具有抗细菌活性的Pestaloticacid化合物及其应用
具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一类具有抗细菌活性的Pestalotic acid 化合物及其应用。
【背景技术】
[0002]植物内生真菌（fungal endophyte)是指生活史的一定阶段或全部阶段生活与健 康植物各组织合格器官内的真菌。它们与宿主植物通过相互作用形成了紧密的共生关系， 可以促进植物的生长，提供植物应对胁迫的适应能力，有的植物内生真菌还具有药用价值。 从植物内生真菌中寻找和发现活性化合物已成为国内外研究的又一热点，如中国专利文献 CN201310194836.5公开了 一株龙胆中分离得到的内生真菌(]\^七31'1'11丨2；[11111)11)421，可用于 防治龙胆叶枯病;专利申请CN201210067829.4则公开了从银杏根、茎、叶等组织中分离得到 的内生真菌腐皮镰孢菌T-7，对辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、苹果腐烂病菌等具有很好的 抑制作用。
[0003]目前在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减 轻病虫草害，保证农作物丰产丰收起到积极的作用，但是由于自然界生物之间的相互制约 相互依存，现在已不建议过分依赖化学农药在进行病害的处理；因此，对植物内生真菌的研 究，利用植物内生真菌与宿主植物生物活性共生的关系，来筛选具有高生物活性的内生真 菌，进一步获得活性产物，是近年来研究的一大热点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的旨在提供一类具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物及其抗 细菌活性应用。
[0005] 本发明的具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物，是将重寄生拟盘多毛孢菌 株发酵培养后，再经提取与分离后得到的化合物，结构式如下：
[0006]
[0007] 本发明的具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物的制备方法，包括以下工艺 步骤：
[0008] 步骤①:将重寄生拟盘多毛孢菌株用培养基室温下培养10-30天；
[0009] 步骤②:将所述步骤①中培养基连同其上的菌落一同切为块状，然后使用混合溶 剂浸泡提取3次;将3次提取物合并浓缩后，用萃取剂萃取至颜色不再改变，然后用旋转蒸 发仪40_50°C减压浓缩至干得浸膏；
[0010] 步骤③:将所述步骤②中的浸膏用溶剂溶解后再用硅胶拌样，经正相柱层析，然后 用石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇系统梯度洗脱，最后经过TLC层析检测，将含有相同Rf值和 显色情况的化合物组分合并在一起，分别减压浓缩至干，得到10个组分Fr. 1至Fr. 10;
[0011] 步骤④:将所述步骤③中的化合物组分Fr. 1至Fr. 10分别用常规分离或洗脱方法 中的一种或多种组合进行反复分离、洗脱后得到具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合 物，所述常规分离或洗脱方法为以下所列方法：
[0012] (l)Sephadex LH-20分离；
[0013] (2)NP7000型-高效液相色谱仪分离；
[0014] ⑶用硅胶拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用石油醚-丙酮系统进行等度洗脱。
[0015] 所述步骤①中培养基的组成（改良M-1-D培养基）：NaH2P〇4.H2〇 20mg，FeCl3 2.0mg，MgS〇4 360mg，KCl 60mg，Ca(N〇3)2 2280mg，KN〇3 80mg，鹿糖30g，酒石酸铵5g，酵母浸 膏0.5g，MnS〇4 5.0mg，ZnS〇4.7H2〇 2.5mg，H3B〇4 1.4mg，KI 0.7mg，蒸馏水lOOOmL，琼脂 15- 20g，pH自然;所述步骤①中培养基的体积为30L。
[0016]所述步骤①中的重寄生拟盘多毛孢菌株为重寄生拟盘多毛孢菌株cr014。
[0017] 所述步骤②中混合溶剂为乙酸乙酯：甲醇：乙酸=80:15:5 (V/V/V)，萃取剂为乙酸 乙酯。
[0018] 所述用于拌样的硅胶为100-200目，所述步骤③中正相柱层析所用硅胶为200-300 目，石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇系统梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯为10:1-6:4,氯仿：甲 醇为 20:1-0:100。
[0019] 所述步骤④中Sephadex LH-20分离时所用的洗脱剂为氯仿：甲醇=1:1、甲醇、丙 酮中的一种;所述步骤④中用石油醚-丙酮系统进行等度洗脱时石油醚:丙酮为8:2-7:3。
[0020] 本发明所述化合物分子结构式(1)到（10)分别对应化合物1到10:
[0021 ] 化合物1:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M-H]-m/z 349.1658)确定其分子式为C19H26〇6,从13C NMR谱和DEPT谱上可以看出化合物7中含有6个季 碳信号（3。197.1、171.4、151.4、133.0、130.3和64.6)，5个次甲基（3。143.3、136.1、127.3、 66.4和59.2)，6个亚甲基（3。55.1、35.2、32.8、31.0、29.8和23.7)和2个甲基（3。14.5和 13.0) 〇
[0022] 根据1H-匪R数据显示：由于具有一个单峰甲基（δΗ1.89, s)和一个三重峰甲基（δ η0.94，t，J = 7.0Hz)，表明化合物1的平面结构与ambuic ac id的类似物相似。由COSY谱中的 数据可以看出该化合物的关键相关点（Η-3/Η-4;Η-11/Η-12/Η-13/Η-14/Η-15/Η-16/Η-17)， 由此可以推导出该化合物具有-C-3-C-4-和-C-11-C-12-C-13-C-14-C-15-C-16-C-17-2 个 片段。该化合物详细的结构由2D-NMR确定，根据HMBC上的数据显示:3位烯基的质子δΗ 6.84 (!1-3)与3。171.4(〇1)，133.0((：-2)，31.0((：-4)，64.6((：-5)和13.0((：-18)相关，18位甲基上 的质子知 1.89(Η-18)与 δ。171.4((：-1)，133.0((：-2)和136.1((：-3)相关;4位亚甲基上的质 子3 113.18和2.74(!1-4)与5。133.0((：-2)，136.1((：-3)，64.6((：-5)和59.2((：-10)相关 ；6位的 质子δΗ 4·85(Η-6)与151.4(〇7)，130.3(〇8)，127.3((：-11)和31.0((：-4)相关；19位的质 子δ Η 4.49和4·28(Η-19)与δ。197.1(C-9)，151.4(C-7)和 130.3(C-4)相关。通过结合其他 相关点，可以推断出该化合物的平面结构。
[0023] 化合物1的相对构型由N0ESY实验确定，Ν0Ε数据显示:H-4、H-6和H-10相关确定了 对应C-5、C-6和C-10构型，并且从1Η-NMR计算出H-11和H-12的耦合常数为15.9Hz，揭示了位 于C-11的双键是E构型，由此得出了化合物1的相对构型，并将其命名为pestalotic acid A〇
[0024] 化合物2:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M-H]-m/z 349.1658;calc.345.1338)确定其分子式为C19H22O6,从13C NMR谱和DEPT谱上可以看出化合 物2中含有 9 个季碳信号（δ。169.1、162.1、148.5、148.1、140.8、129.7、122.6、119.2和 110.7)，3个次甲基（3。195.0、138.5和100.4)，5个亚甲基（3。32.1、29.1、28.2、24.9和 23.1) 和2个甲基0。14.3和12.7)。
[0025] 表1化合物1-9的碳谱数据
[0027] a核磁数据在⑶30D中获得.
