放射性氟化肽的制作方法
专利名称：放射性氟化肽的制作方法
专利说明放射性氟化肽 本发明涉及新的肽基化合物和它们在使用正电子发射断层显像(PET)用于诊断成像中的用途。更具体地，本发明涉及这样的肽基化合物作为与和血管生成相关的受体结合的靶向载体的用途，特别是整联蛋白受体，例如αvβ3整联蛋白受体。因此这样的化合物可以用于诊断或治疗例如恶性疾病、心脏病、子宫内膜异位症、与炎症相关的疾病、类风湿性关节炎和卡波济氏肉瘤(kaposi’s sarcoma)。此外，它还涉及制备该肽基化合物的方法和试剂。
本申请用于诊断成像的放射性标记生物活性肽在核医学上获得重要地位。与特定细胞类型选择性相互使用的生物学活性分子可以用于对目标组织释放放射活性。例如放射性标记的肽对向肿瘤、梗塞和感染组织释放放射性核素以用于诊断成像和放射治疗具有重要的潜力。18F具有半衰期大约为110分钟，是许多受体成像研究的正电子-放射核素的选择。因此，因为在PET定量测定和表征多种疾病中的应用，18F-标记生物活性肽具有很大的临床潜力。
新血管可以通过两种不同的机理形成血管发生(vasculogenesis)或血管生成(angiogenesis)。血管生成是从存在的血管分支形成新血管。这种过程的主要刺激可能是对组织中的细胞的不充分的营养和氧(氧不足)的供应。细胞可以通过分泌多种的血管发生因子响应；常常提到的一个例子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。这些因子引起蛋白水解酶的分泌，蛋白水解酶裂解基膜蛋白质，以及限制这些可能有害酶的作用的抑制剂。血管发生因子的其他突出的作用是引起内皮细胞位移和分裂。与基膜附着的内皮细胞，围绕血管在contralumenal侧上形成连续片状，该内皮细胞没有经历有丝分裂。附着损失和来自血管生成因子受体的信号的联合作用引起内皮细胞内皮细胞移动、繁殖和自身重排，最终在新血管周围合成基膜。
血管生成在组织生长和重塑中是突出的，包括伤口愈合和炎症过程。当肿瘤达到毫米大小时为了保持它们的生长速度，必须开始血管生成。血管生成伴随内皮细胞和它们的环境的特征性变化。除了在影响和控制蛋白质水解中涉及的各种蛋白质之外，在准备移动中这些细胞的表面被重塑，基膜被降解的地方隐蔽结构被暴露。在肿瘤的情况下，得到的血管网通常被打乱，形成明显的纽结还有动静脉的分路。对血管生成的抑制作用也被认为是抗肿瘤治疗有希望的策略。伴随血管生成的转化作用对于诊断也是非常有希望的，一个明显的例子是恶性疾病，但是这个概念还指出对炎症和各种炎症相关的疾病非常有前途，包括动脉粥样硬化、早期动脉粥样硬化损伤的巨噬细胞可能是血管生成因子的潜在根源。
细胞粘着中涉及的很多配体包含三肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)。该RGD序列表现出作为代表该序列的配体与细胞表面上的受体之间的主要识别位点而起作用。普遍认为配体和受体之间的二级相互作用提高相互作用的特异性。这些二级作用可能发生在配体和紧邻RGD序列的受体之间的部分或者发生在远离RGD序列的位点。
因此与体内血管发生相关的整联蛋白受体的有效靶向和成像要求化学稳健和稳定的选择性、高亲和性RGD为基础的载体。此外，当为了减少与背景有关的问题而设计显像剂时，排泄途径是重要的因素。
WO 03/006491描述了目标为与血管生成相关的整联蛋白受体的肽基化合物。然而，存在对另外的可用于诊断成像技术如PET的肽基化合物的需要。共同待决的国际申请PCT/GB2004/001052描述了适用于标记具有18F的生物学活性载体的方法。但这里还需要肽基化合物，其可以迅速地和有效地制备，并且还具有理想的生物活性。
在第一方面，本发明提供了一种放射性氟化方法，其包含式(I)化合物的反应
其中载体包含片段
和式(II)的化合物
其中 n是0-20的整数； m是0-10的整数； Y是H、C1-6烷基(如甲基)，或苯基 得到式(III)化合物
其中m、n和Y如式(II)化合物中所定义，载体如对式(I)化合物中所定义。
这个反应可以在合适溶剂，例如在pH范围为1-11，合适的为2-11，更合适的为2-6的含水缓冲液中，并在非端点温度5-100℃，合适的为20-70℃，优选环境温度下进行。
在一个具体方面，式(I)或(III)中的载体为式(A)
其中X7为-NH2或
其中a是1-10的整数，优选a是1。
选择式(I)化合物中形成载体部分的连接物用于提供良好的体内药物动力学，如式(III)的最终共轭物有利的排泄特性。使用具有不同的亲脂性和或电荷的连接基团可以显著地改变体内肽的药物动力学，以适合诊断的需要。例如，当希望通过肾排泄从身体清除式(III)共轭物时，使用亲水连接物，当希望通过肝胆管排泄清除时，使用疏水连接物。连接物包括聚乙二醇部分，已经发现在一些情况下有希望用来减缓血液清除率。
式(I)化合物中载体的连接物形成部分为C1-60烃基基团，合适的为C1-30烃基基团，任选包括1-30个杂原子，合适地为1-10个杂原子如氧或氮。合适的连接基基团包括烷基、烯基、炔基链、芳香、多芳香和杂芳香环，聚合物包含乙二醇、氨基酸或碳水化合物亚单元。优选式(I)化合物中载体的连接物形成部分包含聚乙二醇亚单元，最优选的连接物是式B
其中b是2-20的整数，优选是3-10，最优选5。
术语“羟基基团”意指由碳和氢组成的有机取代基，这些基团可以包括饱和、不饱和或芳香部分。
因此，优选的式(I)化合物为式(Ia)化合物
其中X7为-NH2或
其中a为1-10的整数，优选a为1，b为2-20的整数，优选3-10，最优选5。
优选的式(II)化合物为其中m是0，n是0，以及Y是氢的化合物。
通过肽合成的标准方法可以制备式(I)和(III)的化合物，例如固相肽合成，例如如Atherton，E.和Sheppard，R.C.；″Solid Phase Synthesis″；IRL PressOxford，1989中所述。通过由肽胺官能团与活性酸反应制备生成稳定的酰胺键，并在肽合成中或之后引入，可以实现在式(I)化合物中引入胺氧基。
另一方面，本发明提供了如上定义的式(I)和(Ia)化合物，其具有作为可用于产生放射性标记的肽基化合物的试剂的用途。
另一方面，本发明提供了如上定义的式(III)化合物或其盐作为放射标记的共轭物。优选的式(III)化合物是式(IIIa)化合物
或其盐，其中X7是-NH2或
其中a为1-10的整数，优选a为1，b为2-20的整数，优选3-10，最优选5。
一个特别优选的式(III)化合物是
