苯并吡喃鎓化合物的制作方法
苯并吡喃鎓化合物的制作方法
【专利说明】苯并化喃鑛化合物
[0001] 本申请要求2012年10月29日提交的美国专利申请顺序号US61/719, 676和2012 年8月28日提交的US61/693,918的优先权，特别地将该些文献各自完整地引入本文参考。
[0002] 公开了用作标记的具有与已知英光化合物相当的特性的化合物。该化合物可W与 蛋白质和核酸缀合W用于生物成像和分析。公开了所述化合物的合成，所述缀合化合物的 形成和用途W及它们各自具体的非限制性实例。所述化合物是基于苯并化喃-聚甲快的化 合物，缩写为苯并化喃鐵化合物，其包含至少一个己二醇。
[0003] 也称作染料的有机英光化合物用作生物学测定中的灵敏性检测试剂。基于苯并化 喃-聚甲快的染料作为研究试剂可W商购。
[0004] 公开了包含至少一个己二醇，二甘醇或聚己二醇（即（聚）己二醇，PEG或聚己二 醇化苯并化喃鐵衍生物）的化合物，特别是包含苯并化喃-聚甲快环结构的化合物的賴醜 胺衍生物和芳基賴醜胺衍生物。该些化合物称作英光聚己二醇化苯并化喃-聚甲快化合物 或染料。将一种或多种芳基賴醜胺衍生物并且将己二醇和/或聚己二醇（阳G)部分添加到 苯并化喃-聚甲快化合物上例如賴醜胺氮上导致超过那些未取代的化合物的增强的亲水 性和其它特性。在一个实施方案中，所述化合物任选地包含可W用于与生物分子共价偶合 的反应基团。
[0005] 该些化合物具有增强的英光，水溶性和生物相容性并且作为英光探针用于生物学 和其它类型测定中的组合物和方法。其特性与带负电荷的賴酸盐衍生物相比更有利。
[0006] 与生物分子（例如具有相应互补种类（complimentaryspecies)用于测定酶动力 学，受体-配体相互作用，体外W及体内核酸杂交动力学的抗原，抗体，DNA-片段等）反应的 化合物称作标记或染料，其用于例如受体和药物的药理学表征，结合数据等。化合物例如咕 吨鐵盐（美国专利US5, 846, 737)和/或花青（美国专利US5, 627, 027)用于该样的应用， 但尤其是在水溶液中聚集并且形成二聚体，该归因于它们的系统的平面性。具有不足 亲水性的化合物与不同表面发生非特异性相互作用，在尝试纯化相应缀合物时产生问题和 不令人意外的信噪比。
[0007] 努力涉及通过引入增加化合物亲水性的取代基减少不期望的特性。挑战在于生成 高亲水性含量的基于聚甲快的英光标记，其具有高消光系数和高光和储存稳定性。它们可 W被简单地激发W通过紫外扣V)，可见或近红外（NIR)光谱范围内的单色光（激光/激光 二极管）或多色光（白色光源）发射英光，或可W起巧灭剂的功能。
[0008] 例如，通常使用在美国专利US5, 627, 027中所要求的对称的咕吨鐵盐（英光素和 若丹明）或聚甲快（說青）。所有该些标记存在如下缺点：它们倾向于尤其是在水溶液中 聚集和二聚化，该归因于系统的平面性。此外，不足的亲水性显示了与不同表面的非特 异性相互作用，在清除相应缀合物和不令人意外的信噪比方面产生问题。为了防止该些缺 点，在PCT/DE00/00802,PCT/DE01/01946和美国专利US6, 924, 372中描述了相应的基于苯 并化喃-2-内鐵盐或苯并比]化喃-4-内鐵盐-化合物的不对称聚甲快类。
[0009] 本发明的化合物和方法通过引入增加化合物亲水性的另外的取代基得W改善。公 开了包含至少一个己二醇，二甘醇或聚己二醇（即（聚）己二醇，PEG)的化合物或基于聚 己二醇化苯并化喃-聚甲快的化合物，其用于例如医学，制药工业和生物科学，环境科学中 的光学且特别是光学-英光测定和检测方法。所公开的化合物用作光学，尤其是英光光学， 测定和检测方法中的标记。所述化合物具有高亲水性，高摩尔吸光性，高光稳定性和高储存 稳定性。该些化合物通过UV，可见或NIR光谱区内的单色光（例如，激光，激光二极管）或 多色光（例如，白色光源）激发W生成英光发射。
[0010] 典型的应用方法基于所述化合物与具有相应互补种类（complimentaryspecies) 的生物分子例如蛋白质（例如抗原，抗体等），DNA和/或RNA片段等的反应。因此，在其它 实施方案中，所述化合物用于测定酶动力学，受体-配体相互作用和体外和/或体内核酸杂 交动力学。所述化合物用于受体和/或药物的药理学表征。应用包括，但不限于在医学，制 药，生物科学，材料科学，环境控制，自然界中存在的有机和无机微量样品的检测中的应用 等。
[0011] 图1显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0012] 图2显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0013] 图3显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0014] 图4显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0015] 图5显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0016] 图6显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0017] 图7显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0018] 