噻唑啉酮2－取代的喹啉的制作方法
专利名称：噻唑啉酮2－取代的喹啉的制作方法
技术领域：
本发明的领域涉及噻唑啉酮取代的喹啉衍生物，其中喹啉环在2位被取代，该衍生物证明具有CDK1抗增殖活性，并且可以用作抗癌剂。
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是在调节细胞周期不同阶段之间的过渡中起关键作用的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，所述的过渡如在从G1中的静止段(对于新一轮的细胞分裂在有丝分裂和DNA复制开始之间的间隔)到S(活跃DNA合成期间)的进展，或者从G2至M阶段的进展，其中发生活跃的有丝分裂和细胞分裂(参见，例如，在Science，2741643-1677(1996)；和Ann.Rev.Cell Dev.Biol，13261-291(1997)中编辑的论文)。通过调节的细胞周期蛋白亚单元(例如，细胞周期蛋白A、B1、B2、D1、D2、D3和E)和催化的激酶亚单元(例如，CDK1、CDK2、CDK4、CDK5和CDK6)的缔合形成CDK配合物。如名称所暗示，CDKs对细胞周期蛋白亚单元显示绝对的相关性，以将它们的目标基质磷酸化，并且不同的激酶/细胞周期蛋白对起着通过细胞周期的具体阶段调节进展的功能。
如上所见，这些蛋白激酶是一类调节各种细胞功能的蛋白(酶)。这是通过在蛋白底物上的特定的氨基酸的磷酸化，从而导致底物蛋白的构象改变而完成的。构象变化调整底物的活性或其与其它结合伙伴相互作用的能力。蛋白激酶的酶活性是指激酶将磷酸基加到底物上的速率。例如，这可以通过测定转变为产物的底物的量随时间的变化来测量。底物的磷酸化发生在蛋白激酶的活性位点。
考虑到上述性质，这些激酶在导致细胞增殖、分化和迁移的生长因子信号转导的传播中扮演重要的部分。成纤维细胞生长因子(FGF)和脉管内皮生长因子(VEGF)已被公认为肿瘤促进血管形成的重要介体。VEGF根据通过两种高亲合力受体发信号而活化内皮细胞，所述的两种高亲合力受体中的一种是含激酶插入域的受体(KDR)(参见，Hennequin L.F.等，J.Med.Chem.45(6)1300(2002)。FGF通过FGF受体(FGFR)发出信号而活化内皮细胞。实体瘤依赖新血管的形成(血管形成)而生长。因此，干扰生长信号转导并且由此减慢或防止血管形成的受体FGFR和KDR的抑制剂在预防和治疗实体瘤中是有用的药剂(参见，Klohs W.E.等，Current Opinion inBiotechnology，10544(1999))。
由于CDKs如CDK1充当细胞分裂的一般活化剂，所以可以将CDK1抑制剂用作抗增殖药剂。可以将这些抑制剂用于开发在抑制失控细胞周期进展中的治疗干涉。
根据本发明，发现了式I的化合物 其中R1是氢、低级烷基、芳氧基-低级烷基、-C(O)2[CH2CH2O]p-R9、-[CH2CH2O]v-R8或R2-(X)n-；X是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基、芳基低级亚烷基、羧基-低级亚烷基、酰氨基低级亚烷基、单-或二卤代-低级亚烷基、氨基-低级亚烷基、单-或二低级烷基氨基-低级亚烷基或亚氨基-低级亚烷基；R2是
是芳基环；含有3至6个碳原子的环烷基；含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有1至2个选自氧、硫和氮的杂原子的5或6元杂芳环；R5、R6和R7独立地选自羟基、低级烷基-砜、羟基-低级烷基、氢、低级烷基、卤素、全氟低级烷基、低级烷氧基、氨基、单-或二低级烷基氨基，或当取代基R5、R6和R7中的两个在环 上的相邻碳原子上取代时，这两个取代基可以与它们相邻的、连接的碳原子一起形成芳基环；3至6元环烷基；4至6元杂环烷基环；或4至6元杂芳环；所述的杂环烷基环和所述的杂芳环含有选自氧、氮或硫的1至2个杂原子；R4是氢、-(O)k[CH2CH2O]y-R10、 或 -O-(CH2)mR14；R19是氢；R20是氢、低级烷基或 是芳基环；含有3至6个碳原子的环烷基；含有选自氧、硫和氮的1至2个杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有选自氧、硫和氮的1至2个杂原子的5至6元杂芳环；R8和R9独立地为氢或低级烷基；R10和R11是低级烷基；R14是全氟低级烷基；R17和R18独立地为氢、低级烷基或 n和k是0至1的整数；
w、y和z是0至3的整数；p是0至6的整数；并且v和m是1至6的整数；或者其中R2含有杂芳环中的氮的化合物的N-氧化物，其中R2含有杂环烷基环或杂芳环中的硫的砜；或其抑制CDKs活性，特别是抑制CDK1活性的药用盐。
本发明的药剂和含有这些药剂的药物组合物可以用于治疗与不受控制的或不需要的细胞增殖有关的各种疾病或疾病状态，如癌症、自身免疫疾病、病毒性疾病、真菌病、神经变性疾病和心血管疾病。
抑制和/或调节CDKs的活性，特别是CDK1的活性，使这些化学式的化合物和含有这些化合物的组合物可以用于治疗由激酶活性介导的疾病，特别是作为治疗癌症中的抗肿瘤药剂。
如本文中所指出的，式I的化合物是可能的抗增殖药剂，并且可以用于介导和/或抑制CDKs，特别是CDK1的活性，从而提供用于治疗与不受控制或异常的细胞增殖有关的癌症或其它疾病的抗肿瘤药剂。
其中，优选的式I化合物是式I-A的化合物 其中R1′是氢，或低级烷基，或低级烷氧基烷基，并且
R4、R19和R20如上所述；或者其药用盐，以及式I-B的化合物 其中R1″是R′2-(X′)n-；n、R4、R19和R20如上所述；并且X是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基，或单-或二卤代低级亚烷基；R2是 是芳基环；含3至6个碳原子的环烷基环；含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有1至2个选自氧、硫和氮的杂原子的5或6元杂芳环；R5′和R6′独立地选自羟基、低级烷基-砜、羟基-低级烷基、氢、低级烷基、卤素、全氟低级烷基、低级烷氧基、氨基、单-或二低级烷基氨基；
或者其中R’2含有杂芳环中的氮的化合物的N-氧化物，其中R’2含有杂环或杂芳环中的硫的砜；或其药用盐。
在其中R1、R1″、R2和X是含有芳基部分的取代基的化合物I和I-B中，优选的芳基部分是苯基。如在本文中使用的，卤素包括全部四种卤素如氟、氯、溴和碘。
如在说明书中所使用的，术语″低级烷基″单独或组合地是指含有1至6个碳原子的一价直链或支链饱和烃烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。
术语″环烷基″是指环状低级烷基取代基，其表示一价未取代的3至6元饱和碳环烃环。其中，优选的环烷基取代基是环丙基、环丁基、环己基等。
术语″低级烷氧基″是指由含有1至6个碳原子的低级烷基形成的直链或支链烷氧基如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等。
术语″芳基″是指一价单-或双环未取代的芳族烃环，如苯基或萘基，其中优选苯基。
术语″杂环烷基″是指含有3至4个碳原子和1个或2个选自氧、氮或硫中的杂原子的4至6元单环饱和环。其中，优选的杂环烷基包括吗啉基、四氢、噻喃基或四氢吡喃基。
术语″杂芳环″是指含有4至5个碳原子和1至2个选自氧、氮或硫中的杂原子的一价5元或6元单环杂芳环。其中，优选的杂芳族基包括噻吩基、噻唑基、吡啶基、呋喃基等。
术语″环-低级亚烷基″是指如上定义的二价环烷基。
术语″低级亚烷基″表示含有1至6个碳原子的二价饱和直链或支链烃取代基。
术语″芳基-低级亚烷基″表示被以上定义的芳基取代的，优选单取代的如上定义的低级亚烷基。实例为苄基、1-苯基乙基或2-苯基乙基。
术语″羧基-低级亚烷基″表示被羧基取代的，优选单取代的如上所表示的低级亚烷基取代基。
术语″羟基-低级亚烷基″表示被羟基取代的，优选单取代的低级亚烷基取代基，在使用酰氨基低级亚烷基时，这表示被酰氨基取代基取代的如上所述的低级亚烷基取代基。
术语″单-或二卤代低级亚烷基″取代基表示此前定义的低级亚烷基取代基，其在低级亚烷基链上的一个或两个碳原子上被单取代或双取代，其中所述的取代基是卤素。
术语″卤素″是指氟、氯、溴或碘。
术语″单-或二低级烷基氨基-低级亚烷基″取代基表示如上定义的低级亚烷基取代基，其在低级亚烷基链上的一个或两个碳原子上被单取代或双取代，其中所述的取代基是单-或二低级烷基氨基。
术语″氨基-低级亚烷基″表示被氨基取代的，优选单取代的如上定义的低级亚烷基取代基。
术语″酰氨基-低级亚烷基″表示用酰氨基在一个位置上取代的如上定义的低级亚烷基取代基。
术语″亚氨基-低级亚烷基″表示用亚氨基在一个位置上取代的如上定义的低级亚烷基取代基。
术语″芳氧基″表示芳氧基取代基，其中芳基如上。优选的芳基为苯基，并且优选的芳氧基为苯氧基。
术语″全氟低级烷基″是指其中低级烷基的全部氢被氟所取代或代替的任何低级烷基。其中，优选的全氟低级烷基为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基等，其中特别优选三氟甲基。
术语″药用盐″是指保留了式I、II、III、IV和V的化合物的生物效力和性质，并由合适的非毒性有机或无机酸或有机或无机碱形成的常规酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐的实例包括从无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨磺酸、磷酸和硝酸衍生的那些盐，和从有机酸如对-甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等衍生的那些盐。碱加成盐的实例包括从铵、钾、钠和季铵氢氧化物如氢氧化四甲铵衍生的那些盐。为了获得改善的化合物的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性，药物化合物(即，药)形成盐的化学修饰是药物化学家公知的技术。参见，例如H.Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(第6版，1995)第196和1456-1457页。
根据本发明，可以根据反应方案1制备式I化合物，其中除非明确另外声明，R1、R4、R19和R20具有以上所给出的含义。
方案1根据本发明，式II化合物通过Knoevenegel反应与式III-A化合物(绕丹宁(2-硫代-噻唑啉-4-酮))反应，以制备式IV化合物。在进行此缩合时，可以采用在进行Knoevenegel反应时常规的任何条件。通常，此反应在碱金属乙酸盐和乙酸存在下、在回流温度进行。
在此合成的下一步骤中，用甲基化试剂处理所得到的式IV的取代噻唑烷，以甲基化在式IV化合物上的硫代基团，制备式V化合物。优选的甲基化试剂是碘代甲烷。此反应在有机胺碱如二异丙基乙胺(DIEA)中进行。在进行此反应时，温度和压力不是关键的，并且此反应可以在室温和大气压下进行。事实上，在进行此反应时，可以使用在甲基化硫代基团中常规的任何条件。
在此合成的下一步骤中，式V化合物与式VI化合物反应，以制备式I化合物。式VI化合物为胺，并且在进行此反应时，可以使用在甲硫基的胺取代中常规使用的任何方法。根据一个实施方案，通过在常规溶剂如乙腈存在下，将式VI化合物与式V化合物反应，来进行此取代。通常，此反应在胺碱如二异丙基乙胺存在下进行。
另一方面，式I化合物可以通过式II化合物与式VII化合物反应来制备 其中R1如上。
式VII化合物与式II化合物制备式I化合物的反应是在封闭体系中，在150℃至250℃的高温，在高度沸腾的有机溶剂如苯或甲苯中进行的。如此，该反应在高温和高压下进行。当希望制备其中R基团在链X或环P中含有卤素的式I化合物时，该反应是特别有利的。式VII化合物可以通过用式III-A化合物与式VI化合物反应的直接置换而直接形成R1-NH2VI其中R1如上。该置换反应通常在用于式IX的噻吩基化合物中的噻吩基的活化剂存在下和胺碱存在下进行。其中，优选的活化剂是氯化汞。此反应在惰性有机溶剂中进行。可以利用任何常规的惰性有机溶剂，如乙腈、二氯甲烷等。在进行此反应时，使用胺碱，如二异丙基乙胺。在进行此反应时，温度和压力不是关键的，并且此反应可以在室温和大气压下进行。在进行此反应时，可以采用用胺置换噻吩基的任何常规方法。
在其中R1为X并且X为羟基低级亚烷基的式VI化合物中，这些化合物可以由相应的氨基酸或氨基酸酯通过用碱金属硼氢化物还原而制备。另一方面，这些羟基低级亚烷基化合物可以通过用氢化铝锂还原相应的氰基羧酸酯而制备。还原反应将氰基还原为氨基，并且将酯还原为羟基。此还原应当在式VI化合物与式V化合物反应之前发生。
另一方面，在其中R1为R2X-并且X为羧基低级亚烷基、酰氨基低级亚烷基或亚氨基低级亚烷基的式VI化合物中的情况下，这些化合物可以通过将相应的式VI化合物与式V化合物或如上所述的式III-A化合物反应而直接转化为式I化合物。
在环 或是形成环 或的含氮环中的氮原子的N-氧化物的情况下，这些N-氧化物可以由叔环氮原子通过氧化而形成。可以利用将叔氮原子氧化为N-氧化物的任何常规方法。优选的氧化剂为间氯过苯甲酸(MCPBA)。
由式II化合物通过Knoevenegel反应与式VII化合物反应以制备式IV化合物，可以制备其中R1是氢的式I化合物。在进行此缩合时，可以采用在进行Knoevenegel反应时常规的任何条件。通常，此反应在碱金属乙酸盐和乙酸存在下、在回流温度进行。在式VII化合物与其中R20是 的式II化合物的Knoevenegel反应中，R20形成酰胺。该酰胺水解形成其中R20是氢的式I化合物的2位处的胺。Knoevenegel反应中使用的碱水解酰胺基，生成相应的胺。
根据本发明，其中R4是氢的式II化合物，即式II-A化合物 其中R19和R20如上，可以由式X化合物
通过以下反应方案2制备，其中R19和R20如上。
方案2将可以由4-碘苯胺用3-乙氧基-丙烯酰氯制备的式X化合物，通过用硫酸处理环化成式XI化合物。通常，该反应在惰性溶剂如二氯甲烷中进行。环化是通过使用硫酸，通过式X化合物的醚部分的α、β不饱和双键而实现的。在进行此反应时，温度和压力不是关键的，并且此环化反应可以在室温和大气压下进行。
