一种多西他赛脂质体无菌冻干制剂及其制备方法
专利名称：一种多西他赛脂质体无菌冻干制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种脂溶性药物多西他赛的脂质体无菌冻干 制剂及其制备方法。
背景技术：
法国罗纳普朗克 安乐公司于1986年研发成功的多西他赛(也称多烯紫杉醇)注 射液是继紫杉醇后又一种新型抗微管药物，1995年4月在墨西哥首先上市，随后在英、美、 法、意、德、日等国家上市。与紫杉醇相比，多西他赛细胞内外流较少且低剂量诱导细胞凋亡效应显著。许多 体外和临床研究均证实多西他赛对多种肿瘤细胞有放射增敏作用且不加重正常组织的放 射损伤。多西他赛的亲和性为紫杉醇的2倍，在体外抗癌活性试验中，多西他赛活性可达紫 杉醇的10倍，除此之外，多西他赛还具有较好的生物利用度，更高的细胞内浓度，更好的水 溶性及优异的抗癌广谱性，它不仅对乳腺癌、肺癌有很好的疗效，而且对患有头颈癌症、胃 癌、胰腺癌及软组织肿瘤的患者也具有较好的治疗作用。此外，多西他赛与某些抗肿瘤药物 联合使用时，还具有协同作用。同紫杉醇一样，多西他赛也不溶于水，临床用的注射用多西 他赛均为注射用浓缩溶液，为2只西林瓶包装，其中一瓶为多西他赛的吐温溶液，另一瓶为 乙醇水溶液，临床应用时先将乙醇水溶液注入多西他赛的吐温溶液中，充分摇晃，5分钟后 观察澄明后才能应用于患者，临床应用非常不方便。并且用药时多西他赛注射液一旦稀释 就必须立即使用，并在规定时间内用完，否则放置数小时即有多西他赛析出，被在线滤器过 滤导致药效降低。这样就迫切需要开发出新的多西他赛剂型，以增加其水溶性，避免由于复 合溶媒带来的过敏反应及其他毒副反应，方便临床应用。脂质体是靶向给药系统的一种新剂型，一直是药剂学研究的热点之一，它可以将 药物选择性地输送到肿瘤部位，发挥治疗作用，同时又不影响正常细胞、组织或器官的功 能，从而达到提高疗效、减少毒副作用的目的。脂质体具有类似于细胞膜的结构，构成双分 子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间。正由于脂质 体的这种类膜结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两亲的物质，它们被包入脂质体内 部水相、插入类脂双分子层或吸附连接在脂质体的表面。脂质体作为药物载体，既起到了对药物的保护作用，又提高了药物对机体特定部 位的靶向性，因此在提高药效方面具有很多优越的特性。主要表现在以下几个方面①脂质 体对机体无毒或毒副作用小，其脂质双分子层与生物膜有较大的相似性以及组织相溶性， 从而易于被组织吸收，提高了药物的吸收利用率；②脂质体包裹药物为物理过程，不改变药 物分子结构，不会破坏药物成分，而包裹的药物则可以避免被体内水解酶所破坏；③包裹后 的药物可以降低其对机体特定部位的毒性，减小药物使用量，使药物具有缓释和控释作用； ④与病毒载体不同，脂质体在宿主体内可以生物降解，无免疫原性；⑤在基因治疗上易于与 基因复合，有较高的靶向性，实现特定细胞的治疗；⑥材料廉价，便于大量制备。近十几年中已经有多篇关于多西他赛脂质体的文献报道，但至今没有一个产品成功的进入市场。究其原因，一是因为所制备的多西他赛脂质体质量不佳、稳定性较差，无法 长期保存；二是制备的多西他赛脂质体载药量较低，临床使用时需要同时输注大量的磷脂 等辅料；三是制备工艺复杂，只适合于实验室小规模制备，不适用大规模工业化生产。目前， 常用的脂质体制备方法包括以下几种方法(1)薄膜分散法将膜材及脂溶性药物溶于有机溶剂中，然后将有机溶剂蒸发，使 其在容器内壁上形成干燥的薄膜，将水溶性药物溶于缓冲液中，加入容器中不断搅拌，即得 脂质体。若想得到粒径更小的脂质体，则需要配合适当的后处理手段，如超声、高压均质以 及挤压等。(2)注入法将磷脂等类脂质及脂溶性药物溶于有机溶剂中，然后将此药液经注 射器缓缓注入一定温度的缓冲液(或含有水溶性药物)中，边加边搅拌，不断搅拌至溶剂除 尽，即得。此法制备工艺简单，易于操作，但脂质体质量不稳定。(3)跨膜梯度主动载药法跨膜梯度主动载药法包括PH梯度法和硫酸铵梯度法。 PH梯度法是通过调节脂质体内外水相的pH，使之形成一定的pH梯度差，利用药物在不同pH 溶液中解离状态的差异，以分子型透过外水相在内水相中形成离子型药物而被包封。硫酸 铵梯度法是先将硫酸铵包于脂质体内水相，然后通过透析、凝胶色谱或超滤的方法除去外 水相的硫酸铵。它是通过游离氨扩散到脂质体外，形成PH梯度，使药物集聚到脂质体内的。 跨膜梯度主动载药法适合于某些弱酸性及弱碱性药物，不适于难溶性药物及中性药物。(4)超声波分散法在薄膜分散法的基础上，再经超声波处理，可得到单室脂质体 (SUV)。超声技术有两种一种是将超声仪的探头浸入脂质体分散体中，此方法是小规模制 备SUV应用最广泛的方法；另外一种是将样品放在试管或烧杯内，再置于水浴式超声仪中。 由于超声探头处能量的释放会导致局部过热，因此必须有降温或散热措施。(5)冷冻干燥法(冻干再水化法)冷冻干燥法即将类脂高度分散于在水溶液中， 冷冻干燥，然后再分散到含药的水性递质中，形成脂质体。在一定范围内，脂质体的包封率 和粒度随冻融次数的增加而略有增大；冻融后搅拌或超声均可使聚集的脂质体解聚，从不 影响包封率的角度考虑，搅拌比超声处理更好。冻干再水化囊泡亦称为冻干再水化脂质体 (FRV)是由预制囊泡制备而成。此法包封率很高，甚至对于大分子也可实现较高的包封率。 干燥工艺使脂质双分子层和待包药物紧密接触，重新溶胀时对附着于脂质上的分子包封机 会较大。