图8显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0019] 图9显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0020] 图10显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0021] 图11显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0022] 图12显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0023] 图13显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0024] 图14显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0025] 图15显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0026] 图16显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0027] 图17显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0028] 图18显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0029] 图19显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0030] 图20显示一种发明化合物675-P(V03-07005)的体内成像和生物分布。
[0031] 图21显示一种发明化合物675-P(V03-07005)在体内测定中的离体蓄积。
[0032] 图22显示一种发明化合物675-P(V03-07005)的体内清除。
[0033] 图23A-E显示一种发明化合物675-P(V03-07005)在体内测定中的组织学。
[0034] 图24显示一种商购化合物值yLi曲t680)的体内成像和生物分布。
[00巧]图25显示一种商购化合物值yLi曲t680)在体内测定中的离体蓄积。
[0036] 图26显示一种商购化合物值yLi曲t680)的体内清除。
[0037] 图27A-E显示一种商购化合物值yLight680)在体内测定中的组织学。
[0038] 下列命名用于描述不同的实施方案；682化合物X，其中X表示包含PEG基团的通 式I或II上的位置。例如，在一个实施方案中，682化合物2/3在R2和R3各自位置上至少 包含己二醇，二甘醇或（聚）己二醇。
[0039] 在一个实施方案中，所述化合物在该化合物的任意位置上具有至少一个己二醇基 团，二甘醇基团或己二醇聚合物（即聚（己）二醇，缩写为PEG)和用于使该化合物在化合 物的任意位置上与生物分子缀合的官能团。在一个实施方案中，所述化合物在该化合物的 任意位置上具有至少一个賴基和/或賴基焼基。在一个实施方案中，所述化合物在该化合 物的任意位置上具有包含己二醇基团或己二醇聚合物（即聚（己）二醇，缩写为阳G)的賴 醜胺和/或甲醜胺基团，所述基团直接或间接连接至该化合物。间接连接表示使用连接基， 直接连接表示不使用该样的连接基。连接基可W是任意的部分。
[0040] 在一个实施方案中，所述化合物是
[0041]
【主权项】
1.下述任一通式的化合物： 通式Ia
通式Ib 通式Ic 通式Id 通式Ie
其中 R1，R2，R3，R4，R5，R 6，R11和R12各自相同或不同且独立地选自H，S03，Z，L-Z，PEG基 团P-L-Z，其中P是乙二醇基团，二甘醇基团或聚乙二醇基团，其中该聚乙二醇基团是 (CH2CH 2O)s，其中s是3-6的整数，该整数包括端值，磺酰胺基团-L-SO2NH-P-L-Z,甲酰胺基 团-L-C0NH-P-L-Z，氢，烷基-，叔-烷基，芳基-，羧基芳基-，二羧基芳基，杂芳基-，环烷 基_，杂环烷基_，烷氧基_，烷基巯基_，其中烷基和环烷基包括烯烃键残基，芳基氧基_，芳 基巯基_，杂芳基氧基_，杂芳基巯基_，羟基_，硝基_，羧酸，氨基或氰基残基；其中L是二价 直链（_ (CH2) t-，t = 0-15)，支链或环状烷基基团，其可以被氧，氮，取代的氮和/或硫中的至 少一个原子取代；其中Z是H，CH3，烷基，磺基烷基，杂烷基，順 2，-(：00_，-(1)0!1，-(1)5!1，0)-順-NH2，-C0F，-COCl，-COBr，-COI，-COO-Su (琥珀酰亚胺基 / 磺基琥珀酰亚胺基），-COO-STP (4-磺 基-2, 3, 5, 6-四氟苯基），-COO-TFP (2, 3, 5, 6-四氟苯基），-C00-苯并三唑，-CO-苯并三唑， -C0NR，-CO-CH2-I，-C0NR，R"，-C0NR，-生物分子，-C0NR，-L-C0CT，-C0NR，-L-C00H，-C0NR，-L-COO-Su，-C0NR' -L-C00-STP，-C0NR' -L-C00-TFP，-C0NR' -L-C0NR" 