式(III)和(IIIa)化合物合适的盐包括药学上可接受的酸加成盐如由盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、醋酸、三氟醋酸、琥珀酸、草(oxaxlic)酸、反丁烯二酸、马来酸、草醋酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸和异乙二酸(isoethionic acids)所成的盐。
式(II)化合物可以从相应的式(IV)前体或其被保护的衍生物制备得到
其中L是离去基团，优选当m≥1时，L是对甲苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐或甲磺酸盐，或卤化物和当m是0时，L是对三烷基铵盐或对硝基，以及Y、m和n如式(II)化合物所描述；通过用回旋加速器反应制备水性[18F]-氟化物，在合适溶剂如乙腈、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，通常在环境或升高的温度例如达到14O℃下通过从碱(例如从四丁铵或K2CO3/Kryptofix-222)进行适当地预活化而制备。氟化作用之后通过简单的酸处理也可以从它们的保护前体如缩醛或缩酮快速产生式(II)化合物的醛或酮官能团。
如下面的体外竞争结合试验所示，式(I)和(Ia)化合物与血管生成相关的受体结合。这些化合物因此可能用于与血管生成相关的治疗、疾病和病症的体内诊断和成像。
术语“与血管生成相关的疾病和病症”包括那些参照以下的疾病和病症。关于这方面也可参见WO 98/47541。
与血管生成相关的疾病或病症包括各种癌和转移，例如乳腺、皮肤、结肠直肠、胰腺、前列腺、肺或卵巢癌。
其它与血管生成相关的疾病或病症是炎症(例如慢性炎症)、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和牙龈炎。
此外，与血管生成相关的疾病或病症是动静脉alformations、星形细胞瘤、绒毛膜癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、血管瘤(幼年期，毛细血管)、肝癌、子宫内膜增生、缺血性心肌、子宫内膜异位症、卡波西肉瘤、黄斑变性、黑素瘤、成神经细胞瘤、外周动脉闭塞疾病、骨关节炎、牛皮癣、视网膜病(糖尿病性，增生性)、硬皮病、精原细胞瘤(seminomas)和溃疡性结肠炎。
本发明也提供一种包含有效量(例如用于体内PET成像的有效数量)如上所定义的通式(III)或(IIIa)化合物或其盐的放射性药物组合物；以及一种或多种药学上可接受的助剂、赋形剂或稀释剂。
本发明的一种优选实施方案涉及如上定义的通式(III)或(IIIa)化合物或其盐用于医药的用途，特别是通过例如PET对与血管生成相关的疾病或病症进行体内诊断或成像。
式(III)或(IIIa)的放射性标记的共轭物可以以足以产生希望的信号的量给药于患者用于PET成像，一般的放射性核素剂量为0.01-100mCi，优选0.1-50mCi，最优选1-20mCi，一般对每70kg体重将是足够的。
因此，可以使用在某种意义上本领域技术人员所熟知的生理学可接受的载体或赋形剂来配制式(III)或(IIIa)的放射性标记的共轭物用于给药。例如，化合物任选加入药学上可接受的赋形剂，可以悬浮或溶于含水介质，然后将得到的溶液或悬浮液灭菌。
从进一步的方面来看，本发明提供了使用如上定义的式(III)或(IIIa)或其盐放射性标记的共轭物，用于制备放射性药物的用途，其在体内成像方法中使用，适合于PET，优选用于与血管生成相关的疾病或病症的成像；包括将所述放射性药物对人或动物体给药和产生至少部分所述身体的成像。
从更进一步的方面来看，本发明提供了用于与血管生成相关的疾病或病症的体内诊断或成像，包括将放射性药物对所述身体给药，例如血管系统，并产生至少一部分所述身体的成像，所述放射性药物使用PET分布在体内，其中所述放射性药物包含式(III)或(IIIa)或其盐的放射性标记的共轭物。
从进一步的方面来看，本发明提供了一种监控使用药物例如细胞毒药物对人或动物体治疗的效果的方法，其用于与癌相关的病症，优选血管生成的癌症。所述方法包含将式(III)或(IIIa)或其盐的放射性标记的共轭物对所述身体给药，并且测定由细胞受体优选内皮细胞受体和尤其是αvβ3受体对所述共轭物的吸收量，任意选择所述给药和测定，但优选重复起作用，例如使用所述药物处理之前、之间和之后。
在本发明又一个的实施方案中提供了一种用于制备包含式(II)辅基和式(I)化合物的放射性氟示踪剂(radiofluorinated tracer)的试剂盒。
在使用该试剂盒时，分别将式(II)化合物加入到式(I)化合物中，其可以适当地溶于含水缓冲液(pH1-11)。在非端点温度下反应1-70分钟后，可以例如使用固相萃取(SPE)或高效液相色谱(HPLC)来纯化和收集标记肽。
实施例 本发明通过实施例进行说明，其中使用了下列缩写词 HPLC高效液相色谱 NMR核磁共振 TFA三氟乙酸 hr(s)小时 min(s)分钟 DMAP4-(二甲基氨基)吡啶 THF四氢呋喃 DCM二氯甲烷 DMFN，N-二甲基甲酰胺 TBAF四丁基氟化铵 MeOH甲醇 TLC薄层色谱法 TIS三异丙基硅烷 DMSO二甲亚砜 PBS磷酸盐缓冲盐水 PyAOP[7-氮杂苯并三唑-1-基氧三(吡咯烷基) 六氟磷酸盐] Boc叔丁氧羰基 RT室温 实施例1 4-三甲基铵苯甲醛三氟甲磺酸盐(化合物1)的制备
根据Haka等人(J.Labelled Cpds.& Radiopharms 1989 27(7)823)描述的方法合成该化合物。
实施例2-肽前体(化合物2)的制备 使用标准肽合成方法合成肽(化合物2)。
(a)1，17-二叠氮-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷 在氩气保护下，将干燥六聚乙二醇(25g，88mmol)和甲磺酰氯(22.3g，195mmol)的干燥THF(125mL)溶液在冰/水浴中冷却至0℃。在45分钟内滴加三乙胺(19.7g，195mmol)在干燥THF(25mL)的溶液。1小时后移去冷却浴并再搅拌反应4小时。然后将水(55mL)加入到混合物，之后加入碳酸氢钠(5.3g，至pH 8)和叠氮化钠(12.7g，195mmol)。通过蒸馏除去THF，并将含水溶液回流24小时(形成两层)。冷却混合物，加入醚(100mL)，含水相加入氯化钠至饱和。分离有机相，用乙醚(4×50mL)萃取含水相。合并有机相，用盐水(2×50mL)洗涤并干燥(MgSO4)。过滤和蒸发溶剂得到26g(89％)的黄色油状物。该产物用于下一步而无需进一步纯化。