(6)逆向蒸发法(REV) =Szoka等于1978年提出了“REV脂质体”的制备工艺，即通 过逆向蒸发法制得内水相体积大且包封率高的脂质体。该方法是脂质体技术的一个突破， 因为其首次考虑到制备具有高内水相体积-脂质比特性的脂质体，且能够包封现有的大部 分水溶性物质。REV脂质体可由各种脂质和脂质混合物制得，其内水相体积-脂质比SUV高 约30倍，比多层脂质体或手摇法制得的囊泡高4倍。在低盐浓度和最佳条件下，有65%的 水相包封在囊泡中，甚至对大分子物质的包封率也很高。此法的基础是“反胶束”的形成， 即被磷脂单分子层稳定的小水滴分散于大量有机溶剂中。这种反胶束是由缓冲水相和有机 相的混合物经超声形成的，其中缓冲水相含有待包封入脂质体的水溶性分子，而有机相溶 有两亲性磷脂。缓慢除去有机相使反胶束转变形成黏稠凝胶状。在此过程的临界点，凝胶 塌陷，部分反胶束破裂。反胶束破裂而产生的过量磷脂，反过来在余下的胶束周围形成完整 的双分子层，形成囊泡即REV脂质体。REV脂质体主要是单室的，但是每个REV制剂中都有
4一些囊泡是由几个同心双分子层构成，从而组成寡层囊泡。REV脂质体的大小与磷脂类型及 其在有机溶剂中的溶解度、水相缓冲液和有机溶剂之间的表面张力以及水相、有机溶剂和 脂质的相对量等因素有关。目前，关于多西他赛脂质体的研究报道较多，处方组成及制备工艺多种多样。 如MariaL. I.等报道的多西他赛脂质体含药量较低，稳定性差，无法长期保存，不适合
IS M (preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing docetaxel.Journal of controlled release 91(2003), 417-429.)CN200510029634.0公开了一种多烯紫杉醇脂质体及其制备方法。但此方法制备的 液态脂质体室温下放置稳定性较差。而且制备工艺较为复杂，需要长时间蒸除有机溶剂，此 过程容易导致磷脂氧化产生溶血磷脂，不适合于工业化生产。CN200510110973. 1公开了一种紫杉烷脂质体冻干组合物及其制备方法，解决了低 成本地提高紫杉烷脂质体药物组合物的复溶后的稳定性问题。但其制备的脂质体处方中添 加了环糊精，在临床应用中存在一定风险。CN1846692A和CN101057831A公开了多烯紫杉醇长循环脂质体剂型及其制备方 法，显著提高了脂质体在体内的循环时间，降低了药物的毒性。但其未对冻干复溶后的脂质 体制剂的稳定性进行考察，特别是复溶后药物的包封率及粒径变化情况。另外，本发明曾按 照其公开的方法用外加法以蔗糖、葡萄糖以及甘露醇作为冻干保护剂，但无法得到外观较 佳的冻干产品，且复溶后脂质体无法重建，药物泄漏严重。CN101015M7A公开了一种多烯紫杉醇脂质体新剂型及其制备方法，但其灭菌方式 采用121摄氏度高压灭菌，这无疑会导致磷脂的大量氧化，药物在此剧烈的条件下稳定性 难以保证。另外，也未对灭菌后的制剂的稳定性进行考察。CN101317816A公开了一种多西他赛长循环制剂，以氯仿作为溶剂，毒性较大，另外 需要长时间旋蒸以去除残留溶剂，这在工业化生产中难以实施。并且未对冻干前后的脂质 体进行稳定性考察。CN101322699A和CN101322689A公开了一种多西他赛长循环脂质体及其冻干粉针 的制备方法。采用了带电荷的合成磷脂作为膜材，这些磷脂均为进口产品，价格昂贵且多数 不是注射级药用辅料。处方中添加抗氧化剂以保护磷脂不被氧化。另外，制备工艺复杂不适 合工业化生产，特别是以氯仿甲醇作为溶剂，毒性较大难以完全去除，安全性得不到保证。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种能够明显降低现有多西他赛 注射液毒副作用、制备工艺简单、易于工业化放大生产的多西他赛脂质体无菌冻干制剂。该 制剂药物包封率高、操作简单，是一种在溶液中能够稳定放置的纳米胶体系统，此制剂经冷 冻干燥后能够长期稳定放置，而且冻干制剂复溶后主要性状维持不变。本发明所制备的多西他赛脂质体制剂中选用的磷脂为天然磷脂，价格低廉、易于 获取。更重要的是所选择的天然磷脂中磷脂酰胆碱的含量适中，这对于最终脂质体制剂的 稳定性及药物的包封都是非常有利的。胆固醇对于脂质体制剂来说具有重要意义，其含量的多少一方面决定了脂质体在
5体内的稳定性，另一方面对药物在体内的释放行为具有重要影响。本发明在现有文献报道 的基础上适当降低了胆固醇的含量，这对于本发明具有重要意义。一方面通过减少胆固醇 的含量提高了脂溶性药物在脂质双分子层中的载药量，另一方面保证了脂质体制剂在体外 及体内的稳定性。本发明所制备的脂质体制剂其平均粒径在100纳米左右，这一方面保证了脂质体 制剂在体内不会被网状内皮系统迅速清除，另一方面有利于抗肿瘤药物在肿瘤部位的聚 集、释放。本发明的另一目的是提供上述多西他赛脂质体无菌冻干制剂的制备方法。此制备 方法最大的优点是将各种膜材在一定温度下溶于适量的乙醇或叔丁醇等有机溶剂中之后 无需另外的步骤去除有机溶剂即可进入下一步操作。之所以选择乙醇或叔丁醇是因为这些 溶剂毒性较小，无需刻意蒸除，只需要冻干步骤即可达到溶剂残留的要求。另外本发明所选 用的膜材在乙醇或叔丁醇中很容易溶解。此制备方法简单易行且适合于规模化生产。术语说明PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺，是一种长循环膜材；mPEG2000-DSPE 甲氧基聚乙二醇2000 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；以上原料可市场购得，也可按现有技术自行制备。