环金合欢烷型倍半萜化合物、制备方法和医药用图
环金合欢烷型倍半萜化合物、制备方法和医药用图
【技术领域】
[0001]本发明属于药物技术领域，具体涉及从蜘蛛香的干燥根茎中分离得到的一种具有 心肌保护作用的环金合欢烷型倍半萜类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 蜘蛛香（Valeriana wallichii DC.或Valerianajatamansi Jone)又名马蹄香、土 细辛、印度缬草等，系败酱草科缬草属植物，植株高20~70cm，根茎粗厚，块柱状，节密，有浓 烈香味。蜘蛛香为多年生草本植物，喜长于海拔2500m以下的山顶草地、灌木林中或溪边，在 我国主要分布于陕西、河南、湖北、四川、贵州、云南等地。蜘蛛香根茎具有丰富的药用价值， 传统中医药认为其具有理气止痛、消炎止泻、祛风除湿、镇静安神等功效，可用于治疗脘腹 胀痛、消化不良、腹泻、痢疾、风湿痹痛、蛇毒、失眠、肥胖等症。
[0003] 现代研究表明，蜘蛛香的主要化学成分有挥发油，环烯醚萜类和黄酮类等。蜘蛛香 的药用价值很大一部分归因于其根和茎所含的丰富挥发油，其化学成分比较复杂，主要包 括单萜烯类、倍半萜烯类及其含氧衍生物等。
[0004] 现代研究表明蜘蛛香具有抗肿瘤作用、镇静、镇痛、抗焦虑作用、以及抗轮状病毒 等作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从蜘蛛香的干燥根茎中分离得到的一种具有心肌保护 作用的环金合欢烷型倍半萜类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物(I)，
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将蜘蛛香的干燥根茎粉碎， 用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱 和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱10个柱 体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱 浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] 药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备心肌保护的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021 ]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0022] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0023] 制备方法：（a)蜘蛛香的干燥根茎（10kg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取（25L X 3 次），合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取 物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积， 再用75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏 (163g); (c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1 (8个柱体积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、12:1 (10个柱体积)和1:1 (5个柱体积） 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶 进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积）、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2(30g)用十八烷基硅烷键合的反相 硅胶0DS-C18分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗 脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I) (143mg)。
[0024] 结构确证:无色油状物;HR-ESMS显示[M+Na]+为m/z 271.1304,结合核磁特征可 得分子式为C15H2Q〇3，不饱和度为6。核磁共振氢谱数据δΗ( ΡΡπι，DMS〇-d6，500MHz):H-2(1 · 72， ddd，J=12.7,4.3,2.1)，H-2(1.97，t，J=12.0)，H-3(6.34，m)，H-4(5.98，m)，H-6(1.81，m)， H-7(1.49，m，2H)，H-8(4.20，m)，Η-10(6·15，br，s)，H-12(0.91，s)，H-13(0.94，s)，H-14 (5.05，111)，!1-14(5.08，111)，!1-15(4.93,8,2!〇 ;核磁共振碳谱数据5。(？?111，〇15〇-(16，1251抱）： 35.2(C，1-C)，30.1(CH2,2-C)，127.8(CH，3-C)，127.4(CH，4-C)，145.3(C，5-C)，55.7(CH，6-C)，33.9(CH2,7-C)，74.5(CH，8-C)，176.1(C，9-C)，114.2(CH，10-C)，173.4(C，n-C)，27.1 (01 3，12-〇,27.1(013，13-〇，108.2((：!12，14-〇,70.1(012，15-〇;碳原子标记参见图1。