物质在制备治疗感冒药物中的应用的制作方法
专利名称：物质在制备治疗感冒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗和/或预防鼻病毒所引起的疾病。
背景技术：
众所周知，上呼吸道中的正常细菌菌群，对防止致病菌过度生长和后续感 染，是非常重要的。正常菌群的大多数细菌，是由α-血溶链球菌(alpha haemo lyticstreptococci,AHS)组成。已经显示，为了抑制鼻窦炎和中耳炎致病菌，AHS利用的最 重要机制之一是，产生相当量的过氧化氢，H2O2[1]。过氧化氢也是鼻咽粘膜非特异性防御体系的成员之一、乳过氧化物酶(LPO)的底 物。乳过氧化物酶依靠过氧化氢产生亚(hypo)硫氰酸酯，0SCN-，一种更加有效的抗菌物 质。包含AHS的正常细菌菌群和人体粘膜，对过氧化氢和亚硫氰酸酯都有天然保护[2]。先前已经公开了产氢酶在油膏中应用，用于皮肤周围和鼻孔以治疗葡萄球菌，本 文则是针对皮肤菌群的治疗，一个包含过氧化氢的油膏Microcid 的平行方案。EP 1 490 096公开了产生过氧化氢的鼻喷剂在治疗中耳炎中的应用，优选用于治 疗儿童。然而，虽然存在多种可望治疗中耳炎的抗生素，但其没有显示出可以积极治疗鼻病 毒所引起的感冒。发明概述本发明惊奇地发现，可以使用产生过氧化氢的酶，以使引发感冒的鼻病毒失活。本发明的一个实施方式涉及治疗和/或预防鼻病毒所引发的疾病的方法，其中有 需要的患者用包含产生过氧化氢的酶的药物进行治疗。在本发明进一步的实施方式中，产生过氧化氢的酶选自由葡糖氧化酶，木糖醇氧 化酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶组成的组。在本发明的另一个实施方式中，产生过氧化氢的酶是与淀粉葡糖苷酶组合的葡糖 氧化酶。在本发明的一个实施方式中，疾病是感冒。在本发明进一步的实施方式中，产生过氧化氢的酶在Ringer' s溶液中制备。在本发明的另一实施方式中，所述药物是水溶性的。在本发明的一个实施方式中，所述药物被制成鼻喷剂。在本发明进一步的实施方式中，所述药物被制成鼻滴剂。在本发明的另一实施方式中，将酶底物加至所述药物中。发明详述鼻病毒(RV)是引起感冒的最普通的媒介[3]。而且，感冒通常发生在儿童的中耳 炎之前。RV不是全身性的感染，而是位于鼻腔和鼻咽[4]。已知过氧化氢能使RV失活[5]， 但是，基于下列多种原因，不可能制备为了失活RV感染而包含过氧化氢的鼻喷剂a.喷剂在鼻的散布不能涉及到大多数病毒颗粒所处的鼻腔的后部[6]。b.粘膜细胞中丰富的过氧化氢酶，会在过氧化氢到达鼻后部区域很早之前，就会 将过氧化氢转化为水和氧气。
c.足量的过氧化氢浓度肯定是高的初始浓度，因此将会相当刺激鼻粘膜[7]。除了针对例如流鼻涕有症状的减轻之外，目前还没有针对感冒发作有文献证明效 果的药物。本发明惊奇地发现，可以利用产生过氧化氢的酶，以持续失活鼻病毒。已显示，温 育仅30分钟，可足以失活相当量(> IOOTCID5ci)的接种在人气管细胞中的鼻病毒。TCID5tl 定义为在至少50%的接种管中显示出细胞病变效应(=感染)需要的病毒浓度。这表明其 可以治疗鼻病毒感染位于鼻腔的后部的感冒。因此，过去不可能预见产生过氧化氢的酶，例 如G0，将会具有下列特性1.在30分钟内持续失活鼻病毒。2.可预防细胞的进一步感染，即使在开始接种后超过两天时进行GO的加入，这意 味着其不仅可以用于预防感冒，而且可以用于治疗症状开始之后的感染。3.可在鼻咽维持足量的过氧化氢浓度一段时间，以失活粘膜中的所有病毒场所。 只有那样，感冒症状会消失。惊奇地是，如我们的实验所示，包含GO和葡萄糖的鼻喷剂满足以上所有标准。