2, -C0NR' -L-CO-生物分子， -C0NR' -L-CO-NH-NH2, -C0NR' -L-OH，-C0NR' -L-O-亚磷酰胺，-C0NR' -L-CHO，-C0NR' -L-马来 酰亚胺或-C0NR'-L-NH-CO-CH2-I ;R'和R"各自选自H，脂族基团或杂脂族基团且所述生物 分子是蛋白质，肽，抗体，核苷酸，寡核苷酸，生物素或半抗原； Rltl，R13和R 14各自相同或不同且独立地选自脂族基团，杂脂族基团，磺基烷基，羧基烷 基，带有末端的303的杂脂族基团，Z，L-Z，PEG基团P-L-Z，其中P是乙二醇基团，二甘醇基 团或聚乙二醇基团，其中该聚乙二醇基团是（CH 2CH2O)s，其中s是3-6的整数，该整数包括端 值，磺酰胺基团-L-SO 2NH-P-L-Z或甲酰胺基团-L-CONH-P-L-Z ; R7和R9各自相同或不同且独立地是氢，脂族基团，杂脂族基团或PEG基团P-L-Z，其中 P选自乙二醇基团，二甘醇基团或聚乙二醇基团，其中该聚乙二醇基团是（CH2CH2O) s，其中s 是3-6的整数，该整数包括端值；或R7和R9 -起形成环状结构，其中R3和R4使用选自如下 ：-(CH2)q-, -(CH2)qO(CH2)q.-, -(CH2)qS(CH2)q.-, -(CH2)qCH = CH-, -OCH =CH-，其中q和q'各自相同或不同且是1-6的整数，该整数包括端值；且 R8选自氢， 烷基，磺基烷基，氟，氯，溴和PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基团，二甘 醇基团或聚乙二醇基团，其中该聚乙二醇基团是（CH2CH2O)s，其中s是3-6的整数，该整数包 括端值； R1和 R 2, R2和 R 3, R3和 R 4, R5和 R 6, R5和 R8, R9和 R 1Q，R11 和 R 12或 R 12和 R 13各自可以形 成一个或多个脂族，杂脂族或芳族环，且其中得到的环任选地被至少一个下列基团取代：烷 基_，磺基烷基，叔-烷基，芳基_，羧基芳基_，二羧基芳基，杂芳基_，环烷基_，杂环烷基_， 烷氧基_，烷基巯基_，其中烷基和环烷基包括烯烃键残基，芳基氧基_，芳基巯基_，杂芳基 氧基_，杂芳基巯基_，羟基_，硝基_，磺酸，羧酸，氨基或氰基残基； R1-R14中的至少一个除了包含至少一个PEG之外，还任选地包含另外的增溶，电离或离 子化取代基，其选自S(V，PO广，CO2H,0H，NR3+,提供亲水性特征的环糊精或糖；所述取代基任 选地通过脂族基团或杂脂族基团或环状间隔基连接至发色团； Kat是Na+，K+，Ca2+，氨或其它补偿负电荷所需的阳离子的成员；η是0，1，2或3 ;〇是 0-12的整数，该整数包括端值；且ρ是1-6的整数，该整数包括端值。
2.权利要求1的化合物，其中 当该化合物是通式Ia时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Ib时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Ic时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ;且 当该化合物是通式Id时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H。
3. 权利要求2的化合物，其中R2或R3中的至少一个是磺基丙基，R5是甲基，且R13或 R14中的至少一个是磺基丙基。
4. 权利要求1的化合物，其中 当该化合物是通式Ie时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式If时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Ig时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ;且 当该化合物是通式Ih时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H。
5. 权利要求4的化合物，其中R2或R3中的至少一个是磺基丙基，R5是甲基，RlO是磺 基丙基，且R14是甲基。
6. 权利要求1的化合物，其中 当该化合物是通式IIa时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式IIb时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Π c时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ; R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ;且 当该化合物是通式π d时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ; R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H。
7. 权利要求6的化合物，其中R2或R3中的至少一个是磺基丙基，R5是甲基，且R13或 R14中的至少一个是磺基丙基。
