来自于真菌的免疫调节组合物的制作方法
专利名称：来自于真菌的免疫调节组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫调节组合物，所述组合物含有可以从真菌的液体培养物中分离出来的多糖。
背景技术：
众所周知，来自真菌和酵母菌的葡聚糖能够促进健康。由于“香菇”真菌(Lentinus edodes)具有这种功效，其可以开发用于多种医药目的，如免疫刺激、抗病毒、抗肿瘤等。对香菇多糖的研究结果已经表明它从多种途径刺激宿主的免疫系统，例如活化辅助性T细胞，增强白细胞介素1以及白细胞介素2的产生，增强针对多种形式的癌的抗体的产生，以及降低血液中胆固醇水平。(Herbs for Health，jan/feb，1997；K.Jones，″ShiitakeMedicine in a mushroom″，p.40-50，54；Anticancer Res，Vol.17(4A)，1997；H.Matsouka，″Lentinan potentiates immunity and prolongs the survival timeof some patients″，p.2751-2755；Adv Appl Microbiol，Vol.39，1993；S.C.Jong，″Medicinal and therapeutic value of theshiitake mushroom″，p.153-184，Int J Immunopharmacol，Vol.14，1992；K.Irinoda，″Stimulation of microbiocidal host defencemechanism against aerosol influenza virus infection bylentinan，p.971-977.，Jpn J Cancer Res，Vol.76(1)，1985；D.Herlyn，″Monoclonal antibody-dependent murine macrophage-mediated cytotoxicity against human tumors is stimulated bylentinan，p.37-42)。
香菇的一个活性成分名为香菇多糖，是一种基于以β-(1，3)葡聚糖为骨架、带有β-(1，6)侧链的化合物的多糖。
″固体状态″反应器通常用于培养真菌，例如香菇。这一技术用于多种目的，如堆肥，生产生物制品，如酶、酱油、醋酸等。为了生产香菇多糖，可以将香菇培养在以树干或木片的方式提供的适宜的固体基质上，所述的基质上经常添加化学性化合物以促进菌丝体生长和子实体发育，大部分香菇多糖位于此处。子实体可以人工采收或机械采收，然后干燥研磨成粉末状，可以直接使用，也可以制成片剂使用，或用于进一步加工，例如提取香菇多糖。
由香菇制备的多糖产品作为″用于注射的香菇多糖″是商业上可以得到的(Eureka Bio-Chemicals Pty，澳大利亚)。该产品具有一些免疫刺激效果(请参见下文实施例)。
专利WO03/020944描述了多种从真菌纯化细胞外免疫刺激组合物的方法，通常这些方法中都包含沉淀步骤。
不过，尚未公开具有高的免疫刺激性活性的组合物。因此本发明的目的是提供新型组合物，优选来自具有高免疫调节活性的真菌的细胞外免疫刺激剂。
发明内容
本发明公开了含有具有显著免疫调节活性的多糖的组合物。有趣的是本发明公开了多糖组合物的特定单糖成分对于免疫调节活性非常重要。
因此本发明的一个目的是提供含有一种或多种多肽和多糖混合物的组合物，其中，组合物中的大部分多糖优选每个多糖的分子量至少为10000Da，且其中所述多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例为(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，优选比例为1∶0～25∶1～50，例如比例为∶1∶0～25∶1～50。
另一种实施方式是组合物含有一种或多种多肽和多糖混合物，其中a)组合物中大部分多糖的分子量至少为30000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)组合物中大部分多糖的分子量至少为100000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或c)组合物中大部分多糖的分子量至少为1000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
本发明的第二个目的是提供生产所述组合物的方法，所述方法包括下列步骤i)在液体生长培养基中培养真菌，ii)从所述液体生长培养基中纯化所述组合物。
本发明的第三个目的是提供用作药物的药物组合物，其中含有上述组合物以及药学上可接受的载体。
本发明进一步的目的是提供治疗个体的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的本发明的组合物的步骤。
本发明的另外一个目的是提供本发明的组合物在制备用于治疗或者预防性治疗有此需要的个体的免疫受损性疾病的药物中的应用。
定义多糖本文中的“多糖”包括多糖，含有和/或共价地连接于肽、多肽或类似物质的多糖，例如蛋白多糖。
含有单糖的多糖多糖被称为含有单糖，其中所述的单糖共价地连接以形成多糖。多糖水解形成游离形式的形成所述多糖的单糖。多糖的单糖成分因而可以通过水解多糖和测定单独单糖的存在来确定。多糖混合物中的单糖成分通过检测全部多糖混合物中的单糖成分而确定。