(b)17-叠氮基-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷胺 在室温下在3小时内向剧烈搅拌的1，17-二叠氮-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷(25g，75mmol)在5％HCl(200mL)中的溶液中加入三苯膦(19.2g，73mmol)在乙醚(150mL)中的溶液。额外搅拌反应混合物24小时。分离各相，用二氯甲烷(3×40mL)萃取含水相。含水相在冰/水浴中冷却，加入固体氢氧化钾调节pH至12。浓缩含水相，将产物吸收入二氯甲烷(150mL)。干燥有机相(Na2SO4)并浓缩得到22g(95％)的黄色油状物。该产物用电喷雾质谱确定。(ESI-MS)(MH+计算值307.19；实测值307.4)。粗油状物用于下一步而无需进一步纯化。
(c)23-叠氮基-5-氧杂-6-氮杂-3，9，12，15，18，21-六氧杂二十三酸 向17-叠氮基-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷胺(15g，50mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入二乙醇酸酐(Acros，6.4g，55mmol)。搅拌反应混合物过夜。通过ESI-MS分析监控反应，加入更多试剂以推动反应完成。浓缩溶液得到黄色残余物，将其溶于水(250mL)。通过二氯甲烷连续萃取从含水相分离产物过夜。干燥并蒸发溶剂得到18g(85％)的收率。该产物用ESI-MS分析表征。(MH+计算值423.20；实测值423.4)。该产物用于下一步而无需进一步纯化。
(d)23-氨基-5-氧杂-6-氮杂-3，9，12，15，18，21-六氧杂二十三酸 将23-叠氮基-5-氧-6-氮杂-3，9，12，15，18，21-六氧杂二十三酸(9.0g，21mmol)溶于水(50mL)，用H2(g)-Pd/C(10％)还原。进行反应直到ESI-MS分析显示完全转化为想要的产品(MH+计算值397.2；实测值397.6)。该粗品用于下一步而无需进一步纯化。
(e)(Boc-氨氧基)乙酰基-PEG(6)-二羟乙酸 将二环己基碳二亚胺(515mg，2.50mmol)在二烷(2.5mL)中的溶液滴加到(Boc-氨氧基)乙酸(477mg，2.50mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(287mg，2.50mmol)在二烷(2.5mL)溶液中。室温下搅拌反应1小时并过滤。将滤液转入包含23-氨基-5-氧-6-氮杂-3，9，12，15，18，21-六氧杂二十三酸(1.0g，2.5mmol)和N-甲基吗啉(278μl，2.50mmol)在水(5mL)中的溶液的反应器中。室温下搅拌混合物30分钟。ESI-MS分析显示完全转化到想要的产品(MH+计算值570.28；实测值570.6)。
粗品用制备HPLC(柱Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm，检测214nm，梯度60分钟内0-5％B，其中A＝H2O/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA，流速10mL/分钟)纯化得到500mg(38％)的纯产物。
通过HPLC(柱Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2.00mm，检测214nm，梯度10分钟内0-50％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，和B＝乙腈/0.1％TFA，流速0.75mL/分钟，Rt＝5.52分钟)分析产品。通过NMR分析进一步证实。
(f)(Boc-氨氧基)乙酰基-PEG(6)-二羟乙酸和化合物2的共轭 将(Boc-氨氧基)乙酰基-PEG(6)-二羟乙酸(0.15mmol，85mg)和PyAOP(0.13mmol，68mg)溶于DMF(2mL)。加入N-甲基吗啉(0.20mmol，20μL)，搅拌混合物10分钟。加入化合物2(0.100mmol，126mg)和N-甲基吗啉(0.20mmol，20μL)在DMF(4mL)的溶液，搅拌反应混合物25分钟。加入另外的N-甲基吗啉(0.20mmol，20μL)，再搅拌反应混合物15分钟。真空下蒸发DMF，产物吸收入10％乙腈-水，用制备HPLC(柱Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm，检测UV214nm，梯度40分钟内5-50％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，和B＝乙腈/0.1％TFA，流速10mL/分钟)纯化得到100mg(38％)的半纯产物。第二个纯化步骤，其中TFA被HCOOH替代(梯度0-30％B，其他方面与上述条件相同)得到89mg(50％)。用HPLC(柱Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm，检测UV 214nm，梯度10分钟内0-30％B，其中A＝H2O/0.1％HCOOH，和B＝乙腈/0.1％HCOOH，流速0.3mL/分钟，室温10.21分钟)分析产物。进一步产物用ESI-MS进行表征(MH+calculated905.4；found 906.0)。
实施例3-18F-氟苯甲醛与化合物3的化学选择性的结合得到化合物4
通过加入包含5％水的TFA至10mg的肽中进行肽3的去保护。将溶于1mL水的Boc-去保护肽(5.9mg，0.0044mmol)加入到溶于1mL乙腈的4-氟苯甲醛(化合物1)(1.1mg，0.94μl，0.0089mmol)中。混合物的pH是3.5。在70℃(degrees)45分钟后，混合物用反相制备色谱法(PhenomenexLuna C18柱，00G-4253-NO；溶剂A＝水+0.1％TFA/B＝CH3CN+0.1％TFA，梯度30分钟内10-40％B，流速5.0mL/分钟；在214nm处检测)提纯两次得到2.0mg(32％)的纯化合物(分析HPLCPhenomenex Luna C18柱，00G-4252-EO；溶剂A＝水+0.1％TFA/B＝CH3CN+0.1％TFA，梯度20分钟内10-50％B，流速1.0mL/分钟；保留时间16.3分钟，在214nm和254nm处检测)。进一步使用质谱法进行表征，得到m/z值1437.2。[M-H+]。