其中含有氧代取代基的环化的式XI化合物可以通过用氯化剂如磷酰氯处理而转化为式XII的氯化化合物。通常优选使用液态高度沸腾的氯化剂如磷酰氯。如此，可以将此反应混合物回流，以高收率地将氧代取代基转化成为氯化物。在进行此反应时，可以使用在将氧代基团转化为氯代基团中常规的任何条件。在该反应的下一步骤中，式XII化合物与氢氧化铵反应以制备式XIII化合物。该反应是通过在100-200℃、优选150℃的温度，在加压下与氢氧化铵反应1至4小时而进行的。如果需要，可以通过式XII化合物与取代的胺的反应，或者通过将伯胺转化成含有低级烷基的仲胺的任何常规方式，制备具有R19和R20取代基的仲胺。其上带 取代基的式II-A的2-酰胺取代化合物可以通过伯胺化合物与酰氯反应而制备。在此合成的下一步骤中，使用甲酰化反应，将式XIII化合物转化为式II-A化合物，从而将在苯环上的碘基团转化为CHO取代基。此反应通过在二苯基丙基膦(dpp)存在下，在碱存在下，使用乙酸钯作为催化剂，将式XIII的化合物与一氧化碳反应来进行。在进行此反应时，在60℃至100℃的温度，在加压下向反应混合物加入一氧化碳。进行此反应时通常利用70至80 psi的压力。可以利用通过与一氧化碳的反应而将苯环上的卤素基团转化成醛的任何常规方法来进行该转化。
2，4二取代的式I化合物，即式II-B的中间体 其中R20′是 并且R4和R11如上，可以根据以下反应方案3而合成，其中R20′和R4如上
方案3式XVII化合物可以由式XVI化合物(化合物XVI的制备描述于实施例2中)，通过式XVI化合物与式XX羧酸的活性衍生物反应而制备， 其中R11如上。
可以采用将胺通过与活性羧酸衍生物如卤化物或酸酐反应而转化成酰胺的任何常规方法进行该反应。含有羟基的式XVII化合物可以通过以下方法转化成式XVIII化合物将式XVII化合物的羟基位点与希望位于式I化合物4-位的R4取代基的卤化物反应。该反应通过在惰性有机溶剂介质中，在回流条件下，将相应的卤化物与式XVII化合物反应而进行。可以利用使羟基与卤化物反应的任何常规方法进行该反应。在此合成的最后一个步骤，使用甲酰化反应，将式XVIII化合物转化为式II-B化合物，从而将在苯环上的碘基团转化为CHO取代基。此反应可以通过如上所述的在碱存在下，使用四(三苯膦)钯催化剂，在60℃至140℃的温度，将式XVIII化合物与一氧化碳反应来进行。进行此反应时，在加压下向反应介质加入一氧化碳。通常使用40至80psi的压力。可以将通过与一氧化碳的反应而将苯环上的卤素基团转化成醛的甲酰化反应的任何常规方法用来将式XVIII化合物转化为式II-B化合物。
其中，式I化合物及其包括式I-A和式I-B化合物的实施方案是其中所有芳基取代基中的芳基都优选为苯基的化合物。
其中，式I-A化合物类的优选实施方案是其中R1是氢的式I-A化合物。在此类化合物中特别优选的实施方案是其中R4为-(O)k(CH2CH2O)y-R10的化合物。
在此情况下，特别优选其中R20是 的化合物。
其中，式I-B化合物的优选实施方案是这样一类化合物，其中n是0并且R2′是低级环烷基环，特别是环丙基。这类化合物中，优选其中R4是-(O)k(CH2CH2O)y-R10的化合物。这类化合物中特别优选的是其中R20是 的化合物。
本发明的另一实施方案是这样的式I-B化合物，其中n是1并且X是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基或单-或二卤代低级亚烷基。在此情况下，R4优选为-(O)k(CH2CH2O)y-R10。在此优选实施方案中，特别优选其中R20是 的化合物。
根据本发明的药物组合物可以备选地或除了式I化合物外，还含有作为活性成分的药用前药、药学活性代谢物和这些化合物和代谢物的药用盐。这些化合物、前药、多聚体、盐和代谢物有时在本文中统称为″活性药剂″或″药剂″。
在药剂是固体的情况下，本领域的技术人员应当理解，本发明的化合物和盐可以以不同的晶体或多晶形形式存在，并且其全部都将在本发明和限定式的范围内。
可以将治疗有效量的本发明活性药剂用于治疗由蛋白激酶CDK1的调制或调节介导的疾病。″有效量″意指药剂显著地抑制增殖和/或防止真核细胞如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞去分化的量，并且对于所指示的效用如特定治疗处理是有效的。
给定药剂与这样量相对应的量将根据因素如具体的化合物、疾病状态及其严重性、受试者或需要这种治疗的宿主的特性(例如，重量)而变化，但仍然可以根据此情形周围的具体环境，包括例如给药的具体药剂、给药路径、待治疗的症状以及受试者或将治疗的宿主，以本领域中已知的方式常规地确定。″治疗″意指至少减轻受试者如哺乳动物(例如，人类)中至少部分地由CDK1蛋白激酶的活性而影响的疾病状态，包括防止疾病状态在哺乳动物中发生，特别是当发现哺乳动物倾向于具有该疾病状态而尚未诊断为具有该疾病状态；调节和/或抑制疾病状态；和/或缓和该疾病状态。
本发明还涉及通过给药本发明的药剂而调节或抑制例如哺乳动物组织中的蛋白激酶CDK1活性的方法。作为抗增殖剂的药剂的活性可以容易地由已知的方法测量，例如通过在MTT检测中使用全细胞培养来测量。可由本领域技术人员可以获得的任何方法测量作为CDK1蛋白激酶活性调节剂的本发明药剂的活性，包括体内和/或体外检测。用于活性测量的适宜检测的实例包括在以下文献中所述的那些国际公布号WO 99/21 845；Parast等，Biochemistry，37，16788-16801(1998)；Connell-Crowley和Harpes，Cell CycleMaterials and Methods，(Michele Pagano编辑，Springer，Berlin，Germany)(1995)；国际公布号WO 97/34876；和国际公布号WO 96/14843。这些性质可以例如通过使用在下面的实施例中列出的一种或多种生物学试验程序进行评估。
可以将本发明的活性药剂配制成如下所述的药物组合物。本发明的药物组合物包含有效调制、调节或抑制量的式I化合物和惰性的、药用载体或稀释剂。在药物组合物的一个实施方案中，提供有效水平的本发明药剂，以提供包括抗增殖活性的治疗益处。″有效水平″是指其中增殖得到抑制或控制的水平。将这些组合物以适宜于给药模式如肠胃外或口服给药的单位剂量形式制备。
本发明的药剂可以以常规剂量形式给药，常规剂量形式是通过将治疗有效量的作为活性成分的药剂(例如，式I的化合物)与适宜的药学载体或稀释剂根据常规程序制备的。这些程序可以包括适宜于所需制剂的混合、粒化和压实或溶解所述成分。
所采用的药学载体可以是固体或液体。示例性的固体载体是乳糖、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性的液体载体是糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域已知的延时或缓释材料，如单独的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或含有蜡、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
可以采用各种药物形式。因此，如果使用固体载体，制剂可以形成片剂，以粉末或丸剂形式放置于硬明胶胶囊中，或为锭或锭剂形式。固体载体的量可以变化。如果使用液体载体，制剂形式可以是糖浆、乳剂、软明胶胶囊、在安瓿或小瓶中的可无菌注射的溶液或混悬液或非水性液体混悬液。
为了得到稳定的水溶性剂量形式，可以将活性药剂的药用盐溶解于有机或无机酸的水溶液中。如果不能得到可溶盐形式，则可以将药剂溶解于适宜的共溶剂或共溶剂的组合中。
应当理解，在本发明的组合物中使用的药剂的实际剂量将根据所使用的具体复合物、配制的具体组合物、给药的模式和将治疗的具体位置、宿主和疾病而变化。对于给定的一组症状的最佳剂量可以由本领域的技术人员考虑到药剂的实验数据，使用常规的剂量确定试验而确定。
本发明的组合物可以以用于制备药物组合物的通常已知的方式制备，例如使用常规的技术如混合、溶解、粒化、制糖丸、研磨、乳化、制胶囊、捕集或冻干。可以以常规方式使用一种或多种生理学上可以接受的载体配制药物组合物，所述的载体可以选自有利于将活性化合物加工成为药学上可以使用的制剂的赋形剂和辅剂。
对于口服给药，可以容易地将所述的化合物与本领域中已知的药用载体组合来配制该化合物。这些载体可以将本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、混悬液等，用于由受治患者经口摄入。口服使用的药物制剂可以通过以下方法得到使用与活性成分(药剂)混合的固体赋形剂，任选研磨得到的混合物，并且如果需要，在加入适宜的辅剂之后加工颗粒的混合物，以得到片剂或糖衣核。
下面将由相应的工作实施例进一步说明本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例15-[1-(2-氨基-喹啉-6-基)-甲-(Z)-亚基]-2-(((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮；与三氟乙酸的复合物 3-乙氧基-N-(4-碘-苯基)-丙烯酰胺的制备 在0℃向草酰氯(40g，0.555mol)溶液中缓慢加入乙基乙烯基醚(105.6g，0.84mol)，将混合物在0℃搅拌2小时并且在室温搅拌12小时。在用旋转蒸发仪除去一些溶剂后，将黑色混合物在120℃回流30min。在用旋转蒸发仪然后用油泵除去溶剂后，获得3-乙氧基-丙烯酰氯(69.9g)，为黑色液体，该液体不经进一步纯化直接用于下一步骤。
向4-碘苯胺(14g，64mmol)和吡啶(10.5mL，128mmol)在二氯甲烷(85mL)中的混合物加入3-乙氧基-丙烯酰氯(10g，75mmol)。在搅拌5小时后，加入更多的3-乙氧基-丙烯酰氯(5g，38mmol)和吡啶(10.5mL，64mmol)。搅拌2天后，将反应混合物用水(3×100mL)洗涤，MgSO4干燥并且浓缩，得到3-乙氧基-N-(4-碘-苯基)-丙烯酰胺，为黑色的油(11.32g，56％)。LC-MSm/e 318(MH+)。
6-碘-1H-喹啉-2-酮的制备 在搅拌下将硫酸缓慢加入3-乙氧基-N-(4-碘-苯基)-丙烯酰胺(11.3g，36mmol)中。在搅拌3小时后，将反应混合物缓慢倒入冰(～300g)中。过滤收集沉淀，用水洗涤并且干燥。经过快速色谱(Merck硅胶60，230-400目，二氯甲烷中的0％-15％甲醇，40分钟内)得到6-碘-1H-喹啉-2-酮(7.23g，75％)，为黑色固体。LC-MS m/e 272(MH+)。
2-氯-6-碘-喹啉的制备 将6-碘-1H-喹啉-2-酮(6.23g，23mmol)在磷酰氯(25mL)中的混合物在N2下回流2h。冷却后，用旋转蒸发仪然后用油泵除去溶剂。缓慢加入饱和碳酸氢钠(100mL)。过滤收集固体，用饱和碳酸氢钠、水洗涤并且干燥，获得2-氯-6-碘-喹啉(5.78g，87％)，为黑色固体。LC-MS m/e 290(MH+)。
6-碘-喹啉-2-基胺的制备
在压力管中将2-氯-6-碘-喹啉(1g，3.46mmol)在氢氧化铵(28％，20mL)中的悬浮液在140℃加热3天。冷却后，用旋转蒸发仪除去溶剂。过滤收集固体，用水洗涤并且干燥，获得6-碘-喹啉-2-基胺(0.78g，84％)，为黑色固体。LC-MS m/e 271(MH+)。
2-氨基-喹啉-6-甲醛的制备 在压力管中，将6-碘-喹啉-2-基胺(200mg，0.74mmol)、三乙胺(0.26mL，1.85mmol)、二苯基丙基膦(dpp，17μL，0.074mmol)和乙酸钯(II)(17mg，0.074mmol)在无水N，N-二甲基甲酰胺(4mL)中的混合物在75psi的一氧化碳下，在室温搅拌10分钟。在加入三己基硅烷(0.53mL，1.5mmol)后，然后将混合物在75psi的一氧化碳下在80℃搅拌4小时。让反应冷却至25℃，然后用二氯甲烷(2×50mL)萃取。将合并的有机层相继用水(3×50mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并且真空浓缩。经过快速色谱(Merck硅胶60，70-230目，乙酸乙酯)得到2-氨基-喹啉-6-甲醛(30mg，24％)，为固体。
2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮的制备 在室温，向(1R，2S)-2-苯基-环丙基胺盐酸盐(0.85g，5mmol)和绕丹宁(2-硫代-噻唑啉-4-酮)(0.68g，5mmol)在乙腈(20mL)中的悬浮液中，加入(N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(2.61mL，15mmol)。然后，将此溶液冷却至0℃，并且在10分钟的期间内，分两份加入氯化汞(1.35g，5mmol)。加入后，让悬浮液温热至室温，并且搅拌2天。通过硅藻土垫过滤得到的黑色固体，并且用乙酸乙酯(500mL)洗涤。真空除去滤液，并且将粗剩余物用水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)稀释。分离成两层，并且将水层用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水溶液洗涤，并且用无水硫酸镁干燥。过滤干燥剂并且在真空下除去溶剂，得到粗剩余物，其用Biotage硅胶柱色谱纯化，得到0.474g(42％收率)的2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮，为白色无定形固体EI-HRMS m/e计算值C12H12N2OS(M+)232.0670，实测值232.0665。
制备5-[1-(2-氨基-喹啉-6-基)-甲-(Z)-亚基]-2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮；与三氟乙酸的复合物 向2-氨基-喹啉-6-甲醛(30mg，0.174mmol)和2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮(26mg，0.11mmol)在甲苯(1mL)中的悬浮液中加入苯甲酸(benzolic acid)(3mg，0.011mmol)和哌啶(3μL，0.011mmol)。用微波将混合物加热到150℃ 20分钟。待冷却到室温后，过滤收集固体，用甲苯洗涤并且干燥。粗产物用HPLC(反相C18，10％-90％乙腈水溶液，10分钟内)纯化，得到与三氟乙酸复合的5-[1-(2-氨基-喹啉-6-基)-甲-(Z)-亚基]-2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮(36mg，84％)，为黄色固体。LC-MS m/e 271(MH+)。