比例多糖或多糖混合物被称为含有具有指定比例的半乳糖、甘露糖和葡萄糖，指的是当水解所述多糖或多糖混合物时会产生指定比例的半乳糖、甘露糖和葡萄糖。半乳糖、甘露糖和葡萄糖的比例为1∶a～b∶c～d的含义是对于每份半乳糖，含甘露糖在a～b份的范围，含葡萄糖在c～d份的范围，因此a，b，c和d代表数量值。因此，例如，多糖混合物含有半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50指的是对于每份半乳糖，该多糖混合物含5～25份范围的甘露糖，和1～50份范围的葡萄糖。
分子量组合物中每种多糖被称为具有至少一种指定数值的分子量。当上述组合物通过过滤方式进行纯化时，最终指定数值的分子量被截留。类似的，组合物中每个多糖被称为具有在指定范围内的分子量，当所述组合物经过一步或多步过滤纯化步骤时，最终截留低值范围的低分子量物质和高值范围的高分子量物质。上述过滤步骤可以例如是超滤、和同孔过滤、超速离心或凝胶过滤方式。但是，对于其中每个多糖都有最低指定分子量或每个多糖都被称为具有指定分子量范围的组合物，也可以通过其它方式制备。
多肽此处所用的术语“多肽”包括蛋白质、肽和多肽。其中，所述的蛋白质、肽或多肽可以也可以不经过转录后修饰。转录后修饰可以是例如磷酸化、甲基化或糖基化。
发明详述组合物本发明的组合物含有一种或多种多肽和多糖混合物。所述多肽可以任选地共价地与多糖连接。不过，所述的多肽或者不与所述多糖结合、或者以非共价键形式与所述多糖结合的情况也包括在本发明中。
因此，组合物含有可以是蛋白多糖、也可以不是蛋白多糖的多糖，或者该组合物可以含有二者的混合物。
本发明的组合物是分离或纯化的组合物，即它们经过一步或多步的纯化步骤。在优选的实施方式中，它们通过使用包括按大小分级的至少一个步骤从真菌菌丝体的液体生长培养基中纯化出来。下面详细介绍纯化方法。
在优选的实施方式中，该组合物基本上由多糖和任选的多肽组成，更优选该组合物基本上由多糖和多肽组成。经常地，该组合物为液体组合物，因此优选该组合物基本由多糖和溶解在任选的含有盐和缓冲液的水溶液中的任选的多肽组成。
本发明的组合物的多糖优选含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖。可以包括在本发明的组合物中的多糖和多肽的例子包括但不限于β-(1，3)，β-(1，6)D-葡聚糖，裂殖菌多糖(schizophyllan)，灰树花多糖(grifolan)，云芝多糖(coriolan)和杂色革盖菌糖基化多肽(Coriolus versicolor glycosylated polypeptides)(例如PSK和PSP)，与α-甘露聚糖结合的多肽(例如KS-2)(其可以通过从香菇(Lentinus edodes)中分离得到)，和灵芝多糖(reishi)(其可以从灵芝(Ganoderma lucidum)中分离得到)，葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖；甘露-葡聚糖；葡甘露聚糖；半乳糖葡聚糖和/或半乳糖葡萄糖甘露聚糖。
真菌在一种优选实施方式中，本发明的组合物是通过真菌生成的。优选地，组合物从真菌细胞外环境纯化得到。更优选的是真菌，最好是真菌菌丝体，培养在液体生长培养基中，然后从液体培养基中纯化得到上述组合物。
因此优选通过下述方法制备本发明的组合物，所述方法包括以下步骤i) 在液体生长培养基中培养真菌，例如真菌菌丝体，和
ii)从所述液体生长培养基中分离组合物。
真菌菌丝体可以是任何真菌生物质，其能在深层培养中生长。该真菌生物质可以是单个菌丝、孢子、菌丝体的集合、以及部分分化的菌丝体的形式。
液体生长培养基可以是任何以下描述的液体生长培养基。
真菌可以是任何真菌，优选形成真菌菌丝的、更优选丝状真菌、更加优选的是选自下述的真菌双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，冬虫夏草(Cordiceps sinensis)，金针菇(Flammulina velutipes)，灵芝(Ganoderma lucidum)，多叶奇果菌(Grifola frondosa)，香菇(Lentinus edodes)，糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)，裂褶菌(Schizophyllum commune)，核盘菌(Sclerotina sclerotium)，白腐担子菌(Trametes(Coriolus)versicolor，采绒革盖菌)，银耳(Tremella fuciformis)，姬松茸(Agaricus blazei)，茶树菇(Agrocybe aegerita)，柱状田头菇(Agrocybe cylindracea)，地花菌(Albatrellus confluens)，蜜环菌(Armillariella mellea)，木耳(Auricularia auricular-judae)，毛木耳(Auriculariapolytricha)，Collybia maracula，蛹虫草(Cordiceps militari)，Dendropolyporus umbellatus，木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)，松生层孔菌(Fomes pinicola)，平盖灵芝(Ganoderma applanatum)，铁杉灵芝(Ganoderma tsμgae)，猴头(Hericium erinaceus)，玉蕈(Hypsizygus marmoreus)，桦褐纤孔菌(Inonotus obliquus)，硫色绚孔菌(Laetiporus sulphurous)，桦革裥菌(Lenzites