红 外光谱表明该化合物含有α，β-不饱和-γ -内酯和羰基基团（1762,1646CHT1) ,Η-NMR谱数据 显示两个甲基信号[5!10.91(8，]\^-12)，0.94(8，]\^-13)]，一个含氧亚甲基信号[5!14.93(8， !1-15,2!0]，一个烯属亚甲基信号[6!15.05(111，!1-14)和5.08(111，!1-14)]，一个含氧次甲基质子 信号[SH4.20(m，H-8)]，以及三个烯属次甲基质子[SH5.98(m，H-4)，6.15(br，s，H-10)，6.34 (m，H-3) ]。13CNMR谱显示了 15个碳信号，包括两个甲基，四个亚甲基[一个含氧亚甲基SC70.1 (C-15)，一个烯属亚甲基δα08.2((Μ4)]，五个次甲基[三个烯属次甲基SC114.2(C-10)， 127.4(C-4)和127.8(C-3); -个含氧次甲基SC74.5(C-8)]，四个季碳[两个烯属季碳δ C145.3(C-5)和 176.1(09);-个羰基碳3(：173.4((：-11)]。腿8(：谱中，Η-2(δΗ1.97)，H-4，Me-12，Me-13 和 H2-14 与次甲基碳(06);出-2，!1-6，]^-12和]^-13与(：-1;以及!1-4，!1-6和!12-14与 C-5的相关性表明该化合物含有一个环己烯，且其连有偕二甲基基团，以及一个环外亚甲 基。此外，次甲基C-6通过侧链-CH2CH0H-与α，β-不饱和-γ-内酯环相连。HMBC谱中，H 2-7与C-9出-8与09，(：-10和(：-15;!1-10与(：-11;以及!12-15与(：-8，(：-9，(：-10和(：-11的相关性验证了 上述推论。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确 定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图 2) 〇
[0025]实施例2:化合物(I)药理作用试验 [0026] -、材料和仪器
[0027]新生1~3天SD大鼠乳鼠（SPF级），雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中心提供 (试验动物生产许可证:SCXK桂2009-0002)。化合物（I)(纯度2 98% )为自制。胎牛血清购于 Hy Clone公司，DMEM培养基购于GIB⑶公司，二甲基亚砜(DMS0)、0 · 25 %胰酶（含EDTA)购于 Solarbio公司，5-溴脱氧尿苷(5-Brdu)、四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Sigma公司，LDH测 试盒购于南京建成生物工程研究所，N0S试剂盒(分型）南京建成生物工程研究所，ATP酶试 剂盒(南京建成生物工程研究所），cTnI酶联免疫吸附测试试剂盒、CK-MB酶联免疫吸附测试 试剂盒购于武汉优尔生。
[0028] C02培养箱（Thermo Forma)，CKX41 相差显微镜（0LUMPUS)，Model 450 自动酶标仪 (美国Bio-Rad公司），96孔板(JET)，722sp可见分光光度计(上海棱光技术有限公司），可调 式微量移液器(Thermo Forma)，单人单面超净工作台（苏州净化设备总厂），XD-101型倒置 生物显微镜（南京江南光电），DW-40L262(低温保存箱）、DW-86L628立式超低温保存箱 (Haier特种电器有限公司 ），手提式压力蒸汽灭菌器、立式蒸汽灭菌器(广州华南医药器械 有限公司），JA2003微量天平（上海第二天平仪器厂），5415D型低温高速离心机（德国 Eppendorf)，LQP-B-4颗粒制冰机(上海安亭）。
[0029]二、试验方法
[0030] 1、心肌细胞的原代培养
[0031] 具体步骤：（1)超净工作台中，将乳鼠放置于250mL烧杯中，喷以75%酒精进行皮肤 消毒。（2)左手捏住鼠背部，右手持无菌眼科剪在胸骨正中偏左平剑突刺入胸腔，抬起剪刀 头端，向前挑起剪一纵向切口，再平剑突往左右剪开约2cm，左手捏住背部皮肤挤压胸部，就 可以见跳动的心脏，换无菌弯镊将心脏取出，置于冷的PBS溶液培养皿中。用无菌眼科剪和 镊除去心房、结缔组织及细胞膜后将心脏放入10mL西林瓶中，用冷PBS溶液反复冲洗三遍， 洗净残血。（3)用无菌弯剪剪碎心脏(约1~2mm大小），加入冷PBS溶液，并冲洗无菌弯镊，用 吸管将小组织块悬液转移至离心管中，冷PBS再清洗两遍。（4)第一、二次消化:按预温好的 胰酶与组织块以2:1的比例缓慢沿离心管壁缓慢加入，室温下以无菌吸管反复轻柔吹打帮 助消化，观察组织块出现丝状物，上清变浑浊，根据浊度停止消化，吸出第一、二次消化的上 清液，弃去。（5)继续消化，步骤同(4)，直至小组织炔基本消化完全为止。收集细胞悬液。（6) 将所有细胞悬液过200目细胞筛，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液终止消化，冷PBS洗涤， 1 OOOrpm离心2次，每次8min，弃去上清。（7)台盼兰计数：（6)所得沉淀中加入适量DMEM培养 基，制成细胞悬液，取〇. 4%台盼兰染液10yL与细胞悬液90yL混匀，室温放置2~3min，将清 洁的细胞计数板放置在倒置显微镜台上，在盖玻片边缘滴1~2滴已染色好的细胞悬液，镜 检可见圆形分散的细胞分布在各处，活细胞整体完整，透明而不着色，而不健康细胞会着 色，计数时除去，计数四大方格的细胞数。压线的细胞只记左线和上线者，细胞团按一个细 胞计数，按以下公式计算悬液的细胞数。细胞数/mL=四大方格细胞数总数/4 X 10000 X稀 释倍数(8)按3 X 105~5 X 105细胞密度接种到培养瓶中，放入95 % 02，5 % C02培养箱中差速 贴壁约2h。差速贴壁后的细胞悬液接种至培养板中，前48h加入终浓度为100μ mol/L的5-Brdu，以抑制非心肌细胞的生长，置于培养箱中继续培养。每24h进行换液。