葡糖氧化酶(GO)是产生过氧化氢的酶，其对人类使用具有良好耐受性。它是蜂蜜 的天然成分[8]，并已经作为抗菌防腐剂使用了许多年。GO的产氢效应，也已经在各种漱口 产品(Oral Balance )和牙膏(Zendium )中，用作抗菌添加剂。淀粉葡糖苷酶(AGO)是从淀粉生产葡萄糖的酶，它在温度50-60°C有其最佳效果。 GO和AGO有时组合使用，以阻止GO在低温下激活。当溶液达到体温时，AGO将开始释放葡 萄糖，同时GO产生过氧化氢。否则，必须使用两腔室的系统，以避免酶(GO)与底物(葡萄 糖)的混合。鼻用的合适底物，例如可以是木糖醇(其本身有抗菌效应)，甘露醇(对某些中 耳炎病原体有粘附效应)，乳酸(天生存在的物质)，半乳糖，甘油(对鼻粘膜有益处)和葡 萄糖。这意味着下列产生过氧化氢的酶，适合在抗鼻病毒的鼻喷剂中用作药物葡糖氧化 酶，木糖醇氧化酶，甘露醇氧化酶乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶。根据我们的试 验室研究，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶，对人肺成纤维细胞(WI 38)是非常温和的。在另一实施方式中，产生过氧化氢的酶是与淀粉葡糖苷酶组合的葡糖氧化酶。临床研究显示，在鼻粘膜的粘膜纤毛系统中，Ringer' s溶液比生理盐溶液有更 有益的效果[9]。这可能显示，Ringer' s溶液是鼻腔药物制剂的优选载体溶液。本发明现在将更紧密联系实验部分进行描述。下列说明的目的是表明由酶产生的 抑制性物质——过氧化氢，可以失活引起感冒的鼻病毒。鼻病毒(属于鼻病毒属的病毒) 是感冒的起因媒介物。先前的研究显示，有良好抑制活性的AHS可产生对应过氧化氢浓度约10mM(= 0. 03% )水平的过氧化氢。产生过氧化氢浓度约0. 05%的葡糖氧化酶浓度，应该因此足以 模拟具有极好抑制活性的体内正常细菌菌群的效果。下列试验显示，低于20U/ml的GO浓 度对鼻病毒感染有作用，这相当于高于IOmM的过氧化氢浓度。实施例1和2中记载的实验显示，20U/ml的葡糖氧化酶浓度足以在WI 38细胞中， 不可逆地失活鼻病毒的细胞病变效应。该失活是在低于30分钟的温育时间内完成的，这样 在葡糖氧化酶经过鼻和鼻咽期间、在其被咽下之前，将足以失活鼻病毒[10]。在第二个实施例中，即使葡糖氧化酶加入的时间晚于开始温育之后2天，也可以预防鼻病毒进一步的细 胞感染，这可能暗示葡糖氧化酶鼻喷剂，即使在症状开始之后也可能具有感冒治疗效应。第三个实施例表明，感冒症状的显著减轻，在治疗12小时后就已经取得。本发明 人在最近三年在感冒期间使用鼻喷剂，使用方案几乎通常相同在开始的12小时每隔2小 时，高频率使用GO鼻喷剂之后，以低频率使用(在接着的2-3天，每天2-4次)，感冒症状在 治疗开始之后的12-24小时内消失。其他志愿者也报道喷剂的相同效果。这些试验性研究 显示，GO以足够的量长时间的存在，以失活位于鼻和鼻咽的RV。过氧化氢酶将过氧化氢迅速转化为氧和水，因此用包含过氧化氢的鼻喷剂来起效 是不可行的，特别是鼻病毒通常位于鼻咽的腺体[5]。过氧化氢酶是催化H2O2转化成O2和 H2O的特异性酶。该反应迅速进行。将来源于人红细胞的纯化过氧化氢酶(> 30000U/mg)， 用于本实验。在模拟感冒的病毒试验中，来自ATCC的两种标准分离物被使用，即ATCC1117(= 鼻病毒7)和ATCC 1118(=鼻病毒8)。鼻病毒试验中所用的细胞培养物，为来自于人胎儿 肺成纤维细胞的推荐WI 38细胞系，其与鼻病毒一起温育时，其具有明显的细胞病变效应 (CPE)。