betulinus)，大白桩菇(Leucopaxilllus giganteus)，灰离褶伞(Lyophyllumcinerascens)，外溶亚脐菇(Omphaina epichysium)，霉状小奥德蘑(Oudemansiella mucida)，晚生扇菇(Panellus serotinus)，桦滴孔菌(Piptoporus betulinus)，裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)，松木层孔菌(Phellinus pini)，光帽鳞伞(Pholiota nameko)，金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus)，肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)，Sarcedon asparatus，香栓菌(Trametes suavolens)，草菇(Volvariella volvacea)和茯苓(Wolfiporia cocos)。
然而更优选的，真菌是从以下品种选出的双孢蘑菇，冬虫夏草，金针菇，灵芝，多叶奇果菌，香菇，糙皮侧耳，裂褶菌，核盘菌，白腐担子菌(采绒革盖菌)和银耳。在其它优选的实施方式中，所述真菌是姬松茸(Agaricus blazei)；在其它优选的实施方式中，所述真菌属于灵芝属，例如灵芝；在其它优选的实施方式中，所述真菌是伞状真菌，例如选自A.blazei，A.blazei Murill，A.bisporus，A.hortensis，A.campestris。
在非常优选的本发明的实施例中，所述真菌属于担子菌类，例如香菇属真菌，如香菇。
在比利时微生物保藏协调中心(BCCM)保藏的香菇IHEM 18992(14Rue J.Wytsman，B-1050 Bruxelles，比利时)提供了一种香菇的优选菌株，其它可用的香菇可以从下列机构获得，例如ATCC(AmericanType Culture Collection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，CBC(Centraalbureau voor Schimmelcultures，PO Box 85167，3508 AD Utrecht，THE NETHERLANDS)和DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig GERMANY)。
另外有关的香菇属物种，除香菇(Lentinus edodes)外，香菇种类还包括Lentinus albovelutinus G.Stev.(1964)＝Rhodocybealbovelutina(G.Stev.)E.Horak(1971)；Lentinus anthocepha lus(Lév.)Pegler；Lentinus badius Bres.；Lentinus castoreus Fr.(1838)＝北方小香菇(Lentinellus ursinus)(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus chrysopeplus Berk.&M.A.Curtis(1869)＝Cyptotramaasprata(Berk.)Redhead & Ginns(1980)；Lentinus cochleatus Fr.；Lentinus concinnus Pat；Lentinus delicatus G.Stev.(1964)＝Marasmius delicatus(G.Stev.)E.Horak(1971)；Lentinusfasciatus Berk.；Lentinus hepatotrichus Berk.(1859)＝北方小香菇(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus hyracinus Kalchbr.(1880)＝北方小香菇(Fr.)Kühner(1926)；洁丽香菇(Lentinuslepideus)sensu Colenso(1891)；洁丽香菇(Fr.)Fr.(1825)＝Lentinus suffrutescens (Brot.)Fr.(1825)；Lentinusnovaezelandiae Berk.(1855)＝Lentinellus ursinus(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus pulvinulus Berk.(1859)＝Lentinelluspulvinulus(Berk.)Pegler(1965)；Lentinus punctaticeps Berk.& Broome(1883)；Lentinus punctaticeps cf.sensu Petersen，Nicholl & Hμghes(1997)；Lentinus pygmaeus Colenso(1887)＝Lentinus zelandicus Sacc.& Cub.(1887)；Lentinus sajor-caju(Fr.)Fr.；Lentinus squarrulosus Mont.；Lentinus strigosus(Schwein.)Fr.(1825)；Lentinus suffrutescens(Brot.)Fr.(1825)；and Lentinus tuber-regium Fr.；Lentinus zelandicus Sacc.& Cub.(1887)(参考http://nzfungi. landcareresearch.co.nz).