[0032 ] 2、过氧化氢诱导心肌细胞氧化应激损伤模型的建立
[0033]选取培养3~4天、生长良好、搏动规律的心肌细胞，吸弃孔内旧培养基，换新培养 基，同时加入终浓度为600ymol/L的H2〇2，重置于C02培养箱中，常规培养24h，建立H 2〇2诱发心 肌细胞氧化应激损伤模型。
[0034] 3、实验分组及给药
[0035] 化合物（I)给药设低、中、高三个剂量组，浓度分别为0.6、6和60ymol/L;阳性药物 维拉帕米(Verapamil)组的终浓度为25ymol/L。选择生长良好、搏动规律的细胞，随机分为： 正常（contro 1);模型(Mode 1);阳性药物组;溶媒对照组(DMS0);化合物（I)低、中、高剂量， 共7组，每组设6个复孔。各组均于造模前12h吸去孔内旧培养液，换成Hanks液以使各组细胞 同步生长（即平衡），各给药组在造模前加入相应药物预孵2h。除正常组外，平衡后的各组细 胞均按上方法加入建立心肌细胞H 2〇2损伤模型。造模结束后吸取各组细胞培养上清液，-20 °〇冰箱保存待测生化指标。各组心肌细胞则按常规方法加入适量0.125%胰蛋白酶消化，4 °C、800rpm离心10min，弃去上清，以生理盐水制成2 X 106~3 X 106细胞悬液，-80°C冰箱保存 备用。
[0036] 4、MTT法测定心肌细胞存活力
[0037]用96孔板培养的各组心肌细胞于造模后加入10yL MTT继续培养4h，倾去培养液， 加入DMSO 150yL，平板震荡器震荡5min，使结晶物充分溶解。以Hanks液培养调零，用酶标仪 以570/630nm双波长测定去除本底光吸收值后的吸光度(0D值），重复3次。
[0038] 5、心肌细胞培养液中LDH活力的测定
[0039]实验原理:乳酸脱氢酶(LDH)能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2,4_二硝基苯肼反 应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。样品前处理， 按照下表进行。依照试剂盒要求将辅酶I、碱性溶液适当稀释。
[0040]
[0041 ]计算心肌细胞培养液中LDH活力：LDH活力(U/L) = (0Du-0Dc)/(0Ds-0Db) X Cs XNX 1000。N为培养液的稀释倍数。
[0042] 6、统计分析
[0043] 数据采用平均值土标准差士s)表示，应用SPSS 13.0统计软件分析处理数据，计 量资料组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
[0044]三、结果及结论
[0045] 1、过氧化氢损伤前后心肌细胞活力
[0046] 正常组的细胞存活率按100 %计，试验结果显示:H202应激损伤后心肌细胞存活率 较正常组心肌细胞下降（P〈0.05);DMS0溶媒组与模型组相比较，DMS0对心肌细胞存活率无 影响(P>0.05);而化合物（I)各给药组均能使心肌细胞存活率明显增加 (P〈0.01)。结果见表 1 (*P〈0 · Olvs正常组，#P〈0 · Olvs模型组，ΑΡΧ) · 05vs模型组）。
[0047 ] 2、心肌细胞过氧化氢损伤培养液中LDH的活性
[0048] 与正常组比，模型组LDH含量明显增高(P〈0.01);与模型组比较，溶媒组的LDH含量 无显著性差异(P>〇.05)，而化合物（I)低、中、高剂量组、阳性药物组的LDH活性明显降低(P〈 0 · 01)。结果见表2(*P〈0 · Olvs正常组，#P〈0 · Olvs模型组，ΑΡΧ) · 05vs模型组）。
[0049] 提示化合物(I)可以进一步研究开发成心肌细胞保护的药物。
[0050] 表1化合物(I)对H202应激损伤后心肌细胞存活率的影响(X ± S，η = 6)
[0052] 表2化合物（I)对H2〇2应激损伤后心肌细胞LDH含量影响(x 土 s，n = 6)
[0054] 实施例3
[0055] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0056] 实施例4
[0057] 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口 服液。
[0058] 实施例5
[0059] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0060] 实施例6
[0061 ]注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0062] 实施例7