8. 权利要求1的化合物，其中 当该化合物是通式Π e时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ; R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式IIf时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Π g时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ; R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ;且 当该化合物是通式IIh时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H。
9. 权利要求8的化合物，其中R2或R3中的至少一个是磺基丙基，R5是甲基，RlO是磺 基丙基，且R14是甲基。
10. 权利要求1的化合物，选自 化合物 Ia-PEG4-682 化合物 Ia-PEG4-682-NHS-酯
化合物Ia-PEG4-682-马来酰亚胺 化合物 Ic-PEG4-682
化合物 If-PEG4-682
化合物 IIa-PEG4-675
化合物 IIg-PEG4-632
11.权利要求1的化合物，其中Rl和R2形成6-元环，且R3和R4形成6-元环，产生如 下所示的化合物的苯并吡喃鎗部分：
12. 权利要求11的化合物，其中R5是烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；且R7， R8和R9各自是H。
13. 权利要求1的化合物，其中Rl和R2形成6-元环，产生如下所示的化合物的苯并吡 喃鎗部分：
14. 权利要求13的化合物，其中R2是磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R3'是磺酸，羧酸或 氨基；R5是烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；且R7, R8和R9各自是H。
15. 权利要求1的化合物，还包含二氢衍生物，偶氮键或打断芳族系统并且产生猝灭剂 的苯基中的至少一个。
16. 权利要求15的化合物，选自
其中Rl是甲氧基或PEG基团，R2是磺基烷基或PEG基团，且R3是-OH或-NH-R，其中 R是PEG基团；
其中Rl和R2各自独立地是烷基或PEG基团，R3是磺基烷基或PEG基团，且R4是-OH 或-NH-R，其中R是PEG基团；和
其中Rl和R2各自独立地是烷基或PEG基团，R3是磺基烷基或PEG基团，且R4是-OH 或-NH-R，其中R是PEG基团。
17. 用于体内成像的方法，该方法包括： 将权利要求1-14任一项的化合物经静脉内注入活体动物，并且 使用所述化合物得到该动物的至少一部分的至少一个图像。
18. 权利要求17的方法，还包括在化合物注射期间，在化合物注射之后，或在化合物注 射期间和在注射之后，得到该图像。
19. 权利要求17或18的方法，其中将所述化合物注入循环系统。
20. 权利要求17-19任一项的方法，还包括得到该动物的至少一部分的离体图像。
21. 权利要求17-20任一项的方法，其中使所述化合物与靶向分子缀合，所述靶向分子 选自肽，蛋白质，核苷酸，寡核苷酸，核酸，糖，酶底物，酶拮抗剂，酶抑制剂和受体-结合化 合物。
22. 标记至少一种生物分子的方法，该方法包括提供一种组合物，其包含至少一种赋形 剂和针对所述至少一种生物分子有效浓度的权利要求1-14任一项的化合物，其中在用所 述化合物足以标记所述生物分子的条件下提供所述组合物。
23. 权利要求22的方法，还包括通过荧光显微法，流式细胞术，体内成像，免疫测定，杂 交，色谱测定，电泳测定，基于微孔板的测定，荧光共振能量转移（FRET)系统，高通量筛选 或微阵列中的至少一种来检测标记的生物分子。
24. 权利要求22或23任一项的方法，其中所述生物分子选自蛋白质，抗体，酶，三磷酸 核苷，寡核苷酸，生物素，半抗原，辅因子，凝集素，抗体结合蛋白，类胡萝卜素，碳水化合物， 激素，神经递质，生长因子，毒素，生物细胞，脂质，受体结合药物，荧光蛋白，有机聚合物载 体材料，无机聚合物载体材料及其组合。
25. 用于标记样品中的至少一种生物分子的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-14任一 项的化合物，至少一种赋形剂和使用所述化合物标记样品中的生物分子的说明书。
【专利摘要】用作标记的具有与已知荧光化合物相当特性的化合物。所述化合物与蛋白质和核酸缀合用于生物成像和分析。提供了所述化合物的合成，所述缀合化合物的形成和用途以及它们各自的具体的非限制性实例。
【IPC分类】C07D405-06, A61K49-10, C07D405-14
【公开号】CN104540819
【申请号】CN201380040246
【发明人】G·赫曼森, P·T·克则内, S·德赛, M·S·温泽尔, F·G·勒尔曼, M·C·内兰德
【申请人】皮尔斯生物科技有限公司, 迪奥米克斯有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年8月20日
【公告号】EP2850078A1, WO2014035712A1
【专利说明】苯并化喃鑛化合物
