtgg朋tea gte ttc gac朋t288ArgMetSerGlyLeuTyrSerlieGluValGlu Ser Val Phe AspAsh859095tcgateageggtttcgttgcg3CgttagetCCt g朋C3g Ctg 333gcg336SerlieSerGlyPheValAlaThrLeuAlaPro Glu Gin Leu LysAla100105110ttacgtgetgatCC3cgtgttg朋tacategag g3C 3g3 attctt384LeuArgAlaAspProArgValGluTyrlieGlu Gin Asp Arg lieLeu115120125etag￡lCCC3ategtctcggCElg朋gteaac c朋agt朋t gca att432ThrLeuAspProlieValSerAlaGluValAsn Gin Ser Asn Alalie130135140tgggggetag￡lCCg￡lattgatc朋cgtElgtctg cct etc aat aac aat480TrpGlyLeuAsp Arg lie Asp Gin Arg Ser Leu Pro Leu Asn Asn Asn145150155160tacagegcc朋ctttgat3Cgggcgtcacg get tec gtt ate gat528TyrSerAlaAsn Phe Asp Gly Thr Gly ValThr Ala Tyr Val lie Asp1651701753Cgggtgtg朋c朋ctcgC3Cgttg朋tttgcc gga cgc tec att tcg576ThrGlyValAsn Asn Ser His Val Glu Phe Ala Gly Arg Ser lieSer180185190tatg￡lCtttgtcg￡lC朋tgatgcg gat gcc agt gac tgt aat gga624GlyTyrAspPheValAspAsnAspAla Asp Ala Ser Asp Cys Asn Gly195200205C3CggcC3Cgtegcgggc3Cgate ggc gga tct ttg tat ggc gtg672HisGlyThrHisValAlaGlyThrlie Gly Gly Ser Leu Tyr Gly Val210215220gCEl朋g朋cgtgageattgttggtgtc aga gtg ctt age tgt tct ggc720AlaLysAsnValSerlieValGlyVal Arg Val Leu Ser Cys Ser Gly225230235 240teaggttea3Cgtecggcgttattgcg ggt gtt gat tgg gte get gcc768SerGlySerThrSerGlyVallieAla Gly Val Asp Trp Val Ala Ala245250 255朋tgettctggtcctteggttgccaac atg agt tta ggt ggt ggg caa816AsnAlaSerGlyProSerValAlaAsn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gin260265 270tctgttgetcttgatagegCElgtgcaa age gca gtt cag tec ggc gtt864SerValAlaLeuAspSerAlaValGin Ser Ala Val Gin Ser Gly Val275280285agetttEltgcttgCElgetggt朋ctec aat get gat gcc tgt aac tac912SerPheMetLeuAlaAlaGlyAsnSer Asn Ala Asp Ala Cys Asn Tyr290295300teacctgcgcgtgtttcttctggtgtt act gtc ggc teg acg acg age960SerProAlaArgValSerSerGlyVal Thr Val Gly Ser Thr Thr Ser305310315 320tctg￡lCgCElcgttctElgttttteaaac tgg ggt age tgt gtc gat gtt1008SerAspAlaArgSerSerPheSerAsn Trp Gly Ser Cys Val Asp Val325330 335tttgetCC3teac朋ate朋gtct get tgg tat gat ggc ggt tat1056PheAlaProGlySerGinlieLysSer Ala Trp Tyr Asp Gly Gly Tyr340345 350朋g3CgateElgtggcactteaEltggca acc cca cat gtt get ggt gtt1104LysThrlieSerGlyThrSerMetAla Thr Pro His Val Ala Gly Val355360365getgcgctttatetcc朋g朋朋cagt gca ctt tea cca age caa gtg1152AlaAlaLeuTyrLeuGinGluAsnSer Ala Leu Ser Pro Ser Gin Val370375380g朋gcgctgategttgagcgcgCEl3CC 3gt ggC朋3 gtC 3Cg g3t1200GluAlaLeulieValGluArgAlaThr Ser Gly Lys Val Thr Asp Thr385390395 400
3gaggcElgtgtg朋taaa ttg ctttac agt tte acg gat gcc gat tgt1248ArgGlySerValAsnLys Leu LeuTyr Ser Leu Thr Asp Ala Asp Cys405410 415ggtc朋gattgtggtggt cct gatCC3 3Cg CC3 g3C CC3 g朋ggt 3331296GlyGinAspCysGlyGly Pro AspPro Thr Pro Asp Pro Glu Gly Lys420425 430ttg3CCtctggtgtgcca gtg agtggc ttg age ggt tea aca ggg cag1344LeuThrSerGlyValPro Val SerGly Leu Ser Gly Ser Thr Gly Gin435440445gt￡lgettattactacgte gat gteg朋gca ggg c朋cgt cte acg