在用包含葡糖氧化酶的鼻喷剂进行的临床研究中，GO在Ringer' s溶液中以 100U/ml浓度，与于等渗溶液中含有5% β-D葡萄糖的葡萄糖喷剂，一起使用。喷剂每次喷 射施放0. 1ml，在本试验中，从各瓶中的各2次喷射作为一个剂量(1瓶G0，1瓶葡萄糖)。临床试验性研究提示，与包含5%葡萄糖溶液的鼻喷剂一起使用的、包含100U葡 糖氧化酶/ml的鼻喷剂，被良好耐受，而且显示可缩短感冒发作的持续时间。GO鼻喷剂的结果迄今为止是非常有前景的，而且本发明人已经得到了伦理委员会 和瑞典医药产品机构的许可，将开始进行随机、安慰剂对照、双盲试验，以研究鼻喷剂缩短 感冒发作的可能性。
实施例实施例1下列实施例的目的是，显示产生过氧化氢的酶——葡糖氧化酶，对引起感冒的鼻 病毒的效果。实验1病毒鼻病毒7，购自ATCC (VR-1117)，其用于代表鼻病毒群。在本试验中，使用10_2 和10_3的稀释液。当与WI 38—起试验时，该浓度应与IOOTCID5ci相联系，并且在以前的稀 释系列中，可产生出清晰、清楚的细胞病变效应(CPE)。将0.3ml各稀释液加入至瓶中。细胞培养将人肺细胞成纤维细胞(WI 38，ATCC-CCL-75)，用于病变效应检测。 10-倍系列的稀释液，从浓缩的病毒悬液制备。0. ImlliT4-IO-5稀释液，足以在2ml孔中5天 之内，产生可见的细胞病变效应。10_3或更高的稀释液，足以在接种5天后，破坏大多数的 细胞。将细胞首先培养在含有10%胎牛血清的RPMI中，直到孔底部看到铺平层。接着，将 培养基换为含有2%胎牛血清的RPMI，在试验期间保存使用。将细胞在37°C、富CO2空气中 温育。在试验期间，使用细胞培养物的第17-18代。过氧化氢酶来自Sigma-Aldrich 。100000U/ml溶液制备自106U/ml的原溶液。
5将0.01ml加至瓶中，可在瓶中获得1000U/ml。H2O2 将20%的溶液稀释在磷酸盐缓冲盐水中(PBS)，至0. 5%和0. 05%溶液。将 0，Iml加至瓶中，即在瓶中为0. 05%或0. 005% ο含有2. 5%葡萄糖的Rehydrex 每瓶使用0. 6ml作为葡糖氧化酶的底物。葡糖氧化酶(GO)来自Sigma-Aldrich ( )。200U/ml和600U/ml的溶液制备自 6000U/ml的原溶液。将0. Iml各稀释液加至瓶中，可在瓶中获得20U/ml或60U/ml葡糖氧化酶。为了评价过氧化氢的作用是否是对病毒本身的直接作用或者细胞保护效应，在病 毒被转移至包含细胞的孔之前，我们将其与过氧化氢预先温育。WI 38细胞也对过氧化氢敏 感，因此在接种至孔之前，有必要在其中添加过氧化氢酶。而且，通过添加过氧化氢酶失活 RV 7，显示出该失活的速率。该设计也可揭示，抑制效应仅仅是病毒抑制效应，还是它能够 不可逆地破坏病毒体。表1列出了 10瓶(Eppendorf)的各瓶内含物质。将各瓶温育在加热器中，保持稳 定的37°C温度。在温育15，30和60min之后，加入1000U过氧化氢酶。将各瓶2x50 μ 1转 移至双份细胞孔(96-孔板)。在对照细胞孔中，我们使用了(双份)细胞+RPMI，细胞+过 氧化氢酶，细胞+葡糖氧化酶，细胞+0. 05 % H2O2，细胞+rehydrex，过氧化氢酶+RV7。将细 胞每天检测，持续5天，最终温育到7天之后。表1.各瓶内含物质
权利要求
治疗和/或预防鼻病毒所引起的疾病的方法，其中将有需要的患者用包含产生过氧化氢的酶的药物进行治疗。
2.权利要求1的方法，其特征在于产生过氧化氢的酶选自由葡糖氧化酶木糖醇氧化 酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶组成的组。