[0001] 本申请要求2012年10月29日提交的美国专利申请顺序号US61/719, 676和2012 年8月28日提交的US61/693,918的优先权，特别地将该些文献各自完整地引入本文参考。
[0002] 公开了用作标记的具有与已知英光化合物相当的特性的化合物。该化合物可W与 蛋白质和核酸缀合W用于生物成像和分析。公开了所述化合物的合成，所述缀合化合物的 形成和用途W及它们各自具体的非限制性实例。所述化合物是基于苯并化喃-聚甲快的化 合物，缩写为苯并化喃鐵化合物，其包含至少一个己二醇。
[0003] 也称作染料的有机英光化合物用作生物学测定中的灵敏性检测试剂。基于苯并化 喃-聚甲快的染料作为研究试剂可W商购。
[0004] 公开了包含至少一个己二醇，二甘醇或聚己二醇（即（聚）己二醇，PEG或聚己二 醇化苯并化喃鐵衍生物）的化合物，特别是包含苯并化喃-聚甲快环结构的化合物的賴醜 胺衍生物和芳基賴醜胺衍生物。该些化合物称作英光聚己二醇化苯并化喃-聚甲快化合物 或染料。将一种或多种芳基賴醜胺衍生物并且将己二醇和/或聚己二醇（阳G)部分添加到 苯并化喃-聚甲快化合物上例如賴醜胺氮上导致超过那些未取代的化合物的增强的亲水 性和其它特性。在一个实施方案中，所述化合物任选地包含可W用于与生物分子共价偶合 的反应基团。
[0005] 该些化合物具有增强的英光，水溶性和生物相容性并且作为英光探针用于生物学 和其它类型测定中的组合物和方法。其特性与带负电荷的賴酸盐衍生物相比更有利。
[0006] 与生物分子（例如具有相应互补种类（complimentaryspecies)用于测定酶动力 学，受体-配体相互作用，体外W及体内核酸杂交动力学的抗原，抗体，DNA-片段等）反应的 化合物称作标记或染料，其用于例如受体和药物的药理学表征，结合数据等。化合物例如咕 吨鐵盐（美国专利US5, 846, 737)和/或花青（美国专利US5, 627, 027)用于该样的应用， 但尤其是在水溶液中聚集并且形成二聚体，该归因于它们的系统的平面性。具有不足 亲水性的化合物与不同表面发生非特异性相互作用，在尝试纯化相应缀合物时产生问题和 不令人意外的信噪比。
[0007] 努力涉及通过引入增加化合物亲水性的取代基减少不期望的特性。挑战在于生成 高亲水性含量的基于聚甲快的英光标记，其具有高消光系数和高光和储存稳定性。它们可 W被简单地激发W通过紫外扣V)，可见或近红外（NIR)光谱范围内的单色光（激光/激光 二极管）或多色光（白色光源）发射英光，或可W起巧灭剂的功能。
[0008] 例如，通常使用在美国专利US5, 627, 027中所要求的对称的咕吨鐵盐（英光素和 若丹明）或聚甲快（說青）。所有该些标记存在如下缺点：它们倾向于尤其是在水溶液中 聚集和二聚化，该归因于系统的平面性。此外，不足的亲水性显示了与不同表面的非特 异性相互作用，在清除相应缀合物和不令人意外的信噪比方面产生问题。为了防止该些缺 点，在PCT/DE00/00802,PCT/DE01/01946和美国专利US6, 924, 372中描述了相应的基于苯 并化喃-2-内鐵盐或苯并比]化喃-4-内鐵盐-化合物的不对称聚甲快类。
[0009] 本发明的化合物和方法通过引入增加化合物亲水性的另外的取代基得W改善。公 开了包含至少一个己二醇，二甘醇或聚己二醇（即（聚）己二醇，PEG)的化合物或基于聚 己二醇化苯并化喃-聚甲快的化合物，其用于例如医学，制药工业和生物科学，环境科学中 的光学且特别是光学-英光测定和检测方法。所公开的化合物用作光学，尤其是英光光学， 测定和检测方法中的标记。所述化合物具有高亲水性，高摩尔吸光性，高光稳定性和高储存 稳定性。该些化合物通过UV，可见或NIR光谱区内的单色光（例如，激光，激光二极管）或 多色光（例如，白色光源）激发W生成英光发射。
[0010] 典型的应用方法基于所述化合物与具有相应互补种类（complimentaryspecies) 的生物分子例如蛋白质（例如抗原，抗体等），DNA和/或RNA片段等的反应。因此，在其它 实施方案中，所述化合物用于测定酶动力学，受体-配体相互作用和体外和/或体内核酸杂 交动力学。所述化合物用于受体和/或药物的药理学表征。应用包括，但不限于在医学，制 药，生物科学，材料科学，环境控制，自然界中存在的有机和无机微量样品的检测中的应用 等。
[0011] 图1显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0012] 图2显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0013] 图3显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0014] 图4显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0015] 图5显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0016] 图6显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0017] 图7显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0018] 图8显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0019] 图9显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0020] 图10显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的功能性测定结果。