gte1392ValAlaTyrTyrTyrVal Asp ValGlu Ala Gly Gin Arg Leu Thr Val450455460c朋Eltgtatggcggcage ggt gatgca gat ttg tat eta cgc ttt ggc1440GinMetTyrGlyGlySer Gly AspAla Asp Leu Tyr Leu Arg Phe Gly465470475 ■tct朋gCC33Cgattaat get tgggat tgt cga cct ttc aga tac ggc1488SerLysProThrlieAsn Ala TrpAsp Cys Arg Pro Phe Arg Tyr Gly485490 495朋c3gtgagtgtgtt朋tgcc act caa age gga cgt tac cac1536AsnSerGluThrCysThr Val AsnAla Thr Gin Ser Gly Arg Tyr His500505 510gt￡lEltgattc朋ggctat tea agetec朋c ggt gte age ate c朋gcg1584ValMetlieGinGlyTyr Ser SerTyr Asn Gly Val Ser lie Gin Ala515520525Elgttacteg1593SerTyr530〈210>2〈211>530〈212>PRT〈213〉哈氏弧菌T4〈400>2MetLeuLysLysLeuLeu Ser CysCys lie Thr Ser Ala Leu Cys Phe1510 15HisSerSerLeuAlaPhe Ser GinSer Thr Glu Leu Pro Asn Asp Ala2025 30AspLeuAlaGinThrPro Ala SerLeu Met Leu Ala Pro Glu Asp Val354045AlalieAlaAspArgTyr lie ValVal Phe His Gin Pro Gin Met Met
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AlaAlaLeuTyrLeuGinGluAsnSerAlaLeuSerProSerGinVal370375380GluAlaLeulieValGluArgAlaThrSerGlyLysValThrAspThr385390395400ArgGlySerValAsnLysLeuLeuTyrSerLeuThrAspAlaAspCys405410415GlyGinAspCysGlyGlyProAspProThrProAspProGluGlyLys420425430LeuThrSerGlyValProValSerGlyLeuSerGlySerThrGlyGin435440445ValAlaTyrTyrTyrValAspValGluAlaGlyGinArgLeuThrVal450455460GinMetTyrGlyGlySerGlyAspAlaAspLeuTyrLeuArgPheGly465470475■SerLysProThrlieAsnAlaTrpAspCysArgProPheArgTyrGly485490495AsnSerGluThrCysThrValAsnAlaThrGinSerGlyArgTyrHis500505510ValMetlieGinGlyTyrSerSerTyrAsnGlyValSerlieGinAla515520525SerTyr530
1权利要求
一种哈氏弧菌分泌型疫苗，其特征在于序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。
2. —种按权利要求1所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的构建，其特征在于1) 质粒pBSVhPl的构建以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，PCR 产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5后在含有安 卡青霉素(Ap) 、5-溴-4-氯-3-吲哚-13 -D-乳糖苷和异丙基-13 -D-硫代半乳糖苷的LB 固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，质粒为pBSVhP 1 ;所述引物为F115' -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGATATCA CTGGTTGCGCGCT-3，；2) 哈氏弧菌分泌型疫苗的构建将质粒pBSVhPl用Ndel/Xhol双酶切回收1. 2kb，同时 将质粒pBT3用Ndel/Xhol双酶切回收4. 3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接 2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选 出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗DH5 a / pTVPlM。
3. —种按权利要求1所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于将表达上述所 得的序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5/pTVPlM在含有 50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至0D6。。为0. 8_1，而后离心收集菌体，将其悬浮于PBS 中至终浓度为4xl08cfU/ml，即为疫苗菌悬液，所得疫苗菌悬液具有对哈氏弧菌免疫保护的 作用。
4. 按权利要求3所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于所述质粒DH5 a / pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至OD,为O. 8-1为首先将DH5 a /pTVPlM 在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；而后取0. 1ml过夜培养后的培养液，将其 加入10ml新鲜的含Ap的LB液体培养基中，于28t:摇动培养至0D6。。为0. 8-1。