[0063] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0064]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将蜘蛛 香的干燥根茎粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步 骤(b)中75 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1 的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次 用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2 用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收 集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备屯、肌保护的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备屯、肌保护的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了环金合欢烷型倍半萜化合物、制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的环金合欢烷型倍半萜类化合物，可以从蜘蛛香的干燥根茎中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能使H2O2应激损伤后心肌细胞存活率明显增加，LDH活性明显降低，可以用来开发成心肌保护的药物。
【IPC分类】A61P9/00, C07D307/58, A61K31/341
【公开号】CN105503795
【申请号】CN201511026389
【发明人】吴金凤
【申请人】吴金凤
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月31日
【技术领域】
[0001]本发明属于药物技术领域，具体涉及从蜘蛛香的干燥根茎中分离得到的一种具有 心肌保护作用的环金合欢烷型倍半萜类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 蜘蛛香（Valeriana wallichii DC.或Valerianajatamansi Jone)又名马蹄香、土 细辛、印度缬草等，系败酱草科缬草属植物，植株高20~70cm，根茎粗厚，块柱状，节密，有浓 烈香味。蜘蛛香为多年生草本植物，喜长于海拔2500m以下的山顶草地、灌木林中或溪边，在 我国主要分布于陕西、河南、湖北、四川、贵州、云南等地。蜘蛛香根茎具有丰富的药用价值， 传统中医药认为其具有理气止痛、消炎止泻、祛风除湿、镇静安神等功效，可用于治疗脘腹 胀痛、消化不良、腹泻、痢疾、风湿痹痛、蛇毒、失眠、肥胖等症。
[0003] 现代研究表明，蜘蛛香的主要化学成分有挥发油，环烯醚萜类和黄酮类等。蜘蛛香 的药用价值很大一部分归因于其根和茎所含的丰富挥发油，其化学成分比较复杂，主要包 括单萜烯类、倍半萜烯类及其含氧衍生物等。
[0004] 现代研究表明蜘蛛香具有抗肿瘤作用、镇静、镇痛、抗焦虑作用、以及抗轮状病毒 等作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种从蜘蛛香的干燥根茎中分离得到的一种具有心肌保护 作用的环金合欢烷型倍半萜类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] 具有下述结构式的化合物(I)，
[0009]所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将蜘蛛香的干燥根茎粉碎， 用75~85 %乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱 和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中 乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱10个柱 体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗脱 浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1 和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的 反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0010] 进一步地，步骤(a)中，用80%乙醇热回流提取，合并提取液。
[0011] 进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
[0012] 药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(I)和药学上可接受的载体。
[0013] 所述的化合物(I)在制备心肌保护的药物中的应用。
[0014] 所述的药物组合物在制备心肌保护的药物中的应用。
[0015] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0016] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0017] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0018] 图1为化合物(I)结构式；