3.权利要求1的方法，其特征在于产生过氧化氢的酶为与淀粉葡糖苷酶组合的葡糖氧 化酶。
4.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于所述疾病是感冒。
5.权利要求1-4任一项的方法，其特征在于将产生过氧化氢的酶在Ringer's溶液中 制备。
6.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述药物是水溶性的。
7.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述药物被制成鼻喷剂。
8.权利要求1-6任一项的方法，其特征在于所述药物被制成鼻滴剂。
9.前述权利要求任一项的方法，其特征在于将酶的底物加至药物中。
10.产生过氧化氢的酶在制备药物中的应用，所述药物用于权利要求1-9中任一项的 方法。
11.权利要求10的应用，其中产生过氧化氢的酶选自由葡糖氧化酶，木糖醇氧化酶， 甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶组成的组。
12.权利要求10的应用，其中产生过氧化氢的酶为与淀粉葡糖苷酶组合的葡糖氧化酶。
13.用于权利要求1-9任一项方法的产生过氧化氢的酶。
14.权利要求13的产生过氧化氢的酶，其中产生过氧化氢的酶选自由葡糖氧化酶木 糖醇氧化酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶组成的组。
全文摘要
本发明涉及治疗和/或预防鼻病毒引起的感冒的方法，其中将有需要的患者用包含产生过氧化氢的酶的药物进行治疗。
文档编号A61K38/44GK101977625SQ200980110037
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月20日 优先权日2008年3月20日
发明者克里斯特·坦诺 申请人:克里斯特·坦诺
技术领域：
本发明涉及治疗和/或预防鼻病毒所引起的疾病。
背景技术：
众所周知，上呼吸道中的正常细菌菌群，对防止致病菌过度生长和后续感 染，是非常重要的。正常菌群的大多数细菌，是由α-血溶链球菌(alpha haemo lyticstreptococci,AHS)组成。已经显示，为了抑制鼻窦炎和中耳炎致病菌，AHS利用的最 重要机制之一是，产生相当量的过氧化氢，H2O2[1]。过氧化氢也是鼻咽粘膜非特异性防御体系的成员之一、乳过氧化物酶(LPO)的底 物。乳过氧化物酶依靠过氧化氢产生亚(hypo)硫氰酸酯，0SCN-，一种更加有效的抗菌物 质。包含AHS的正常细菌菌群和人体粘膜，对过氧化氢和亚硫氰酸酯都有天然保护[2]。先前已经公开了产氢酶在油膏中应用，用于皮肤周围和鼻孔以治疗葡萄球菌，本 文则是针对皮肤菌群的治疗，一个包含过氧化氢的油膏Microcid 的平行方案。EP 1 490 096公开了产生过氧化氢的鼻喷剂在治疗中耳炎中的应用，优选用于治 疗儿童。然而，虽然存在多种可望治疗中耳炎的抗生素，但其没有显示出可以积极治疗鼻病 毒所引起的感冒。发明概述本发明惊奇地发现，可以使用产生过氧化氢的酶，以使引发感冒的鼻病毒失活。本发明的一个实施方式涉及治疗和/或预防鼻病毒所引发的疾病的方法，其中有 需要的患者用包含产生过氧化氢的酶的药物进行治疗。在本发明进一步的实施方式中，产生过氧化氢的酶选自由葡糖氧化酶，木糖醇氧 化酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶组成的组。在本发明的另一个实施方式中，产生过氧化氢的酶是与淀粉葡糖苷酶组合的葡糖 氧化酶。