5. 按权利要求3所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于将所述疫苗菌悬液 lOOul腹腔注射于牙鲆体内，20天后再次将lOOul疫苗菌悬液液腹腔注射于牙鲆。
全文摘要
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其制备和应用。具体为分泌型疫苗为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其构建为以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，产物与pBS-T于室温连接，将质粒pBSVhP1用NdeI/XhoI双酶切回收1.2kb，同时将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗。所得疫苗菌具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。本发明的疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达90％。制备过程简单，无需灭活处理等步骤，且不需任何佐剂。
文档编号A61P31/04GK101780273SQ20091022980
公开日2010年7月21日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者孙黎, 张卫卫, 程爽 申请人:中国科学院海洋研究所
技术领域：
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其
构建和应用。
背景技术：
哈氏弧菌(Vibrio harveyi)为水产养殖生物重要病原菌，能够感染多种水产养殖 动物，包括鱼、虾、贝等。目前对于哈氏弧菌的防控依赖抗生素和免疫防治。由于抗生素对 环境以及人类健康的潜在危害性，其使用已逐渐在国际上受到限制。针对哈氏弧菌的疫苗 主要为简单的灭活疫苗，分泌型疫苗的应用尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 —种哈氏弧菌分泌型疫苗序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。
哈氏弧菌分泌型疫苗的构建 1)质粒pBSVhPl的构建以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩 增，PCR产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5后在 含有安卡青霉素(Ap) 、5-溴-4-氯-3-吲哚-13 -D-乳糖苷和异丙基_ 13 -D-硫代半乳糖苷 的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，质粒为pBSVhPl ;
所述弓I物为Fl 1 5， -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGA TATCACTGGTTGCGCGCT-3，； 2)哈氏弧菌分泌型疫苗的构建将质粒pBSVhPl用Ndel/Xhol双酶切回收1. 2kb， 同时将质粒pBT3用Ndel/Xhol双酶切回收4. 3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温 连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小 时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No. l中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗 DH5 a /pTVPlM。 哈氏弧菌分泌型疫苗的应用将表达上述所得的序列表SEQ ID No. 1中的碱基序 列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养 至0D6。。为0. 8-l，而后离心收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为4X 108cfu/ml，即为疫 苗菌悬液，所得疫苗菌悬液具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。 所述质粒DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至0D6。。为 0. 8-1为首先将DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；而后取 0. 1ml过夜培养后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap的LB液体培养基中，于28。C摇动 培养至OD,为O. 8-1。 将所述疫苗菌悬液lOOul腹腔注射于牙鲆体内，20天后再次将lOOul疫苗菌悬液 液腹腔注射于牙鲆。
本发明具有如下优点 1.高保护率。本发明的疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达90%。 2.制备简单。本发明的疫苗制备过程简单，只需常规的细菌培养，无需灭活处理等步骤。 3.无需佐剂。本发明的疫苗应用时不需如弗氏佐剂等有副作用的免疫剌激剂。
4.本发明构建的分泌型疫苗是将疫苗抗原基因通过一种载体菌表达并且以可溶 性重组蛋白的形式分泌至胞外，从而被免疫系统识别并产生相应的保护性免疫应答。本发 明疫苗相对灭活疫苗而言，转基因载体菌为基础的分泌型疫苗具有免疫效应强、重复性好、 操作简单、造价低廉。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。 在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法 1.质粒提取、DNA(PGR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收、细菌基因组DNA提取皆