[0028] b核磁数据在⑶3C0⑶3获得
[0029] 由1H_NMR、13C匪R和DEPT谱数据可以看出化合物2是ambuic acid的类似物，区别 在于ambuic acid中的6元环在该化合物中变为了苯环。由COSY谱中的数据可以看出该化合 物的关键相关点(H-3/H-4;H-13/H-14/H-15/H-16/H-17)，由此可以推导出该化合物具有-C-3-C-4-和-C-13-C-14-C-15-C-16-C-17-2个片段。该化合物的细微结构由2D-NMR确定，根 据HMBC谱的数据可以看出苯环上连接有3个羟基、1个醛基和1个异戊烯基基团；3位烯基的 质子δ Η 6·96(H-3)与δ。169.1(01)，129.7(02) ,24.9(04)，119.2(C-5) (w)和 12.7(018) 相关，18位甲基上的质子δΗ 2.06(H-18)与δ。169.1(〇1)，129.7(〇2)和138.5.0((：-3)相 关；4位亚甲基上的质子δ Η 3·87(Η-4)与5。169.1(01)，129.7(02)，138.5((：-3)，119.2((：- 5)，148.1((：-6)和140.8((：-10)相关；11位烯基的质子5116.97(!1-11)与心148.1((：-6)， 122.6(07) ,162.1(12)和29.1(013)相关；13位的质子5(12.84(!1-13)与心 l〇〇.4(C-ll)， 162.1(〇12)，28.2(〇14)和32.1(〇15)相关；19位醛基上的质子5( 110.34(!1-19)与3。 148.1(06)，122.6(07)，110.7(08)，148.5(09)和 140.8(010)相关。
[0030] 最后用化合物的总不饱和度除了双键、两个酮基以及苯环的不饱和度外，还有一 个不饱和度，暗示了还有一个额外的环状结构在该化合物的骨架上:该环是C-6和C-12通过 氧桥连接形成的。基于上述数据可以推断出化合物2的结构，最后将其命名为pestalotic acid B〇
[0031 ] 化合物3 :褐色油状，结合13C匪R和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS( [M+Na]+m/z 379.1284)确定其分子式为C18H2535C105，并从化合物3的ESI-MS的实验数据中可以观察到化 合物3的分子量中有一个为m/z 381[M+2+Na] +同位素峰，其丰度为另一个同位素峰m/z 379 [M+Na]+的三分之一，因此可以判定化合物3中含有一个Cl原子取代基。
[0032]化合物3在HMBC和COSY谱上的关键相关点和化合物1的几乎一样，除了化合物3中 少了一个化学位移为知55.1的碳，以及在6元环上多了一个C1原子取代基。在化合物3中，6 位的质子δΗ 4·43(Η-6)与δ。156.1(07)，lSO.SCC-llhWlSCCDjg.TKDjO.iKC- iO) 和 36.9(C-4) 相关， 18 位烯基上的质子 5111.91(!1-18)与知171.8((：-1)，132.0((：-2)，137.6 (C-3)和36.9(04)相关；10位次甲基上的质子δ Η 5·02(Η-10)与δ。193.0(09)和79.7(05) 相关。为了确定Cl原子取代基的位置，测定了化合物3在氘代丙酮中的核磁数据。结果显示： 一个羟基信号（3h 5.19)位于C-6上，另一个羟基信号（3h 4.69)位于05上，并且羟基质子5[1 5.19与C-7，C-5和C-6相关，羟基质子δΗ 4.69与C-4，C-5，C-6和C-10相关。
[0033] 由N0ESY实验结果可以看出：Η-4与Η-6和Η-10相关确定了对应C-5、C-6和C-10构 型，并且从 1H-匪R计算出Η-ll和H-12的耦合常数为15.3HZ，揭示了位于C-11的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物3的相对构型，并将其命名为pestalotic acid C〇
[0034] 化合物4:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-EI-MS([M]+m/ Z338.1285)确定其分子式为C18H2335Cl〇4,化合物4的与化合物3的不同之处在于化合物9中 的6元环在化合物4中变为了苯环。
[0035]基于以下的HMBC谱的相关数据，可以看出化合物4中的2个羟基和1个C1原子取代 基分别位于C-6，C-9和C-10上：3位烯基上的质子δΗ 6.72(!1-3)与5。172.0(C-1)，128.6(w) (〇5)，28.8(〇4)和12.9((：-18)相关，4位的质子3[ 13.70(!1-4)与3。172.0(￥)((：-1)，146.3 (C-6) ,141.3(C-3) ,129.1 (C-2) ,128.6(C-5)和121.1 (C-10)相关；8位芳环上的质子δΗ 6.88(!1-8)与知 148.3(09)，146.3(06)，125.4(C-11)和121.1 (C-10)相关；11位烯基上的 质子δΗ 6·64(H-11)与δ。146.3(06)，127.9(07)，112.0(08)和34.6(013)相关。
[0036] 从1Η-匪R计算出Η-ll和Η-12的耦合常数为15.6HZ，揭示了位于C-11的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物4的相对构型，并将其命名为pestalotic acid D〇
[0037] 化合物5:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M+H]+m/z 413.2665; calc. 413.2668)确定其分子式为C21H26〇7，根据1H-、 13C-NMR和DEPT谱数据可以判 断出化合物5是ambui c ac id的类似物[9,13 ]。
[0038] 通过与ambuic acid进行比较后发现，6位甲基上的质子δΗ 3.82(H_6)与5c193.3C-7)，134.2(〇9)和62.7(〇5)相关，19位含氧亚甲基的质子5 114.79和5.08(!1-19)与5。193.3 (C-7)，172.1 (C-1)，144.6(C-8)和134.2(C-9)相关，以上的相关说明了9-OH被氧化为酮基， 一个乙酰基与19-OH相连接。
[0039] 由N0ESY实验结果可以看出：H-4和H-10相关确定了对应C-5和C-10构型，并且从 h-NMR计算出Η-ll和H-12的耦合常数为15.8Hz，揭示了位于C-11的双键是E构型，基于上述 实验结果，由此得出了化合物5的相对构型，并将其命名为pestalotic acid E。
[0040] 化合物6:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M+H]+m/z 371.1464; calc. 371.1471)确定其分子式为C19H24〇6，根据1Η-谱、 13C-谱和DEPT谱数据可以判 断出化合物6是ambuic acid的类似物。
[0041 ]表2化合物1-9的氢谱数据
[0043] a核磁数据在CD30D中获得·
[0044] b核磁数据在⑶3C0⑶3获得
[0045] 通过与ambuic acid进行比较后发现，由HMBC的相关发现一个位于C-11/C-12的 双键移动到了 C-12/C-13,而C-11上则通过氧桥连接上了一个亚甲基(C-19):19位亚甲基上 的一个质子δΗ 4·79(Η-19)与Sc190.2(C-10)，157.0(C-8)，132.0(C-9)，129.4(C-12WP86.8 (C-11)相关，11位含氧次甲基的质子δ Η 5.29(H-11)与δ。157.0(C-8)和134.2(C-13)相关。
[0046] 由N0ESY实验结果可以看出：H-4与H-6和H-10相关确定了对应C-5、C-6与C-10构 型，并且从1H-匪R计算出H-12和H-13的耦合常数为18.3H Z，揭示了位于C-12的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物6的相对构型，并将其命名为pestalotic acid F〇