实施例25-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-2-[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮
6-溴-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮的制备 将2-氨基-5-溴-苯甲酸(280g，1.3mol)的乙腈(1.31)溶液温热到50-55℃。同时滴加吡啶(206g，2.61mol)和三光气(128.8g，0.43mol)的二氯甲烷(720ml)溶液。加完后，将混合物在50-55℃再搅拌2h。减压除去溶剂，并且加入水。过滤收集沉淀，用水和冷却的二氯甲烷顺序洗涤，然后真空干燥，得到所需的产物6-溴-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(304g，98％)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
2-氨基-6-溴-喹啉-4-醇的制备 在50-60℃将6-溴-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(90g，0.373mol)的(N，N-二甲基甲酰胺)(DMF)(400ml)溶液中加入到丙二腈(37g，0.41mol)和三乙胺(41.4g，0.41mol)的DMF(150ml)溶液中。将反应混合物在50-60℃保持30分钟。向冰冷的0.2N HCl(400ml)中的反相淬灭产生沉淀。将该物质过滤分离并且真空干燥。然后溶解在8N KOH(21)中，并且将溶液回流40h。待冷却到室温后，用HCl中和混合物，将得到的沉淀过滤并且风干，得到2-氨基-6-溴-喹啉-4-醇，为浅黄色固体(95g，97％)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
N-(6-溴-4-羟基-喹啉-2-基)-乙酰胺的制备 将2-氨基-6-溴-喹啉-4-醇(29.4g，0.12mol)、乙酸酐(36.7g，0.36mol)和硫酸(20ml)在冰醋酸(300ml)中的混合物回流30分钟。让混合物冷却到室温，然后倒入水中。过滤分离沉淀并且干燥，得到产物N-(6-溴-4-羟基-喹啉-2-基)-乙酰胺，为棕色固体(32g，93％)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
N-(6-溴-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺的制备 将N-(6-溴-4-羟基-喹啉-2-基)-乙酰胺(32g，0.114mol)、乙基碘(26.77g，0.171mol)和碳酸钾(130g，0.912mol)在乙腈(250ml)中的混合物回流2h。蒸发溶剂，并且将残余物用水研磨。将沉淀通过过滤收集并且干燥，得到N-(6-溴-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺，为浅黄色固体(28g，80％)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺的制备
用氮气吹扫四(三苯膦)钯(Pd(PPh3)4)和甲酸钠(5g，48mmol)在乙腈(30ml)中的混合物。通过橡胶隔片加入N-(6-溴-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺(2.5g，8.12mmol)的DMSO(30mL)溶液。将容器置于一氧化碳(50psi)下、密封并且加热到120℃ 30分钟。将混合物冷却到室温，并且减压蒸发乙腈。加入水，通过过滤收集得到的沉淀并且干燥，得到所需的醛N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺，为浅黄色固体(0.8g，40％)。
5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-2-[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮的制备 在微波合成器中，在180℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(实施例2e，50mg，0.19mmol)的乙酸(1.5ml)溶液用2[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮(69mg，0.29mmol)和乙酸钠(63mg，0.77mmol)处理60分钟。加入水(0.5ml)，并且在140℃微波处理反应混合物15分钟。用1NNaOH猝灭混合物。通过吸滤收集沉淀，并且用水、乙醚和二氯甲烷顺序洗涤。然后将粗沉淀物溶解在DMF中并且浓缩至干。将该物质用二噁烷研磨并且过滤。减压浓缩母液，得到粉末状的产物5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-2-[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮(23mg，28％)。
LC-MS m/e 437(MH+)。
实施例32-氨基-5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-噻唑-4-酮 在微波合成器中，在180℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(实施例2e，50mg，0.19mmol)的乙酸(1.5ml)溶液用假海硫因(34mg，0.29mmol)和乙酸钠(63mg，0.77mmol)处理45分钟。将混合物在1N NaOH和二氯甲烷之间分配。将含有所需产物的水层浓缩至干，并且将粗残余物用RP HPLC纯化，得到TFA盐形式的产物(5mg，8％)。LC-MS m/e 315(MH+)。
实施例4N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2-[(四氢-吡喃-4-基甲基-氨基)-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基]-乙酰胺 c-(四氢-吡喃-4-基)-甲基乙酸铵的制备
将冷却(冰水浴)的四氢-4H-吡喃-4-酮(7.5g，75mmol)和甲苯磺酰基甲胩(16.05g，82.4mmol)的DME(125ml)溶液用叔丁醇钾(16.8g，150mmoles)在叔丁醇(250ml)中的悬浮液处理。反应混合物在室温搅拌31/2小时，然后用乙醚(250ml)稀释。将混合物用水和盐水顺序洗涤，然后用硫酸钠干燥、过滤并且浓缩。粗产物通过高真空下的短程蒸馏进行纯化，得到无色油状的腈(2.98g)。将该物质溶解在1M硼烷/四氢呋喃(THF)(134ml，134mmol)中，并且在室温搅拌过夜。通过加入甲醇(室温，1h)猝灭过量的硼烷，并且将混合物浓缩至干。将残余物溶解在4N HCl/二噁烷中，在室温搅拌1h，其后减压浓缩。固体残余物用乙醚洗涤并且通过吸滤收集。在室温下，将该物质(1.81g，11.9mmol)在THF(30ml)中的悬浮液用1N NaOH(11.9ml，11.9mmol)处理1/2h。蒸馏除去THF，将水溶液用NaCl饱合，然后用二氯甲烷萃取。有机层用硫酸钠干燥并且减压浓缩。残余物用乙酸(0.68ml，11.9mmol)处理，在真空烘箱中干燥后得到c-(四氢-吡喃-4-基)-甲基乙酸铵(1.71g)。
N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2-[(四氢-吡喃-4-基甲基-氨基)-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基]-乙酰胺的制备 在室温下，将N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺(实施例6a，50mg，0.12mmol)在乙腈(2ml)中的悬浮液与二异丙基乙胺(0.20ml，1.2mmol)和碘代甲烷(0.15ml，2.3mmol)反应45分钟。将混合物浓缩至干，并且将残余物悬浮在乙腈(2ml)中。在室温下顺序加入二异丙基乙胺(0.20ml，1.2mmol)和c-(四氢-吡喃-4-基)-甲基乙酸铵(100mg，0.58mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜。通过吸滤收集沉淀，将其吸附在SiO2上，并且在使用0-10％甲醇/乙酸乙酯梯度的硅胶柱上纯化，得到固体产物(29mg，56％)。LC-MS m/e 455(MH+)。
实施例5N-[6-(2-环丙基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺 2-环丙基氨基-噻唑-4-酮的制备 将氯乙酸乙酯(20g，0.16mol)和硫氰酸钾(12.7g，0.13mol)的乙醇(100ml)溶液回流3h。将溶液过滤和减压浓缩，得到18.7g的氰硫基-乙酸乙酯(97％)。将环丙基乙酸铵(0.50g，4.27mmol)和氰硫基-乙酸乙酯(0.62g，4.27mmol)的混合物加热到90℃ 3h，并且在室温放置过夜。将反应混合物在6N HCl和二氯甲烷之间分配。分离各层。加入6N氢氧化铵使水层变为碱性，然后浓缩至干。将粗品用二氯甲烷研磨，并且通过过滤将溶液与固体分离。该溶液用硫酸钠干燥并且浓缩至干。粗品在使用100％乙酸乙酯的硅胶柱上纯化，得到2-环丙基氨基-噻唑-4-酮(244mg，37％)。
N-[6-(2-环丙基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺的制备
在微波合成器中，在180℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(100mg，0.39mmol)的乙酸(2ml)溶液用2-环丙基氨基-噻唑-4-酮(61mg，0.39mmol)和乙酸钠(127mg，1.55mmol)处理90分钟。通过吸滤收集沉淀，并且用水和乙醚顺序洗涤，在真空烘箱中干燥后得到产物N-[6-(2-环丙基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺，为固体(32mg，21％)。LC-MS m/e 397(MH+)。
实施例6N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2[2-(四氢-吡喃-4-基)-乙基氨基]-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基)-乙酰胺 N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺的制备
在微波合成器中，在160℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(400mg，1.55mmol)的乙酸(6ml)溶液用绕丹宁(320mg，0.29mmol)和乙酸钠(530mg，6.5mmol)处理25分钟。通过吸滤收集沉淀，用乙酸、水和乙醚洗涤，然后在真空烘箱中干燥，得到中间体N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺，为棕色固体(396mg，68％)。
N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2[2-(四氢-吡喃-4-基)-乙基氨基]-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基)-乙酰胺的制备 在室温下将N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺(实施例6a，50mg，0.11mmol)在乙腈(1.5ml)中的悬浮液与二异丙基乙胺(0.200ml，1.15mmol)和碘代甲烷(0.15ml，2.3mmol)反应30分钟。将混合物浓缩至干，并且将残余物悬浮在乙腈(1.5ml)中。在室温顺序加入二异丙基乙胺(0.20ml，1.15mmol)和4-(2-氨基乙基)四氢吡喃(0.075ml，0.58mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜。通过吸滤收集沉淀，并且用乙腈洗涤。然后吸附在SiO2上，并且在使用0-10％甲醇/乙酸乙酯梯度的硅胶柱上进行纯化，得到产物N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2[2-(四氢-吡喃-4-基)-乙基氨基]-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基)-乙酰胺，为浅黄色固体(22mg，50％)。LC-MS m/e 469(MH+)。
实施例7N-(6-{2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺
将N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺(实施例6a，80mg，0.21mmol)在乙腈(3ml)中的悬浮液与二异丙基乙胺(0.40ml，2.2mmol)和碘代甲烷(0.30ml，4.6mmol)在室温反应30分钟。将混合物浓缩至干，并且将残余物悬浮在DMF(0.5ml)中。在室温下加入氨的甲醇溶液(7N，5ml，35mmol)，并且将混合物在室温搅拌24h。将混合物浓缩至干，并且将固体用水研磨。通过吸滤收集沉淀，用水和乙醚相继洗涤，然后风干，得到浅棕色固体产物(50mg，663％)。LC-MS m/e 357(MH+)。
实施例8N-[6-(2-环丙基甲基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺2-环丙基甲基氨基-噻唑-4-酮的制备 将环丙基甲基乙酸铵(0.45g，3.44mmol)和氰硫基-乙酸乙酯(0.5g，3.44mmol)的混合物加热到90℃ 2h。将反应混合物在6N HCl和二氯甲烷之间分配。分离各层。通过加入6N氢氧化铵使水层成碱性，然后用二氯甲烷萃取。将有机层用硫酸钠干燥并且减压浓缩。水层也浓缩至干，并且将残余物用DMF研磨。将DMF溶液过滤并且浓缩至干。合并残余物，在使用100％乙酸乙酯的硅胶柱上纯化，得到2-环丙基甲基氨基-噻唑-4-酮(275mg，47％)。