本发明技术方案的详细描述如下本发明的技术方案是首先选择一种或多种适合于多西他赛药物本身性质的磷脂 并将药物与磷脂溶于适量水溶性有机溶剂中，在适当的温度及搅拌条件下充分溶解。向上 述溶液中添加适量的含有赋形剂及冻干保护剂的缓冲盐溶液，在适当的温度及搅拌条件下 充分混合后即可得到粗制的脂质体混悬液。此混悬液中的脂质颗粒具有较大的粒径分布， 粒子的粒径介于几十纳米到几十微米之间。之后选择适当的工艺可以将粒子的粒径降低至 Ium以下，优选地，平均粒径控制在200nm以下。通过上述步骤，即可得到多西他赛脂质体制 剂，此制剂经无菌过滤后可在室温下稳定的放置90天以上而不发生聚集、沉淀，2-8°C条件 下可稳定放置12个月以上。为进一步提高制剂的稳定性、便于保存及临床应用，可以选择 冷冻干燥的方式对上述制剂进行处理。经冷冻干燥后的多西他赛脂质体制剂可长期稳定放 置，并且复溶后性质无明显改变。脂质体的制备过程中所用到的主要辅料是磷脂，包括天然磷脂如大豆磷脂、蛋 黄磷脂、心磷脂以及鞘磷脂等；也包括各种合成或半合成磷脂如氢化大豆磷脂、氢化蛋黄 磷脂、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)等；还可以是带有电荷 的磷脂如二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰丝氨酸(D0PQ、二肉豆蔻酰磷脂酰甘 油(DMPG)等。本发明所使用的磷脂可以是上述磷脂中的一种或几种的组合物，其中优选 地使用天然磷脂，这些天然磷脂其磷脂酰胆碱的含量大于50%以上，优选地大于70%以 上。本发明所选用的磷脂与抗肿瘤药物多西他赛具有一定的比例，此比例介于1 100到 1 10(重量比)之间，优选地介于1 50到1 10之间。本发明所述脂质体中还加入了胆固醇，脂质体中胆固醇的加入可以使脂质双分子 层更加稳定，在高于相变温度的情况下可以减少脂质体膜的流动性，而在低于相变温度的前提下又可以增加膜的流动性。在体内环境中，胆固醇的存在一方面可以降低脂质体的清 除速度，另一方面还有利于药物的缓慢释放。不仅如此，胆固醇在脂质体中还能够减少自由 基的生成，从而降低了氧化水平，防止溶血性磷脂的产生。但是，对于脂溶性药物来说，胆固 醇的加入会降低药物嵌入脂质体双分子层的能力，从而降低脂质体的载药量。故而，胆固醇 的加入量需要精心设计。本发明通过多次实验发现，当胆固醇的加入量超过磷脂重量的5% (重量比)时，制备的脂质体制剂在短时间内就会出现沉淀。因此本发明中胆固醇的加入量 为磷脂重量的0-5% (重量比)之间。为了提高脂质体的稳定性，特别是在体内的循环时间，增加药物的半衰期，向脂质 体中添加适量的长循环材料如鞘磷脂、神经节苷脂(GMl)以及聚乙二醇(PEG)衍生化的磷 脂也是适宜的。本发明采用了向脂质体中添加PEG化的磷脂如(PEG-DSPE，聚乙二醇化的 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)的方式来延长脂质体的体内半衰期，提高肿瘤治疗效果。其中， PEG-DSPE的添加量需要与磷脂的量保持一定的比例，此比例可以是0-50 % (重量比)，优选 地选择0-30%。如果选择0，则意味着此脂质体为普通脂质体，不具有长循环功能。脂质体的制备方法也是多种多样的，包括薄膜蒸发法、注入法、超声分散法、冷冻 干燥法、逆向蒸发法等方式在内的各种制备方法均适于本发明。但是由于这些方法所制备 的脂质体在稳定性、包封率、载药量等方面差异较大，因此制备的脂质体质量差异较大，有 时甚至出现质量较差的情况。为了能够制备出质量较高的脂质体，同时简化制备工艺使其 适用于工业化规模生产，本发明采用了一种改良的制备工艺。具体来说，首先将适量的磷 月旨、胆固醇、多西他赛共同溶于与水互溶的有机溶剂中，此有机溶剂可以是乙醇、叔丁醇、甲 醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿等中的一种或多种的组合物。由于本发明不需要去除有机溶剂，因 此选择毒性较小的乙醇及叔丁醇是较佳的选择。为了更好的溶解，可以通过升高温度以及 搅拌或超声的方式。另外，有机溶剂的添加量也是需要精心选择的，本发明有机溶剂的添 加量与最终的制备体积具有相关性，具体来说有机溶剂的添加量不宜超过最终制备体积的 20%，其中又以不超过10%为佳，例如制备体积若为1000ml，则有机溶剂的添加量以不大 于IOOml为佳。上述步骤之后，可以象现有技术报道的那样选择旋转蒸发或其他合适的工艺将有 机溶剂去除。但本发明中却无需此步骤，这大大简化了制备工艺、缩短了制备周期，特别适 合于大规模制备。然后，可以直接将配制好的缓冲盐溶液加入至溶解有药物和磷脂的溶剂 中进行孵育。此时的孵育温度为30-70°C之间，以40-60°C为最佳，孵育时间为10-60分钟。 上述缓冲盐溶液有多种选择，可以是磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲夜等等，PH 介于3. 0-8. 0之间，优选4. 0-7. 0之间。另外，为了便于冷冻干燥的进行，缓冲盐溶液中添 加适量的冻干保护剂也是必需的。这些冻干保护剂可以是一种或多种糖类物质，其中以单 糖及双糖为佳，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、半乳糖等；也可以是其他非糖类物质 如甘露醇、白蛋白、甘氨酸等。