[0047] 化合物7:褐色油状，结合13C谱和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M+H]+m/z 389 · 1575; calc · 389 · 1576)确定其分子式为 C19H26O7。
[0048] 通过与ambuic acid进行比较后，并通过HMBC发现，C-13被氧化，连了一个羟基位 于C-13上：12位烯基上的质子δΗ 5·92(Η-12)与5。131.3(09)，122.2(011)，73.5((：-13)和 38.0(〇14)相关，13位含氧次甲基的质子4.14(!1-13)与心142.0((：-12)，122.2((：-13)， 38.0(014)和 28.79(015)相关。
[0049] 由N0ESY实验结果可以看出：Η-4与Η-6和Η-10相关确定了对应C-5、C-6与C-10构 型，并且从1H-匪R计算出H-12和H-13的耦合常数为16.0Hz，揭示了位于C-12的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物7的相对构型，并将其命名为pestalotic acid G〇
[0050] 化合物8 :褐色油状，结合13C谱和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS( [M+H]+m/z 389 · 1573; calc · 389 · 1576)确定其分子式为 C19H26O7。
[0051] 通过与ambuic acid进行比较后，并通过HMBC发现，C-14被氧化，并且一个羟基位 于C-14上：11位烯基上的质子δΗ 6·23(Η-11)与Sc196.0(C-10)，151.1(C-8)，136.5(C-12), 131.9(09)，71.8(014)和42.6((：-13)相关 ；13位亚甲基上的质子5[12.35(!1-13)与5。136.5 (C-12)，124.9(C-11)，71.8(C-14)和40.2(C-15)相关；14位含氧次甲基上的质子δ Η 3.67 (Η-14)与 δ。136.5(012)，40.2(015)和19.9((：-16)相关。
[0052] 由N0ESY实验结果可以看出：Η-4与Η-6和Η-10相关确定了对应C-5、C-6与C-10构 型，并且从1H-匪R计算出H-11和H-12的耦合常数为15.9Hz，揭示了位于C-l 1的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物8的相对构型，并将其命名为pestalotic acid H〇
[0053] 化合物9 :褐色油状，结合13C谱和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS( [M+H]+m/z 389 · 1573; calc · 389 · 1576)确定其分子式为 C19H26O7。
[0054] 通过与ambuic acid进行比较后，并通过HMBC发现，C-16被氧化，并且一个羟基位 于C-16上：17位甲基上的质子δΗ 1.16(H-17)与δ[68.4((Μ6)和39.6(015)相关；16位含氧 次甲基上的质子δΗ 3·75(Η-16)与δ。39.6(C-15)，26.4(C-14)和23.5(C-17)相关。
[0055] 由N0ESY实验结果可以看出：Η-4与Η-6和Η-10相关确定了对应C-5、C-6与C-10构 型，并且从 1H-匪R计算出Η-ll和H-12的耦合常数为15.5HZ，揭示了位于C-11的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物9的相对构型，并将其命名为pestalotic acid I〇
[0056] 本发明的具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物的抗细菌活性应用。
[0057] 本发明相对于现有技术具有以下优点：
[0058] 1、本发明的pestalotic acid化合物获取简单，具有抗细菌活性，可以作为抗细 菌剂用于防治植物青枯病。
[0059] 2、本发明的pestalotic acid化合物为研制抗细菌剂，防治植物病害提供了新的 途径。
[0060] 3、本发明的pestalotic acid化合物抗细菌活性高，能够作为抗细菌剂用于防治 植物青枯病。
【附图说明】
[0061 ] 图1为本发明的pestalotic acid化合物的结构式。
【具体实施方式】
[0062]以下通过实施例对本发明做进一步详细描述，但本发明并不限于下述的实施例。 [0063] 实施例1:
[0064] pestalotic acid化合物的分离制备：
[0065] a)培养基和培养条件
[0066] 改良M-1-D培养基：NaH2P〇4 · H20 20mg，FeCl3 2.0mg，MgS〇4 360mg，KCl 60mg，Ca (N03)2 2280mg，KN03 80mg，蔗糖30g，酒石酸铵5g，酵母浸膏0.5g，MnS〇4 5.0mg，ZnS〇4.7H20 2.5mg，H3B〇4 1.4mg，KI 0.7mg，蒸馏水 1000mL，琼脂 15-20g，pH自然。
[0067] 培养条件:菌株cr014用改良M-1-D培养基发酵30L，室温下培养20d。
[0068] b)发酵产物的提取与分离
[0069]将已发酵20d的改良Fries培养基连同其上的菌落一同切为细小块状，用乙酸乙 酯：甲醇：乙酸= 80:15:5(V/V/V)混合溶剂浸泡提取3次，将3次提取物合并浓缩后，再用乙 酸乙酯萃取至颜色不再改变，最后用旋转蒸发仪45°C减压浓缩至干得浸膏(37.337g)。 [0070]将乙酸乙酯萃取后所得的浸膏（37.337g)用适量的溶剂溶解后，用硅胶（100-200 目）拌样，经正相柱层析（200-300目），用石油醚：乙酸乙酯= (10:1-6:4)，氯仿：甲醇= (20:1-0:100)系统梯度洗脱，经TLC层析检测，将含 有相同Rf值和显色情况化合物的组分 合并在一起，分别减压浓缩至干，共分为10个组分:Fr. 1-Fr. 10。
[0071 ] Fr.4(8.423g)经Sephadex LH_20(氯仿：甲醇=1:1)分离后得到4个组分(？1*.4.1-Fr. 4.4);其中Fr. 4.2 (635mg)经S印hadex LH-20 (甲醇）分离后，再经NP7000型-高效液相色 谱仪分离得到化合物5(1.2mg)和化合物4(3.9mg) ;Fr.4.4(63mg)经Sephadex LH-20(氯仿： 甲醇= 1:1)分离后得到化合物2(12.2mg)。
[0072] Fr · 5(2 · 377g)经Sephadex LH-20(甲醇）分离后得到5个组分(Fr · 5 · 1-Fr · 5 · 5);其 中Fr · 5 · 4(329mg)经Sephadex LH-20 (甲醇)分离后，再用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填 装为GF254硅胶，用石油醚:丙酮= (8:2)系统进行等度洗脱，得到化合物3(9.8mg)。
[0073] Fr.6(213mg)经Sephadex LH_20(氯仿：甲醇=1:1)分离后得到4个组分(卩1*.6.1-Fr. 6.4);其中Fr. 6.2用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用石油醚:丙酮= (8:2)系统进行等度洗脱，得到化合物10(9.8mg) ;Fr.6.3经Sephadex LH-20(氯仿：甲醇= 1:1)分离后得到Fr. 6.3.1;Fr. 6.3.1用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用 含有0.3 %甲酸的石油醚:丙酮=(7: 2)系统进行等度洗脱后，再经Sephadex LH-20(甲醇） 纯化后得到化合物1 (1. lmg)。