N-[6-(2-环丙基甲基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺的制备
在微波合成器中，在180℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(100mg，0.39mmol)的乙酸(2ml)溶液用2-环丙基甲基氨基-噻唑-4-酮(66mg，0.39mmol)和乙酸钠(127mg，1.55mmol)处理2h。将反应混合物在1NNaOH和乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶1)之间分配。有机层用硫酸钠干燥、过滤并且浓缩至干。粗品在使用0-7％甲醇/乙酸乙酯梯度的硅胶柱上纯化，得到产物N-[6-(2-环丙基甲基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺，为固体(10mg，7％)。LC-MS m/e 411(MH+)。
实施例9N-(6-{2-[(1，4]二氧杂环己烷-2-基甲基)-氨基]-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺 将N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺(实施例6a，50mg，0.12mmol)在乙腈(1.5ml)中的悬浮液与二异丙基乙胺(0.20ml，1.2mmol)和碘代甲烷(0.15ml，2.3mmol)在室温反应30分钟。将混合物浓缩至干，并且将残余物悬浮在乙腈(1.5ml)中。在室温下顺序加入二异丙基乙胺(0.20ml，1.2mmol)和c-[1，4]二氧杂环己烷-2-基-甲胺(68mg，0.58mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜。通过吸滤收集沉淀，将其吸附在SiO2上，并且在使用100％乙酸乙酯的硅胶柱上纯化，得到固体产物N-(6-{2-[([1，4]二氧杂环己烷-2-基甲基)-氨基]-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺(34mg，63％)。LC-MS m/e 457(MH+)。
实施例10药理学检测本发明化合物的药理学性能可以由许多药理学检测证实。已经用根据本发明的化合物及它们的盐进行了下面的示例性药理学检测。本发明化合物显示出CDK1/细胞周期蛋白B活性，其中Ki值低于5.0μM。这证明所有这些化合物对于抑制CDK1/细胞周期蛋白B具有活性。
为了测定CDK1活性的抑制，进行FlashPlateTM检测(NENTM-LifeScience Products)检测或HTRF检测。两种类型的激酶检测都是使用重组人CDK1/细胞周期蛋白B复合物进行的。在杆状病毒载体中的GST-细胞周期蛋白B(GST-cycB)和CDK1cDNA克隆由Baylor College of Medicine，Houston，TX的W.Harper博士提供。在High FiveTM昆虫细胞中共表达蛋白质，如前所描述(Harper，J.W.等Cell 1993，75，805-816)，在谷胱甘肽琼脂糖树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)上纯化复合物。成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白(氨基酸386-928)的6x-组氨酸标记的截短型被用作CDK1/细胞周期蛋白B检测的底物(表达质粒由英国Welwyn Garden City，Roche ResearchCentre，Department of Molecular Virology的Veronica Sullivan博士提供)。Rb蛋白为通过CDK1磷酸化的天然底物(参见Herwig和Strauss Eur.J.Biochem.Vol.246(1997)pp.581-601，及其中引用的参考文献)。62Kd蛋白的表达受M15E.Coli菌株中IPTG可诱导的启动子控制。通过超声处理裂解细胞，通过将pH 8.0的裂解产物结合到预先用1mM咪唑预处理的Ni-螯合的琼脂糖柱上，进行纯化。然后用逐渐降低至pH 6.0的pH缓冲液洗涤树脂几次，并用500mM咪唑洗脱。将洗脱的蛋白用20mM HEPES pH7.5、30％甘油、200mM NaCl和1mM DTT透析。定量纯化的Rb融合蛋白原液的蛋白浓度，分成等份，在-70℃下储存。
对于FlashPlate激酶的检测，Rb蛋白以10μg/ml的浓度，每孔使用100μl涂布96孔FlashPlate。将该板在4℃下温育过夜，或在振摇器、室温下温育3小时。为了控制非特异性磷酸化，一行孔用100μl/孔涂布缓冲液(20mM HEPES，0.2M NaCl)涂布。然后用洗涤缓冲液(0.01％吐温20的磷酸盐缓冲盐水)冲洗该板两次。要测试的化合物(“测试化合物”)以5×最终浓度加入到孔中。通过立即加入40μl反应混合物(25mM HEPES，20mMMgCl2，0.002％吐温20，2mM DTT，1μM ATP，4nM 33P-ATP)和足够量的酶引发反应，获得高于背景至少10倍的计数。在振摇器上、室温下温育该板30分钟。用洗涤缓冲液洗涤该板4次，密封，并在TopCount闪烁计数器(Packard Instrument Co.，Downers Grove，IL]上计数。根据下式确定Rb磷酸化抑制百分数，其为CDK活性抑制的衡量标准100×[1-(测试化合物-非特异性数)/(总数-非特异性数)]其中“测试化合物”指重复测试的每分钟的平均计数，“非特异性数”指当不加入CDK1/细胞周期蛋白B等时的每分钟平均计数，而“总数”指不加入化合物时每分钟的平均计数。IC50值为在所述测试条件下放射标记的蛋白激酶诱导的结合减少50％的测试化合物的浓度。由下式计算抑制剂常数Ki的值Ki＝IC50/(1+[S]/Km)，其中[S]是ATP浓度，并且Km为Michaelis常数。
使用96-孔聚丙烯板(BD Biosciences，Bedford，MA)进行均匀时间分辨荧光(HTRF)激酶检测。将试验化合物首先溶解于DMSO中，然后稀释于激酶检测缓冲液1(25mM HEPES，pH7.0，8mM MgCl2，1.5mM DTT，和162μM ATP)，其中DMSO浓度为15％。将CDK1/细胞周期蛋白B酶稀释于激酶检测缓冲液2(25mM HEPES，pH 7.0，8mM MgCl2，0.003％吐温20，0.045％BSA，1.5mM DTT和0.338μM Rb蛋白)。为了引发激酶反应，将20μL的化合物溶液与40μL的CDK1/细胞周期蛋白B溶液在检测板中混合，其中CDK1/细胞周期蛋白B和Rb的最终浓度分别为0.1μg/mL和0.113μM，并且在37℃温育30分钟。将15μL的抗-磷酸-Rb(Ser 780)抗体(CellSignaling Technology，Beverly，MA)在抗体1∶7692稀释的条件下加入。于37℃继续温育25分钟，然后，将LANCE Eu-W1024标记的抗兔IgG(1nM，PerkinElmer，Wellesley，MA)和共轭到 SureLight-Allophucocyanin的抗-His抗体(20nM，PerkinElmer，Wellesley，MA)加入至孔中。在37℃继续温育40分钟。将温育完成后，将35μl的反应混合物转移到新鲜的384-孔黑聚苯乙烯板(Corning Incorporated，Corning，NY)中，并且在340nm的激发波长和665/615nm的发射波长下在荧光板读出器上读出。
显示出采用本发明主题的化合物的CDK1/细胞周期蛋白B活性的Ki值的范围为约0.001μM至约5.000μM。一些实施例的具体数据如下
权利要求
1.式I的化合物 其中R1是氢、低级烷基、芳氧基-低级烷基、-C(O)2[CH2CH2O]p-R9、-[CH2CH2O]v-R8或R2-(X)n-；X是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基、芳基低级亚烷基、羧基-低级亚烷基、酰氨基低级亚烷基、单-或二卤代-低级亚烷基、氨基-低级亚烷基、单-或二低级烷基氨基-低级亚烷基或亚氨基-低级亚烷基；R2是 是芳基环；含有3至6个碳原子的环烷基；含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有1至2个选自氧、硫和氮的杂原子的5或6元杂芳环；R5、R6和R7独立地选自羟基、低级烷基-砜、羟基-低级烷基、氢、低级烷基、卤素、全氟低级烷基、低级烷氧基、氨基、单-或二低级烷基氨基，或当取代基R5、R6和R7中的两个在环 上的相邻碳原子上取代时，这两个取代基可以与它们相邻的、连接的碳原子一起形成芳基环；3至6元环烷基环；4至6元杂环烷基环；或4至6元杂芳环；所述的杂环烷基环和所述的杂芳环含有选自氧、氮或硫的1至2个杂原子；R4是氢、-(O)k[CH2CH2O]y-R10、 或-O-(CH2)mR14；R19是氢；R20是氢、低级烷基或 是芳基环；含有3至6个碳原子的环烷基；含有选自氧、硫和氮的1至2个杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有选自氧、硫和氮的1至2个杂原子的5至6元杂芳环；R8和R9独立地为氢或低级烷基；R10和R11是低级烷基；R14是全氟低级烷基；R17和R18独立地为氢、低级烷基或 n和k是0至1的整数；w、y和z是0至3的整数；p是0至6的整数；并且v和m是1至6的整数；或者其中R2含有杂芳环中的氮的化合物的N-氧化物，其中R2含有杂环烷基环或杂芳环中的硫的砜；或其药用盐。
2.权利要求1的化合物，其中所述的化合物是 其中R1′是氢或低级烷基；并且R4、R19和R20如权利要求1所定义；或其药用盐。
3.权利要求2的化合物，其中R1′是氢；R4是-(O)k(CH2CH2O)y-R10；并且R10、k和y如权利要求1所定义。
4.权利要求3的化合物，其中所述的化合物是N-(6-{2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺；和2-氨基-5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-噻唑-4-酮。
5.权利要求1的化合物，其中所述的化合物是 其中R1″是R′2-(X′)n-；n、R4、R19和R20如权利要求1所定义；并且X′是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基、单-或二卤代低级亚烷基；R2′是 是芳基环；含3至6个碳原子的环烷基环；含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的4至6元杂环烷基环；含有1至2个选自氧、硫和氮的杂原子的5或6元杂芳环；R5′和R6′独立地选自羟基、低级烷基-砜、羟基-低级烷基、氢、低级烷基、卤素、全氟低级烷基、低级烷氧基、氨基、以及单-或二低级烷基氨基；或者其中R’2含有杂芳环中的氮的化合物的N-氧化物，其中R’2含有杂环烷基环或杂芳环中的硫的砜；或其药用盐。
6.权利要求5的化合物，其中X′是低级亚烷基；R’2是苯基，该苯基任选被卤素取代；R4是-O-CH2-CH3；n是1。
7.权利要求6的化合物，其中所述的化合物是5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-2-[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮。
8.权利要求5的化合物，其中X′是低级亚烷基；R’2是含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的杂环；R4是-O-CH2-CH3；n是1。
9.权利要求8的化合物，其中所述的化合物是N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2[2-(四氢-吡喃-4-基)-乙基氨基]-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基)-乙酰胺；N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2-[(四氢-吡喃-4-基甲基-氨基)-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基]-乙酰胺；和N-(6-{2-[([1，4]二氧杂环己烷-2-基甲基)-氨基]-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺。
10.权利要求5的化合物，其中X′是低级亚烷基；R’2是环丙基，该环丙基是未取代的或者被苯基取代；R4是氢或-O-CH2-CH3；n是0或1。
11.权利要求10的化合物，其中所述的化合物是N-[6-(2-环丙基甲基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺；N-[6-(2-环丙基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺；和5-[1-(2-氨基-喹啉-6-基)-甲-(Z)-亚基]-2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑4-酮。
12.用于制备根据权利要求1的式I化合物的方法，其中a)将式II化合物 在式III化合物存在下反应， 以得到式IV化合物 和b)将所述的式IV化合物在甲基化试剂存在下进一步反应，得到式V化合物 和c)将所述的式V化合物与式VI的胺进一步反应，R1-NH2VI以得到式I化合物，和d)将所述的式I化合物从反应混合物中分离，并且如果需要，将其转化成药用盐，并且其中R1、R4、R19和R20具有权利要求1中给出的含义。
13.根据权利要求12的方法，其中b)项中的甲基化试剂是碘代甲烷。
14.根据权利要求1的式I化合物，其用于治疗癌症，特别是实体瘤。
15.一种用于治疗癌症，特别是用于治疗实体瘤的药物组合物，其包含一种或多种式I化合物，以及药用辅剂。
16.根据权利要求1的式I化合物，其用于制备药物，所述药物用于治疗基于失控细胞周期进展的疾病。
17.根据权利要求1的式I化合物，其用于制备药物，所述药物用于治疗癌症，特别是实体瘤。
18.采用根据权利要求12的方法制备的根据权利要求1的式I化合物。