实施例418F-化合物4的放射合成 方法1 18F-氟化物(达到370MBq)在Kryptofix 222(5mg在0.5mL乙腈中)和碳酸钾(50μl、0.1M在水中)存在下，在N2保护下加热至110℃恒沸干燥20分钟。此时加入3×0.5mL乙腈并蒸干。冷却至＜40℃后，加入三甲基铵苯甲醛三氟甲磺酸盐溶液(1mg在0.4mL DMSO中)。密封反应器并加热至90℃15分钟实施标记。同时，室温下用5％在TFA(200μl)中的水处理化合物3(6mg)5分钟。然后在真空中除去溶剂。去保护的肽再溶解于0.1M NH4OAc缓冲液、pH4(0.4mL)中，与4-18F-氟苯甲醛在反应器中混合。密封反应器并加热至70℃15分钟实施偶合。冷却至室温后，用制备放射HPLC(柱Phenomenex Luna C18(2)3μm 10×100mm，溶剂A＝水/01％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度5分钟内15-25％B；25％B12分钟；10分钟内25-50％B；流速4.0mL/分钟；UV在210nm和254nm处检测)得到产物。产物部分用水稀释(10mL)并装载在SepPakC18-plus cartridge(用10mL EtOH和20mL H2O调节)。在乙醇(1mL)中洗脱化合物4。在真空中除去乙醇，在PBS中配制化合物4。
方法2 a)18F-氟苯甲醛的放射合成 18F-氟化物(达到370MBq)在Kryptofix 222(5mg在0.5mL乙腈中)和碳酸钾(50μl、0.1M的水溶液)存在下，在N2保护下加热至110℃恒沸干燥20分钟。此时加入3×0.5mL乙腈并蒸干。冷却至＜40℃后，加入三甲基铵苯甲醛三氟甲磺酸盐溶液(1mg在0.4mL DMSO中)。密封反应器并加热至90℃15分钟实施标记。冷却粗的反应混合物至室温，加水稀释。混合物连续通过离子交换柱(用乙醇(或乙腈)和水预处理)，在乙腈/水混合物中洗脱。洗脱物使用C18 Seppak浓缩，氟苯甲醛在乙腈中洗脱。
b)化合物3和4-18F-氟苯甲醛的共轭 在室温下化合物3用5％三氟乙酸的水溶液处理5分钟。然后真空下蒸发除去溶剂。肽再溶解于0.1M NH4OAc缓冲液、pH4(0.5mL)中，与4-18F-氟苯甲醛在反应器中合并。密封反应器并加热至70℃15分钟实施共轭。冷却至室温后，用制备放射HPLC(如方法1所描述)或用SPE得到产物。
生物数据 结合研究 使用已知表达αvβ3整联蛋白受体的细胞膜制备法，并使用125I-echistatin和F-19标记肽作为竞争性配体来进行竞争性结合研究。使用PrismTM软件获得结合曲线和计算Kj值。
化合物4具有10nM的Kj值。
Lewis肺肿瘤的生物分布 将Lewis肺肿瘤(LLC)细胞(0.1mL，1×107细胞/mL，在培养基中)皮下注射到小鼠(雄性C57BL/6，大约25g)的右大腿内。控制动物用于肿瘤生长达到15天，在肿瘤模型发展中选择使用这个时间是因为这时它显示血管生成的最高的浓度。
为了测定18F-化合物的生物分布，借助于尾部血管将测试药品(0.1mL，5-10MBq/mL)作为一种静脉内丸剂注射到患肿瘤动物。用安乐死处理不同倍数二次注射的动物。剖析肌肉、肾、尿、肺、肝脏、胃、小肠、大肠、甲状腺、肿瘤，并提取血样。称重和计算剖析过的组织和血样(Wallac自动γ粒子计数系统)。研究至少三个动物的每个时间点。结果用％id和％id每克组织来表示。
表1 显示化合物4在小鼠Lewis肺肿瘤模型中的生物分布。随时间的概括数据。5个独立试验的平均数据以平均值(SD)存在。
表1 作为对照，表2显示了化合物5在小鼠Lewis肺肿瘤模型中的生物分布。随时间的概括数据。5个独立试验的平均数据以平均值(SD)存在。
表2 化合物4额外的PEG部分给予显著更有利的体内特性。具体地说，存在于背景组织如血液、肌肉、肺和肝脏中化合物4的剩余活性，120分钟后大体上小于化合物5的活性。随后的肿瘤显著地改善背景比率，因此能够成像。
权利要求
1.一种放射性氟化方法，其包含式(I)化合物
其中载体包含片段
与式(II)的化合物的反应
其中
n是0-20的整数；
m是0-10的整数；
Y是氢、C1-6烷基(如甲基)，或苯基
得到式(III)化合物
其中m、n和Y如式(II)化合物中所定义，载体如式(I)化合物中所定义。
2.根据权利要求1的方法，其中式(I)或(III)中的载体为式(A)
其中X7为-NH2或
其中a是1-10的整数，优选a是1。
3.根据权利要求1或2的方法，其中式(I)化合物为式(Ia)化合物
其中X7为-NH2或
其中a为1-10的整数，优选a为1，b为2-20的整数，优选3-10，最优选5。
4.如权利要求1或2所定义的式(I)化合物。
5.如权利要求3所定义的式(Ia)化合物。
6.如权利要求1或2所定义的式(III)化合物或其盐。
7.式(IIIa)化合物
或其盐，其中X7是-NH2或
其中a为1-10的整数，优选a为1，b为2-20的整数，优选3-10，最优选5。
8.式(III)化合物，其为
9.一种包含有效量的如权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐的放射性药物组合物；以及一种或多种药学上可接受的助剂、赋形剂或稀释剂。
10.如权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐用于医药的用途，特别是与血管生成相关的疾病或病症的体内诊断或成像，例如用PET。
11.如权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐的放射性标记的共轭物的用途，用于制备放射性药物，其在体内成像方法中使用，适合于PET，优选用于与血管生成相关的疾病或病症的成像；包括将所述放射性药物对人或动物体给药和产生至少部分所述身体成像。
12.一种用于与血管生成相关的疾病或病症的体内诊断或成像的方法，包括将放射性药物对所述身体给药，例如进入血管系统，并产生至少部分所述身体的成像，在其中所述放射性药物使用PET分配，其中所述放射性药物包含权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐。
13.一种监控使用药物对人或动物体治疗的效果的方法，所述药物用于与癌相关的症状斗争，优选血管生成，所述方法包含将权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐对所述身体给药，并且测定由细胞受体对所述化合物的吸收，所述给药和检测任选但优选重复进行。
全文摘要