[0074] Fr.8(386mg)经Sephadex LH-20(丙酮）分离后得到3个组分(Fr.8.1-Fr.8.3);其 中Fr.8.1经NP7000型-高效液相色谱仪分离得到3个亚组分（Fr.8.1. l-Fr.8.1.3); Fr. 8.1.1用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用含有0.3%甲酸的石油醚： 丙酮=(7 :3)系统进行等度洗脱后，得到化合物9(4.5mg);Fr. 8.1.3经NP7000型-高效液相 色谱仪分离得到4个亚组分(Fr · 8 · 1 · 3 · 1-Fr · 8 · 1 · 3 · 4) ;Fr · 8 · 1 · 3 · 3用硅胶（100-200目）拌 样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用含有0.3%甲酸的石油醚:丙酮=(7:3)系统进行等度洗脱 后，得到化合物8( 14. Omg) Jr. 8.1.3.4用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶， 用含有0.3%甲酸的石油醚:丙酮=(7:3)系统进行等度洗脱后，得到化合物7(17.4mg)和化 合物 6(1.0mg)。
[0075] 实施例2:
[0076] pestalotic acid化合物活性研究：
[0077] a)供试化合物及试剂
[0078] 供试化合物:化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物7、化合物8、化合物9; [0079]阳性对照：Cefotaxime;
[0080] 供试菌种：Ralstoniasolanacearum，Salmonella typhi ,Escherichia coli , Staphylococcus aureus。
[0081 ] b)检测原理与方法
[0082] 细菌的MICs值采用改良的微生物稀释法测定。4株病原细菌于25°C下在营养琼脂 培养基上培养18至24h，然后用无菌的接种环收集病原细菌菌体，于装有10mL无菌的生理盐 水的离心管中培养。细菌悬浮液的浓度在630nm光学密度为0.10的标准条件下调整为 108CFU/mL。该浓度的细菌悬浮液在使用前稀释100倍，最终浓度为106CFU/mL。所有被测试 的化合物均溶解于DMS0中，最终配成浓度为4ygAxL的溶液。测定活性时采用倍比稀释法，将 不同浓度的待测化合物和含有细菌悬浮液的肉汤添加到96孔版中，最终反应体积定在200μ L(DMS0的最终浓度等于或少于5% )。以DMS0作为阴性对照，未加入化合物和DMS0的细菌悬 浮液作为空白对照，以加入Cefotaxime作为阳性对照。最后将96孔板置于37°C下培养24h。 24h后，通过测定吸光(0D)值确定细菌增长量，细菌增长量几乎为0时的化合物浓度即为MIC 值。每个处理均设置3次重复。
[0083] 研究测定了化合物2-5和化合物7-9抗4种病原细菌(R. solanacearum，Salmonella typhi，E.coli，Staphylococcus aureus)的活性。所有被测定的化合物均有抗细菌活性，结 果见表3。从结果中可以看出化合物2、化合物3、化合物7和化合物8抑制R. Solanacearum生 长的能力与阳性对照Cefotaxime-样强，因此这几种化合物可以作为抗细菌剂用于防治植 物青枯病。
[0084] 表3化合物抗细菌活性(yg/mL)
[0086]注：表示MIC>100yg/mL时无活性。
[0087] 实施例3:
[0088] pestalotic acid化合物理化常数和波谱数据：
[0089] Pestalotic acidA( 1):褐色油状，[Q ]f= - 47, 0 '(C = 0· 33，MoOli) ;UV (MeOH)Amax(loge):292(4.10),206(4.25);NMR data see Tables 1 and 2;ESI-MS:349 [M-H] -;HR-ESI-MS :349.1658(349[M-H]-，calc .349.1651)。
[0090] Pestalotic acidB(2):褐色油状，[a ]= = - 7. 33 (C 二 0, 10，MeOH) ;UV (Me0H)Amax(l〇ge) :318(4.16) ,232(4.30) ,207(4.40) ;ESI-MS:345[M-H] - ;HR-ESI-MS: 345.1338([M-H]-，calc.345.1338)。
[0091 ] Pe s ta 1 o t i c a c idC(3):褐色油状，[a ]「/= - 23.0 (c=0. 19，MoOll) ;UV (Me0H)Amax(l〇ge)nm:285(4.31) ,204(4.20) ；ESI-MS:357[M+H] + ,359[M+2+H]+,379[M+Na] + , 381 [M+2+Na] + ；HR-ESI-MS: 379.1284( [M+Na]+,calc. 379.1288) 〇
[0092] Pestalotic acidD(4):褐色油状，.[a = 7 (C. = .0. 1.2，iUoOli、）；UV (Me0H)Amax(l0ge)nm:317(3.82) ,217(4.52) ;ESI-MS:337[M-H]-，339[M+2-H] - ;HR-EI-MS: 338.1285([M] + ,calc.338.1285) 〇
[0093] Pestalotic acidE(5):褐色油状，[a = + 20 (c = 0. 1? i\k、()l:I) ;UV (Me0H)Amax(l0ge) :310(3.47) ,208(4.07) ；ESI-MS:413[M+H] + ；HR-ESI-MS:413.2665([M+H ]+，calc.413.2668)。
[0094] Pestalotic ac idF(6):褐色油状，[a :]^1 = + 10. 89 (c = 07，MeOH) ;uv (Me0H)Amax(l〇ge) :257(3.73) ,203(4.26) ；ESI-MS:371 [M+Na] + ；HR-ESI-MS:371.1464([M+ Na]+,calc.371.1471)〇
[0095] Pestalotic acidG(7):褐色油状，[€( = + 96, 98 (C = 0. 07, ;UV (Me0H)Amax(l0ge) :269(3.81) ,211(4.59) ；ESI-MS:389[M+Na] + ；HR-ESI-MS:389.1575([M+ Na]+,calc.389.1576)〇
[0096] Pestalotic acidH(8):褐色油状，[a 二 + 8S. 18 (C = 0· 22，MoOli) ;UV (Me0H)Amax(l0ge) :274(3.60) ,211(4.41) ；ESI-MS:389[M+Na] + ；HR-ESI-MS:389.1573([M+ Na]+,calc.389.1576)〇
[0097] Pestalotic acidl(9):褐色油状，[α M:1 = + 76. 67 :(C = 0. 20，MoO丨丨）；UV (Me0H)Amax(l0ge) :273(3.59) ,208(4.37) ；ESI-MS:389[M+Na] + ；HR-ESI-MS:389.1573([M+ Na]+,calc.389.1576)〇
[0098] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物，是将重寄生拟盘多毛抱菌株发酵培养 后，再经提取与分离后得到的化合物。2. 如权利要求1所述具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物，其特征在于，结构式 如下：3. 如权利要求2所述具有抗细菌活性的化Stalotic acid化合物的抗细菌活性应用。
【专利摘要】本发明提供了一类具有抗细菌活性的Pestalotic？acid化合物，是将重寄生拟盘多毛孢菌株发酵培养后，再经提取与分离后得到的化合物，本发明的pestalotic？acid化合物获取简单，具有抗细菌活性，抗细菌活性高，能够作为抗细菌剂用于防治植物青枯病，为研制抗细菌剂，防治植物病害提供了新的途径。
【IPC分类】A01N43/90, C07D493/04, C07C59/90, A01N43/20, A01N37/38, A01N37/42, C07D307/79, A01P1/00, C07C59/56, C07D303/38
【公开号】CN105503780
【申请号】CN201510955816
【发明人】赵沛基, 李靖, 谢津