本发明中选择了上述冻干保护剂中的一种或多种物质。冻干 保护剂在缓冲液中的重量体积比以2-20%为佳，优选地介于5-15%之间。经上述孵育步骤之后形成的混悬液即为脂质体粗混悬液，此混悬液中的脂质体多 为多室脂质体或多层脂质体，粒径也较大，一般介于几十纳米到几十微米之间。此混悬液 不适于作为静脉注射液用脂质体，也不稳定。因此需要进一步加工，具体来说可以通过高 压挤出、超声、高速搅拌等方式将此混悬液进一步降低粒径提高稳定性。本发明采用了微射流设备对粗混悬液进行加工，压力选择介于1000-20000psi之间，循环次数介于2-20个 之间。优选地工艺是先经过低压O000-6000psi)进行2-10个微射流循环，再经过高压 (7000-20000psi)进行2-10个微射流循环。如此工艺之后，制备的脂质体的平均粒径可降 低至微米以下，如果工艺选择合适，平均粒径可降低至50-500nm之间。经上述步骤之后制备的脂质体经逐级过滤除菌后室温下可以稳定的放置90天以 上而不会发生明显的质量改变。上述脂质体溶液经除菌过滤后可直接用于静脉注射。为了进一步提高稳定性，可 选择冷冻干燥或喷雾干燥的方式去除水分。将最终制剂的水分含量控制在3%以下。优选的，本发明所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂中，每100克多西他赛脂质 体无菌冻干制剂中含有如下组分
权利要求
1. 一种多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于每100克多西他赛脂质体无菌冻干 制剂中含有如下组分
2.如权利要求1所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于制备方法包括如下 步骤(1)称取天然卵磷脂、PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和胆固醇溶于有机 溶剂中，于40-60°C条件下搅拌溶解得磷脂溶液；(2)称取多西他赛并加入上述磷脂溶液中；(3)采用注射用水配制含有冻干保护剂的缓冲盐溶液，调节pH至4.0-7.0之间；并 将其加入至上述步骤( 制得的磷脂溶液中，保持温度40-60°C，搅拌或超声条件下孵育 10-60分钟得混悬液；(4)将步骤C3)得到的混悬液加入至微射流仪中，调节压力为2000-6000psi，循环2-10 次之后，调节压力为7000-20000psi，循环2-10次；得到脂质体溶液；(5)将步骤(4)得到的脂质体溶液依次经0.8um、0. 45um、0. 22um滤膜逐级过滤、得多西 他赛脂质体；在无菌条件下分装，冷冻干燥即得多西他赛脂质体无菌冻干制剂。
3.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于所述的天然磷 脂为天然的大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。
4.如权利要求3所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于在所述的大豆卵磷 脂或蛋黄卵磷脂中，磷脂酰胆碱的含量大于70wt%，溶血性磷脂的含量小于3wt%。
5.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于所述的冻干保 护剂为麦芽糖、甘露醇、半乳糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一种或几种的组合物。
6.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于所述的缓冲盐 选自磷酸盐、醋酸盐或甘氨酸盐。
7.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于制备过程中所 用的有机溶剂选自乙醇、叔丁醇中的一种或两种的组合物，有机溶剂的用量不超过最终制 备的液体制剂体积的20%，优选为不超过10%。
8.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于多西他赛脂质 体无菌冻干制剂加入生理盐水、葡萄糖注射液或注射用水复溶后平均粒径在50-200nm之 间，药物包封率大于95%, pH介于4. 0-7. 0之间。
全文摘要
本发明涉及一种多西他赛脂质体无菌冻干制剂及其制备方法，多西他赛脂质体无菌冻干制剂由多西他赛、天然卵磷脂、PEG-DSPE、胆固醇、冻干保护剂、缓冲盐组成。将天然卵磷脂、PEG-DSPE、胆固醇以及多西他赛溶于有机溶剂中，加入含有冻干保护剂的缓冲液，孵育10-60分钟，将脂质体的平均粒径降至50-200nm，除菌过滤后冷冻干燥即得。本发明制备的多西他赛脂质体与目前市售普通注射液相比，具有毒副作用小、疗效高的优点。本发明的制备方法简单易行、适合工业化生产，所制备的多西他赛脂质体包封率高、稳定性好。
文档编号A61P35/00GK102085189SQ200910230758
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者张明会, 李伯涛, 杨光丽, 杨清敏, 王晶翼, 王栋海, 王琳琳 申请人:齐鲁制药有限公司
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种脂溶性药物多西他赛的脂质体无菌冻干 制剂及其制备方法。