19.基本上如上所述的新型化合物、方法、组合物和用途。
全文摘要
本发明提供式(I)的噻唑啉取代的喹啉衍生物，其中喹啉环在2位被取代，该衍生物证明具有CDK1抗增殖活性，因此可以用作抗癌剂；还提供含有所述化合物的药物组合物以及它们的制备方法。
文档编号A61P35/00GK101018785SQ200580030902
公开日2007年8月15日 申请日期2005年9月15日 优先权日2004年9月17日
发明者陈力, 陈少清, C·米舒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
技术领域：
本发明的领域涉及噻唑啉酮取代的喹啉衍生物，其中喹啉环在2位被取代，该衍生物证明具有CDK1抗增殖活性，并且可以用作抗癌剂。
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是在调节细胞周期不同阶段之间的过渡中起关键作用的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，所述的过渡如在从G1中的静止段(对于新一轮的细胞分裂在有丝分裂和DNA复制开始之间的间隔)到S(活跃DNA合成期间)的进展，或者从G2至M阶段的进展，其中发生活跃的有丝分裂和细胞分裂(参见，例如，在Science，2741643-1677(1996)；和Ann.Rev.Cell Dev.Biol，13261-291(1997)中编辑的论文)。通过调节的细胞周期蛋白亚单元(例如，细胞周期蛋白A、B1、B2、D1、D2、D3和E)和催化的激酶亚单元(例如，CDK1、CDK2、CDK4、CDK5和CDK6)的缔合形成CDK配合物。如名称所暗示，CDKs对细胞周期蛋白亚单元显示绝对的相关性，以将它们的目标基质磷酸化，并且不同的激酶/细胞周期蛋白对起着通过细胞周期的具体阶段调节进展的功能。
如上所见，这些蛋白激酶是一类调节各种细胞功能的蛋白(酶)。这是通过在蛋白底物上的特定的氨基酸的磷酸化，从而导致底物蛋白的构象改变而完成的。构象变化调整底物的活性或其与其它结合伙伴相互作用的能力。蛋白激酶的酶活性是指激酶将磷酸基加到底物上的速率。例如，这可以通过测定转变为产物的底物的量随时间的变化来测量。底物的磷酸化发生在蛋白激酶的活性位点。
考虑到上述性质，这些激酶在导致细胞增殖、分化和迁移的生长因子信号转导的传播中扮演重要的部分。成纤维细胞生长因子(FGF)和脉管内皮生长因子(VEGF)已被公认为肿瘤促进血管形成的重要介体。VEGF根据通过两种高亲合力受体发信号而活化内皮细胞，所述的两种高亲合力受体中的一种是含激酶插入域的受体(KDR)(参见，Hennequin L.F.等，J.Med.Chem.45(6)1300(2002)。FGF通过FGF受体(FGFR)发出信号而活化内皮细胞。实体瘤依赖新血管的形成(血管形成)而生长。因此，干扰生长信号转导并且由此减慢或防止血管形成的受体FGFR和KDR的抑制剂在预防和治疗实体瘤中是有用的药剂(参见，Klohs W.E.等，Current Opinion inBiotechnology，10544(1999))。
由于CDKs如CDK1充当细胞分裂的一般活化剂，所以可以将CDK1抑制剂用作抗增殖药剂。可以将这些抑制剂用于开发在抑制失控细胞周期进展中的治疗干涉。
根据本发明，发现了式I的化合物 其中R1是氢、低级烷基、芳氧基-低级烷基、-C(O)2[CH2CH2O]p-R9、-[CH2CH2O]v-R8或R2-(X)n-；X是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基、芳基低级亚烷基、羧基-低级亚烷基、酰氨基低级亚烷基、单-或二卤代-低级亚烷基、氨基-低级亚烷基、单-或二低级烷基氨基-低级亚烷基或亚氨基-低级亚烷基；R2是
是芳基环；含有3至6个碳原子的环烷基；含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有1至2个选自氧、硫和氮的杂原子的5或6元杂芳环；R5、R6和R7独立地选自羟基、低级烷基-砜、羟基-低级烷基、氢、低级烷基、卤素、全氟低级烷基、低级烷氧基、氨基、单-或二低级烷基氨基，或当取代基R5、R6和R7中的两个在环 上的相邻碳原子上取代时，这两个取代基可以与它们相邻的、连接的碳原子一起形成芳基环；3至6元环烷基；4至6元杂环烷基环；或4至6元杂芳环；所述的杂环烷基环和所述的杂芳环含有选自氧、氮或硫的1至2个杂原子；R4是氢、-(O)k[CH2CH2O]y-R10、 或 -O-(CH2)mR14；R19是氢；R20是氢、低级烷基或 是芳基环；含有3至6个碳原子的环烷基；含有选自氧、硫和氮的1至2个杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有选自氧、硫和氮的1至2个杂原子的5至6元杂芳环；R8和R9独立地为氢或低级烷基；R10和R11是低级烷基；R14是全氟低级烷基；R17和R18独立地为氢、低级烷基或 n和k是0至1的整数；
w、y和z是0至3的整数；p是0至6的整数；并且v和m是1至6的整数；或者其中R2含有杂芳环中的氮的化合物的N-氧化物，其中R2含有杂环烷基环或杂芳环中的硫的砜；或其抑制CDKs活性，特别是抑制CDK1活性的药用盐。
本发明的药剂和含有这些药剂的药物组合物可以用于治疗与不受控制的或不需要的细胞增殖有关的各种疾病或疾病状态，如癌症、自身免疫疾病、病毒性疾病、真菌病、神经变性疾病和心血管疾病。
抑制和/或调节CDKs的活性，特别是CDK1的活性，使这些化学式的化合物和含有这些化合物的组合物可以用于治疗由激酶活性介导的疾病，特别是作为治疗癌症中的抗肿瘤药剂。
如本文中所指出的，式I的化合物是可能的抗增殖药剂，并且可以用于介导和/或抑制CDKs，特别是CDK1的活性，从而提供用于治疗与不受控制或异常的细胞增殖有关的癌症或其它疾病的抗肿瘤药剂。
其中，优选的式I化合物是式I-A的化合物 其中R1′是氢，或低级烷基，或低级烷氧基烷基，并且
R4、R19和R20如上所述；或者其药用盐，以及式I-B的化合物 其中R1″是R′2-(X′)n-；n、R4、R19和R20如上所述；并且X是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基，或单-或二卤代低级亚烷基；R2是 是芳基环；含3至6个碳原子的环烷基环；含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有1至2个选自氧、硫和氮的杂原子的5或6元杂芳环；R5′和R6′独立地选自羟基、低级烷基-砜、羟基-低级烷基、氢、低级烷基、卤素、全氟低级烷基、低级烷氧基、氨基、单-或二低级烷基氨基；
或者其中R’2含有杂芳环中的氮的化合物的N-氧化物，其中R’2含有杂环或杂芳环中的硫的砜；或其药用盐。
在其中R1、R1″、R2和X是含有芳基部分的取代基的化合物I和I-B中，优选的芳基部分是苯基。如在本文中使用的，卤素包括全部四种卤素如氟、氯、溴和碘。
如在说明书中所使用的，术语″低级烷基″单独或组合地是指含有1至6个碳原子的一价直链或支链饱和烃烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。
术语″环烷基″是指环状低级烷基取代基，其表示一价未取代的3至6元饱和碳环烃环。其中，优选的环烷基取代基是环丙基、环丁基、环己基等。
术语″低级烷氧基″是指由含有1至6个碳原子的低级烷基形成的直链或支链烷氧基如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等。
术语″芳基″是指一价单-或双环未取代的芳族烃环，如苯基或萘基，其中优选苯基。
术语″杂环烷基″是指含有3至4个碳原子和1个或2个选自氧、氮或硫中的杂原子的4至6元单环饱和环。其中，优选的杂环烷基包括吗啉基、四氢、噻喃基或四氢吡喃基。
术语″杂芳环″是指含有4至5个碳原子和1至2个选自氧、氮或硫中的杂原子的一价5元或6元单环杂芳环。其中，优选的杂芳族基包括噻吩基、噻唑基、吡啶基、呋喃基等。
术语″环-低级亚烷基″是指如上定义的二价环烷基。
术语″低级亚烷基″表示含有1至6个碳原子的二价饱和直链或支链烃取代基。
术语″芳基-低级亚烷基″表示被以上定义的芳基取代的，优选单取代的如上定义的低级亚烷基。实例为苄基、1-苯基乙基或2-苯基乙基。
术语″羧基-低级亚烷基″表示被羧基取代的，优选单取代的如上所表示的低级亚烷基取代基。
术语″羟基-低级亚烷基″表示被羟基取代的，优选单取代的低级亚烷基取代基，在使用酰氨基低级亚烷基时，这表示被酰氨基取代基取代的如上所述的低级亚烷基取代基。
术语″单-或二卤代低级亚烷基″取代基表示此前定义的低级亚烷基取代基，其在低级亚烷基链上的一个或两个碳原子上被单取代或双取代，其中所述的取代基是卤素。
术语″卤素″是指氟、氯、溴或碘。
术语″单-或二低级烷基氨基-低级亚烷基″取代基表示如上定义的低级亚烷基取代基，其在低级亚烷基链上的一个或两个碳原子上被单取代或双取代，其中所述的取代基是单-或二低级烷基氨基。
术语″氨基-低级亚烷基″表示被氨基取代的，优选单取代的如上定义的低级亚烷基取代基。
术语″酰氨基-低级亚烷基″表示用酰氨基在一个位置上取代的如上定义的低级亚烷基取代基。
术语″亚氨基-低级亚烷基″表示用亚氨基在一个位置上取代的如上定义的低级亚烷基取代基。
术语″芳氧基″表示芳氧基取代基，其中芳基如上。优选的芳基为苯基，并且优选的芳氧基为苯氧基。
术语″全氟低级烷基″是指其中低级烷基的全部氢被氟所取代或代替的任何低级烷基。其中，优选的全氟低级烷基为三氟甲基、五氟乙基、七氟丙基等，其中特别优选三氟甲基。
术语″药用盐″是指保留了式I、II、III、IV和V的化合物的生物效力和性质，并由合适的非毒性有机或无机酸或有机或无机碱形成的常规酸加成盐或碱加成盐。酸加成盐的实例包括从无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨磺酸、磷酸和硝酸衍生的那些盐，和从有机酸如对-甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等衍生的那些盐。碱加成盐的实例包括从铵、钾、钠和季铵氢氧化物如氢氧化四甲铵衍生的那些盐。为了获得改善的化合物的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性，药物化合物(即，药)形成盐的化学修饰是药物化学家公知的技术。参见，例如H.Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(第6版，1995)第196和1456-1457页。
根据本发明，可以根据反应方案1制备式I化合物，其中除非明确另外声明，R1、R4、R19和R20具有以上所给出的含义。
方案1根据本发明，式II化合物通过Knoevenegel反应与式III-A化合物(绕丹宁(2-硫代-噻唑啉-4-酮))反应，以制备式IV化合物。在进行此缩合时，可以采用在进行Knoevenegel反应时常规的任何条件。通常，此反应在碱金属乙酸盐和乙酸存在下、在回流温度进行。
在此合成的下一步骤中，用甲基化试剂处理所得到的式IV的取代噻唑烷，以甲基化在式IV化合物上的硫代基团，制备式V化合物。优选的甲基化试剂是碘代甲烷。此反应在有机胺碱如二异丙基乙胺(DIEA)中进行。在进行此反应时，温度和压力不是关键的，并且此反应可以在室温和大气压下进行。事实上，在进行此反应时，可以使用在甲基化硫代基团中常规的任何条件。
在此合成的下一步骤中，式V化合物与式VI化合物反应，以制备式I化合物。式VI化合物为胺，并且在进行此反应时，可以使用在甲硫基的胺取代中常规使用的任何方法。根据一个实施方案，通过在常规溶剂如乙腈存在下，将式VI化合物与式V化合物反应，来进行此取代。通常，此反应在胺碱如二异丙基乙胺存在下进行。
另一方面，式I化合物可以通过式II化合物与式VII化合物反应来制备 其中R1如上。
式VII化合物与式II化合物制备式I化合物的反应是在封闭体系中，在150℃至250℃的高温，在高度沸腾的有机溶剂如苯或甲苯中进行的。如此，该反应在高温和高压下进行。当希望制备其中R基团在链X或环P中含有卤素的式I化合物时，该反应是特别有利的。式VII化合物可以通过用式III-A化合物与式VI化合物反应的直接置换而直接形成R1-NH2VI其中R1如上。该置换反应通常在用于式IX的噻吩基化合物中的噻吩基的活化剂存在下和胺碱存在下进行。其中，优选的活化剂是氯化汞。此反应在惰性有机溶剂中进行。可以利用任何常规的惰性有机溶剂，如乙腈、二氯甲烷等。在进行此反应时，使用胺碱，如二异丙基乙胺。在进行此反应时，温度和压力不是关键的，并且此反应可以在室温和大气压下进行。在进行此反应时，可以采用用胺置换噻吩基的任何常规方法。
在其中R1为X并且X为羟基低级亚烷基的式VI化合物中，这些化合物可以由相应的氨基酸或氨基酸酯通过用碱金属硼氢化物还原而制备。另一方面，这些羟基低级亚烷基化合物可以通过用氢化铝锂还原相应的氰基羧酸酯而制备。还原反应将氰基还原为氨基，并且将酯还原为羟基。此还原应当在式VI化合物与式V化合物反应之前发生。
另一方面，在其中R1为R2X-并且X为羧基低级亚烷基、酰氨基低级亚烷基或亚氨基低级亚烷基的式VI化合物中的情况下，这些化合物可以通过将相应的式VI化合物与式V化合物或如上所述的式III-A化合物反应而直接转化为式I化合物。
在环 或是形成环 或的含氮环中的氮原子的N-氧化物的情况下，这些N-氧化物可以由叔环氮原子通过氧化而形成。可以利用将叔氮原子氧化为N-氧化物的任何常规方法。优选的氧化剂为间氯过苯甲酸(MCPBA)。
由式II化合物通过Knoevenegel反应与式VII化合物反应以制备式IV化合物，可以制备其中R1是氢的式I化合物。在进行此缩合时，可以采用在进行Knoevenegel反应时常规的任何条件。通常，此反应在碱金属乙酸盐和乙酸存在下、在回流温度进行。在式VII化合物与其中R20是 的式II化合物的Knoevenegel反应中，R20形成酰胺。该酰胺水解形成其中R20是氢的式I化合物的2位处的胺。Knoevenegel反应中使用的碱水解酰胺基，生成相应的胺。
根据本发明，其中R4是氢的式II化合物，即式II-A化合物 其中R19和R20如上，可以由式X化合物
通过以下反应方案2制备，其中R19和R20如上。
方案2将可以由4-碘苯胺用3-乙氧基-丙烯酰氯制备的式X化合物，通过用硫酸处理环化成式XI化合物。通常，该反应在惰性溶剂如二氯甲烷中进行。环化是通过使用硫酸，通过式X化合物的醚部分的α、β不饱和双键而实现的。在进行此反应时，温度和压力不是关键的，并且此环化反应可以在室温和大气压下进行。