免疫系统的调节本发明的组合物优选用于免疫调节，优选该组合物用于刺激免疫。例如通过增加抗体的产生或者通过辅助T细胞的激活，或通过白细胞介素如白细胞介素1和白细胞介素2的产量表现对免疫系统的刺激。
本领域技术人员知道的任何适用于检测组合物是否具有免疫调节性的测试都可以用于检测本发明中的组合物是否具有免疫调节性。这些测试可以是体内或体外测试。
一种优选的测试是检测该组合物是否能诱导IL-1的产生，如IL1-α和/或IL1-β的产生。因此，在本发明的优选的实施方式中，本发明的组合物能够通过体外试验从至少-种IL-1产生细胞诱导产生IL-1。该细胞可以是任何IL-1产生细胞，例如P388小鼠巨噬细胞，优选的所述的细胞是IL-1β产生细胞。IL-1的产量可以采用任何适当的方法检测。通常使用特定的IL-1抗体，如特定的IL1-α和/或IL1-β抗体都适用。这些检测可以是例如Western印迹，ELISA或其它类似的检测，检测可以通过实施例4所述的步骤进行。
因为难以校准白介素1的检测，检测时最好使用一个特定具体的组合物作参考。因此在本发明的优选的实施方式中，所述组合物能够诱导产生的IL1-α应该比用市售香菇注射剂(Eureka Bio-ChemicalsPty，Little Collins Street.Melbourne 3000，澳大利亚)在平行条件下进行的参考试验诱导的IL1-α的量多至少1.5倍，优选是至少2倍，例如至少4倍，例如至少6倍，例如至少8倍，例如至少10倍，例如至少15倍，例如至少20倍，例如至少30倍，例如至少40倍。在本发明的优选的实施方式中，该组合物能够诱导产生的IL1-β应该比用市售香菇注射剂(Eureka Biochemicals Pty)在平行条件下进行的参考试验诱导的IL1-β的量多至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少4倍，例如至少6倍，例如至少8倍，例如至少10倍，例如至少15倍，例如至少20倍。优选地，上述试验按照实施例4所述的进行，最优选的是所述组合物如以上所述的诱导IL1-α和IL1-β二者的产生。
在本发明的另外的实施方式中，当给予所述哺乳动物时，所述组合物能够提高在哺乳动物中的抗体产生。哺乳动物可以是例如小鼠，大鼠，兔子甚至人。优选这样的检测通过在给予抗原(或者在佐剂的存在下)之前或同时向哺乳动物给予该组合物来进行。优选地，在给予抗原之前的1～30天范围，优选1～10天的范围，更优选1～3天的范围给予组合物。随后可以确定抗体在哺乳动物内的产生。与没有给予该组合物所诱导产生的抗体量相比，该组合物优选能够诱导产生至少1.5倍，更优选至少2倍，甚至更优选至少是2.5倍，例如3倍，例如至少4倍，例如6倍多的抗体。这样的试验的例子请参见实施例6。
优选该组合物在1个以上的检测系统中具有免疫调节性，例如上述任何检测系统的组合。
在优选的实施方式中，本发明的组合物的作用能提高TNF-α的产生，这可以通过实施例9所述的试验进行测定。
单糖成分本发明的组合物优选包括多糖，其中大部分的多糖，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选80％，当然更优选至少90％，甚至更优选95％，当然更优选基本上所有的多糖，最优选每个多糖的分子量大于10000Da，优选大于30000Da，更优选大于40000Da，甚至更优选大于50000Da，例如至少100000Da，例如至少300000Da，例如至少1000000Da。在本发明的一个具体实施方式
中，组合物的大部分的多糖，优选每个多糖的分子量在10000～3000000Da之间，例如30000～3000000之间，例如40000～3000000之间，例如50000～3000000之间，例如50000～100000之间，例如100000～300000的范围，例如300000～1000000的范围，例如1000000～3000000的范围。
优选地，该组合物通过涉及至少一个按大小分级的步骤进行纯化。因此优选，该组合物是经过至少一次分离步骤纯化的，其中，一些分子量高于截留(cut off)分子量的多糖与那些分子量低于截留分子量的多糖得到分离。例如，如果用超滤法或微孔过滤法进行分离，应使用与截留分子量相同的过滤膜；如果用凝胶过滤法，应使用与截留分子量相同的凝胶或使用某特定洗脱部分。在本发明的实施方式中，使用大分子量的级分，其中，截留分子量优选为10000Da，更优选是30000Da，甚至更优选是40000Da，当然更优选是50000Da。