背景技术：
法国罗纳普朗克 安乐公司于1986年研发成功的多西他赛(也称多烯紫杉醇)注 射液是继紫杉醇后又一种新型抗微管药物，1995年4月在墨西哥首先上市，随后在英、美、 法、意、德、日等国家上市。与紫杉醇相比，多西他赛细胞内外流较少且低剂量诱导细胞凋亡效应显著。许多 体外和临床研究均证实多西他赛对多种肿瘤细胞有放射增敏作用且不加重正常组织的放 射损伤。多西他赛的亲和性为紫杉醇的2倍，在体外抗癌活性试验中，多西他赛活性可达紫 杉醇的10倍，除此之外，多西他赛还具有较好的生物利用度，更高的细胞内浓度，更好的水 溶性及优异的抗癌广谱性，它不仅对乳腺癌、肺癌有很好的疗效，而且对患有头颈癌症、胃 癌、胰腺癌及软组织肿瘤的患者也具有较好的治疗作用。此外，多西他赛与某些抗肿瘤药物 联合使用时，还具有协同作用。同紫杉醇一样，多西他赛也不溶于水，临床用的注射用多西 他赛均为注射用浓缩溶液，为2只西林瓶包装，其中一瓶为多西他赛的吐温溶液，另一瓶为 乙醇水溶液，临床应用时先将乙醇水溶液注入多西他赛的吐温溶液中，充分摇晃，5分钟后 观察澄明后才能应用于患者，临床应用非常不方便。并且用药时多西他赛注射液一旦稀释 就必须立即使用，并在规定时间内用完，否则放置数小时即有多西他赛析出，被在线滤器过 滤导致药效降低。这样就迫切需要开发出新的多西他赛剂型，以增加其水溶性，避免由于复 合溶媒带来的过敏反应及其他毒副反应，方便临床应用。脂质体是靶向给药系统的一种新剂型，一直是药剂学研究的热点之一，它可以将 药物选择性地输送到肿瘤部位，发挥治疗作用，同时又不影响正常细胞、组织或器官的功 能，从而达到提高疗效、减少毒副作用的目的。脂质体具有类似于细胞膜的结构，构成双分 子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间。正由于脂质 体的这种类膜结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两亲的物质，它们被包入脂质体内 部水相、插入类脂双分子层或吸附连接在脂质体的表面。脂质体作为药物载体，既起到了对药物的保护作用，又提高了药物对机体特定部 位的靶向性，因此在提高药效方面具有很多优越的特性。主要表现在以下几个方面①脂质 体对机体无毒或毒副作用小，其脂质双分子层与生物膜有较大的相似性以及组织相溶性， 从而易于被组织吸收，提高了药物的吸收利用率；②脂质体包裹药物为物理过程，不改变药 物分子结构，不会破坏药物成分，而包裹的药物则可以避免被体内水解酶所破坏；③包裹后 的药物可以降低其对机体特定部位的毒性，减小药物使用量，使药物具有缓释和控释作用； ④与病毒载体不同，脂质体在宿主体内可以生物降解，无免疫原性；⑤在基因治疗上易于与 基因复合，有较高的靶向性，实现特定细胞的治疗；⑥材料廉价，便于大量制备。近十几年中已经有多篇关于多西他赛脂质体的文献报道，但至今没有一个产品成功的进入市场。究其原因，一是因为所制备的多西他赛脂质体质量不佳、稳定性较差，无法 长期保存；二是制备的多西他赛脂质体载药量较低，临床使用时需要同时输注大量的磷脂 等辅料；三是制备工艺复杂，只适合于实验室小规模制备，不适用大规模工业化生产。目前， 常用的脂质体制备方法包括以下几种方法(1)薄膜分散法将膜材及脂溶性药物溶于有机溶剂中，然后将有机溶剂蒸发，使 其在容器内壁上形成干燥的薄膜，将水溶性药物溶于缓冲液中，加入容器中不断搅拌，即得 脂质体。若想得到粒径更小的脂质体，则需要配合适当的后处理手段，如超声、高压均质以 及挤压等。(2)注入法将磷脂等类脂质及脂溶性药物溶于有机溶剂中，然后将此药液经注 射器缓缓注入一定温度的缓冲液(或含有水溶性药物)中，边加边搅拌，不断搅拌至溶剂除 尽，即得。此法制备工艺简单，易于操作，但脂质体质量不稳定。(3)跨膜梯度主动载药法跨膜梯度主动载药法包括PH梯度法和硫酸铵梯度法。 PH梯度法是通过调节脂质体内外水相的pH，使之形成一定的pH梯度差，利用药物在不同pH 溶液中解离状态的差异，以分子型透过外水相在内水相中形成离子型药物而被包封。硫酸 铵梯度法是先将硫酸铵包于脂质体内水相，然后通过透析、凝胶色谱或超滤的方法除去外 水相的硫酸铵。它是通过游离氨扩散到脂质体外，形成PH梯度，使药物集聚到脂质体内的。 跨膜梯度主动载药法适合于某些弱酸性及弱碱性药物，不适于难溶性药物及中性药物。(4)超声波分散法在薄膜分散法的基础上，再经超声波处理，可得到单室脂质体 (SUV)。超声技术有两种一种是将超声仪的探头浸入脂质体分散体中，此方法是小规模制 备SUV应用最广泛的方法；另外一种是将样品放在试管或烧杯内，再置于水浴式超声仪中。 由于超声探头处能量的释放会导致局部过热，因此必须有降温或散热措施。(5)冷冻干燥法(冻干再水化法)冷冻干燥法即将类脂高度分散于在水溶液中， 冷冻干燥，然后再分散到含药的水性递质中，形成脂质体。在一定范围内，脂质体的包封率 和粒度随冻融次数的增加而略有增大；冻融后搅拌或超声均可使聚集的脂质体解聚，从不 影响包封率的角度考虑，搅拌比超声处理更好。冻干再水化囊泡亦称为冻干再水化脂质体 (FRV)是由预制囊泡制备而成。此法包封率很高，甚至对于大分子也可实现较高的包封率。 干燥工艺使脂质双分子层和待包药物紧密接触，重新溶胀时对附着于脂质上的分子包封机 会较大。(6)逆向蒸发法(REV) =Szoka等于1978年提出了“REV脂质体”的制备工艺，即通 过逆向蒸发法制得内水相体积大且包封率高的脂质体。