[0021] 图11显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0022] 图12显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0023] 图13显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0024] 图14显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0025] 图15显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0026] 图16显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0027] 图17显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0028] 图18显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0029] 图19显示在一个实施方案中使用商购染料与本发明化合物的免疫英光测定结 果。
[0030] 图20显示一种发明化合物675-P(V03-07005)的体内成像和生物分布。
[0031] 图21显示一种发明化合物675-P(V03-07005)在体内测定中的离体蓄积。
[0032] 图22显示一种发明化合物675-P(V03-07005)的体内清除。
[0033] 图23A-E显示一种发明化合物675-P(V03-07005)在体内测定中的组织学。
[0034] 图24显示一种商购化合物值yLi曲t680)的体内成像和生物分布。
[00巧]图25显示一种商购化合物值yLi曲t680)在体内测定中的离体蓄积。
[0036] 图26显示一种商购化合物值yLi曲t680)的体内清除。
[0037] 图27A-E显示一种商购化合物值yLight680)在体内测定中的组织学。
[0038] 下列命名用于描述不同的实施方案；682化合物X，其中X表示包含PEG基团的通 式I或II上的位置。例如，在一个实施方案中，682化合物2/3在R2和R3各自位置上至少 包含己二醇，二甘醇或（聚）己二醇。
[0039] 在一个实施方案中，所述化合物在该化合物的任意位置上具有至少一个己二醇基 团，二甘醇基团或己二醇聚合物（即聚（己）二醇，缩写为PEG)和用于使该化合物在化合 物的任意位置上与生物分子缀合的官能团。在一个实施方案中，所述化合物在该化合物的 任意位置上具有至少一个賴基和/或賴基焼基。在一个实施方案中，所述化合物在该化合 物的任意位置上具有包含己二醇基团或己二醇聚合物（即聚（己）二醇，缩写为阳G)的賴 醜胺和/或甲醜胺基团，所述基团直接或间接连接至该化合物。间接连接表示使用连接基， 直接连接表示不使用该样的连接基。连接基可W是任意的部分。
[0040] 在一个实施方案中，所述化合物是
[0041]
【主权项】
1.下述任一通式的化合物： 通式Ia
通式Ib 通式Ic 通式Id 通式Ie
其中 R1，R2，R3，R4，R5，R 6，R11和R12各自相同或不同且独立地选自H，S03，Z，L-Z，PEG基 团P-L-Z，其中P是乙二醇基团，二甘醇基团或聚乙二醇基团，其中该聚乙二醇基团是 (CH2CH 2O)s，其中s是3-6的整数，该整数包括端值，磺酰胺基团-L-SO2NH-P-L-Z,甲酰胺基 团-L-C0NH-P-L-Z，氢，烷基-，叔-烷基，芳基-，羧基芳基-，二羧基芳基，杂芳基-，环烷 基_，杂环烷基_，烷氧基_，烷基巯基_，其中烷基和环烷基包括烯烃键残基，芳基氧基_，芳 基巯基_，杂芳基氧基_，杂芳基巯基_，羟基_，硝基_，羧酸，氨基或氰基残基；其中L是二价 直链（_ (CH2) t-，t = 0-15)，支链或环状烷基基团，其可以被氧，氮，取代的氮和/或硫中的至 少一个原子取代；其中Z是H，CH3，烷基，磺基烷基，杂烷基，順 2，-(：00_，-(1)0!1，-(1)5!1，0)-順-NH2，-C0F，-COCl，-COBr，-COI，-COO-Su (琥珀酰亚胺基 / 磺基琥珀酰亚胺基），-COO-STP (4-磺 基-2, 3, 5, 6-四氟苯基），-COO-TFP (2, 3, 5, 6-四氟苯基），-C00-苯并三唑，-CO-苯并三唑， -C0NR，-CO-CH2-I，-C0NR，R"，-C0NR，-生物分子，-C0NR，-L-C0CT，-C0NR，-L-C00H，-C0NR，-L-COO-Su，-C0NR' -L-C00-STP，-C0NR' -L-C00-TFP，-C0NR' -L-C0NR" 2, -C0NR' -L-CO-生物分子， -C0NR' -L-CO-NH-NH2, -C0NR' -L-OH，-C0NR' -L-O-亚磷酰胺，-C0NR' -L-CHO，-C0NR' -L-马来 酰亚胺或-C0NR'-L-NH-CO-CH2-I ;R'和R"各自选自H，脂族基团或杂脂族基团且所述生物 分子是蛋白质，肽，抗体，核苷酸，寡核苷酸，生物素或半抗原； Rltl，R13和R 14各自相同或不同且独立地选自脂族基团，杂脂族基团，磺基烷基，羧基烷 基，带有末端的303的杂脂族基团，Z，L-Z，PEG基团P-L-Z，其中P是乙二醇基团，二甘醇基 团或聚乙二醇基团，其中该聚乙二醇基团是（CH 2CH2O)s，其中s是3-6的整数，该整数包括端 值，磺酰胺基团-L-SO 2NH-P-L-Z或甲酰胺基团-L-CONH-P-L-Z ; R7和R9各自相同或不同且独立地是氢，脂族基团，杂脂族基团或PEG基团P-L-Z，其中 P选自乙二醇基团，二甘醇基团或聚乙二醇基团，其中该聚乙二醇基团是（CH2CH2O) s，其中s 是3-6的整数，该整数包括端值；或R7和R9 -起形成环状结构，其中R3和R4使用选自如下 ：-(CH2)q-, -(CH2)qO(CH2)q.-, -(CH2)qS(CH2)q.-, -(CH2)qCH = CH-, -OCH =CH-，其中q和q'各自相同或不同且是1-6的整数，该整数包括端值；且 R8选自氢， 烷基，磺基烷基，氟，氯，溴和PEG基团P-L-Z，其中P选自乙二醇基团，二甘 醇基团或聚乙二醇基团，其中该聚乙二醇基团是（CH2CH2O)s，其中s是3-6的整数，该整数包 括端值； R1和 R 2, R2和 R 3, R3和 R 4, R5和 R 6, R5和 R8, R9和 R 1Q，R11 和 R 12或 R 12和 R 13各自可以形 成一个或多个脂族，杂脂族或芳族环，且其中得到的环任选地被至少一个下列基团取代：烷 基_，磺基烷基，叔-烷基，芳基_，羧基芳基_，二羧基芳基，杂芳基_，环烷基_，杂环烷基_， 烷氧基_，烷基巯基_，其中烷基和环烷基包括烯烃键残基，芳基氧基_，芳基巯基_，杂芳基 氧基_，杂芳基巯基_，羟基_，硝基_，磺酸，羧酸，氨基或氰基残基； R1-R14中的至少一个除了包含至少一个PEG之外，还任选地包含另外的增溶，电离或离 子化取代基，其选自S(V，PO广，CO2H,0H，NR3+,提供亲水性特征的环糊精或糖；所述取代基任 选地通过脂族基团或杂脂族基团或环状间隔基连接至发色团； Kat是Na+，K+，Ca2+，氨或其它补偿负电荷所需的阳离子的成员；η是0，1，2或3 ;〇是 0-12的整数，该整数包括端值；且ρ是1-6的整数，该整数包括端值。
2.权利要求1的化合物，其中 当该化合物是通式Ia时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Ib时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Ic时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ;且 当该化合物是通式Id时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H。
3. 权利要求2的化合物，其中R2或R3中的至少一个是磺基丙基，R5是甲基，且R13或 R14中的至少一个是磺基丙基。
4. 权利要求1的化合物，其中 当该化合物是通式Ie时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式If时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Ig时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ;且 当该化合物是通式Ih时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H。
5. 权利要求4的化合物，其中R2或R3中的至少一个是磺基丙基，R5是甲基，RlO是磺 基丙基，且R14是甲基。
6. 权利要求1的化合物，其中 当该化合物是通式IIa时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式IIb时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Π c时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ; R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ;且 当该化合物是通式π d时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ; R5是 烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是磺酸，羧酸或氨基；R13和R14各自独立地 选自烷基，磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H。
7. 权利要求6的化合物，其中R2或R3中的至少一个是磺基丙基，R5是甲基，且R13或 R14中的至少一个是磺基丙基。