在本发明的其他的实施方式中，组合物已经通过含有一个或多个大小分级的步骤纯化后，其中最终得到的级分含有分子量高于截留分子量的多糖和分子量低于截留分子量的多糖。例如，如果大小级分是通过超滤或微孔过滤，第一个级分步骤可以使用具有较低截留分子量的滤膜进行，可以收集大分子量片段并使之进行用具有较高的截留分子量的滤膜进行超滤或微孔过滤。在第二次分级步骤后，可以收集具有较低分子量的级分。如果用凝胶过滤，可以使用特定的洗脱级分；如果用超速离心法，可以使用具有较低截留分子量的滤膜和具有较高截留分子量的滤膜。
本发明的组合物含有多糖混合物，其中，所述的混合物含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例为1∶5～25∶1～50。这个比例反映了在全部多糖混合物中的比例。因此，在混合物中的每个多糖中含有不同比例的单糖是可行的。
通常，比例测定是通过将全部多糖混合物降解成单糖，然后确定每种所述单糖的浓度而确定的。多糖可以通过水解，例如强酸水解，比如用HCl降解成它们的组成单糖，本领域人员可以利用能采用的常规方法分析水解产物，例如HPLC，质谱法或NMR。
在本发明的一个实施方式中，多糖含有单糖葡萄糖和甘露糖。在另外的实施方式中，本发明的多糖含有单糖葡萄糖和半乳糖。在本发明优选的实施方式中，组合物的多糖含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖。
优选的多糖组合物中含有在5～25范围内，优选在5～20范围，更优选在5～17范围，甚至更优选在6～15范围，当然更优选在7～14，例如10～17的范围，例如11～16的范围，诸如12～15的范围，例如13～14的范围，诸如大约13.4+/-0.4，例如13.4+/-0.4份甘露糖，对应于每份葡萄糖。
优选的多糖组合物中含有在1～50范围，优选在1～40范围，更优选在1～30范围，甚至更优选在1～25范围，当然更优选在1～20范围，甚至更优选在2～15，当然更优选在2～14，例如8～17的范围，例如9～16的范围，例如10～15的范围，例如在11～14的范围，例如大约12.6+/-1.3，例如12.6+/-1.3份的葡萄糖，对应于每份半乳糖。
在更优选的多糖混合物中，含有的甘露糖和葡萄糖的比例如上所述，含有葡萄糖和半乳糖的比例如上所述。
在本发明的具体实施方式
中，其中多糖包含甘露糖和葡萄糖，并且含有它们的范围优选为0.1～30，例如在0.1～0.25的范围，例如在0.25～0.5的范围，例如在0.5～0.75的范围，例如在0.75～1的范围，诸如1～5的范围，例如5～10的范围，10～20的范围，例如20～30范围份的葡萄糖，对应于每份甘露糖。优选地，多糖含有0.5～2份葡萄糖，对应于每份甘露糖，更优选地，13.4+/-0.4份甘露糖，对应于12.6+/--1.3份葡萄糖。
本发明非常优选的组合物包含的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50，更优选1∶13.4+/-0.4∶12.6+/-1.3。
本发明其它的实施方式中，该组合物含有多糖混合物，其中在所述混合物中的该多糖的分子量在50000～100000范围，含有3～15份，优选地在4～14的范围，更优选地在5～13的范围，甚至更优选地在6～12的范围，当然更优选地在7～11的范围，甚至更优选地在7.9～9.9的范围，例如大约8.9份甘露糖，对应于每份半乳糖在该实施方式中，优选多糖的分子量在50000～100000的范围，含有1～5份范围，优选地在2～4的范围，更优选地在2.5～3.5的范围，例如大约2.9份葡萄糖，对应于每份半乳糖。更优选地，所述组合物的多糖分子量范围在50000～100000Da，含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖的比例在1∶4～14∶1～5，优选地比例大约为1∶8.9∶2.9。
本发明另外的实施方式中，组合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量范围在100000～300000，含有3～15份，优选地3～14的范围，更优选地3～13的范围，甚至更优选地3～12的范围，当然更优选地4～11的范围，甚至更优选地5～10的范围，当然更优选地在6.3～8.3的范围，例如大约7.3份甘露糖，对应于每份半乳糖。在该实施方式中，多糖的分子量优选100000～300000，含有1～5份范围，优选地2～4的范围，甚至更优选地2.5～3.5的范围，例如大约2.9份葡萄糖，对应于每份半乳糖。更优选地，所述组合物的多糖的分子量范围在50000～100000Da，含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例在1∶3～13∶1～5，优选比例是大约1∶7.3∶2.9。