[0019] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0021 ]实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0022] 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化 学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0023] 制备方法：（a)蜘蛛香的干燥根茎（10kg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取（25L X 3 次），合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水饱 和的正丁醇(3LX3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取 物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积， 再用75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏 (163g); (c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1 (8个柱体积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、12:1 (10个柱体积)和1:1 (5个柱体积） 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶 进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积）、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二 氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2(30g)用十八烷基硅烷键合的反相 硅胶0DS-C18分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~10个柱体积洗 脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I) (143mg)。
[0024] 结构确证:无色油状物;HR-ESMS显示[M+Na]+为m/z 271.1304,结合核磁特征可 得分子式为C15H2Q〇3，不饱和度为6。核磁共振氢谱数据δΗ( ΡΡπι，DMS〇-d6，500MHz):H-2(1 · 72， ddd，J=12.7,4.3,2.1)，H-2(1.97，t，J=12.0)，H-3(6.34，m)，H-4(5.98，m)，H-6(1.81，m)， H-7(1.49，m，2H)，H-8(4.20，m)，Η-10(6·15，br，s)，H-12(0.91，s)，H-13(0.94，s)，H-14 (5.05，111)，!1-14(5.08，111)，!1-15(4.93,8,2!〇 ;核磁共振碳谱数据5。(？?111，〇15〇-(16，1251抱）： 35.2(C，1-C)，30.1(CH2,2-C)，127.8(CH，3-C)，127.4(CH，4-C)，145.3(C，5-C)，55.7(CH，6-C)，33.9(CH2,7-C)，74.5(CH，8-C)，176.1(C，9-C)，114.2(CH，10-C)，173.4(C，n-C)，27.1 (01 3，12-〇,27.1(013，13-〇，108.2((：!12，14-〇,70.1(012，15-〇;碳原子标记参见图1。红 外光谱表明该化合物含有α，β-不饱和-γ -内酯和羰基基团（1762,1646CHT1) ,Η-NMR谱数据 显示两个甲基信号[5!10.91(8，]\^-12)，0.94(8，]\^-13)]，一个含氧亚甲基信号[5!14.93(8， !1-15,2!0]，一个烯属亚甲基信号[6!15.05(111，!1-14)和5.08(111，!1-14)]，一个含氧次甲基质子 信号[SH4.20(m，H-8)]，以及三个烯属次甲基质子[SH5.98(m，H-4)，6.15(br，s，H-10)，6.34 (m，H-3) ]。13CNMR谱显示了 15个碳信号，包括两个甲基，四个亚甲基[一个含氧亚甲基SC70.1 (C-15)，一个烯属亚甲基δα08.2((Μ4)]，五个次甲基[三个烯属次甲基SC114.2(C-10)， 127.4(C-4)和127.8(C-3); -个含氧次甲基SC74.5(C-8)]，四个季碳[两个烯属季碳δ C145.3(C-5)和 176.1(09);-个羰基碳3(：173.4((：-11)]。腿8(：谱中，Η-2(δΗ1.97)，H-4，Me-12，Me-13 和 H2-14 与次甲基碳(06);出-2，!1-6，]^-12和]^-13与(：-1;以及!1-4，!1-6和!12-14与 C-5的相关性表明该化合物含有一个环己烯，且其连有偕二甲基基团，以及一个环外亚甲 基。此外，次甲基C-6通过侧链-CH2CH0H-与α，β-不饱和-γ-内酯环相连。HMBC谱中，H 2-7与C-9出-8与09，(：-10和(：-15;!1-10与(：-11;以及!12-15与(：-8，(：-9，(：-10和(：-11的相关性验证了 上述推论。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确 定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图 2) 〇
[0025]实施例2:化合物(I)药理作用试验 [0026] -、材料和仪器