其中含有氧代取代基的环化的式XI化合物可以通过用氯化剂如磷酰氯处理而转化为式XII的氯化化合物。通常优选使用液态高度沸腾的氯化剂如磷酰氯。如此，可以将此反应混合物回流，以高收率地将氧代取代基转化成为氯化物。在进行此反应时，可以使用在将氧代基团转化为氯代基团中常规的任何条件。在该反应的下一步骤中，式XII化合物与氢氧化铵反应以制备式XIII化合物。该反应是通过在100-200℃、优选150℃的温度，在加压下与氢氧化铵反应1至4小时而进行的。如果需要，可以通过式XII化合物与取代的胺的反应，或者通过将伯胺转化成含有低级烷基的仲胺的任何常规方式，制备具有R19和R20取代基的仲胺。其上带 取代基的式II-A的2-酰胺取代化合物可以通过伯胺化合物与酰氯反应而制备。在此合成的下一步骤中，使用甲酰化反应，将式XIII化合物转化为式II-A化合物，从而将在苯环上的碘基团转化为CHO取代基。此反应通过在二苯基丙基膦(dpp)存在下，在碱存在下，使用乙酸钯作为催化剂，将式XIII的化合物与一氧化碳反应来进行。在进行此反应时，在60℃至100℃的温度，在加压下向反应混合物加入一氧化碳。进行此反应时通常利用70至80 psi的压力。可以利用通过与一氧化碳的反应而将苯环上的卤素基团转化成醛的任何常规方法来进行该转化。
2，4二取代的式I化合物，即式II-B的中间体 其中R20′是 并且R4和R11如上，可以根据以下反应方案3而合成，其中R20′和R4如上
方案3式XVII化合物可以由式XVI化合物(化合物XVI的制备描述于实施例2中)，通过式XVI化合物与式XX羧酸的活性衍生物反应而制备， 其中R11如上。
可以采用将胺通过与活性羧酸衍生物如卤化物或酸酐反应而转化成酰胺的任何常规方法进行该反应。含有羟基的式XVII化合物可以通过以下方法转化成式XVIII化合物将式XVII化合物的羟基位点与希望位于式I化合物4-位的R4取代基的卤化物反应。该反应通过在惰性有机溶剂介质中，在回流条件下，将相应的卤化物与式XVII化合物反应而进行。可以利用使羟基与卤化物反应的任何常规方法进行该反应。在此合成的最后一个步骤，使用甲酰化反应，将式XVIII化合物转化为式II-B化合物，从而将在苯环上的碘基团转化为CHO取代基。此反应可以通过如上所述的在碱存在下，使用四(三苯膦)钯催化剂，在60℃至140℃的温度，将式XVIII化合物与一氧化碳反应来进行。进行此反应时，在加压下向反应介质加入一氧化碳。通常使用40至80psi的压力。可以将通过与一氧化碳的反应而将苯环上的卤素基团转化成醛的甲酰化反应的任何常规方法用来将式XVIII化合物转化为式II-B化合物。
其中，式I化合物及其包括式I-A和式I-B化合物的实施方案是其中所有芳基取代基中的芳基都优选为苯基的化合物。
其中，式I-A化合物类的优选实施方案是其中R1是氢的式I-A化合物。在此类化合物中特别优选的实施方案是其中R4为-(O)k(CH2CH2O)y-R10的化合物。
在此情况下，特别优选其中R20是 的化合物。
其中，式I-B化合物的优选实施方案是这样一类化合物，其中n是0并且R2′是低级环烷基环，特别是环丙基。这类化合物中，优选其中R4是-(O)k(CH2CH2O)y-R10的化合物。这类化合物中特别优选的是其中R20是 的化合物。
本发明的另一实施方案是这样的式I-B化合物，其中n是1并且X是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基或单-或二卤代低级亚烷基。在此情况下，R4优选为-(O)k(CH2CH2O)y-R10。在此优选实施方案中，特别优选其中R20是 的化合物。
根据本发明的药物组合物可以备选地或除了式I化合物外，还含有作为活性成分的药用前药、药学活性代谢物和这些化合物和代谢物的药用盐。这些化合物、前药、多聚体、盐和代谢物有时在本文中统称为″活性药剂″或″药剂″。
在药剂是固体的情况下，本领域的技术人员应当理解，本发明的化合物和盐可以以不同的晶体或多晶形形式存在，并且其全部都将在本发明和限定式的范围内。
可以将治疗有效量的本发明活性药剂用于治疗由蛋白激酶CDK1的调制或调节介导的疾病。″有效量″意指药剂显著地抑制增殖和/或防止真核细胞如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞去分化的量，并且对于所指示的效用如特定治疗处理是有效的。
给定药剂与这样量相对应的量将根据因素如具体的化合物、疾病状态及其严重性、受试者或需要这种治疗的宿主的特性(例如，重量)而变化，但仍然可以根据此情形周围的具体环境，包括例如给药的具体药剂、给药路径、待治疗的症状以及受试者或将治疗的宿主，以本领域中已知的方式常规地确定。″治疗″意指至少减轻受试者如哺乳动物(例如，人类)中至少部分地由CDK1蛋白激酶的活性而影响的疾病状态，包括防止疾病状态在哺乳动物中发生，特别是当发现哺乳动物倾向于具有该疾病状态而尚未诊断为具有该疾病状态；调节和/或抑制疾病状态；和/或缓和该疾病状态。
本发明还涉及通过给药本发明的药剂而调节或抑制例如哺乳动物组织中的蛋白激酶CDK1活性的方法。作为抗增殖剂的药剂的活性可以容易地由已知的方法测量，例如通过在MTT检测中使用全细胞培养来测量。可由本领域技术人员可以获得的任何方法测量作为CDK1蛋白激酶活性调节剂的本发明药剂的活性，包括体内和/或体外检测。用于活性测量的适宜检测的实例包括在以下文献中所述的那些国际公布号WO 99/21 845；Parast等，Biochemistry，37，16788-16801(1998)；Connell-Crowley和Harpes，Cell CycleMaterials and Methods，(Michele Pagano编辑，Springer，Berlin，Germany)(1995)；国际公布号WO 97/34876；和国际公布号WO 96/14843。这些性质可以例如通过使用在下面的实施例中列出的一种或多种生物学试验程序进行评估。
可以将本发明的活性药剂配制成如下所述的药物组合物。本发明的药物组合物包含有效调制、调节或抑制量的式I化合物和惰性的、药用载体或稀释剂。在药物组合物的一个实施方案中，提供有效水平的本发明药剂，以提供包括抗增殖活性的治疗益处。″有效水平″是指其中增殖得到抑制或控制的水平。将这些组合物以适宜于给药模式如肠胃外或口服给药的单位剂量形式制备。
本发明的药剂可以以常规剂量形式给药，常规剂量形式是通过将治疗有效量的作为活性成分的药剂(例如，式I的化合物)与适宜的药学载体或稀释剂根据常规程序制备的。这些程序可以包括适宜于所需制剂的混合、粒化和压实或溶解所述成分。
所采用的药学载体可以是固体或液体。示例性的固体载体是乳糖、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性的液体载体是糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似地，载体或稀释剂可以包括本领域已知的延时或缓释材料，如单独的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或含有蜡、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
可以采用各种药物形式。因此，如果使用固体载体，制剂可以形成片剂，以粉末或丸剂形式放置于硬明胶胶囊中，或为锭或锭剂形式。固体载体的量可以变化。如果使用液体载体，制剂形式可以是糖浆、乳剂、软明胶胶囊、在安瓿或小瓶中的可无菌注射的溶液或混悬液或非水性液体混悬液。
为了得到稳定的水溶性剂量形式，可以将活性药剂的药用盐溶解于有机或无机酸的水溶液中。如果不能得到可溶盐形式，则可以将药剂溶解于适宜的共溶剂或共溶剂的组合中。
应当理解，在本发明的组合物中使用的药剂的实际剂量将根据所使用的具体复合物、配制的具体组合物、给药的模式和将治疗的具体位置、宿主和疾病而变化。对于给定的一组症状的最佳剂量可以由本领域的技术人员考虑到药剂的实验数据，使用常规的剂量确定试验而确定。
本发明的组合物可以以用于制备药物组合物的通常已知的方式制备，例如使用常规的技术如混合、溶解、粒化、制糖丸、研磨、乳化、制胶囊、捕集或冻干。可以以常规方式使用一种或多种生理学上可以接受的载体配制药物组合物，所述的载体可以选自有利于将活性化合物加工成为药学上可以使用的制剂的赋形剂和辅剂。
对于口服给药，可以容易地将所述的化合物与本领域中已知的药用载体组合来配制该化合物。这些载体可以将本发明的化合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、混悬液等，用于由受治患者经口摄入。口服使用的药物制剂可以通过以下方法得到使用与活性成分(药剂)混合的固体赋形剂，任选研磨得到的混合物，并且如果需要，在加入适宜的辅剂之后加工颗粒的混合物，以得到片剂或糖衣核。
下面将由相应的工作实施例进一步说明本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例15-[1-(2-氨基-喹啉-6-基)-甲-(Z)-亚基]-2-(((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮；与三氟乙酸的复合物 3-乙氧基-N-(4-碘-苯基)-丙烯酰胺的制备 在0℃向草酰氯(40g，0.555mol)溶液中缓慢加入乙基乙烯基醚(105.6g，0.84mol)，将混合物在0℃搅拌2小时并且在室温搅拌12小时。在用旋转蒸发仪除去一些溶剂后，将黑色混合物在120℃回流30min。在用旋转蒸发仪然后用油泵除去溶剂后，获得3-乙氧基-丙烯酰氯(69.9g)，为黑色液体，该液体不经进一步纯化直接用于下一步骤。
向4-碘苯胺(14g，64mmol)和吡啶(10.5mL，128mmol)在二氯甲烷(85mL)中的混合物加入3-乙氧基-丙烯酰氯(10g，75mmol)。在搅拌5小时后，加入更多的3-乙氧基-丙烯酰氯(5g，38mmol)和吡啶(10.5mL，64mmol)。搅拌2天后，将反应混合物用水(3×100mL)洗涤，MgSO4干燥并且浓缩，得到3-乙氧基-N-(4-碘-苯基)-丙烯酰胺，为黑色的油(11.32g，56％)。LC-MSm/e 318(MH+)。
6-碘-1H-喹啉-2-酮的制备 在搅拌下将硫酸缓慢加入3-乙氧基-N-(4-碘-苯基)-丙烯酰胺(11.3g，36mmol)中。在搅拌3小时后，将反应混合物缓慢倒入冰(～300g)中。过滤收集沉淀，用水洗涤并且干燥。经过快速色谱(Merck硅胶60，230-400目，二氯甲烷中的0％-15％甲醇，40分钟内)得到6-碘-1H-喹啉-2-酮(7.23g，75％)，为黑色固体。LC-MS m/e 272(MH+)。
2-氯-6-碘-喹啉的制备 将6-碘-1H-喹啉-2-酮(6.23g，23mmol)在磷酰氯(25mL)中的混合物在N2下回流2h。冷却后，用旋转蒸发仪然后用油泵除去溶剂。缓慢加入饱和碳酸氢钠(100mL)。过滤收集固体，用饱和碳酸氢钠、水洗涤并且干燥，获得2-氯-6-碘-喹啉(5.78g，87％)，为黑色固体。LC-MS m/e 290(MH+)。
6-碘-喹啉-2-基胺的制备
在压力管中将2-氯-6-碘-喹啉(1g，3.46mmol)在氢氧化铵(28％，20mL)中的悬浮液在140℃加热3天。冷却后，用旋转蒸发仪除去溶剂。过滤收集固体，用水洗涤并且干燥，获得6-碘-喹啉-2-基胺(0.78g，84％)，为黑色固体。LC-MS m/e 271(MH+)。
2-氨基-喹啉-6-甲醛的制备 在压力管中，将6-碘-喹啉-2-基胺(200mg，0.74mmol)、三乙胺(0.26mL，1.85mmol)、二苯基丙基膦(dpp，17μL，0.074mmol)和乙酸钯(II)(17mg，0.074mmol)在无水N，N-二甲基甲酰胺(4mL)中的混合物在75psi的一氧化碳下，在室温搅拌10分钟。在加入三己基硅烷(0.53mL，1.5mmol)后，然后将混合物在75psi的一氧化碳下在80℃搅拌4小时。让反应冷却至25℃，然后用二氯甲烷(2×50mL)萃取。将合并的有机层相继用水(3×50mL)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并且真空浓缩。经过快速色谱(Merck硅胶60，70-230目，乙酸乙酯)得到2-氨基-喹啉-6-甲醛(30mg，24％)，为固体。
2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮的制备 在室温，向(1R，2S)-2-苯基-环丙基胺盐酸盐(0.85g，5mmol)和绕丹宁(2-硫代-噻唑啉-4-酮)(0.68g，5mmol)在乙腈(20mL)中的悬浮液中，加入(N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(2.61mL，15mmol)。然后，将此溶液冷却至0℃，并且在10分钟的期间内，分两份加入氯化汞(1.35g，5mmol)。加入后，让悬浮液温热至室温，并且搅拌2天。通过硅藻土垫过滤得到的黑色固体，并且用乙酸乙酯(500mL)洗涤。真空除去滤液，并且将粗剩余物用水(100mL)和乙酸乙酯(100mL)稀释。分离成两层，并且将水层用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水溶液洗涤，并且用无水硫酸镁干燥。过滤干燥剂并且在真空下除去溶剂，得到粗剩余物，其用Biotage硅胶柱色谱纯化，得到0.474g(42％收率)的2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮，为白色无定形固体EI-HRMS m/e计算值C12H12N2OS(M+)232.0670，实测值232.0665。
制备5-[1-(2-氨基-喹啉-6-基)-甲-(Z)-亚基]-2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮；与三氟乙酸的复合物 向2-氨基-喹啉-6-甲醛(30mg，0.174mmol)和2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮(26mg，0.11mmol)在甲苯(1mL)中的悬浮液中加入苯甲酸(benzolic acid)(3mg，0.011mmol)和哌啶(3μL，0.011mmol)。用微波将混合物加热到150℃ 20分钟。待冷却到室温后，过滤收集固体，用甲苯洗涤并且干燥。粗产物用HPLC(反相C18，10％-90％乙腈水溶液，10分钟内)纯化，得到与三氟乙酸复合的5-[1-(2-氨基-喹啉-6-基)-甲-(Z)-亚基]-2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑-4-酮(36mg，84％)，为黄色固体。LC-MS m/e 271(MH+)。