使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相应试剂盒。 2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell : Molecular Cloning :A Laboratory Man皿al. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001); 3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于"北京，纽英伦生物技术有限公司"。
实施例1 哈氏弧菌分泌型疫苗为序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。序列表SEQ ID Nol
(a)序列特征 參长度1593bp 參类型碱基序列 參链型单链 參拓扑结构线性 (b)分子类型双链DNA (C)假设否 (d)反义否 (e)最初来源哈氏弧菌T4 (f)特异性名称Vhpl 哈氏弧菌分泌型疫苗的构建 1)质粒pBSVhPl的构建以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩 增，PCR条件为94°C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s，51。C 60s，72。C 60s，5个循环后 改为94°C 40s，62°C 60s，72°C 60s，25个循环后再在72"C延伸反应10min。 PCR产物用天 根DNA产物纯化试剂盒纯化后与PCR克隆载体pBS-T (购自于"天根生化科技有限公司"，北 京)于室温连接2-4小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 a后在含有100ug/ml安卡青霉素 (Ap) 、40ug/ml Xgal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P _D_乳糖苷)和24ug/ml异丙基-P _D_硫代 半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，即为质粒 pBSVhPl ; 2)哈氏弧菌分泌型疫苗的构建将质粒pBSVhPl用Ndel/Xhol双酶切回收 1. 2kb片段，同时将质粒pBT3(可按照此文献进行构建，Zhang W， Sun K， Cheng S， Sun L Characterization of DegQvh，a serine protease and a protective immimogenfrom a pathogenic Vibrio harveyi strain. Appl Environ Microbiol 2008 ;74 :6254 62.并也 可由公众在市面购得)用Ndel/XhoI双酶切回收4. 3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于 室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 a后在含有Ap (100ug/ml)的LB固体培养 基上培养24小时，挑取1个转化子，命名为DH5 a /pTVPlM。将DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ ml Ap的LB培养基中过夜培养，提取质粒，用引物BRF2(5 '-ATAGGGGTTCCGCGCACA-3')测 序，测序结果证明DH5 a /pTVPlM确实含有序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列。
所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠， 97.5%蒸馏水；其中所述菌株T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 1985，分类命名为哈氏弧菌(Vibrio harveyi)。
所述弓I物为Fl 1 5， -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGA TATCACTGGTTGCGCGCT-3，。
实施例2 疫苗菌悬液将上述所得的表达序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的哈氏弧菌分
5泌型疫苗菌株DH5 a /pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0. 1ml过 夜后的培养液，将其加入10ml新鲜的含Ap(50ug/ml)的LB液体培养基中，于28。C下转速 160rpm摇动培养至0D6。。为0. 8_1，而后将细菌培养液离心(5000g， 4°C ， 10min)，收集菌体， 将其悬浮于PBS中至终浓度为4X 108cfu/ml，即为疫苗制备液。 疫苗对照液将质粒pBT3用Hanahan方法转化入DH5 a ，得转化子DH5 a /pBT3。 将DH5 a /pBT3在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；取0. 1ml过夜后的培养 液，将其加入10ml新鲜的含Ap(50ug/ml)的LB液体培养基中，于28。C下转速160rpm摇动 培养至0D6。。为0. 8-1，而后将细菌培养液离心(同上)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终 浓度为4X 108cfu/ml，即为疫苗对照液。 所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl，O. 02 % KCl，O. 358 % Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04。
实施例3 将上述疫苗菌悬液免疫注射将80条牙鲆(每条重约10g)随机分为2组，每组
40条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别腹腔注射100ul疫苗菌悬液，将
B组的每条鱼分别腹腔注射lOOul疫苗对照液。20天后，再次将A组的每条鱼分别腹腔注
射lOOul疫苗菌悬液，将B组的每条鱼分别腹腔注射lOOul疫苗对照液。 哈氏弧菌悬液的制备在LB培养基中分别培养哈氏弧菌T4至0D6。。为0. 6，然后离
心(5000g，4°C，10min)。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为8X 107cfu/ml，即为哈氏