本发明涉及式(III)或(IIIa)化合物或其盐的共轭物，它们作为放射性药物，它们的制备方法，以及用于该方法的合成中间体。
文档编号A61K51/08GK101151054SQ200580030720
公开日2008年3月26日 申请日期2005年9月14日 优先权日2004年9月14日
发明者M·索尔巴肯, B·阿波, A·卡思伯森, A·吉布森 申请人:通用电气医疗集团股份有限公司, 通用电气健康护理有限公司
专利说明
本申请用于诊断成像的放射性标记生物活性肽在核医学上获得重要地位。与特定细胞类型选择性相互使用的生物学活性分子可以用于对目标组织释放放射活性。例如放射性标记的肽对向肿瘤、梗塞和感染组织释放放射性核素以用于诊断成像和放射治疗具有重要的潜力。18F具有半衰期大约为110分钟，是许多受体成像研究的正电子-放射核素的选择。因此，因为在PET定量测定和表征多种疾病中的应用，18F-标记生物活性肽具有很大的临床潜力。
新血管可以通过两种不同的机理形成血管发生(vasculogenesis)或血管生成(angiogenesis)。血管生成是从存在的血管分支形成新血管。这种过程的主要刺激可能是对组织中的细胞的不充分的营养和氧(氧不足)的供应。细胞可以通过分泌多种的血管发生因子响应；常常提到的一个例子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)。这些因子引起蛋白水解酶的分泌，蛋白水解酶裂解基膜蛋白质，以及限制这些可能有害酶的作用的抑制剂。血管发生因子的其他突出的作用是引起内皮细胞位移和分裂。与基膜附着的内皮细胞，围绕血管在contralumenal侧上形成连续片状，该内皮细胞没有经历有丝分裂。附着损失和来自血管生成因子受体的信号的联合作用引起内皮细胞内皮细胞移动、繁殖和自身重排，最终在新血管周围合成基膜。
血管生成在组织生长和重塑中是突出的，包括伤口愈合和炎症过程。当肿瘤达到毫米大小时为了保持它们的生长速度，必须开始血管生成。血管生成伴随内皮细胞和它们的环境的特征性变化。除了在影响和控制蛋白质水解中涉及的各种蛋白质之外，在准备移动中这些细胞的表面被重塑，基膜被降解的地方隐蔽结构被暴露。在肿瘤的情况下，得到的血管网通常被打乱，形成明显的纽结还有动静脉的分路。对血管生成的抑制作用也被认为是抗肿瘤治疗有希望的策略。伴随血管生成的转化作用对于诊断也是非常有希望的，一个明显的例子是恶性疾病，但是这个概念还指出对炎症和各种炎症相关的疾病非常有前途，包括动脉粥样硬化、早期动脉粥样硬化损伤的巨噬细胞可能是血管生成因子的潜在根源。
细胞粘着中涉及的很多配体包含三肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)。该RGD序列表现出作为代表该序列的配体与细胞表面上的受体之间的主要识别位点而起作用。普遍认为配体和受体之间的二级相互作用提高相互作用的特异性。这些二级作用可能发生在配体和紧邻RGD序列的受体之间的部分或者发生在远离RGD序列的位点。
因此与体内血管发生相关的整联蛋白受体的有效靶向和成像要求化学稳健和稳定的选择性、高亲和性RGD为基础的载体。此外，当为了减少与背景有关的问题而设计显像剂时，排泄途径是重要的因素。
WO 03/006491描述了目标为与血管生成相关的整联蛋白受体的肽基化合物。然而，存在对另外的可用于诊断成像技术如PET的肽基化合物的需要。共同待决的国际申请PCT/GB2004/001052描述了适用于标记具有18F的生物学活性载体的方法。但这里还需要肽基化合物，其可以迅速地和有效地制备，并且还具有理想的生物活性。
在第一方面，本发明提供了一种放射性氟化方法，其包含式(I)化合物的反应
其中载体包含片段
和式(II)的化合物
其中 n是0-20的整数； m是0-10的整数； Y是H、C1-6烷基(如甲基)，或苯基 得到式(III)化合物
其中m、n和Y如式(II)化合物中所定义，载体如对式(I)化合物中所定义。
这个反应可以在合适溶剂，例如在pH范围为1-11，合适的为2-11，更合适的为2-6的含水缓冲液中，并在非端点温度5-100℃，合适的为20-70℃，优选环境温度下进行。
在一个具体方面，式(I)或(III)中的载体为式(A)
其中X7为-NH2或
其中a是1-10的整数，优选a是1。
选择式(I)化合物中形成载体部分的连接物用于提供良好的体内药物动力学，如式(III)的最终共轭物有利的排泄特性。使用具有不同的亲脂性和或电荷的连接基团可以显著地改变体内肽的药物动力学，以适合诊断的需要。例如，当希望通过肾排泄从身体清除式(III)共轭物时，使用亲水连接物，当希望通过肝胆管排泄清除时，使用疏水连接物。连接物包括聚乙二醇部分，已经发现在一些情况下有希望用来减缓血液清除率。
式(I)化合物中载体的连接物形成部分为C1-60烃基基团，合适的为C1-30烃基基团，任选包括1-30个杂原子，合适地为1-10个杂原子如氧或氮。合适的连接基基团包括烷基、烯基、炔基链、芳香、多芳香和杂芳香环，聚合物包含乙二醇、氨基酸或碳水化合物亚单元。优选式(I)化合物中载体的连接物形成部分包含聚乙二醇亚单元，最优选的连接物是式B
其中b是2-20的整数，优选是3-10，最优选5。
术语“羟基基团”意指由碳和氢组成的有机取代基，这些基团可以包括饱和、不饱和或芳香部分。
因此，优选的式(I)化合物为式(Ia)化合物
其中X7为-NH2或
其中a为1-10的整数，优选a为1，b为2-20的整数，优选3-10，最优选5。
优选的式(II)化合物为其中m是0，n是0，以及Y是氢的化合物。
通过肽合成的标准方法可以制备式(I)和(III)的化合物，例如固相肽合成，例如如Atherton，E.和Sheppard，R.C.；″Solid Phase Synthesis″；IRL PressOxford，1989中所述。通过由肽胺官能团与活性酸反应制备生成稳定的酰胺键，并在肽合成中或之后引入，可以实现在式(I)化合物中引入胺氧基。
另一方面，本发明提供了如上定义的式(I)和(Ia)化合物，其具有作为可用于产生放射性标记的肽基化合物的试剂的用途。
另一方面，本发明提供了如上定义的式(III)化合物或其盐作为放射标记的共轭物。优选的式(III)化合物是式(IIIa)化合物
或其盐，其中X7是-NH2或
其中a为1-10的整数，优选a为1，b为2-20的整数，优选3-10，最优选5。
一个特别优选的式(III)化合物是
式(III)和(IIIa)化合物合适的盐包括药学上可接受的酸加成盐如由盐酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、醋酸、三氟醋酸、琥珀酸、草(oxaxlic)酸、反丁烯二酸、马来酸、草醋酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸和异乙二酸(isoethionic acids)所成的盐。