在本发明的一个实施方式中，疾病是感冒。在本发明进一步的实施方式中，产生过氧化氢的酶在Ringer' s溶液中制备。在本发明的另一实施方式中，所述药物是水溶性的。在本发明的一个实施方式中，所述药物被制成鼻喷剂。在本发明进一步的实施方式中，所述药物被制成鼻滴剂。在本发明的另一实施方式中，将酶底物加至所述药物中。发明详述鼻病毒(RV)是引起感冒的最普通的媒介[3]。而且，感冒通常发生在儿童的中耳 炎之前。RV不是全身性的感染，而是位于鼻腔和鼻咽[4]。已知过氧化氢能使RV失活[5]， 但是，基于下列多种原因，不可能制备为了失活RV感染而包含过氧化氢的鼻喷剂a.喷剂在鼻的散布不能涉及到大多数病毒颗粒所处的鼻腔的后部[6]。b.粘膜细胞中丰富的过氧化氢酶，会在过氧化氢到达鼻后部区域很早之前，就会 将过氧化氢转化为水和氧气。
c.足量的过氧化氢浓度肯定是高的初始浓度，因此将会相当刺激鼻粘膜[7]。除了针对例如流鼻涕有症状的减轻之外，目前还没有针对感冒发作有文献证明效 果的药物。本发明惊奇地发现，可以利用产生过氧化氢的酶，以持续失活鼻病毒。已显示，温 育仅30分钟，可足以失活相当量(> IOOTCID5ci)的接种在人气管细胞中的鼻病毒。TCID5tl 定义为在至少50%的接种管中显示出细胞病变效应(=感染)需要的病毒浓度。这表明其 可以治疗鼻病毒感染位于鼻腔的后部的感冒。因此，过去不可能预见产生过氧化氢的酶，例 如G0，将会具有下列特性1.在30分钟内持续失活鼻病毒。2.可预防细胞的进一步感染，即使在开始接种后超过两天时进行GO的加入，这意 味着其不仅可以用于预防感冒，而且可以用于治疗症状开始之后的感染。3.可在鼻咽维持足量的过氧化氢浓度一段时间，以失活粘膜中的所有病毒场所。 只有那样，感冒症状会消失。惊奇地是，如我们的实验所示，包含GO和葡萄糖的鼻喷剂满足以上所有标准。葡糖氧化酶(GO)是产生过氧化氢的酶，其对人类使用具有良好耐受性。它是蜂蜜 的天然成分[8]，并已经作为抗菌防腐剂使用了许多年。GO的产氢效应，也已经在各种漱口 产品(Oral Balance )和牙膏(Zendium )中，用作抗菌添加剂。淀粉葡糖苷酶(AGO)是从淀粉生产葡萄糖的酶，它在温度50-60°C有其最佳效果。 GO和AGO有时组合使用，以阻止GO在低温下激活。当溶液达到体温时，AGO将开始释放葡 萄糖，同时GO产生过氧化氢。否则，必须使用两腔室的系统，以避免酶(GO)与底物(葡萄 糖)的混合。鼻用的合适底物，例如可以是木糖醇(其本身有抗菌效应)，甘露醇(对某些中 耳炎病原体有粘附效应)，乳酸(天生存在的物质)，半乳糖，甘油(对鼻粘膜有益处)和葡 萄糖。这意味着下列产生过氧化氢的酶，适合在抗鼻病毒的鼻喷剂中用作药物葡糖氧化 酶，木糖醇氧化酶，甘露醇氧化酶乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶。根据我们的试 验室研究，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶，对人肺成纤维细胞(WI 38)是非常温和的。在另一实施方式中，产生过氧化氢的酶是与淀粉葡糖苷酶组合的葡糖氧化酶。临床研究显示，在鼻粘膜的粘膜纤毛系统中，Ringer' s溶液比生理盐溶液有更 有益的效果[9]。这可能显示，Ringer' s溶液是鼻腔药物制剂的优选载体溶液。本发明现在将更紧密联系实验部分进行描述。下列说明的目的是表明由酶产生的 抑制性物质——过氧化氢，可以失活引起感冒的鼻病毒。鼻病毒(属于鼻病毒属的病毒) 是感冒的起因媒介物。先前的研究显示，有良好抑制活性的AHS可产生对应过氧化氢浓度约10mM(= 0. 