弧菌悬液。 疫苗的免疫保护效应检测将上述免疫注射后的牙鲆第35天，用上述的哈氏弧菌 悬液腹腔注射于上述的A和B组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的20天中，每天观察 并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，3条；B组，30条。利 用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS): RPS = 100X (l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)故DH5 a / pTVPlM针对哈氏弧菌的免疫保护效率为90%。 由此得出DH5 a /pTVPlM能够高效地保护牙鲆抵御哈氏弧菌侵染。 序列表 SEQUENCE LISTING 〈110〉中国科学院海洋研究所 〈120〉 一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其构建和应用 〈130〉 〈160>2 〈170>PatentIn version 3. 1 〈210>1 〈211>1593 〈212>DNA 〈213〉哈氏弧菌T4 〈220〉 〈221>CDS
6
〈22:》(1〕..(1593)〈223〉〈400>13tgtta朋getaetaElgttgttgtateacc tcg gca etc tgtttc48MetLeuLysLysLeuLeuSerCysCyslieThr Ser Ala Leu CysPhe151015cattcttctetcgetttttcgc朋tcgg朋etc CC3朋t gatgcg96HisSerSerLeuAlaPheSerGinSerThrGlu Leu Pro Asn AspAla202530gatttagcgCElgcctgcgteactgEltgctt gcg cct gaa gacgtc144AspLeuAlaGinThrProAlaSerLeuMetLeu Ala Pro Glu AspVal354045gccategetgatcgttatategttgt￡ltttcat caa cct caa atgEltg192AlalieAlaAspArgTyrlieValValPheHis Gin Pro Gin MetMet505560Eltg朋t朋tteacttg朋ttaCElgCElgttcc朋c朋tct gtgg￡lC240MetAsnAsnSerLeuGluLeuGinGinPheThr Gin Gin Ser ValAsp65707580Cg￡lEltgtctggtttgtacteaateg朋gtgg朋tea gte ttc gac朋t288ArgMetSerGlyLeuTyrSerlieGluValGlu Ser Val Phe AspAsh859095tcgateageggtttcgttgcg3CgttagetCCt g朋C3g Ctg 333gcg336SerlieSerGlyPheValAlaThrLeuAlaPro Glu Gin Leu LysAla100105110ttacgtgetgatCC3cgtgttg朋tacategag g3C 3g3 attctt384LeuArgAlaAspProArgValGluTyrlieGlu Gin Asp Arg lieLeu115120125etag￡lCCC3ategtctcggCElg朋gteaac c朋agt朋t gca att432ThrLeuAspProlieValSerAlaGluValAsn Gin Ser Asn Alalie130135140tgggggetag￡lCCg￡lattgatc朋cgtElgtctg cct etc aat aac aat480TrpGlyLeuAsp Arg lie Asp Gin Arg Ser Leu Pro Leu Asn Asn Asn145150155160tacagegcc朋ctttgat3Cgggcgtcacg get tec gtt ate gat528TyrSerAlaAsn Phe Asp Gly Thr Gly ValThr Ala Tyr Val lie Asp1651701753Cgggtgtg朋c朋ctcgC3Cgttg朋tttgcc gga cgc tec att tcg576ThrGlyValAsn Asn Ser His Val Glu Phe Ala Gly Arg Ser lieSer180185190tatg￡lCtttgtcg￡lC朋tgatgcg gat gcc agt gac tgt aat gga624GlyTyrAspPheValAspAsnAspAla Asp Ala Ser Asp Cys Asn Gly195200205C3CggcC3Cgtegcgggc3Cgate ggc gga tct ttg tat ggc gtg672HisGlyThrHisValAlaGlyThrlie Gly Gly Ser Leu Tyr Gly Val210215220gCEl朋g朋cgtgageattgttggtgtc aga gtg ctt age tgt tct ggc720AlaLysAsnValSerlieValGlyVal Arg Val Leu Ser Cys Ser Gly225230235 240teaggttea3Cgtecggcgttattgcg ggt gtt gat tgg gte get gcc768SerGlySerThrSerGlyVallieAla Gly Val Asp Trp Val Ala Ala245250 255朋tgettctggtcctteggttgccaac atg agt tta ggt ggt ggg caa816AsnAlaSerGlyProSerValAlaAsn Met Ser Leu Gly Gly Gly Gin260265 270tctgttgetcttgatagegCElgtgcaa age gca gtt cag tec ggc gtt864SerValAlaLeuAspSerAlaValGin Ser Ala Val Gin Ser Gly Val275280285agetttEltgcttgCElgetggt朋ctec aat get gat gcc tgt aac tac912SerPheMetLeuAlaAlaGlyAsnSer Asn Ala Asp Ala Cys Asn Tyr290295300teacctgcgcgtgtttcttctggtgtt