【申请人】中国科学院昆明植物研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月17日
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一类具有抗细菌活性的Pestalotic acid 化合物及其应用。
【背景技术】
[0002]植物内生真菌（fungal endophyte)是指生活史的一定阶段或全部阶段生活与健 康植物各组织合格器官内的真菌。它们与宿主植物通过相互作用形成了紧密的共生关系， 可以促进植物的生长，提供植物应对胁迫的适应能力，有的植物内生真菌还具有药用价值。 从植物内生真菌中寻找和发现活性化合物已成为国内外研究的又一热点，如中国专利文献 CN201310194836.5公开了 一株龙胆中分离得到的内生真菌(]\^七31'1'11丨2；[11111)11)421，可用于 防治龙胆叶枯病;专利申请CN201210067829.4则公开了从银杏根、茎、叶等组织中分离得到 的内生真菌腐皮镰孢菌T-7，对辣椒疫霉病菌、番茄枯萎病菌、苹果腐烂病菌等具有很好的 抑制作用。
[0003]目前在农业生产过程中控制农作物病虫草害的主要手段是化学农药防治，其对减 轻病虫草害，保证农作物丰产丰收起到积极的作用，但是由于自然界生物之间的相互制约 相互依存，现在已不建议过分依赖化学农药在进行病害的处理；因此，对植物内生真菌的研 究，利用植物内生真菌与宿主植物生物活性共生的关系，来筛选具有高生物活性的内生真 菌，进一步获得活性产物，是近年来研究的一大热点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的旨在提供一类具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物及其抗 细菌活性应用。
[0005] 本发明的具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物，是将重寄生拟盘多毛孢菌 株发酵培养后，再经提取与分离后得到的化合物，结构式如下：
[0006]
[0007] 本发明的具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物的制备方法，包括以下工艺 步骤：
[0008] 步骤①:将重寄生拟盘多毛孢菌株用培养基室温下培养10-30天；
[0009] 步骤②:将所述步骤①中培养基连同其上的菌落一同切为块状，然后使用混合溶 剂浸泡提取3次;将3次提取物合并浓缩后，用萃取剂萃取至颜色不再改变，然后用旋转蒸 发仪40_50°C减压浓缩至干得浸膏；
[0010] 步骤③:将所述步骤②中的浸膏用溶剂溶解后再用硅胶拌样，经正相柱层析，然后 用石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇系统梯度洗脱，最后经过TLC层析检测，将含有相同Rf值和 显色情况的化合物组分合并在一起，分别减压浓缩至干，得到10个组分Fr. 1至Fr. 10;
[0011] 步骤④:将所述步骤③中的化合物组分Fr. 1至Fr. 10分别用常规分离或洗脱方法 中的一种或多种组合进行反复分离、洗脱后得到具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合 物，所述常规分离或洗脱方法为以下所列方法：
[0012] (l)Sephadex LH-20分离；
[0013] (2)NP7000型-高效液相色谱仪分离；
[0014] ⑶用硅胶拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用石油醚-丙酮系统进行等度洗脱。
[0015] 所述步骤①中培养基的组成（改良M-1-D培养基）：NaH2P〇4.H2〇 20mg，FeCl3 2.0mg，MgS〇4 360mg，KCl 60mg，Ca(N〇3)2 2280mg，KN〇3 80mg，鹿糖30g，酒石酸铵5g，酵母浸 膏0.5g，MnS〇4 5.0mg，ZnS〇4.7H2〇 2.5mg，H3B〇4 1.4mg，KI 0.7mg，蒸馏水lOOOmL，琼脂 15- 20g，pH自然;所述步骤①中培养基的体积为30L。
[0016]所述步骤①中的重寄生拟盘多毛孢菌株为重寄生拟盘多毛孢菌株cr014。
[0017] 所述步骤②中混合溶剂为乙酸乙酯：甲醇：乙酸=80:15:5 (V/V/V)，萃取剂为乙酸 乙酯。
[0018] 所述用于拌样的硅胶为100-200目，所述步骤③中正相柱层析所用硅胶为200-300 目，石油醚-乙酸乙酯、氯仿-甲醇系统梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯为10:1-6:4,氯仿：甲 醇为 20:1-0:100。
[0019] 所述步骤④中Sephadex LH-20分离时所用的洗脱剂为氯仿：甲醇=1:1、甲醇、丙 酮中的一种;所述步骤④中用石油醚-丙酮系统进行等度洗脱时石油醚:丙酮为8:2-7:3。
[0020] 本发明所述化合物分子结构式(1)到（10)分别对应化合物1到10:
[0021 ] 化合物1:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M-H]-m/z 349.1658)确定其分子式为C19H26〇6,从13C NMR谱和DEPT谱上可以看出化合物7中含有6个季 碳信号（3。197.1、171.4、151.4、133.0、130.3和64.6)，5个次甲基（3。143.3、136.1、127.3、 66.4和59.2)，6个亚甲基（3。55.1、35.2、32.8、31.0、29.8和23.7)和2个甲基（3。14.5和 13.0) 〇
[0022] 根据1H-匪R数据显示：由于具有一个单峰甲基（δΗ1.89, s)和一个三重峰甲基（δ η0.94，t，J = 7.0Hz)，表明化合物1的平面结构与ambuic ac id的类似物相似。由COSY谱中的 数据可以看出该化合物的关键相关点（Η-3/Η-4;Η-11/Η-12/Η-13/Η-14/Η-15/Η-16/Η-17)， 由此可以推导出该化合物具有-C-3-C-4-和-C-11-C-12-C-13-C-14-C-15-C-16-C-17-2 个 片段。该化合物详细的结构由2D-NMR确定，根据HMBC上的数据显示:3位烯基的质子δΗ 6.84 (!1-3)与3。171.4(〇1)，133.0((：-2)，31.0((：-4)，64.6((：-5)和13.0((：-18)相关，18位甲基上 的质子知 1.89(Η-18)与 δ。171.4((：-1)，133.0((：-2)和136.1((：-3)相关;4位亚甲基上的质 子3 113.18和2.74(!1-4)与5。133.0((：-2)，136.1((：-3)，64.6((：-5)和59.2((：-10)相关 ；6位的 质子δΗ 4·85(Η-6)与151.4(〇7)，130.3(〇8)，127.3((：-11)和31.0((：-4)相关；19位的质 子δ Η 4.49和4·28(Η-19)与δ。197.1(C-9)，151.4(C-7)和 130.3(C-4)相关。通过结合其他 相关点，可以推断出该化合物的平面结构。
[0023] 化合物1的相对构型由N0ESY实验确定，Ν0Ε数据显示:H-4、H-6和H-10相关确定了 对应C-5、C-6和C-10构型，并且从1Η-NMR计算出H-11和H-12的耦合常数为15.9Hz，揭示了位 于C-11的双键是E构型，由此得出了化合物1的相对构型，并将其命名为pestalotic acid A〇
[0024] 化合物2:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M-H]-m/z 349.1658;calc.345.1338)确定其分子式为C19H22O6,从13C NMR谱和DEPT谱上可以看出化合 物2中含有 9 个季碳信号（δ。169.1、162.1、148.5、148.1、140.8、129.7、122.6、119.2和 110.7)，3个次甲基（3。195.0、138.5和100.4)，5个亚甲基（3。32.1、29.1、28.2、24.9和 23.1) 和2个甲基0。14.3和12.7)。
[0025] 表1化合物1-9的碳谱数据
[0027] a核磁数据在⑶30D中获得.