[0027]新生1~3天SD大鼠乳鼠（SPF级），雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中心提供 (试验动物生产许可证:SCXK桂2009-0002)。化合物（I)(纯度2 98% )为自制。胎牛血清购于 Hy Clone公司，DMEM培养基购于GIB⑶公司，二甲基亚砜(DMS0)、0 · 25 %胰酶（含EDTA)购于 Solarbio公司，5-溴脱氧尿苷(5-Brdu)、四甲基偶氮唑盐(MTT)购于美国Sigma公司，LDH测 试盒购于南京建成生物工程研究所，N0S试剂盒(分型）南京建成生物工程研究所，ATP酶试 剂盒(南京建成生物工程研究所），cTnI酶联免疫吸附测试试剂盒、CK-MB酶联免疫吸附测试 试剂盒购于武汉优尔生。
[0028] C02培养箱（Thermo Forma)，CKX41 相差显微镜（0LUMPUS)，Model 450 自动酶标仪 (美国Bio-Rad公司），96孔板(JET)，722sp可见分光光度计(上海棱光技术有限公司），可调 式微量移液器(Thermo Forma)，单人单面超净工作台（苏州净化设备总厂），XD-101型倒置 生物显微镜（南京江南光电），DW-40L262(低温保存箱）、DW-86L628立式超低温保存箱 (Haier特种电器有限公司 ），手提式压力蒸汽灭菌器、立式蒸汽灭菌器(广州华南医药器械 有限公司），JA2003微量天平（上海第二天平仪器厂），5415D型低温高速离心机（德国 Eppendorf)，LQP-B-4颗粒制冰机(上海安亭）。
[0029]二、试验方法
[0030] 1、心肌细胞的原代培养
[0031] 具体步骤：（1)超净工作台中，将乳鼠放置于250mL烧杯中，喷以75%酒精进行皮肤 消毒。（2)左手捏住鼠背部，右手持无菌眼科剪在胸骨正中偏左平剑突刺入胸腔，抬起剪刀 头端，向前挑起剪一纵向切口，再平剑突往左右剪开约2cm，左手捏住背部皮肤挤压胸部，就 可以见跳动的心脏，换无菌弯镊将心脏取出，置于冷的PBS溶液培养皿中。用无菌眼科剪和 镊除去心房、结缔组织及细胞膜后将心脏放入10mL西林瓶中，用冷PBS溶液反复冲洗三遍， 洗净残血。（3)用无菌弯剪剪碎心脏(约1~2mm大小），加入冷PBS溶液，并冲洗无菌弯镊，用 吸管将小组织块悬液转移至离心管中，冷PBS再清洗两遍。（4)第一、二次消化:按预温好的 胰酶与组织块以2:1的比例缓慢沿离心管壁缓慢加入，室温下以无菌吸管反复轻柔吹打帮 助消化，观察组织块出现丝状物，上清变浑浊，根据浊度停止消化，吸出第一、二次消化的上 清液，弃去。（5)继续消化，步骤同(4)，直至小组织炔基本消化完全为止。收集细胞悬液。（6) 将所有细胞悬液过200目细胞筛，加入含10 %胎牛血清的DMEM培养液终止消化，冷PBS洗涤， 1 OOOrpm离心2次，每次8min，弃去上清。（7)台盼兰计数：（6)所得沉淀中加入适量DMEM培养 基，制成细胞悬液，取〇. 4%台盼兰染液10yL与细胞悬液90yL混匀，室温放置2~3min，将清 洁的细胞计数板放置在倒置显微镜台上，在盖玻片边缘滴1~2滴已染色好的细胞悬液，镜 检可见圆形分散的细胞分布在各处，活细胞整体完整，透明而不着色，而不健康细胞会着 色，计数时除去，计数四大方格的细胞数。压线的细胞只记左线和上线者，细胞团按一个细 胞计数，按以下公式计算悬液的细胞数。细胞数/mL=四大方格细胞数总数/4 X 10000 X稀 释倍数(8)按3 X 105~5 X 105细胞密度接种到培养瓶中，放入95 % 02，5 % C02培养箱中差速 贴壁约2h。差速贴壁后的细胞悬液接种至培养板中，前48h加入终浓度为100μ mol/L的5-Brdu，以抑制非心肌细胞的生长，置于培养箱中继续培养。每24h进行换液。
[0032 ] 2、过氧化氢诱导心肌细胞氧化应激损伤模型的建立
[0033]选取培养3~4天、生长良好、搏动规律的心肌细胞，吸弃孔内旧培养基，换新培养 基，同时加入终浓度为600ymol/L的H2〇2，重置于C02培养箱中，常规培养24h，建立H 2〇2诱发心 肌细胞氧化应激损伤模型。
[0034] 3、实验分组及给药
[0035] 化合物（I)给药设低、中、高三个剂量组，浓度分别为0.6、6和60ymol/L;阳性药物 维拉帕米(Verapamil)组的终浓度为25ymol/L。选择生长良好、搏动规律的细胞，随机分为： 正常（contro 1);模型(Mode 1);阳性药物组;溶媒对照组(DMS0);化合物（I)低、中、高剂量， 共7组，每组设6个复孔。各组均于造模前12h吸去孔内旧培养液，换成Hanks液以使各组细胞 同步生长（即平衡），各给药组在造模前加入相应药物预孵2h。除正常组外，平衡后的各组细 胞均按上方法加入建立心肌细胞H 2〇2损伤模型。造模结束后吸取各组细胞培养上清液，-20 °〇冰箱保存待测生化指标。各组心肌细胞则按常规方法加入适量0.125%胰蛋白酶消化，4 °C、800rpm离心10min，弃去上清，以生理盐水制成2 X 106~3 X 106细胞悬液，-80°C冰箱保存 备用。
[0036] 4、MTT法测定心肌细胞存活力
[0037]用96孔板培养的各组心肌细胞于造模后加入10yL MTT继续培养4h，倾去培养液， 加入DMSO 150yL，平板震荡器震荡5min，使结晶物充分溶解。以Hanks液培养调零，用酶标仪 以570/630nm双波长测定去除本底光吸收值后的吸光度(0D值），重复3次。
[0038] 5、心肌细胞培养液中LDH活力的测定
[0039]实验原理:乳酸脱氢酶(LDH)能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2,4_二硝基苯肼反 应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。样品前处理， 按照下表进行。依照试剂盒要求将辅酶I、碱性溶液适当稀释。
[0040]
[0041 ]计算心肌细胞培养液中LDH活力：LDH活力(U/L) = (0Du-0Dc)/(0Ds-0Db) X Cs XNX 1000。N为培养液的稀释倍数。
[0042] 6、统计分析