act gtc ggc teg acg acg age960SerProAlaArgValSerSerGlyVal Thr Val Gly Ser Thr Thr Ser305310315 320tctg￡lCgCElcgttctElgttttteaaac tgg ggt age tgt gtc gat gtt1008SerAspAlaArgSerSerPheSerAsn Trp Gly Ser Cys Val Asp Val325330 335tttgetCC3teac朋ate朋gtct get tgg tat gat ggc ggt tat1056PheAlaProGlySerGinlieLysSer Ala Trp Tyr Asp Gly Gly Tyr340345 350朋g3CgateElgtggcactteaEltggca acc cca cat gtt get ggt gtt1104LysThrlieSerGlyThrSerMetAla Thr Pro His Val Ala Gly Val355360365getgcgctttatetcc朋g朋朋cagt gca ctt tea cca age caa gtg1152AlaAlaLeuTyrLeuGinGluAsnSer Ala Leu Ser Pro Ser Gin Val370375380g朋gcgctgategttgagcgcgCEl3CC 3gt ggC朋3 gtC 3Cg g3t1200GluAlaLeulieValGluArgAlaThr Ser Gly Lys Val Thr Asp Thr385390395 400
3gaggcElgtgtg朋taaa ttg ctttac agt tte acg gat gcc gat tgt1248ArgGlySerValAsnLys Leu LeuTyr Ser Leu Thr Asp Ala Asp Cys405410 415ggtc朋gattgtggtggt cct gatCC3 3Cg CC3 g3C CC3 g朋ggt 3331296GlyGinAspCysGlyGly Pro AspPro Thr Pro Asp Pro Glu Gly Lys420425 430ttg3CCtctggtgtgcca gtg agtggc ttg age ggt tea aca ggg cag1344LeuThrSerGlyValPro Val SerGly Leu Ser Gly Ser Thr Gly Gin435440445gt￡lgettattactacgte gat gteg朋gca ggg c朋cgt cte acg gte1392ValAlaTyrTyrTyrVal Asp ValGlu Ala Gly Gin Arg Leu Thr Val450455460c朋Eltgtatggcggcage ggt gatgca gat ttg tat eta cgc ttt ggc1440GinMetTyrGlyGlySer Gly AspAla Asp Leu Tyr Leu Arg Phe Gly465470475 ■tct朋gCC33Cgattaat get tgggat tgt cga cct ttc aga tac ggc1488SerLysProThrlieAsn Ala TrpAsp Cys Arg Pro Phe Arg Tyr Gly485490 495朋c3gtgagtgtgtt朋tgcc act caa age gga cgt tac cac1536AsnSerGluThrCysThr Val AsnAla Thr Gin Ser Gly Arg Tyr His500505 510gt￡lEltgattc朋ggctat tea agetec朋c ggt gte age ate c朋gcg1584ValMetlieGinGlyTyr Ser SerTyr Asn Gly Val Ser lie Gin Ala515520525Elgttacteg1593SerTyr530〈210>2〈211>530〈212>PRT〈213〉哈氏弧菌T4〈400>2MetLeuLysLysLeuLeu Ser CysCys lie Thr Ser Ala Leu Cys Phe1510 15HisSerSerLeuAlaPhe Ser GinSer Thr Glu Leu Pro Asn Asp Ala2025 30AspLeuAlaGinThrPro Ala SerLeu Met Leu Ala Pro Glu Asp Val354045AlalieAlaAspArgTyr lie ValVal Phe His Gin Pro Gin Met Met
505560MetAsnAsnSerLeuGluLeuGinGinPheThrGinGinSerValAsp65707580ArgMetSerGlyLeuTyrSerlieGluValGluSerValPheAspAsn859095SerlieSerGlyPheValAlaThrLeuAlaProGluGinLeuLysAla100105110LeuArgAlaAspProArgValGluTyrlieGluGinAspArglieLeu115120125ThrLeuAspProlieValSerAlaGluValAsnGinSerAsnAlalie130135140TrpGlyLeuAspArglieAspGinArgSerLeuProLeuAsnAsnAsn145150155160TyrSerAlaAsnPheAspGlyThrGlyValThrAlaTyrVallieAsp165170175ThrGlyValAsnAsnSerHisValGluPheAlaGlyArgSerlieSer180185190GlyTyrAspPheValAspAsnAspAlaAspAlaSerAspCysAsnGly195200205HisGlyThrHisValAlaGlyThrlieGlyGlySerLeuTyrGlyVal210215220AlaLysAsnValSerlieValGlyValArgValLeuSerCysSerGly225230235240SerGlySerThrSerGlyVallieAlaGlyValAspTrpValAlaAla245250255AsnAlaSerGlyProSerValAlaAsnMetSerLeuGlyGlyGlyGin260265270SerValAlaLeuAspSerAlaValGinSerAlaValGinSerGlyVal275280285SerPheMetLeuAlaAlaGlyAsnSerAsnAlaAspAlaCysAsnTyr290295300SerProAlaArgValSerSerGlyValThrValGlySerThrThrSer305310315320SerAspAlaArgSerSerPheSerAsnTrpGlySerCysValAspVal325330335PheAlaProGlySerGinlieLysSerAlaTrpTyrAspGlyGlyTyr340345350LysThrlieSerGlyThrSerMetAlaThrProHisValAlaGlyVal355360365