[0028] b核磁数据在⑶3C0⑶3获得
[0029] 由1H_NMR、13C匪R和DEPT谱数据可以看出化合物2是ambuic acid的类似物，区别 在于ambuic acid中的6元环在该化合物中变为了苯环。由COSY谱中的数据可以看出该化合 物的关键相关点(H-3/H-4;H-13/H-14/H-15/H-16/H-17)，由此可以推导出该化合物具有-C-3-C-4-和-C-13-C-14-C-15-C-16-C-17-2个片段。该化合物的细微结构由2D-NMR确定，根 据HMBC谱的数据可以看出苯环上连接有3个羟基、1个醛基和1个异戊烯基基团；3位烯基的 质子δ Η 6·96(H-3)与δ。169.1(01)，129.7(02) ,24.9(04)，119.2(C-5) (w)和 12.7(018) 相关，18位甲基上的质子δΗ 2.06(H-18)与δ。169.1(〇1)，129.7(〇2)和138.5.0((：-3)相 关；4位亚甲基上的质子δ Η 3·87(Η-4)与5。169.1(01)，129.7(02)，138.5((：-3)，119.2((：- 5)，148.1((：-6)和140.8((：-10)相关；11位烯基的质子5116.97(!1-11)与心148.1((：-6)， 122.6(07) ,162.1(12)和29.1(013)相关；13位的质子5(12.84(!1-13)与心 l〇〇.4(C-ll)， 162.1(〇12)，28.2(〇14)和32.1(〇15)相关；19位醛基上的质子5( 110.34(!1-19)与3。 148.1(06)，122.6(07)，110.7(08)，148.5(09)和 140.8(010)相关。
[0030] 最后用化合物的总不饱和度除了双键、两个酮基以及苯环的不饱和度外，还有一 个不饱和度，暗示了还有一个额外的环状结构在该化合物的骨架上:该环是C-6和C-12通过 氧桥连接形成的。基于上述数据可以推断出化合物2的结构，最后将其命名为pestalotic acid B〇
[0031 ] 化合物3 :褐色油状，结合13C匪R和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS( [M+Na]+m/z 379.1284)确定其分子式为C18H2535C105，并从化合物3的ESI-MS的实验数据中可以观察到化 合物3的分子量中有一个为m/z 381[M+2+Na] +同位素峰，其丰度为另一个同位素峰m/z 379 [M+Na]+的三分之一，因此可以判定化合物3中含有一个Cl原子取代基。
[0032]化合物3在HMBC和COSY谱上的关键相关点和化合物1的几乎一样，除了化合物3中 少了一个化学位移为知55.1的碳，以及在6元环上多了一个C1原子取代基。在化合物3中，6 位的质子δΗ 4·43(Η-6)与δ。156.1(07)，lSO.SCC-llhWlSCCDjg.TKDjO.iKC- iO) 和 36.9(C-4) 相关， 18 位烯基上的质子 5111.91(!1-18)与知171.8((：-1)，132.0((：-2)，137.6 (C-3)和36.9(04)相关；10位次甲基上的质子δ Η 5·02(Η-10)与δ。193.0(09)和79.7(05) 相关。为了确定Cl原子取代基的位置，测定了化合物3在氘代丙酮中的核磁数据。结果显示： 一个羟基信号（3h 5.19)位于C-6上，另一个羟基信号（3h 4.69)位于05上，并且羟基质子5[1 5.19与C-7，C-5和C-6相关，羟基质子δΗ 4.69与C-4，C-5，C-6和C-10相关。
[0033] 由N0ESY实验结果可以看出：Η-4与Η-6和Η-10相关确定了对应C-5、C-6和C-10构 型，并且从 1H-匪R计算出Η-ll和H-12的耦合常数为15.3HZ，揭示了位于C-11的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物3的相对构型，并将其命名为pestalotic acid C〇
[0034] 化合物4:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-EI-MS([M]+m/ Z338.1285)确定其分子式为C18H2335Cl〇4,化合物4的与化合物3的不同之处在于化合物9中 的6元环在化合物4中变为了苯环。
[0035]基于以下的HMBC谱的相关数据，可以看出化合物4中的2个羟基和1个C1原子取代 基分别位于C-6，C-9和C-10上：3位烯基上的质子δΗ 6.72(!1-3)与5。172.0(C-1)，128.6(w) (〇5)，28.8(〇4)和12.9((：-18)相关，4位的质子3[ 13.70(!1-4)与3。172.0(￥)((：-1)，146.3 (C-6) ,141.3(C-3) ,129.1 (C-2) ,128.6(C-5)和121.1 (C-10)相关；8位芳环上的质子δΗ 6.88(!1-8)与知 148.3(09)，146.3(06)，125.4(C-11)和121.1 (C-10)相关；11位烯基上的 质子δΗ 6·64(H-11)与δ。146.3(06)，127.9(07)，112.0(08)和34.6(013)相关。
[0036] 从1Η-匪R计算出Η-ll和Η-12的耦合常数为15.6HZ，揭示了位于C-11的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物4的相对构型，并将其命名为pestalotic acid D〇
[0037] 化合物5:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M+H]+m/z 413.2665; calc. 413.2668)确定其分子式为C21H26〇7，根据1H-、 13C-NMR和DEPT谱数据可以判 断出化合物5是ambui c ac id的类似物[9,13 ]。
[0038] 通过与ambuic acid进行比较后发现，6位甲基上的质子δΗ 3.82(H_6)与5c193.3C-7)，134.2(〇9)和62.7(〇5)相关，19位含氧亚甲基的质子5 114.79和5.08(!1-19)与5。193.3 (C-7)，172.1 (C-1)，144.6(C-8)和134.2(C-9)相关，以上的相关说明了9-OH被氧化为酮基， 一个乙酰基与19-OH相连接。
[0039] 由N0ESY实验结果可以看出：H-4和H-10相关确定了对应C-5和C-10构型，并且从 h-NMR计算出Η-ll和H-12的耦合常数为15.8Hz，揭示了位于C-11的双键是E构型，基于上述 实验结果，由此得出了化合物5的相对构型，并将其命名为pestalotic acid E。
[0040] 化合物6:褐色油状，结合13C NMR和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M+H]+m/z 371.1464; calc. 371.1471)确定其分子式为C19H24〇6，根据1Η-谱、 13C-谱和DEPT谱数据可以判 断出化合物6是ambuic acid的类似物。
[0041 ]表2化合物1-9的氢谱数据
[0043] a核磁数据在CD30D中获得·
[0044] b核磁数据在⑶3C0⑶3获得
[0045] 通过与ambuic acid进行比较后发现，由HMBC的相关发现一个位于C-11/C-12的 双键移动到了 C-12/C-13,而C-11上则通过氧桥连接上了一个亚甲基(C-19):19位亚甲基上 的一个质子δΗ 4·79(Η-19)与Sc190.2(C-10)，157.0(C-8)，132.0(C-9)，129.4(C-12WP86.8 (C-11)相关，11位含氧次甲基的质子δ Η 5.29(H-11)与δ。157.0(C-8)和134.2(C-13)相关。
[0046] 由N0ESY实验结果可以看出：H-4与H-6和H-10相关确定了对应C-5、C-6与C-10构 型，并且从1H-匪R计算出H-12和H-13的耦合常数为18.3H Z，揭示了位于C-12的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物6的相对构型，并将其命名为pestalotic acid F〇