式(II)化合物可以从相应的式(IV)前体或其被保护的衍生物制备得到
其中L是离去基团，优选当m≥1时，L是对甲苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐或甲磺酸盐，或卤化物和当m是0时，L是对三烷基铵盐或对硝基，以及Y、m和n如式(II)化合物所描述；通过用回旋加速器反应制备水性[18F]-氟化物，在合适溶剂如乙腈、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，通常在环境或升高的温度例如达到14O℃下通过从碱(例如从四丁铵或K2CO3/Kryptofix-222)进行适当地预活化而制备。氟化作用之后通过简单的酸处理也可以从它们的保护前体如缩醛或缩酮快速产生式(II)化合物的醛或酮官能团。
如下面的体外竞争结合试验所示，式(I)和(Ia)化合物与血管生成相关的受体结合。这些化合物因此可能用于与血管生成相关的治疗、疾病和病症的体内诊断和成像。
术语“与血管生成相关的疾病和病症”包括那些参照以下的疾病和病症。关于这方面也可参见WO 98/47541。
与血管生成相关的疾病或病症包括各种癌和转移，例如乳腺、皮肤、结肠直肠、胰腺、前列腺、肺或卵巢癌。
其它与血管生成相关的疾病或病症是炎症(例如慢性炎症)、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和牙龈炎。
此外，与血管生成相关的疾病或病症是动静脉alformations、星形细胞瘤、绒毛膜癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、血管瘤(幼年期，毛细血管)、肝癌、子宫内膜增生、缺血性心肌、子宫内膜异位症、卡波西肉瘤、黄斑变性、黑素瘤、成神经细胞瘤、外周动脉闭塞疾病、骨关节炎、牛皮癣、视网膜病(糖尿病性，增生性)、硬皮病、精原细胞瘤(seminomas)和溃疡性结肠炎。
本发明也提供一种包含有效量(例如用于体内PET成像的有效数量)如上所定义的通式(III)或(IIIa)化合物或其盐的放射性药物组合物；以及一种或多种药学上可接受的助剂、赋形剂或稀释剂。
本发明的一种优选实施方案涉及如上定义的通式(III)或(IIIa)化合物或其盐用于医药的用途，特别是通过例如PET对与血管生成相关的疾病或病症进行体内诊断或成像。
式(III)或(IIIa)的放射性标记的共轭物可以以足以产生希望的信号的量给药于患者用于PET成像，一般的放射性核素剂量为0.01-100mCi，优选0.1-50mCi，最优选1-20mCi，一般对每70kg体重将是足够的。
因此，可以使用在某种意义上本领域技术人员所熟知的生理学可接受的载体或赋形剂来配制式(III)或(IIIa)的放射性标记的共轭物用于给药。例如，化合物任选加入药学上可接受的赋形剂，可以悬浮或溶于含水介质，然后将得到的溶液或悬浮液灭菌。
从进一步的方面来看，本发明提供了使用如上定义的式(III)或(IIIa)或其盐放射性标记的共轭物，用于制备放射性药物的用途，其在体内成像方法中使用，适合于PET，优选用于与血管生成相关的疾病或病症的成像；包括将所述放射性药物对人或动物体给药和产生至少部分所述身体的成像。
从更进一步的方面来看，本发明提供了用于与血管生成相关的疾病或病症的体内诊断或成像，包括将放射性药物对所述身体给药，例如血管系统，并产生至少一部分所述身体的成像，所述放射性药物使用PET分布在体内，其中所述放射性药物包含式(III)或(IIIa)或其盐的放射性标记的共轭物。
从进一步的方面来看，本发明提供了一种监控使用药物例如细胞毒药物对人或动物体治疗的效果的方法，其用于与癌相关的病症，优选血管生成的癌症。所述方法包含将式(III)或(IIIa)或其盐的放射性标记的共轭物对所述身体给药，并且测定由细胞受体优选内皮细胞受体和尤其是αvβ3受体对所述共轭物的吸收量，任意选择所述给药和测定，但优选重复起作用，例如使用所述药物处理之前、之间和之后。
在本发明又一个的实施方案中提供了一种用于制备包含式(II)辅基和式(I)化合物的放射性氟示踪剂(radiofluorinated tracer)的试剂盒。
在使用该试剂盒时，分别将式(II)化合物加入到式(I)化合物中，其可以适当地溶于含水缓冲液(pH1-11)。在非端点温度下反应1-70分钟后，可以例如使用固相萃取(SPE)或高效液相色谱(HPLC)来纯化和收集标记肽。
实施例 本发明通过实施例进行说明，其中使用了下列缩写词 HPLC高效液相色谱 NMR核磁共振 TFA三氟乙酸 hr(s)小时 min(s)分钟 DMAP4-(二甲基氨基)吡啶 THF四氢呋喃 DCM二氯甲烷 DMFN，N-二甲基甲酰胺 TBAF四丁基氟化铵 MeOH甲醇 TLC薄层色谱法 TIS三异丙基硅烷 DMSO二甲亚砜 PBS磷酸盐缓冲盐水 PyAOP[7-氮杂苯并三唑-1-基氧三(吡咯烷基) 六氟磷酸盐] Boc叔丁氧羰基 RT室温 实施例1 4-三甲基铵苯甲醛三氟甲磺酸盐(化合物1)的制备
根据Haka等人(J.Labelled Cpds.& Radiopharms 1989 27(7)823)描述的方法合成该化合物。
实施例2-肽前体(化合物2)的制备 使用标准肽合成方法合成肽(化合物2)。
(a)1，17-二叠氮-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷 在氩气保护下，将干燥六聚乙二醇(25g，88mmol)和甲磺酰氯(22.3g，195mmol)的干燥THF(125mL)溶液在冰/水浴中冷却至0℃。在45分钟内滴加三乙胺(19.7g，195mmol)在干燥THF(25mL)的溶液。1小时后移去冷却浴并再搅拌反应4小时。然后将水(55mL)加入到混合物，之后加入碳酸氢钠(5.3g，至pH 8)和叠氮化钠(12.7g，195mmol)。通过蒸馏除去THF，并将含水溶液回流24小时(形成两层)。冷却混合物，加入醚(100mL)，含水相加入氯化钠至饱和。分离有机相，用乙醚(4×50mL)萃取含水相。合并有机相，用盐水(2×50mL)洗涤并干燥(MgSO4)。过滤和蒸发溶剂得到26g(89％)的黄色油状物。该产物用于下一步而无需进一步纯化。