实施例25-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-2-[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮
6-溴-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮的制备 将2-氨基-5-溴-苯甲酸(280g，1.3mol)的乙腈(1.31)溶液温热到50-55℃。同时滴加吡啶(206g，2.61mol)和三光气(128.8g，0.43mol)的二氯甲烷(720ml)溶液。加完后，将混合物在50-55℃再搅拌2h。减压除去溶剂，并且加入水。过滤收集沉淀，用水和冷却的二氯甲烷顺序洗涤，然后真空干燥，得到所需的产物6-溴-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(304g，98％)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
2-氨基-6-溴-喹啉-4-醇的制备 在50-60℃将6-溴-1H-苯并[d][1，3]噁嗪-2，4-二酮(90g，0.373mol)的(N，N-二甲基甲酰胺)(DMF)(400ml)溶液中加入到丙二腈(37g，0.41mol)和三乙胺(41.4g，0.41mol)的DMF(150ml)溶液中。将反应混合物在50-60℃保持30分钟。向冰冷的0.2N HCl(400ml)中的反相淬灭产生沉淀。将该物质过滤分离并且真空干燥。然后溶解在8N KOH(21)中，并且将溶液回流40h。待冷却到室温后，用HCl中和混合物，将得到的沉淀过滤并且风干，得到2-氨基-6-溴-喹啉-4-醇，为浅黄色固体(95g，97％)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
N-(6-溴-4-羟基-喹啉-2-基)-乙酰胺的制备 将2-氨基-6-溴-喹啉-4-醇(29.4g，0.12mol)、乙酸酐(36.7g，0.36mol)和硫酸(20ml)在冰醋酸(300ml)中的混合物回流30分钟。让混合物冷却到室温，然后倒入水中。过滤分离沉淀并且干燥，得到产物N-(6-溴-4-羟基-喹啉-2-基)-乙酰胺，为棕色固体(32g，93％)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
N-(6-溴-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺的制备 将N-(6-溴-4-羟基-喹啉-2-基)-乙酰胺(32g，0.114mol)、乙基碘(26.77g，0.171mol)和碳酸钾(130g，0.912mol)在乙腈(250ml)中的混合物回流2h。蒸发溶剂，并且将残余物用水研磨。将沉淀通过过滤收集并且干燥，得到N-(6-溴-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺，为浅黄色固体(28g，80％)。该物质不经进一步纯化直接用于下一步骤。
N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺的制备
用氮气吹扫四(三苯膦)钯(Pd(PPh3)4)和甲酸钠(5g，48mmol)在乙腈(30ml)中的混合物。通过橡胶隔片加入N-(6-溴-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺(2.5g，8.12mmol)的DMSO(30mL)溶液。将容器置于一氧化碳(50psi)下、密封并且加热到120℃ 30分钟。将混合物冷却到室温，并且减压蒸发乙腈。加入水，通过过滤收集得到的沉淀并且干燥，得到所需的醛N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺，为浅黄色固体(0.8g，40％)。
5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-2-[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮的制备 在微波合成器中，在180℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(实施例2e，50mg，0.19mmol)的乙酸(1.5ml)溶液用2[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮(69mg，0.29mmol)和乙酸钠(63mg，0.77mmol)处理60分钟。加入水(0.5ml)，并且在140℃微波处理反应混合物15分钟。用1NNaOH猝灭混合物。通过吸滤收集沉淀，并且用水、乙醚和二氯甲烷顺序洗涤。然后将粗沉淀物溶解在DMF中并且浓缩至干。将该物质用二噁烷研磨并且过滤。减压浓缩母液，得到粉末状的产物5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-2-[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮(23mg，28％)。
LC-MS m/e 437(MH+)。
实施例32-氨基-5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-噻唑-4-酮 在微波合成器中，在180℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(实施例2e，50mg，0.19mmol)的乙酸(1.5ml)溶液用假海硫因(34mg，0.29mmol)和乙酸钠(63mg，0.77mmol)处理45分钟。将混合物在1N NaOH和二氯甲烷之间分配。将含有所需产物的水层浓缩至干，并且将粗残余物用RP HPLC纯化，得到TFA盐形式的产物(5mg，8％)。LC-MS m/e 315(MH+)。
实施例4N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2-[(四氢-吡喃-4-基甲基-氨基)-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基]-乙酰胺 c-(四氢-吡喃-4-基)-甲基乙酸铵的制备
将冷却(冰水浴)的四氢-4H-吡喃-4-酮(7.5g，75mmol)和甲苯磺酰基甲胩(16.05g，82.4mmol)的DME(125ml)溶液用叔丁醇钾(16.8g，150mmoles)在叔丁醇(250ml)中的悬浮液处理。反应混合物在室温搅拌31/2小时，然后用乙醚(250ml)稀释。将混合物用水和盐水顺序洗涤，然后用硫酸钠干燥、过滤并且浓缩。粗产物通过高真空下的短程蒸馏进行纯化，得到无色油状的腈(2.98g)。将该物质溶解在1M硼烷/四氢呋喃(THF)(134ml，134mmol)中，并且在室温搅拌过夜。通过加入甲醇(室温，1h)猝灭过量的硼烷，并且将混合物浓缩至干。将残余物溶解在4N HCl/二噁烷中，在室温搅拌1h，其后减压浓缩。固体残余物用乙醚洗涤并且通过吸滤收集。在室温下，将该物质(1.81g，11.9mmol)在THF(30ml)中的悬浮液用1N NaOH(11.9ml，11.9mmol)处理1/2h。蒸馏除去THF，将水溶液用NaCl饱合，然后用二氯甲烷萃取。有机层用硫酸钠干燥并且减压浓缩。残余物用乙酸(0.68ml，11.9mmol)处理，在真空烘箱中干燥后得到c-(四氢-吡喃-4-基)-甲基乙酸铵(1.71g)。
N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2-[(四氢-吡喃-4-基甲基-氨基)-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基]-乙酰胺的制备 在室温下，将N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺(实施例6a，50mg，0.12mmol)在乙腈(2ml)中的悬浮液与二异丙基乙胺(0.20ml，1.2mmol)和碘代甲烷(0.15ml，2.3mmol)反应45分钟。将混合物浓缩至干，并且将残余物悬浮在乙腈(2ml)中。在室温下顺序加入二异丙基乙胺(0.20ml，1.2mmol)和c-(四氢-吡喃-4-基)-甲基乙酸铵(100mg，0.58mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜。通过吸滤收集沉淀，将其吸附在SiO2上，并且在使用0-10％甲醇/乙酸乙酯梯度的硅胶柱上纯化，得到固体产物(29mg，56％)。LC-MS m/e 455(MH+)。
实施例5N-[6-(2-环丙基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺 2-环丙基氨基-噻唑-4-酮的制备 将氯乙酸乙酯(20g，0.16mol)和硫氰酸钾(12.7g，0.13mol)的乙醇(100ml)溶液回流3h。将溶液过滤和减压浓缩，得到18.7g的氰硫基-乙酸乙酯(97％)。将环丙基乙酸铵(0.50g，4.27mmol)和氰硫基-乙酸乙酯(0.62g，4.27mmol)的混合物加热到90℃ 3h，并且在室温放置过夜。将反应混合物在6N HCl和二氯甲烷之间分配。分离各层。加入6N氢氧化铵使水层变为碱性，然后浓缩至干。将粗品用二氯甲烷研磨，并且通过过滤将溶液与固体分离。该溶液用硫酸钠干燥并且浓缩至干。粗品在使用100％乙酸乙酯的硅胶柱上纯化，得到2-环丙基氨基-噻唑-4-酮(244mg，37％)。
N-[6-(2-环丙基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺的制备
在微波合成器中，在180℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(100mg，0.39mmol)的乙酸(2ml)溶液用2-环丙基氨基-噻唑-4-酮(61mg，0.39mmol)和乙酸钠(127mg，1.55mmol)处理90分钟。通过吸滤收集沉淀，并且用水和乙醚顺序洗涤，在真空烘箱中干燥后得到产物N-[6-(2-环丙基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺，为固体(32mg，21％)。LC-MS m/e 397(MH+)。
实施例6N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2[2-(四氢-吡喃-4-基)-乙基氨基]-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基)-乙酰胺 N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺的制备
在微波合成器中，在160℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(400mg，1.55mmol)的乙酸(6ml)溶液用绕丹宁(320mg，0.29mmol)和乙酸钠(530mg，6.5mmol)处理25分钟。通过吸滤收集沉淀，用乙酸、水和乙醚洗涤，然后在真空烘箱中干燥，得到中间体N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺，为棕色固体(396mg，68％)。
N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2[2-(四氢-吡喃-4-基)-乙基氨基]-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基)-乙酰胺的制备 在室温下将N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺(实施例6a，50mg，0.11mmol)在乙腈(1.5ml)中的悬浮液与二异丙基乙胺(0.200ml，1.15mmol)和碘代甲烷(0.15ml，2.3mmol)反应30分钟。将混合物浓缩至干，并且将残余物悬浮在乙腈(1.5ml)中。在室温顺序加入二异丙基乙胺(0.20ml，1.15mmol)和4-(2-氨基乙基)四氢吡喃(0.075ml，0.58mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜。通过吸滤收集沉淀，并且用乙腈洗涤。然后吸附在SiO2上，并且在使用0-10％甲醇/乙酸乙酯梯度的硅胶柱上进行纯化，得到产物N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2[2-(四氢-吡喃-4-基)-乙基氨基]-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基)-乙酰胺，为浅黄色固体(22mg，50％)。LC-MS m/e 469(MH+)。
实施例7N-(6-{2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺
将N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺(实施例6a，80mg，0.21mmol)在乙腈(3ml)中的悬浮液与二异丙基乙胺(0.40ml，2.2mmol)和碘代甲烷(0.30ml，4.6mmol)在室温反应30分钟。将混合物浓缩至干，并且将残余物悬浮在DMF(0.5ml)中。在室温下加入氨的甲醇溶液(7N，5ml，35mmol)，并且将混合物在室温搅拌24h。将混合物浓缩至干，并且将固体用水研磨。通过吸滤收集沉淀，用水和乙醚相继洗涤，然后风干，得到浅棕色固体产物(50mg，663％)。LC-MS m/e 357(MH+)。
实施例8N-[6-(2-环丙基甲基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺2-环丙基甲基氨基-噻唑-4-酮的制备 将环丙基甲基乙酸铵(0.45g，3.44mmol)和氰硫基-乙酸乙酯(0.5g，3.44mmol)的混合物加热到90℃ 2h。将反应混合物在6N HCl和二氯甲烷之间分配。分离各层。通过加入6N氢氧化铵使水层成碱性，然后用二氯甲烷萃取。将有机层用硫酸钠干燥并且减压浓缩。水层也浓缩至干，并且将残余物用DMF研磨。将DMF溶液过滤并且浓缩至干。合并残余物，在使用100％乙酸乙酯的硅胶柱上纯化，得到2-环丙基甲基氨基-噻唑-4-酮(275mg，47％)。