[0047] 化合物7:褐色油状，结合13C谱和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS([M+H]+m/z 389 · 1575; calc · 389 · 1576)确定其分子式为 C19H26O7。
[0048] 通过与ambuic acid进行比较后，并通过HMBC发现，C-13被氧化，连了一个羟基位 于C-13上：12位烯基上的质子δΗ 5·92(Η-12)与5。131.3(09)，122.2(011)，73.5((：-13)和 38.0(〇14)相关，13位含氧次甲基的质子4.14(!1-13)与心142.0((：-12)，122.2((：-13)， 38.0(014)和 28.79(015)相关。
[0049] 由N0ESY实验结果可以看出：Η-4与Η-6和Η-10相关确定了对应C-5、C-6与C-10构 型，并且从1H-匪R计算出H-12和H-13的耦合常数为16.0Hz，揭示了位于C-12的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物7的相对构型，并将其命名为pestalotic acid G〇
[0050] 化合物8 :褐色油状，结合13C谱和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS( [M+H]+m/z 389 · 1573; calc · 389 · 1576)确定其分子式为 C19H26O7。
[0051] 通过与ambuic acid进行比较后，并通过HMBC发现，C-14被氧化，并且一个羟基位 于C-14上：11位烯基上的质子δΗ 6·23(Η-11)与Sc196.0(C-10)，151.1(C-8)，136.5(C-12), 131.9(09)，71.8(014)和42.6((：-13)相关 ；13位亚甲基上的质子5[12.35(!1-13)与5。136.5 (C-12)，124.9(C-11)，71.8(C-14)和40.2(C-15)相关；14位含氧次甲基上的质子δ Η 3.67 (Η-14)与 δ。136.5(012)，40.2(015)和19.9((：-16)相关。
[0052] 由N0ESY实验结果可以看出：Η-4与Η-6和Η-10相关确定了对应C-5、C-6与C-10构 型，并且从1H-匪R计算出H-11和H-12的耦合常数为15.9Hz，揭示了位于C-l 1的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物8的相对构型，并将其命名为pestalotic acid H〇
[0053] 化合物9 :褐色油状，结合13C谱和DEPT谱，高分辨质谱HR-ESI-MS( [M+H]+m/z 389 · 1573; calc · 389 · 1576)确定其分子式为 C19H26O7。
[0054] 通过与ambuic acid进行比较后，并通过HMBC发现，C-16被氧化，并且一个羟基位 于C-16上：17位甲基上的质子δΗ 1.16(H-17)与δ[68.4((Μ6)和39.6(015)相关；16位含氧 次甲基上的质子δΗ 3·75(Η-16)与δ。39.6(C-15)，26.4(C-14)和23.5(C-17)相关。
[0055] 由N0ESY实验结果可以看出：Η-4与Η-6和Η-10相关确定了对应C-5、C-6与C-10构 型，并且从 1H-匪R计算出Η-ll和H-12的耦合常数为15.5HZ，揭示了位于C-11的双键是E构 型，基于上述实验结果，由此得出了化合物9的相对构型，并将其命名为pestalotic acid I〇
[0056] 本发明的具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物的抗细菌活性应用。
[0057] 本发明相对于现有技术具有以下优点：
[0058] 1、本发明的pestalotic acid化合物获取简单，具有抗细菌活性，可以作为抗细 菌剂用于防治植物青枯病。
[0059] 2、本发明的pestalotic acid化合物为研制抗细菌剂，防治植物病害提供了新的 途径。
[0060] 3、本发明的pestalotic acid化合物抗细菌活性高，能够作为抗细菌剂用于防治 植物青枯病。
【附图说明】
[0061 ] 图1为本发明的pestalotic acid化合物的结构式。
【具体实施方式】
[0062]以下通过实施例对本发明做进一步详细描述，但本发明并不限于下述的实施例。 [0063] 实施例1:
[0064] pestalotic acid化合物的分离制备：
[0065] a)培养基和培养条件
[0066] 改良M-1-D培养基：NaH2P〇4 · H20 20mg，FeCl3 2.0mg，MgS〇4 360mg，KCl 60mg，Ca (N03)2 2280mg，KN03 80mg，蔗糖30g，酒石酸铵5g，酵母浸膏0.5g，MnS〇4 5.0mg，ZnS〇4.7H20 2.5mg，H3B〇4 1.4mg，KI 0.7mg，蒸馏水 1000mL，琼脂 15-20g，pH自然。
[0067] 培养条件:菌株cr014用改良M-1-D培养基发酵30L，室温下培养20d。
[0068] b)发酵产物的提取与分离
[0069]将已发酵20d的改良Fries培养基连同其上的菌落一同切为细小块状，用乙酸乙 酯：甲醇：乙酸= 80:15:5(V/V/V)混合溶剂浸泡提取3次，将3次提取物合并浓缩后，再用乙 酸乙酯萃取至颜色不再改变，最后用旋转蒸发仪45°C减压浓缩至干得浸膏(37.337g)。 [0070]将乙酸乙酯萃取后所得的浸膏（37.337g)用适量的溶剂溶解后，用硅胶（100-200 目）拌样，经正相柱层析（200-300目），用石油醚：乙酸乙酯= (10:1-6:4)，氯仿：甲醇= (20:1-0:100)系统梯度洗脱，经TLC层析检测，将含 有相同Rf值和显色情况化合物的组分 合并在一起，分别减压浓缩至干，共分为10个组分:Fr. 1-Fr. 10。
[0071 ] Fr.4(8.423g)经Sephadex LH_20(氯仿：甲醇=1:1)分离后得到4个组分(？1*.4.1-Fr. 4.4);其中Fr. 4.2 (635mg)经S印hadex LH-20 (甲醇）分离后，再经NP7000型-高效液相色 谱仪分离得到化合物5(1.2mg)和化合物4(3.9mg) ;Fr.4.4(63mg)经Sephadex LH-20(氯仿： 甲醇= 1:1)分离后得到化合物2(12.2mg)。
[0072] Fr · 5(2 · 377g)经Sephadex LH-20(甲醇）分离后得到5个组分(Fr · 5 · 1-Fr · 5 · 5);其 中Fr · 5 · 4(329mg)经Sephadex LH-20 (甲醇)分离后，再用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填 装为GF254硅胶，用石油醚:丙酮= (8:2)系统进行等度洗脱，得到化合物3(9.8mg)。
[0073] Fr.6(213mg)经Sephadex LH_20(氯仿：甲醇=1:1)分离后得到4个组分(卩1*.6.1-Fr. 6.4);其中Fr. 6.2用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用石油醚:丙酮= (8:2)系统进行等度洗脱，得到化合物10(9.8mg) ;Fr.6.3经Sephadex LH-20(氯仿：甲醇= 1:1)分离后得到Fr. 6.3.1;Fr. 6.3.1用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用 含有0.3 %甲酸的石油醚:丙酮=(7: 2)系统进行等度洗脱后，再经Sephadex LH-20(甲醇） 纯化后得到化合物1 (1. lmg)。