(b)17-叠氮基-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷胺 在室温下在3小时内向剧烈搅拌的1，17-二叠氮-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷(25g，75mmol)在5％HCl(200mL)中的溶液中加入三苯膦(19.2g，73mmol)在乙醚(150mL)中的溶液。额外搅拌反应混合物24小时。分离各相，用二氯甲烷(3×40mL)萃取含水相。含水相在冰/水浴中冷却，加入固体氢氧化钾调节pH至12。浓缩含水相，将产物吸收入二氯甲烷(150mL)。干燥有机相(Na2SO4)并浓缩得到22g(95％)的黄色油状物。该产物用电喷雾质谱确定。(ESI-MS)(MH+计算值307.19；实测值307.4)。粗油状物用于下一步而无需进一步纯化。
(c)23-叠氮基-5-氧杂-6-氮杂-3，9，12，15，18，21-六氧杂二十三酸 向17-叠氮基-3，6，9，12，15-五氧杂十七烷胺(15g，50mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入二乙醇酸酐(Acros，6.4g，55mmol)。搅拌反应混合物过夜。通过ESI-MS分析监控反应，加入更多试剂以推动反应完成。浓缩溶液得到黄色残余物，将其溶于水(250mL)。通过二氯甲烷连续萃取从含水相分离产物过夜。干燥并蒸发溶剂得到18g(85％)的收率。该产物用ESI-MS分析表征。(MH+计算值423.20；实测值423.4)。该产物用于下一步而无需进一步纯化。
(d)23-氨基-5-氧杂-6-氮杂-3，9，12，15，18，21-六氧杂二十三酸 将23-叠氮基-5-氧-6-氮杂-3，9，12，15，18，21-六氧杂二十三酸(9.0g，21mmol)溶于水(50mL)，用H2(g)-Pd/C(10％)还原。进行反应直到ESI-MS分析显示完全转化为想要的产品(MH+计算值397.2；实测值397.6)。该粗品用于下一步而无需进一步纯化。
(e)(Boc-氨氧基)乙酰基-PEG(6)-二羟乙酸 将二环己基碳二亚胺(515mg，2.50mmol)在二烷(2.5mL)中的溶液滴加到(Boc-氨氧基)乙酸(477mg，2.50mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(287mg，2.50mmol)在二烷(2.5mL)溶液中。室温下搅拌反应1小时并过滤。将滤液转入包含23-氨基-5-氧-6-氮杂-3，9，12，15，18，21-六氧杂二十三酸(1.0g，2.5mmol)和N-甲基吗啉(278μl，2.50mmol)在水(5mL)中的溶液的反应器中。室温下搅拌混合物30分钟。ESI-MS分析显示完全转化到想要的产品(MH+计算值570.28；实测值570.6)。
粗品用制备HPLC(柱Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm，检测214nm，梯度60分钟内0-5％B，其中A＝H2O/0.1％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA，流速10mL/分钟)纯化得到500mg(38％)的纯产物。
通过HPLC(柱Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2.00mm，检测214nm，梯度10分钟内0-50％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，和B＝乙腈/0.1％TFA，流速0.75mL/分钟，Rt＝5.52分钟)分析产品。通过NMR分析进一步证实。
(f)(Boc-氨氧基)乙酰基-PEG(6)-二羟乙酸和化合物2的共轭 将(Boc-氨氧基)乙酰基-PEG(6)-二羟乙酸(0.15mmol，85mg)和PyAOP(0.13mmol，68mg)溶于DMF(2mL)。加入N-甲基吗啉(0.20mmol，20μL)，搅拌混合物10分钟。加入化合物2(0.100mmol，126mg)和N-甲基吗啉(0.20mmol，20μL)在DMF(4mL)的溶液，搅拌反应混合物25分钟。加入另外的N-甲基吗啉(0.20mmol，20μL)，再搅拌反应混合物15分钟。真空下蒸发DMF，产物吸收入10％乙腈-水，用制备HPLC(柱Phenomenex Luna 5μC18(2)250×21.20mm，检测UV214nm，梯度40分钟内5-50％B，其中A＝H2O/0.1％TFA，和B＝乙腈/0.1％TFA，流速10mL/分钟)纯化得到100mg(38％)的半纯产物。第二个纯化步骤，其中TFA被HCOOH替代(梯度0-30％B，其他方面与上述条件相同)得到89mg(50％)。用HPLC(柱Phenomenex Luna 3μC18(2)50×2mm，检测UV 214nm，梯度10分钟内0-30％B，其中A＝H2O/0.1％HCOOH，和B＝乙腈/0.1％HCOOH，流速0.3mL/分钟，室温10.21分钟)分析产物。进一步产物用ESI-MS进行表征(MH+calculated905.4；found 906.0)。
实施例3-18F-氟苯甲醛与化合物3的化学选择性的结合得到化合物4
通过加入包含5％水的TFA至10mg的肽中进行肽3的去保护。将溶于1mL水的Boc-去保护肽(5.9mg，0.0044mmol)加入到溶于1mL乙腈的4-氟苯甲醛(化合物1)(1.1mg，0.94μl，0.0089mmol)中。混合物的pH是3.5。在70℃(degrees)45分钟后，混合物用反相制备色谱法(PhenomenexLuna C18柱，00G-4253-NO；溶剂A＝水+0.1％TFA/B＝CH3CN+0.1％TFA，梯度30分钟内10-40％B，流速5.0mL/分钟；在214nm处检测)提纯两次得到2.0mg(32％)的纯化合物(分析HPLCPhenomenex Luna C18柱，00G-4252-EO；溶剂A＝水+0.1％TFA/B＝CH3CN+0.1％TFA，梯度20分钟内10-50％B，流速1.0mL/分钟；保留时间16.3分钟，在214nm和254nm处检测)。进一步使用质谱法进行表征，得到m/z值1437.2。[M-H+]。