本发明另外的实施方式中，组合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量范围在300000～1000000，含有3～16份范围，优选地5～15的范围，更优选地5～14的范围，甚至更优选地6～13的范围，当然更优选的7～12的范围，甚至更优选地8.9～10.9的范围，例如大约9.9份甘露糖，对应于每份半乳糖。在该实施方式中，优选多糖的分子量在300000～1000000的范围，其中含有1～5份，优选地2～4的范围，甚至更优选地2.5～3.5的范围，例如大约3.1份葡萄糖，对应于每份半乳糖。优选地，所述组合物的多糖的分子量范围在300000～1000000Da，含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例在1∶5～15∶1～5，优选地比例大约是1∶9.9∶3.1。
在本发明另外的实施方式中，组合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量至少1000000，含有3～17份范围，优选地4～16的范围，更优选地5～15的范围，甚至更优选地6～14的范围，当然更优选地7～13的范围，甚至更优选地8～12的范围，甚至9.3～11.3份，例如大约10.3份甘露糖，对应于每份半乳糖。在该实施方式中，多糖的分子量优选分子量至少1000000，其中含有1～5份，优选的2～4份，更优选的2.5～3.5份，例如大约2.9份葡萄糖，对应于每份半乳糖。优选地，所述组合物中的多糖的分子量至少在1000000Da，含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例是1∶4～1∶5～15∶1～5，优选比例大约是1∶10.3∶2.9。
在一个实施方式中，本发明含有摩尔比为半乳糖甘露糖葡萄糖为1∶10～20∶30～50，例如1∶12～18∶35～45，例如1∶14～16∶38～42，例如1约15∶约40，如1∶15∶40。
因而，在一个组合物的实施方式中，多肽含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，它们的比例(半乳糖甘露糖葡萄糖)为1∶0～25∶1～50，例如1∶10～20∶30～50，例如1∶12～18∶35～45，例如1∶14～16∶38～42，例如1∶约15∶约40，例如1∶15∶40。
在另外一个实施方式中，本发明的多糖含有摩尔比为半乳糖甘露糖葡萄糖为1∶0.5～5∶6～12，例如1∶1～4∶7～11，例如1∶1.5～3.5∶7.5～10，例如1∶2.0～3.0∶7.5～9.5，例如1∶2.2～2.8∶8.0～9.0，例如1∶约2.5∶8.0～9.0，例如1∶2.5∶8.0～9.0，例如1∶2.5∶8.6。
本发明两个优选的组合物的实施方式中，含有乳糖甘露糖葡萄糖的摩尔比为1∶12∶40和1∶3∶5。
在本发明的一个优选的实施方式中，糖组合物获自姬松茸(Ganoderma)，并且含有10～20份甘露糖，30～50份葡萄糖和0～2份半乳糖，例如11～17份甘露糖，35～45份葡萄糖和0～1份半乳糖。更优选地，糖组合物获自姬松茸，并且含有约15份甘露糖，约40份葡萄糖和约1份半乳糖，这里的“约”指与所述的数值相差在20％之内，例如与所述的数值相差在10％之内，例如与所述的数值相差在5％之内。
在本发明另外的优选的实施方式中，糖组合物获自灵芝，并且含有0.5～5份甘露糖，4～15份葡萄糖和0～2份半乳糖，例如2～3份甘露糖，7～9.5份葡萄糖和0.5～1.5份半乳糖。更优选地，该糖组合物获自灵芝，含有约2.5份甘露糖，约8.6份葡萄糖和约1份半乳糖，这里的“约”指与所述的数值相差在20％之内，例如与所述的数值相差在10％之内，例如与所述的数值相差在5％之内。
具有指定范围内的分子量的多糖的单糖成分含量的确定可以通过对于组合物的分子大小的分级，例如通过超滤、微孔过滤、超速离心或凝胶过滤来确定，例如，这可以如实施例2中所述的进行。