03% )水平的过氧化氢。产生过氧化氢浓度约0. 05%的葡糖氧化酶浓度，应该因此足以 模拟具有极好抑制活性的体内正常细菌菌群的效果。下列试验显示，低于20U/ml的GO浓 度对鼻病毒感染有作用，这相当于高于IOmM的过氧化氢浓度。实施例1和2中记载的实验显示，20U/ml的葡糖氧化酶浓度足以在WI 38细胞中， 不可逆地失活鼻病毒的细胞病变效应。该失活是在低于30分钟的温育时间内完成的，这样 在葡糖氧化酶经过鼻和鼻咽期间、在其被咽下之前，将足以失活鼻病毒[10]。在第二个实施例中，即使葡糖氧化酶加入的时间晚于开始温育之后2天，也可以预防鼻病毒进一步的细 胞感染，这可能暗示葡糖氧化酶鼻喷剂，即使在症状开始之后也可能具有感冒治疗效应。第三个实施例表明，感冒症状的显著减轻，在治疗12小时后就已经取得。本发明 人在最近三年在感冒期间使用鼻喷剂，使用方案几乎通常相同在开始的12小时每隔2小 时，高频率使用GO鼻喷剂之后，以低频率使用(在接着的2-3天，每天2-4次)，感冒症状在 治疗开始之后的12-24小时内消失。其他志愿者也报道喷剂的相同效果。这些试验性研究 显示，GO以足够的量长时间的存在，以失活位于鼻和鼻咽的RV。过氧化氢酶将过氧化氢迅速转化为氧和水，因此用包含过氧化氢的鼻喷剂来起效 是不可行的，特别是鼻病毒通常位于鼻咽的腺体[5]。过氧化氢酶是催化H2O2转化成O2和 H2O的特异性酶。该反应迅速进行。将来源于人红细胞的纯化过氧化氢酶(> 30000U/mg)， 用于本实验。在模拟感冒的病毒试验中，来自ATCC的两种标准分离物被使用，即ATCC1117(= 鼻病毒7)和ATCC 1118(=鼻病毒8)。鼻病毒试验中所用的细胞培养物，为来自于人胎儿 肺成纤维细胞的推荐WI 38细胞系，其与鼻病毒一起温育时，其具有明显的细胞病变效应 (CPE)。在用包含葡糖氧化酶的鼻喷剂进行的临床研究中，GO在Ringer' s溶液中以 100U/ml浓度，与于等渗溶液中含有5% β-D葡萄糖的葡萄糖喷剂，一起使用。喷剂每次喷 射施放0. 1ml，在本试验中，从各瓶中的各2次喷射作为一个剂量(1瓶G0，1瓶葡萄糖)。临床试验性研究提示，与包含5%葡萄糖溶液的鼻喷剂一起使用的、包含100U葡 糖氧化酶/ml的鼻喷剂，被良好耐受，而且显示可缩短感冒发作的持续时间。GO鼻喷剂的结果迄今为止是非常有前景的，而且本发明人已经得到了伦理委员会 和瑞典医药产品机构的许可，将开始进行随机、安慰剂对照、双盲试验，以研究鼻喷剂缩短 感冒发作的可能性。
实施例实施例1下列实施例的目的是，显示产生过氧化氢的酶——葡糖氧化酶，对引起感冒的鼻 病毒的效果。实验1病毒鼻病毒7，购自ATCC (VR-1117)，其用于代表鼻病毒群。在本试验中，使用10_2 和10_3的稀释液。当与WI 38—起试验时，该浓度应与IOOTCID5ci相联系，并且在以前的稀 释系列中，可产生出清晰、清楚的细胞病变效应(CPE)。将0.3ml各稀释液加入至瓶中。细胞培养将人肺细胞成纤维细胞(WI 38，ATCC-CCL-75)，用于病变效应检测。 10-倍系列的稀释液，从浓缩的病毒悬液制备。0. ImlliT4-IO-5稀释液，足以在2ml孔中5天 之内，产生可见的细胞病变效应。10_3或更高的稀释液，足以在接种5天后，破坏大多数的 细胞。将细胞首先培养在含有10%胎牛血清的RPMI中，直到孔底部看到铺平层。接着，将 培养基换为含有2%胎牛血清的RPMI，在试验期间保存使用。将细胞在37°C、富CO2空气中 温育。在试验期间，使用细胞培养物的第17-18代。过氧化氢酶来自Sigma-Aldrich 。100000U/ml溶液制备自106U/ml的原溶液。