AlaAlaLeuTyrLeuGinGluAsnSerAlaLeuSerProSerGinVal370375380GluAlaLeulieValGluArgAlaThrSerGlyLysValThrAspThr385390395400ArgGlySerValAsnLysLeuLeuTyrSerLeuThrAspAlaAspCys405410415GlyGinAspCysGlyGlyProAspProThrProAspProGluGlyLys420425430LeuThrSerGlyValProValSerGlyLeuSerGlySerThrGlyGin435440445ValAlaTyrTyrTyrValAspValGluAlaGlyGinArgLeuThrVal450455460GinMetTyrGlyGlySerGlyAspAlaAspLeuTyrLeuArgPheGly465470475■SerLysProThrlieAsnAlaTrpAspCysArgProPheArgTyrGly485490495AsnSerGluThrCysThrValAsnAlaThrGinSerGlyArgTyrHis500505510ValMetlieGinGlyTyrSerSerTyrAsnGlyValSerlieGinAla515520525SerTyr530
1权利要求
一种哈氏弧菌分泌型疫苗，其特征在于序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。
2. —种按权利要求1所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的构建，其特征在于1) 质粒pBSVhPl的构建以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，PCR 产物纯化后与PCR克隆载体pBS-T于室温连接，连接混合液转化大肠杆菌DH5后在含有安 卡青霉素(Ap) 、5-溴-4-氯-3-吲哚-13 -D-乳糖苷和异丙基-13 -D-硫代半乳糖苷的LB 固体培养基上培养18小时，筛选出白色转化子，提取质粒，质粒为pBSVhP 1 ;所述引物为F115' -CCCGGGCATATGTTAAAGAAACTACTAAGTTGT-3'和R85' -CTCGAGGATATCA CTGGTTGCGCGCT-3，；2) 哈氏弧菌分泌型疫苗的构建将质粒pBSVhPl用Ndel/Xhol双酶切回收1. 2kb，同时 将质粒pBT3用Ndel/Xhol双酶切回收4. 3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接 2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选 出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗DH5 a / pTVPlM。
3. —种按权利要求1所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于将表达上述所 得的序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗菌株DH5/pTVPlM在含有 50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至0D6。。为0. 8_1，而后离心收集菌体，将其悬浮于PBS 中至终浓度为4xl08cfU/ml，即为疫苗菌悬液，所得疫苗菌悬液具有对哈氏弧菌免疫保护的 作用。
4. 按权利要求3所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于所述质粒DH5 a / pTVPlM在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中培养至OD,为O. 8-1为首先将DH5 a /pTVPlM 在含有50ug/ml Ap的LB液体培养基中过夜培养；而后取0. 1ml过夜培养后的培养液，将其 加入10ml新鲜的含Ap的LB液体培养基中，于28t:摇动培养至0D6。。为0. 8-1。
5. 按权利要求3所述的哈氏弧菌分泌型疫苗的应用，其特征在于将所述疫苗菌悬液 lOOul腹腔注射于牙鲆体内，20天后再次将lOOul疫苗菌悬液液腹腔注射于牙鲆。
全文摘要
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种哈氏弧菌分泌型疫苗及其制备和应用。具体为分泌型疫苗为序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其构建为以哈氏弧菌T4为模板，用F11和R8为引物进行PCR扩增，产物与pBS-T于室温连接，将质粒pBSVhP1用NdeI/XhoI双酶切回收1.2kb，同时将质粒pBT3用NdeI/XhoI双酶切回收4.3kb片段，将这两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α后在含有Ap的LB固体培养基上培养24小时，筛选出白色转化子，即为表达序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的哈氏弧菌分泌型疫苗。所得疫苗菌具有对哈氏弧菌免疫保护的作用。本发明的疫苗对哈氏弧菌的免疫保护效率达90％。制备过程简单，无需灭活处理等步骤，且不需任何佐剂。
文档编号A61P31/04GK101780273SQ20091022980
公开日2010年7月21日 申请日期2009年10月30日 优先权日2009年10月30日
发明者孙黎, 张卫卫, 程爽 申请人:中国科学院海洋研究所
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