[0074] Fr.8(386mg)经Sephadex LH-20(丙酮）分离后得到3个组分(Fr.8.1-Fr.8.3);其 中Fr.8.1经NP7000型-高效液相色谱仪分离得到3个亚组分（Fr.8.1. l-Fr.8.1.3); Fr. 8.1.1用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用含有0.3%甲酸的石油醚： 丙酮=(7 :3)系统进行等度洗脱后，得到化合物9(4.5mg);Fr. 8.1.3经NP7000型-高效液相 色谱仪分离得到4个亚组分(Fr · 8 · 1 · 3 · 1-Fr · 8 · 1 · 3 · 4) ;Fr · 8 · 1 · 3 · 3用硅胶（100-200目）拌 样，洗脱柱填装为GF254硅胶，用含有0.3%甲酸的石油醚:丙酮=(7:3)系统进行等度洗脱 后，得到化合物8( 14. Omg) Jr. 8.1.3.4用硅胶（100-200目）拌样，洗脱柱填装为GF254硅胶， 用含有0.3%甲酸的石油醚:丙酮=(7:3)系统进行等度洗脱后，得到化合物7(17.4mg)和化 合物 6(1.0mg)。
[0075] 实施例2:
[0076] pestalotic acid化合物活性研究：
[0077] a)供试化合物及试剂
[0078] 供试化合物:化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物7、化合物8、化合物9; [0079]阳性对照：Cefotaxime;
[0080] 供试菌种：Ralstoniasolanacearum，Salmonella typhi ,Escherichia coli , Staphylococcus aureus。
[0081 ] b)检测原理与方法
[0082] 细菌的MICs值采用改良的微生物稀释法测定。4株病原细菌于25°C下在营养琼脂 培养基上培养18至24h，然后用无菌的接种环收集病原细菌菌体，于装有10mL无菌的生理盐 水的离心管中培养。细菌悬浮液的浓度在630nm光学密度为0.10的标准条件下调整为 108CFU/mL。该浓度的细菌悬浮液在使用前稀释100倍，最终浓度为106CFU/mL。所有被测试 的化合物均溶解于DMS0中，最终配成浓度为4ygAxL的溶液。测定活性时采用倍比稀释法，将 不同浓度的待测化合物和含有细菌悬浮液的肉汤添加到96孔版中，最终反应体积定在200μ L(DMS0的最终浓度等于或少于5% )。以DMS0作为阴性对照，未加入化合物和DMS0的细菌悬 浮液作为空白对照，以加入Cefotaxime作为阳性对照。最后将96孔板置于37°C下培养24h。 24h后，通过测定吸光(0D)值确定细菌增长量，细菌增长量几乎为0时的化合物浓度即为MIC 值。每个处理均设置3次重复。
[0083] 研究测定了化合物2-5和化合物7-9抗4种病原细菌(R. solanacearum，Salmonella typhi，E.coli，Staphylococcus aureus)的活性。所有被测定的化合物均有抗细菌活性，结 果见表3。从结果中可以看出化合物2、化合物3、化合物7和化合物8抑制R. Solanacearum生 长的能力与阳性对照Cefotaxime-样强，因此这几种化合物可以作为抗细菌剂用于防治植 物青枯病。
[0084] 表3化合物抗细菌活性(yg/mL)
[0086]注：表示MIC>100yg/mL时无活性。
[0087] 实施例3:
[0088] pestalotic acid化合物理化常数和波谱数据：
[0089] Pestalotic acidA( 1):褐色油状，[Q ]f= - 47, 0 '(C = 0· 33，MoOli) ;UV (MeOH)Amax(loge):292(4.10),206(4.25);NMR data see Tables 1 and 2;ESI-MS:349 [M-H] -;HR-ESI-MS :349.1658(349[M-H]-，calc .349.1651)。
[0090] Pestalotic acidB(2):褐色油状，[a ]= = - 7. 33 (C 二 0, 10，MeOH) ;UV (Me0H)Amax(l〇ge) :318(4.16) ,232(4.30) ,207(4.40) ;ESI-MS:345[M-H] - ;HR-ESI-MS: 345.1338([M-H]-，calc.345.1338)。
[0091 ] Pe s ta 1 o t i c a c idC(3):褐色油状，[a ]「/= - 23.0 (c=0. 19，MoOll) ;UV (Me0H)Amax(l〇ge)nm:285(4.31) ,204(4.20) ；ESI-MS:357[M+H] + ,359[M+2+H]+,379[M+Na] + , 381 [M+2+Na] + ；HR-ESI-MS: 379.1284( [M+Na]+,calc. 379.1288) 〇
[0092] Pestalotic acidD(4):褐色油状，.[a = 7 (C. = .0. 1.2，iUoOli、）；UV (Me0H)Amax(l0ge)nm:317(3.82) ,217(4.52) ;ESI-MS:337[M-H]-，339[M+2-H] - ;HR-EI-MS: 338.1285([M] + ,calc.338.1285) 〇
[0093] Pestalotic acidE(5):褐色油状，[a = + 20 (c = 0. 1? i\k、()l:I) ;UV (Me0H)Amax(l0ge) :310(3.47) ,208(4.07) ；ESI-MS:413[M+H] + ；HR-ESI-MS:413.2665([M+H ]+，calc.413.2668)。
[0094] Pestalotic ac idF(6):褐色油状，[a :]^1 = + 10. 89 (c = 07，MeOH) ;uv (Me0H)Amax(l〇ge) :257(3.73) ,203(4.26) ；ESI-MS:371 [M+Na] + ；HR-ESI-MS:371.1464([M+ Na]+,calc.371.1471)〇
[0095] Pestalotic acidG(7):褐色油状，[€( = + 96, 98 (C = 0. 07, ;UV (Me0H)Amax(l0ge) :269(3.81) ,211(4.59) ；ESI-MS:389[M+Na] + ；HR-ESI-MS:389.1575([M+ Na]+,calc.389.1576)〇
[0096] Pestalotic acidH(8):褐色油状，[a 二 + 8S. 18 (C = 0· 22，MoOli) ;UV (Me0H)Amax(l0ge) :274(3.60) ,211(4.41) ；ESI-MS:389[M+Na] + ；HR-ESI-MS:389.1573([M+ Na]+,calc.389.1576)〇
[0097] Pestalotic acidl(9):褐色油状，[α M:1 = + 76. 67 :(C = 0. 20，MoO丨丨）；UV (Me0H)Amax(l0ge) :273(3.59) ,208(4.37) ；ESI-MS:389[M+Na] + ；HR-ESI-MS:389.1573([M+ Na]+,calc.389.1576)〇
[0098] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物，是将重寄生拟盘多毛抱菌株发酵培养 后，再经提取与分离后得到的化合物。2. 如权利要求1所述具有抗细菌活性的Pestalotic acid化合物，其特征在于，结构式 如下：3. 如权利要求2所述具有抗细菌活性的化Stalotic acid化合物的抗细菌活性应用。
【专利摘要】本发明提供了一类具有抗细菌活性的Pestalotic？acid化合物，是将重寄生拟盘多毛孢菌株发酵培养后，再经提取与分离后得到的化合物，本发明的pestalotic？acid化合物获取简单，具有抗细菌活性，抗细菌活性高，能够作为抗细菌剂用于防治植物青枯病，为研制抗细菌剂，防治植物病害提供了新的途径。
【IPC分类】A01N43/90, C07D493/04, C07C59/90, A01N43/20, A01N37/38, A01N37/42, C07D307/79, A01P1/00, C07C59/56, C07D303/38
【公开号】CN105503780
【申请号】CN201510955816
【发明人】赵沛基, 李靖, 谢津
【申请人】中国科学院昆明植物研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月17日
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