8. 权利要求1的化合物，其中 当该化合物是通式Π e时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ; R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式IIf时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ; 当该化合物是通式Π g时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ; R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H ;且 当该化合物是通式IIh时，R2和R3各自独立地选自磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R5是 烧基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；Rll是横酸，竣酸或氣基；RlO是烧基，横基烧基 或PEG基团P-L-Z ;R14是烷基；且Rl，R4, R7, R8, R9和R12各自是H。
9. 权利要求8的化合物，其中R2或R3中的至少一个是磺基丙基，R5是甲基，RlO是磺 基丙基，且R14是甲基。
10. 权利要求1的化合物，选自 化合物 Ia-PEG4-682 化合物 Ia-PEG4-682-NHS-酯
化合物Ia-PEG4-682-马来酰亚胺 化合物 Ic-PEG4-682
化合物 If-PEG4-682
化合物 IIa-PEG4-675
化合物 IIg-PEG4-632
11.权利要求1的化合物，其中Rl和R2形成6-元环，且R3和R4形成6-元环，产生如 下所示的化合物的苯并吡喃鎗部分：
12. 权利要求11的化合物，其中R5是烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；且R7， R8和R9各自是H。
13. 权利要求1的化合物，其中Rl和R2形成6-元环，产生如下所示的化合物的苯并吡 喃鎗部分：
14. 权利要求13的化合物，其中R2是磺基烷基或PEG基团P-L-Z ;R3'是磺酸，羧酸或 氨基；R5是烷基；R6是叔丁基或未取代或取代的苯基；且R7, R8和R9各自是H。
15. 权利要求1的化合物，还包含二氢衍生物，偶氮键或打断芳族系统并且产生猝灭剂 的苯基中的至少一个。
16. 权利要求15的化合物，选自
其中Rl是甲氧基或PEG基团，R2是磺基烷基或PEG基团，且R3是-OH或-NH-R，其中 R是PEG基团；
其中Rl和R2各自独立地是烷基或PEG基团，R3是磺基烷基或PEG基团，且R4是-OH 或-NH-R，其中R是PEG基团；和
其中Rl和R2各自独立地是烷基或PEG基团，R3是磺基烷基或PEG基团，且R4是-OH 或-NH-R，其中R是PEG基团。
17. 用于体内成像的方法，该方法包括： 将权利要求1-14任一项的化合物经静脉内注入活体动物，并且 使用所述化合物得到该动物的至少一部分的至少一个图像。
18. 权利要求17的方法，还包括在化合物注射期间，在化合物注射之后，或在化合物注 射期间和在注射之后，得到该图像。
19. 权利要求17或18的方法，其中将所述化合物注入循环系统。
20. 权利要求17-19任一项的方法，还包括得到该动物的至少一部分的离体图像。
21. 权利要求17-20任一项的方法，其中使所述化合物与靶向分子缀合，所述靶向分子 选自肽，蛋白质，核苷酸，寡核苷酸，核酸，糖，酶底物，酶拮抗剂，酶抑制剂和受体-结合化 合物。
22. 标记至少一种生物分子的方法，该方法包括提供一种组合物，其包含至少一种赋形 剂和针对所述至少一种生物分子有效浓度的权利要求1-14任一项的化合物，其中在用所 述化合物足以标记所述生物分子的条件下提供所述组合物。
23. 权利要求22的方法，还包括通过荧光显微法，流式细胞术，体内成像，免疫测定，杂 交，色谱测定，电泳测定，基于微孔板的测定，荧光共振能量转移（FRET)系统，高通量筛选 或微阵列中的至少一种来检测标记的生物分子。
24. 权利要求22或23任一项的方法，其中所述生物分子选自蛋白质，抗体，酶，三磷酸 核苷，寡核苷酸，生物素，半抗原，辅因子，凝集素，抗体结合蛋白，类胡萝卜素，碳水化合物， 激素，神经递质，生长因子，毒素，生物细胞，脂质，受体结合药物，荧光蛋白，有机聚合物载 体材料，无机聚合物载体材料及其组合。
25. 用于标记样品中的至少一种生物分子的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-14任一 项的化合物，至少一种赋形剂和使用所述化合物标记样品中的生物分子的说明书。
【专利摘要】用作标记的具有与已知荧光化合物相当特性的化合物。所述化合物与蛋白质和核酸缀合用于生物成像和分析。提供了所述化合物的合成，所述缀合化合物的形成和用途以及它们各自的具体的非限制性实例。
【IPC分类】C07D405-06, A61K49-10, C07D405-14
【公开号】CN104540819
【申请号】CN201380040246
【发明人】G·赫曼森, P·T·克则内, S·德赛, M·S·温泽尔, F·G·勒尔曼, M·C·内兰德
【申请人】皮尔斯生物科技有限公司, 迪奥米克斯有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2013年8月20日
【公告号】EP2850078A1, WO2014035712A1
最新回复(0)