[0043] 数据采用平均值土标准差士s)表示，应用SPSS 13.0统计软件分析处理数据，计 量资料组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
[0044]三、结果及结论
[0045] 1、过氧化氢损伤前后心肌细胞活力
[0046] 正常组的细胞存活率按100 %计，试验结果显示:H202应激损伤后心肌细胞存活率 较正常组心肌细胞下降（P〈0.05);DMS0溶媒组与模型组相比较，DMS0对心肌细胞存活率无 影响(P>0.05);而化合物（I)各给药组均能使心肌细胞存活率明显增加 (P〈0.01)。结果见表 1 (*P〈0 · Olvs正常组，#P〈0 · Olvs模型组，ΑΡΧ) · 05vs模型组）。
[0047 ] 2、心肌细胞过氧化氢损伤培养液中LDH的活性
[0048] 与正常组比，模型组LDH含量明显增高(P〈0.01);与模型组比较，溶媒组的LDH含量 无显著性差异(P>〇.05)，而化合物（I)低、中、高剂量组、阳性药物组的LDH活性明显降低(P〈 0 · 01)。结果见表2(*P〈0 · Olvs正常组，#P〈0 · Olvs模型组，ΑΡΧ) · 05vs模型组）。
[0049] 提示化合物(I)可以进一步研究开发成心肌细胞保护的药物。
[0050] 表1化合物(I)对H202应激损伤后心肌细胞存活率的影响(X ± S，η = 6)
[0052] 表2化合物（I)对H2〇2应激损伤后心肌细胞LDH含量影响(x 土 s，n = 6)
[0054] 实施例3
[0055] 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的 比例加入赋形剂，制粒压片。
[0056] 实施例4
[0057] 口服液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口 服液。
[0058] 实施例5
[0059] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒 石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重 量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0060] 实施例6
[0061 ]注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠 檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤， 灌封灭菌制成注射液。
[0062] 实施例7
[0063] 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水 中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封 得粉针剂。
[0064]上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将蜘蛛 香的干燥根茎粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油 酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃 取物；（b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用 75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步 骤(b)中75 %乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1 的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次 用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2 用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收 集8~10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80%乙醇 热回流提取，合并提取液。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备屯、肌保护的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备屯、肌保护的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了环金合欢烷型倍半萜化合物、制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的环金合欢烷型倍半萜类化合物，可以从蜘蛛香的干燥根茎中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能使H2O2应激损伤后心肌细胞存活率明显增加，LDH活性明显降低，可以用来开发成心肌保护的药物。
【IPC分类】A61P9/00, C07D307/58, A61K31/341
【公开号】CN105503795
【申请号】CN201511026389
【发明人】吴金凤
【申请人】吴金凤
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月31日
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