N-[6-(2-环丙基甲基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺的制备
在微波合成器中，在180℃将N-(4-乙氧基-6-甲酰基-喹啉-2-基)-乙酰胺(100mg，0.39mmol)的乙酸(2ml)溶液用2-环丙基甲基氨基-噻唑-4-酮(66mg，0.39mmol)和乙酸钠(127mg，1.55mmol)处理2h。将反应混合物在1NNaOH和乙酸乙酯/二氯甲烷(1∶1)之间分配。有机层用硫酸钠干燥、过滤并且浓缩至干。粗品在使用0-7％甲醇/乙酸乙酯梯度的硅胶柱上纯化，得到产物N-[6-(2-环丙基甲基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺，为固体(10mg，7％)。LC-MS m/e 411(MH+)。
实施例9N-(6-{2-[(1，4]二氧杂环己烷-2-基甲基)-氨基]-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺 将N-[4-乙氧基-6-(4-氧代-2-硫代-噻唑烷-5-亚基甲基)-喹啉-2-基]-乙酰胺(实施例6a，50mg，0.12mmol)在乙腈(1.5ml)中的悬浮液与二异丙基乙胺(0.20ml，1.2mmol)和碘代甲烷(0.15ml，2.3mmol)在室温反应30分钟。将混合物浓缩至干，并且将残余物悬浮在乙腈(1.5ml)中。在室温下顺序加入二异丙基乙胺(0.20ml，1.2mmol)和c-[1，4]二氧杂环己烷-2-基-甲胺(68mg，0.58mmol)，并且将混合物在室温搅拌过夜。通过吸滤收集沉淀，将其吸附在SiO2上，并且在使用100％乙酸乙酯的硅胶柱上纯化，得到固体产物N-(6-{2-[([1，4]二氧杂环己烷-2-基甲基)-氨基]-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺(34mg，63％)。LC-MS m/e 457(MH+)。
实施例10药理学检测本发明化合物的药理学性能可以由许多药理学检测证实。已经用根据本发明的化合物及它们的盐进行了下面的示例性药理学检测。本发明化合物显示出CDK1/细胞周期蛋白B活性，其中Ki值低于5.0μM。这证明所有这些化合物对于抑制CDK1/细胞周期蛋白B具有活性。
为了测定CDK1活性的抑制，进行FlashPlateTM检测(NENTM-LifeScience Products)检测或HTRF检测。两种类型的激酶检测都是使用重组人CDK1/细胞周期蛋白B复合物进行的。在杆状病毒载体中的GST-细胞周期蛋白B(GST-cycB)和CDK1cDNA克隆由Baylor College of Medicine，Houston，TX的W.Harper博士提供。在High FiveTM昆虫细胞中共表达蛋白质，如前所描述(Harper，J.W.等Cell 1993，75，805-816)，在谷胱甘肽琼脂糖树脂(Pharmacia，Piscataway，NJ)上纯化复合物。成视网膜细胞瘤(Rb)蛋白(氨基酸386-928)的6x-组氨酸标记的截短型被用作CDK1/细胞周期蛋白B检测的底物(表达质粒由英国Welwyn Garden City，Roche ResearchCentre，Department of Molecular Virology的Veronica Sullivan博士提供)。Rb蛋白为通过CDK1磷酸化的天然底物(参见Herwig和Strauss Eur.J.Biochem.Vol.246(1997)pp.581-601，及其中引用的参考文献)。62Kd蛋白的表达受M15E.Coli菌株中IPTG可诱导的启动子控制。通过超声处理裂解细胞，通过将pH 8.0的裂解产物结合到预先用1mM咪唑预处理的Ni-螯合的琼脂糖柱上，进行纯化。然后用逐渐降低至pH 6.0的pH缓冲液洗涤树脂几次，并用500mM咪唑洗脱。将洗脱的蛋白用20mM HEPES pH7.5、30％甘油、200mM NaCl和1mM DTT透析。定量纯化的Rb融合蛋白原液的蛋白浓度，分成等份，在-70℃下储存。
对于FlashPlate激酶的检测，Rb蛋白以10μg/ml的浓度，每孔使用100μl涂布96孔FlashPlate。将该板在4℃下温育过夜，或在振摇器、室温下温育3小时。为了控制非特异性磷酸化，一行孔用100μl/孔涂布缓冲液(20mM HEPES，0.2M NaCl)涂布。然后用洗涤缓冲液(0.01％吐温20的磷酸盐缓冲盐水)冲洗该板两次。要测试的化合物(“测试化合物”)以5×最终浓度加入到孔中。通过立即加入40μl反应混合物(25mM HEPES，20mMMgCl2，0.002％吐温20，2mM DTT，1μM ATP，4nM 33P-ATP)和足够量的酶引发反应，获得高于背景至少10倍的计数。在振摇器上、室温下温育该板30分钟。用洗涤缓冲液洗涤该板4次，密封，并在TopCount闪烁计数器(Packard Instrument Co.，Downers Grove，IL]上计数。根据下式确定Rb磷酸化抑制百分数，其为CDK活性抑制的衡量标准100×[1-(测试化合物-非特异性数)/(总数-非特异性数)]其中“测试化合物”指重复测试的每分钟的平均计数，“非特异性数”指当不加入CDK1/细胞周期蛋白B等时的每分钟平均计数，而“总数”指不加入化合物时每分钟的平均计数。IC50值为在所述测试条件下放射标记的蛋白激酶诱导的结合减少50％的测试化合物的浓度。由下式计算抑制剂常数Ki的值Ki＝IC50/(1+[S]/Km)，其中[S]是ATP浓度，并且Km为Michaelis常数。
使用96-孔聚丙烯板(BD Biosciences，Bedford，MA)进行均匀时间分辨荧光(HTRF)激酶检测。将试验化合物首先溶解于DMSO中，然后稀释于激酶检测缓冲液1(25mM HEPES，pH7.0，8mM MgCl2，1.5mM DTT，和162μM ATP)，其中DMSO浓度为15％。将CDK1/细胞周期蛋白B酶稀释于激酶检测缓冲液2(25mM HEPES，pH 7.0，8mM MgCl2，0.003％吐温20，0.045％BSA，1.5mM DTT和0.338μM Rb蛋白)。为了引发激酶反应，将20μL的化合物溶液与40μL的CDK1/细胞周期蛋白B溶液在检测板中混合，其中CDK1/细胞周期蛋白B和Rb的最终浓度分别为0.1μg/mL和0.113μM，并且在37℃温育30分钟。将15μL的抗-磷酸-Rb(Ser 780)抗体(CellSignaling Technology，Beverly，MA)在抗体1∶7692稀释的条件下加入。于37℃继续温育25分钟，然后，将LANCE Eu-W1024标记的抗兔IgG(1nM，PerkinElmer，Wellesley，MA)和共轭到 SureLight-Allophucocyanin的抗-His抗体(20nM，PerkinElmer，Wellesley，MA)加入至孔中。在37℃继续温育40分钟。将温育完成后，将35μl的反应混合物转移到新鲜的384-孔黑聚苯乙烯板(Corning Incorporated，Corning，NY)中，并且在340nm的激发波长和665/615nm的发射波长下在荧光板读出器上读出。
显示出采用本发明主题的化合物的CDK1/细胞周期蛋白B活性的Ki值的范围为约0.001μM至约5.000μM。一些实施例的具体数据如下
权利要求
1.式I的化合物 其中R1是氢、低级烷基、芳氧基-低级烷基、-C(O)2[CH2CH2O]p-R9、-[CH2CH2O]v-R8或R2-(X)n-；X是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基、芳基低级亚烷基、羧基-低级亚烷基、酰氨基低级亚烷基、单-或二卤代-低级亚烷基、氨基-低级亚烷基、单-或二低级烷基氨基-低级亚烷基或亚氨基-低级亚烷基；R2是 是芳基环；含有3至6个碳原子的环烷基；含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有1至2个选自氧、硫和氮的杂原子的5或6元杂芳环；R5、R6和R7独立地选自羟基、低级烷基-砜、羟基-低级烷基、氢、低级烷基、卤素、全氟低级烷基、低级烷氧基、氨基、单-或二低级烷基氨基，或当取代基R5、R6和R7中的两个在环 上的相邻碳原子上取代时，这两个取代基可以与它们相邻的、连接的碳原子一起形成芳基环；3至6元环烷基环；4至6元杂环烷基环；或4至6元杂芳环；所述的杂环烷基环和所述的杂芳环含有选自氧、氮或硫的1至2个杂原子；R4是氢、-(O)k[CH2CH2O]y-R10、 或-O-(CH2)mR14；R19是氢；R20是氢、低级烷基或 是芳基环；含有3至6个碳原子的环烷基；含有选自氧、硫和氮的1至2个杂原子的4至6元杂环烷基环；或含有选自氧、硫和氮的1至2个杂原子的5至6元杂芳环；R8和R9独立地为氢或低级烷基；R10和R11是低级烷基；R14是全氟低级烷基；R17和R18独立地为氢、低级烷基或 n和k是0至1的整数；w、y和z是0至3的整数；p是0至6的整数；并且v和m是1至6的整数；或者其中R2含有杂芳环中的氮的化合物的N-氧化物，其中R2含有杂环烷基环或杂芳环中的硫的砜；或其药用盐。
2.权利要求1的化合物，其中所述的化合物是 其中R1′是氢或低级烷基；并且R4、R19和R20如权利要求1所定义；或其药用盐。
3.权利要求2的化合物，其中R1′是氢；R4是-(O)k(CH2CH2O)y-R10；并且R10、k和y如权利要求1所定义。
4.权利要求3的化合物，其中所述的化合物是N-(6-{2-氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺；和2-氨基-5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-噻唑-4-酮。
5.权利要求1的化合物，其中所述的化合物是 其中R1″是R′2-(X′)n-；n、R4、R19和R20如权利要求1所定义；并且X′是低级亚烷基、羟基-低级亚烷基、环-低级亚烷基、单-或二卤代低级亚烷基；R2′是 是芳基环；含3至6个碳原子的环烷基环；含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的4至6元杂环烷基环；含有1至2个选自氧、硫和氮的杂原子的5或6元杂芳环；R5′和R6′独立地选自羟基、低级烷基-砜、羟基-低级烷基、氢、低级烷基、卤素、全氟低级烷基、低级烷氧基、氨基、以及单-或二低级烷基氨基；或者其中R’2含有杂芳环中的氮的化合物的N-氧化物，其中R’2含有杂环烷基环或杂芳环中的硫的砜；或其药用盐。
6.权利要求5的化合物，其中X′是低级亚烷基；R’2是苯基，该苯基任选被卤素取代；R4是-O-CH2-CH3；n是1。
7.权利要求6的化合物，其中所述的化合物是5-(2-氨基-4-乙氧基-喹啉-6-基亚甲基)-2-[2-(3-氟-苯基)-乙基氨基]-噻唑-4-酮。
8.权利要求5的化合物，其中X′是低级亚烷基；R’2是含有3至5个碳原子和1至2个选自氧、氮和硫的杂原子的杂环；R4是-O-CH2-CH3；n是1。
9.权利要求8的化合物，其中所述的化合物是N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2[2-(四氢-吡喃-4-基)-乙基氨基]-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基)-乙酰胺；N-(4-乙氧基-6-{4-氧代-2-[(四氢-吡喃-4-基甲基-氨基)-4H-噻唑-5-亚基甲基}-喹啉-2-基]-乙酰胺；和N-(6-{2-[([1，4]二氧杂环己烷-2-基甲基)-氨基]-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基}-4-乙氧基-喹啉-2-基)-乙酰胺。
10.权利要求5的化合物，其中X′是低级亚烷基；R’2是环丙基，该环丙基是未取代的或者被苯基取代；R4是氢或-O-CH2-CH3；n是0或1。
11.权利要求10的化合物，其中所述的化合物是N-[6-(2-环丙基甲基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺；N-[6-(2-环丙基氨基-4-氧代-4H-噻唑-5-亚基甲基)-4-乙氧基-喹啉-2-基]-乙酰胺；和5-[1-(2-氨基-喹啉-6-基)-甲-(Z)-亚基]-2-((1R，2S)-2-苯基-环丙基氨基)-噻唑4-酮。
12.用于制备根据权利要求1的式I化合物的方法，其中a)将式II化合物 在式III化合物存在下反应， 以得到式IV化合物 和b)将所述的式IV化合物在甲基化试剂存在下进一步反应，得到式V化合物 和c)将所述的式V化合物与式VI的胺进一步反应，R1-NH2VI以得到式I化合物，和d)将所述的式I化合物从反应混合物中分离，并且如果需要，将其转化成药用盐，并且其中R1、R4、R19和R20具有权利要求1中给出的含义。
13.根据权利要求12的方法，其中b)项中的甲基化试剂是碘代甲烷。
14.根据权利要求1的式I化合物，其用于治疗癌症，特别是实体瘤。
15.一种用于治疗癌症，特别是用于治疗实体瘤的药物组合物，其包含一种或多种式I化合物，以及药用辅剂。
16.根据权利要求1的式I化合物，其用于制备药物，所述药物用于治疗基于失控细胞周期进展的疾病。
17.根据权利要求1的式I化合物，其用于制备药物，所述药物用于治疗癌症，特别是实体瘤。
18.采用根据权利要求12的方法制备的根据权利要求1的式I化合物。
19.基本上如上所述的新型化合物、方法、组合物和用途。
全文摘要
本发明提供式(I)的噻唑啉取代的喹啉衍生物，其中喹啉环在2位被取代，该衍生物证明具有CDK1抗增殖活性，因此可以用作抗癌剂；还提供含有所述化合物的药物组合物以及它们的制备方法。
文档编号A61P35/00GK101018785SQ200580030902
公开日2007年8月15日 申请日期2005年9月15日 优先权日2004年9月17日
发明者陈力, 陈少清, C·米舒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司
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