该方法是脂质体技术的一个突破， 因为其首次考虑到制备具有高内水相体积-脂质比特性的脂质体，且能够包封现有的大部 分水溶性物质。REV脂质体可由各种脂质和脂质混合物制得，其内水相体积-脂质比SUV高 约30倍，比多层脂质体或手摇法制得的囊泡高4倍。在低盐浓度和最佳条件下，有65%的 水相包封在囊泡中，甚至对大分子物质的包封率也很高。此法的基础是“反胶束”的形成， 即被磷脂单分子层稳定的小水滴分散于大量有机溶剂中。这种反胶束是由缓冲水相和有机 相的混合物经超声形成的，其中缓冲水相含有待包封入脂质体的水溶性分子，而有机相溶 有两亲性磷脂。缓慢除去有机相使反胶束转变形成黏稠凝胶状。在此过程的临界点，凝胶 塌陷，部分反胶束破裂。反胶束破裂而产生的过量磷脂，反过来在余下的胶束周围形成完整 的双分子层，形成囊泡即REV脂质体。REV脂质体主要是单室的，但是每个REV制剂中都有
4一些囊泡是由几个同心双分子层构成，从而组成寡层囊泡。REV脂质体的大小与磷脂类型及 其在有机溶剂中的溶解度、水相缓冲液和有机溶剂之间的表面张力以及水相、有机溶剂和 脂质的相对量等因素有关。目前，关于多西他赛脂质体的研究报道较多，处方组成及制备工艺多种多样。 如MariaL. I.等报道的多西他赛脂质体含药量较低，稳定性差，无法长期保存，不适合
IS M (preparation, characterization, cytotoxicity and pharmacokinetics of liposomes containing docetaxel.Journal of controlled release 91(2003), 417-429.)CN200510029634.0公开了一种多烯紫杉醇脂质体及其制备方法。但此方法制备的 液态脂质体室温下放置稳定性较差。而且制备工艺较为复杂，需要长时间蒸除有机溶剂，此 过程容易导致磷脂氧化产生溶血磷脂，不适合于工业化生产。CN200510110973. 1公开了一种紫杉烷脂质体冻干组合物及其制备方法，解决了低 成本地提高紫杉烷脂质体药物组合物的复溶后的稳定性问题。但其制备的脂质体处方中添 加了环糊精，在临床应用中存在一定风险。CN1846692A和CN101057831A公开了多烯紫杉醇长循环脂质体剂型及其制备方 法，显著提高了脂质体在体内的循环时间，降低了药物的毒性。但其未对冻干复溶后的脂质 体制剂的稳定性进行考察，特别是复溶后药物的包封率及粒径变化情况。另外，本发明曾按 照其公开的方法用外加法以蔗糖、葡萄糖以及甘露醇作为冻干保护剂，但无法得到外观较 佳的冻干产品，且复溶后脂质体无法重建，药物泄漏严重。CN101015M7A公开了一种多烯紫杉醇脂质体新剂型及其制备方法，但其灭菌方式 采用121摄氏度高压灭菌，这无疑会导致磷脂的大量氧化，药物在此剧烈的条件下稳定性 难以保证。另外，也未对灭菌后的制剂的稳定性进行考察。CN101317816A公开了一种多西他赛长循环制剂，以氯仿作为溶剂，毒性较大，另外 需要长时间旋蒸以去除残留溶剂，这在工业化生产中难以实施。并且未对冻干前后的脂质 体进行稳定性考察。CN101322699A和CN101322689A公开了一种多西他赛长循环脂质体及其冻干粉针 的制备方法。采用了带电荷的合成磷脂作为膜材，这些磷脂均为进口产品，价格昂贵且多数 不是注射级药用辅料。处方中添加抗氧化剂以保护磷脂不被氧化。另外，制备工艺复杂不适 合工业化生产，特别是以氯仿甲醇作为溶剂，毒性较大难以完全去除，安全性得不到保证。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的主要目的是提供一种能够明显降低现有多西他赛 注射液毒副作用、制备工艺简单、易于工业化放大生产的多西他赛脂质体无菌冻干制剂。该 制剂药物包封率高、操作简单，是一种在溶液中能够稳定放置的纳米胶体系统，此制剂经冷 冻干燥后能够长期稳定放置，而且冻干制剂复溶后主要性状维持不变。本发明所制备的多西他赛脂质体制剂中选用的磷脂为天然磷脂，价格低廉、易于 获取。更重要的是所选择的天然磷脂中磷脂酰胆碱的含量适中，这对于最终脂质体制剂的 稳定性及药物的包封都是非常有利的。胆固醇对于脂质体制剂来说具有重要意义，其含量的多少一方面决定了脂质体在
5体内的稳定性，另一方面对药物在体内的释放行为具有重要影响。本发明在现有文献报道 的基础上适当降低了胆固醇的含量，这对于本发明具有重要意义。一方面通过减少胆固醇 的含量提高了脂溶性药物在脂质双分子层中的载药量，另一方面保证了脂质体制剂在体外 及体内的稳定性。本发明所制备的脂质体制剂其平均粒径在100纳米左右，这一方面保证了脂质体 制剂在体内不会被网状内皮系统迅速清除，另一方面有利于抗肿瘤药物在肿瘤部位的聚 集、释放。本发明的另一目的是提供上述多西他赛脂质体无菌冻干制剂的制备方法。此制备 方法最大的优点是将各种膜材在一定温度下溶于适量的乙醇或叔丁醇等有机溶剂中之后 无需另外的步骤去除有机溶剂即可进入下一步操作。之所以选择乙醇或叔丁醇是因为这些 溶剂毒性较小，无需刻意蒸除，只需要冻干步骤即可达到溶剂残留的要求。另外本发明所选 用的膜材在乙醇或叔丁醇中很容易溶解。此制备方法简单易行且适合于规模化生产。术语说明PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺，是一种长循环膜材；mPEG2000-DSPE 甲氧基聚乙二醇2000 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；以上原料可市场购得，也可按现有技术自行制备。