实施例418F-化合物4的放射合成 方法1 18F-氟化物(达到370MBq)在Kryptofix 222(5mg在0.5mL乙腈中)和碳酸钾(50μl、0.1M在水中)存在下，在N2保护下加热至110℃恒沸干燥20分钟。此时加入3×0.5mL乙腈并蒸干。冷却至＜40℃后，加入三甲基铵苯甲醛三氟甲磺酸盐溶液(1mg在0.4mL DMSO中)。密封反应器并加热至90℃15分钟实施标记。同时，室温下用5％在TFA(200μl)中的水处理化合物3(6mg)5分钟。然后在真空中除去溶剂。去保护的肽再溶解于0.1M NH4OAc缓冲液、pH4(0.4mL)中，与4-18F-氟苯甲醛在反应器中混合。密封反应器并加热至70℃15分钟实施偶合。冷却至室温后，用制备放射HPLC(柱Phenomenex Luna C18(2)3μm 10×100mm，溶剂A＝水/01％TFA和B＝乙腈/0.1％TFA；梯度5分钟内15-25％B；25％B12分钟；10分钟内25-50％B；流速4.0mL/分钟；UV在210nm和254nm处检测)得到产物。产物部分用水稀释(10mL)并装载在SepPakC18-plus cartridge(用10mL EtOH和20mL H2O调节)。在乙醇(1mL)中洗脱化合物4。在真空中除去乙醇，在PBS中配制化合物4。
方法2 a)18F-氟苯甲醛的放射合成 18F-氟化物(达到370MBq)在Kryptofix 222(5mg在0.5mL乙腈中)和碳酸钾(50μl、0.1M的水溶液)存在下，在N2保护下加热至110℃恒沸干燥20分钟。此时加入3×0.5mL乙腈并蒸干。冷却至＜40℃后，加入三甲基铵苯甲醛三氟甲磺酸盐溶液(1mg在0.4mL DMSO中)。密封反应器并加热至90℃15分钟实施标记。冷却粗的反应混合物至室温，加水稀释。混合物连续通过离子交换柱(用乙醇(或乙腈)和水预处理)，在乙腈/水混合物中洗脱。洗脱物使用C18 Seppak浓缩，氟苯甲醛在乙腈中洗脱。
b)化合物3和4-18F-氟苯甲醛的共轭 在室温下化合物3用5％三氟乙酸的水溶液处理5分钟。然后真空下蒸发除去溶剂。肽再溶解于0.1M NH4OAc缓冲液、pH4(0.5mL)中，与4-18F-氟苯甲醛在反应器中合并。密封反应器并加热至70℃15分钟实施共轭。冷却至室温后，用制备放射HPLC(如方法1所描述)或用SPE得到产物。
生物数据 结合研究 使用已知表达αvβ3整联蛋白受体的细胞膜制备法，并使用125I-echistatin和F-19标记肽作为竞争性配体来进行竞争性结合研究。使用PrismTM软件获得结合曲线和计算Kj值。
化合物4具有10nM的Kj值。
Lewis肺肿瘤的生物分布 将Lewis肺肿瘤(LLC)细胞(0.1mL，1×107细胞/mL，在培养基中)皮下注射到小鼠(雄性C57BL/6，大约25g)的右大腿内。控制动物用于肿瘤生长达到15天，在肿瘤模型发展中选择使用这个时间是因为这时它显示血管生成的最高的浓度。
为了测定18F-化合物的生物分布，借助于尾部血管将测试药品(0.1mL，5-10MBq/mL)作为一种静脉内丸剂注射到患肿瘤动物。用安乐死处理不同倍数二次注射的动物。剖析肌肉、肾、尿、肺、肝脏、胃、小肠、大肠、甲状腺、肿瘤，并提取血样。称重和计算剖析过的组织和血样(Wallac自动γ粒子计数系统)。研究至少三个动物的每个时间点。结果用％id和％id每克组织来表示。
表1 显示化合物4在小鼠Lewis肺肿瘤模型中的生物分布。随时间的概括数据。5个独立试验的平均数据以平均值(SD)存在。
表1 作为对照，表2显示了化合物5在小鼠Lewis肺肿瘤模型中的生物分布。随时间的概括数据。5个独立试验的平均数据以平均值(SD)存在。
表2 化合物4额外的PEG部分给予显著更有利的体内特性。具体地说，存在于背景组织如血液、肌肉、肺和肝脏中化合物4的剩余活性，120分钟后大体上小于化合物5的活性。随后的肿瘤显著地改善背景比率，因此能够成像。
权利要求
1.一种放射性氟化方法，其包含式(I)化合物
其中载体包含片段
与式(II)的化合物的反应
其中
n是0-20的整数；
m是0-10的整数；
Y是氢、C1-6烷基(如甲基)，或苯基
得到式(III)化合物
其中m、n和Y如式(II)化合物中所定义，载体如式(I)化合物中所定义。
2.根据权利要求1的方法，其中式(I)或(III)中的载体为式(A)
其中X7为-NH2或
其中a是1-10的整数，优选a是1。
3.根据权利要求1或2的方法，其中式(I)化合物为式(Ia)化合物
其中X7为-NH2或
其中a为1-10的整数，优选a为1，b为2-20的整数，优选3-10，最优选5。
4.如权利要求1或2所定义的式(I)化合物。
5.如权利要求3所定义的式(Ia)化合物。
6.如权利要求1或2所定义的式(III)化合物或其盐。
7.式(IIIa)化合物
或其盐，其中X7是-NH2或
其中a为1-10的整数，优选a为1，b为2-20的整数，优选3-10，最优选5。
8.式(III)化合物，其为
9.一种包含有效量的如权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐的放射性药物组合物；以及一种或多种药学上可接受的助剂、赋形剂或稀释剂。
10.如权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐用于医药的用途，特别是与血管生成相关的疾病或病症的体内诊断或成像，例如用PET。
11.如权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐的放射性标记的共轭物的用途，用于制备放射性药物，其在体内成像方法中使用，适合于PET，优选用于与血管生成相关的疾病或病症的成像；包括将所述放射性药物对人或动物体给药和产生至少部分所述身体成像。
12.一种用于与血管生成相关的疾病或病症的体内诊断或成像的方法，包括将放射性药物对所述身体给药，例如进入血管系统，并产生至少部分所述身体的成像，在其中所述放射性药物使用PET分配，其中所述放射性药物包含权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐。
13.一种监控使用药物对人或动物体治疗的效果的方法，所述药物用于与癌相关的症状斗争，优选血管生成，所述方法包含将权利要求6-8任一项所定义的式(III)或(IIIa)化合物或其盐对所述身体给药，并且测定由细胞受体对所述化合物的吸收，所述给药和检测任选但优选重复进行。
全文摘要
本发明涉及式(III)或(IIIa)化合物或其盐的共轭物，它们作为放射性药物，它们的制备方法，以及用于该方法的合成中间体。
文档编号A61K51/08GK101151054SQ200580030720
公开日2008年3月26日 申请日期2005年9月14日 优先权日2004年9月14日
发明者M·索尔巴肯, B·阿波, A·卡思伯森, A·吉布森 申请人:通用电气医疗集团股份有限公司, 通用电气健康护理有限公司
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