5将0.01ml加至瓶中，可在瓶中获得1000U/ml。H2O2 将20%的溶液稀释在磷酸盐缓冲盐水中(PBS)，至0. 5%和0. 05%溶液。将 0，Iml加至瓶中，即在瓶中为0. 05%或0. 005% ο含有2. 5%葡萄糖的Rehydrex 每瓶使用0. 6ml作为葡糖氧化酶的底物。葡糖氧化酶(GO)来自Sigma-Aldrich ( )。200U/ml和600U/ml的溶液制备自 6000U/ml的原溶液。将0. Iml各稀释液加至瓶中，可在瓶中获得20U/ml或60U/ml葡糖氧化酶。为了评价过氧化氢的作用是否是对病毒本身的直接作用或者细胞保护效应，在病 毒被转移至包含细胞的孔之前，我们将其与过氧化氢预先温育。WI 38细胞也对过氧化氢敏 感，因此在接种至孔之前，有必要在其中添加过氧化氢酶。而且，通过添加过氧化氢酶失活 RV 7，显示出该失活的速率。该设计也可揭示，抑制效应仅仅是病毒抑制效应，还是它能够 不可逆地破坏病毒体。表1列出了 10瓶(Eppendorf)的各瓶内含物质。将各瓶温育在加热器中，保持稳 定的37°C温度。在温育15，30和60min之后，加入1000U过氧化氢酶。将各瓶2x50 μ 1转 移至双份细胞孔(96-孔板)。在对照细胞孔中，我们使用了(双份)细胞+RPMI，细胞+过 氧化氢酶，细胞+葡糖氧化酶，细胞+0. 05 % H2O2，细胞+rehydrex，过氧化氢酶+RV7。将细 胞每天检测，持续5天，最终温育到7天之后。表1.各瓶内含物质
权利要求
治疗和/或预防鼻病毒所引起的疾病的方法，其中将有需要的患者用包含产生过氧化氢的酶的药物进行治疗。
2.权利要求1的方法，其特征在于产生过氧化氢的酶选自由葡糖氧化酶木糖醇氧化 酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶组成的组。
3.权利要求1的方法，其特征在于产生过氧化氢的酶为与淀粉葡糖苷酶组合的葡糖氧 化酶。
4.权利要求1-3任一项的方法，其特征在于所述疾病是感冒。
5.权利要求1-4任一项的方法，其特征在于将产生过氧化氢的酶在Ringer's溶液中 制备。
6.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述药物是水溶性的。
7.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述药物被制成鼻喷剂。
8.权利要求1-6任一项的方法，其特征在于所述药物被制成鼻滴剂。
9.前述权利要求任一项的方法，其特征在于将酶的底物加至药物中。
10.产生过氧化氢的酶在制备药物中的应用，所述药物用于权利要求1-9中任一项的 方法。
11.权利要求10的应用，其中产生过氧化氢的酶选自由葡糖氧化酶，木糖醇氧化酶， 甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶组成的组。
12.权利要求10的应用，其中产生过氧化氢的酶为与淀粉葡糖苷酶组合的葡糖氧化酶。
13.用于权利要求1-9任一项方法的产生过氧化氢的酶。
14.权利要求13的产生过氧化氢的酶，其中产生过氧化氢的酶选自由葡糖氧化酶木 糖醇氧化酶，甘露醇氧化酶，乳酸氧化酶，半乳糖氧化酶和甘油氧化酶组成的组。
全文摘要
本发明涉及治疗和/或预防鼻病毒引起的感冒的方法，其中将有需要的患者用包含产生过氧化氢的酶的药物进行治疗。
文档编号A61K38/44GK101977625SQ200980110037
公开日2011年2月16日 申请日期2009年3月20日 优先权日2008年3月20日
发明者克里斯特·坦诺 申请人:克里斯特·坦诺
最新回复(0)