本发明技术方案的详细描述如下本发明的技术方案是首先选择一种或多种适合于多西他赛药物本身性质的磷脂 并将药物与磷脂溶于适量水溶性有机溶剂中，在适当的温度及搅拌条件下充分溶解。向上 述溶液中添加适量的含有赋形剂及冻干保护剂的缓冲盐溶液，在适当的温度及搅拌条件下 充分混合后即可得到粗制的脂质体混悬液。此混悬液中的脂质颗粒具有较大的粒径分布， 粒子的粒径介于几十纳米到几十微米之间。之后选择适当的工艺可以将粒子的粒径降低至 Ium以下，优选地，平均粒径控制在200nm以下。通过上述步骤，即可得到多西他赛脂质体制 剂，此制剂经无菌过滤后可在室温下稳定的放置90天以上而不发生聚集、沉淀，2-8°C条件 下可稳定放置12个月以上。为进一步提高制剂的稳定性、便于保存及临床应用，可以选择 冷冻干燥的方式对上述制剂进行处理。经冷冻干燥后的多西他赛脂质体制剂可长期稳定放 置，并且复溶后性质无明显改变。脂质体的制备过程中所用到的主要辅料是磷脂，包括天然磷脂如大豆磷脂、蛋 黄磷脂、心磷脂以及鞘磷脂等；也包括各种合成或半合成磷脂如氢化大豆磷脂、氢化蛋黄 磷脂、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱 (DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)等；还可以是带有电荷 的磷脂如二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰丝氨酸(D0PQ、二肉豆蔻酰磷脂酰甘 油(DMPG)等。本发明所使用的磷脂可以是上述磷脂中的一种或几种的组合物，其中优选 地使用天然磷脂，这些天然磷脂其磷脂酰胆碱的含量大于50%以上，优选地大于70%以 上。本发明所选用的磷脂与抗肿瘤药物多西他赛具有一定的比例，此比例介于1 100到 1 10(重量比)之间，优选地介于1 50到1 10之间。本发明所述脂质体中还加入了胆固醇，脂质体中胆固醇的加入可以使脂质双分子 层更加稳定，在高于相变温度的情况下可以减少脂质体膜的流动性，而在低于相变温度的前提下又可以增加膜的流动性。在体内环境中，胆固醇的存在一方面可以降低脂质体的清 除速度，另一方面还有利于药物的缓慢释放。不仅如此，胆固醇在脂质体中还能够减少自由 基的生成，从而降低了氧化水平，防止溶血性磷脂的产生。但是，对于脂溶性药物来说，胆固 醇的加入会降低药物嵌入脂质体双分子层的能力，从而降低脂质体的载药量。故而，胆固醇 的加入量需要精心设计。本发明通过多次实验发现，当胆固醇的加入量超过磷脂重量的5% (重量比)时，制备的脂质体制剂在短时间内就会出现沉淀。因此本发明中胆固醇的加入量 为磷脂重量的0-5% (重量比)之间。为了提高脂质体的稳定性，特别是在体内的循环时间，增加药物的半衰期，向脂质 体中添加适量的长循环材料如鞘磷脂、神经节苷脂(GMl)以及聚乙二醇(PEG)衍生化的磷 脂也是适宜的。本发明采用了向脂质体中添加PEG化的磷脂如(PEG-DSPE，聚乙二醇化的 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)的方式来延长脂质体的体内半衰期，提高肿瘤治疗效果。其中， PEG-DSPE的添加量需要与磷脂的量保持一定的比例，此比例可以是0-50 % (重量比)，优选 地选择0-30%。如果选择0，则意味着此脂质体为普通脂质体，不具有长循环功能。脂质体的制备方法也是多种多样的，包括薄膜蒸发法、注入法、超声分散法、冷冻 干燥法、逆向蒸发法等方式在内的各种制备方法均适于本发明。但是由于这些方法所制备 的脂质体在稳定性、包封率、载药量等方面差异较大，因此制备的脂质体质量差异较大，有 时甚至出现质量较差的情况。为了能够制备出质量较高的脂质体，同时简化制备工艺使其 适用于工业化规模生产，本发明采用了一种改良的制备工艺。具体来说，首先将适量的磷 月旨、胆固醇、多西他赛共同溶于与水互溶的有机溶剂中，此有机溶剂可以是乙醇、叔丁醇、甲 醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿等中的一种或多种的组合物。由于本发明不需要去除有机溶剂，因 此选择毒性较小的乙醇及叔丁醇是较佳的选择。为了更好的溶解，可以通过升高温度以及 搅拌或超声的方式。另外，有机溶剂的添加量也是需要精心选择的，本发明有机溶剂的添 加量与最终的制备体积具有相关性，具体来说有机溶剂的添加量不宜超过最终制备体积的 20%，其中又以不超过10%为佳，例如制备体积若为1000ml，则有机溶剂的添加量以不大 于IOOml为佳。上述步骤之后，可以象现有技术报道的那样选择旋转蒸发或其他合适的工艺将有 机溶剂去除。但本发明中却无需此步骤，这大大简化了制备工艺、缩短了制备周期，特别适 合于大规模制备。然后，可以直接将配制好的缓冲盐溶液加入至溶解有药物和磷脂的溶剂 中进行孵育。此时的孵育温度为30-70°C之间，以40-60°C为最佳，孵育时间为10-60分钟。 上述缓冲盐溶液有多种选择，可以是磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲夜等等，PH 介于3. 0-8. 0之间，优选4. 0-7. 0之间。另外，为了便于冷冻干燥的进行，缓冲盐溶液中添 加适量的冻干保护剂也是必需的。这些冻干保护剂可以是一种或多种糖类物质，其中以单 糖及双糖为佳，如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、半乳糖等；也可以是其他非糖类物质 如甘露醇、白蛋白、甘氨酸等。本发明中选择了上述冻干保护剂中的一种或多种物质。冻干 保护剂在缓冲液中的重量体积比以2-20%为佳，优选地介于5-15%之间。经上述孵育步骤之后形成的混悬液即为脂质体粗混悬液，此混悬液中的脂质体多 为多室脂质体或多层脂质体，粒径也较大，一般介于几十纳米到几十微米之间。此混悬液 不适于作为静脉注射液用脂质体，也不稳定。因此需要进一步加工，具体来说可以通过高 压挤出、超声、高速搅拌等方式将此混悬液进一步降低粒径提高稳定性。本发明采用了微射流设备对粗混悬液进行加工，压力选择介于1000-20000psi之间，循环次数介于2-20个 之间。优选地工艺是先经过低压O000-6000psi)进行2-10个微射流循环，再经过高压 (7000-20000psi)进行2-10个微射流循环。如此工艺之后，制备的脂质体的平均粒径可降 低至微米以下，如果工艺选择合适，平均粒径可降低至50-500nm之间。经上述步骤之后制备的脂质体经逐级过滤除菌后室温下可以稳定的放置90天以 上而不会发生明显的质量改变。上述脂质体溶液经除菌过滤后可直接用于静脉注射。为了进一步提高稳定性，可 选择冷冻干燥或喷雾干燥的方式去除水分。将最终制剂的水分含量控制在3%以下。优选的，本发明所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂中，每100克多西他赛脂质 体无菌冻干制剂中含有如下组分
权利要求
1. 一种多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于每100克多西他赛脂质体无菌冻干 制剂中含有如下组分
2.如权利要求1所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于制备方法包括如下 步骤(1)称取天然卵磷脂、PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)和胆固醇溶于有机 溶剂中，于40-60°C条件下搅拌溶解得磷脂溶液；(2)称取多西他赛并加入上述磷脂溶液中；(3)采用注射用水配制含有冻干保护剂的缓冲盐溶液，调节pH至4.0-7.0之间；并 将其加入至上述步骤( 制得的磷脂溶液中，保持温度40-60°C，搅拌或超声条件下孵育 10-60分钟得混悬液；(4)将步骤C3)得到的混悬液加入至微射流仪中，调节压力为2000-6000psi，循环2-10 次之后，调节压力为7000-20000psi，循环2-10次；得到脂质体溶液；(5)将步骤(4)得到的脂质体溶液依次经0.8um、0. 45um、0. 22um滤膜逐级过滤、得多西 他赛脂质体；在无菌条件下分装，冷冻干燥即得多西他赛脂质体无菌冻干制剂。
3.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于所述的天然磷 脂为天然的大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。
4.如权利要求3所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于在所述的大豆卵磷 脂或蛋黄卵磷脂中，磷脂酰胆碱的含量大于70wt%，溶血性磷脂的含量小于3wt%。
5.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于所述的冻干保 护剂为麦芽糖、甘露醇、半乳糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖中的一种或几种的组合物。
6.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于所述的缓冲盐 选自磷酸盐、醋酸盐或甘氨酸盐。
7.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于制备过程中所 用的有机溶剂选自乙醇、叔丁醇中的一种或两种的组合物，有机溶剂的用量不超过最终制 备的液体制剂体积的20%，优选为不超过10%。
8.如权利要求1或2所述的多西他赛脂质体无菌冻干制剂，其特征在于多西他赛脂质 体无菌冻干制剂加入生理盐水、葡萄糖注射液或注射用水复溶后平均粒径在50-200nm之 间，药物包封率大于95%, pH介于4. 0-7. 0之间。
全文摘要
本发明涉及一种多西他赛脂质体无菌冻干制剂及其制备方法，多西他赛脂质体无菌冻干制剂由多西他赛、天然卵磷脂、PEG-DSPE、胆固醇、冻干保护剂、缓冲盐组成。将天然卵磷脂、PEG-DSPE、胆固醇以及多西他赛溶于有机溶剂中，加入含有冻干保护剂的缓冲液，孵育10-60分钟，将脂质体的平均粒径降至50-200nm，除菌过滤后冷冻干燥即得。本发明制备的多西他赛脂质体与目前市售普通注射液相比，具有毒副作用小、疗效高的优点。本发明的制备方法简单易行、适合工业化生产，所制备的多西他赛脂质体包封率高、稳定性好。
文档编号A61P35/00GK102085189SQ200910230758
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者张明会, 李伯涛, 杨光丽, 杨清敏, 王晶翼, 王栋海, 王琳琳 申请人:齐鲁制药有限公司
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