优选多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例为(0～1.5)∶(0～0.5)～(15～35)∶(0.5～1.5)～(45～55)，例如下面所述的任何一个(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)，
(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0.8-1.2)∶(0-0.1)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)。
在本发明另外一种实施方式中，本发明的组合物的糖组合物含有1-25份甘露糖，5-45份葡萄糖和0-1.5份半乳糖，(这里的“份”指相对摩尔比，即每1-25摩尔甘露糖，有5-45摩尔的葡萄糖和0-1.5摩尔的半乳糖)，进而糖组合物可含有A)，B)和C)，如下A)从如下组中选出的1个数量的甘露糖1-25份1-20份1-15份1-10份1-4份1-3份1.5-2.5份4-6份7-15份7-23份9-19份12-20份10-25份12-17份
14-16份和B)从如下组中选出1个数量的葡萄糖5-45份5-13份7-13份7-15份8-15份8-12份8-10份8-9份8.4-8.7份8.6份10-20份20-30份30-40份30-45份35-45份35-42份37-45份39-41份40份以及C)从如下组中选出1个数量的半乳糖0-1.5份0.2-1.2份0.7-1.5份
0-0.2份0-1份0份1份1-1.5份。
具体实施例方式
在本发明一个实施方式中，提供了下述组合物其含有一种或多种多肽和一种多糖混合物，其中a)组合物的大部分多糖的分子量至少是30000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)组合物的大部分多糖的分子量至少是100000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或c)组合物的大部分多糖的分子量至少是1000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
因此，在本发明的一个实施方式中，组合物的大部分多糖的分子量至少为10000Da，优选至少30000Da，并且所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例为1∶0～25∶1～50，也可以为如下比例中的任何一个1∶0～15∶1～251∶15～25∶1～251∶0～25∶25～501∶15～25∶25～501∶0～7∶1～501∶0～7∶1～251∶7～15∶1～50
1∶7～15∶40～501∶0～25∶1～401∶0～25∶25～401∶0～10∶1～50。
本发明的另一个实施方式中，组合物的大部分多糖的分子量至少是1000Da，例如至少5000Da，例如至少10000Da，例如至少20000Da，例如至少40000Da，例如至少50000Da，例如至少60000Da，75000Da，例如至少85000Da，最优选的是至少100000Da；并且这里所说的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或如下比例中的任何一个0～0.5∶0.5～7∶0.5～500～0.5∶0.5～4∶0.5～500～0.5∶0.5～2∶0.5～500～0.5∶3～10∶0.5～500～0.5∶5～10∶0.5～500～0.5∶3～7∶0.5～500～0.1∶0.5～7∶0.5～500～0.1∶0.5～4∶0.5～500～0.1∶0.5～2∶0.5～500～0.1∶3～10∶0.5～500～0.1∶5～10∶0.5～500～0.1∶3～7∶0.5～500～0.5∶0.5～7∶0.5～250～0.5∶0.5～4∶0.5～120～0.5∶0.5～2∶10～500～0.5∶3～10∶0.5～50～0.5∶5～10∶15～400～0.5∶3～7∶25～500～0.1∶0.5～7∶45～50
0～0.1∶0.5～4∶40～500～0.1∶0.5～2∶35～500～0.1∶3～10∶20～300～0.1∶5～10∶15～450～0.1∶3～7∶25～300～0.1∶0.5～1.5∶15～200～0.1∶0.5～1.5∶0.5～1.5优选地，所述比例是大约0∶1∶18或大约0∶1∶1。
在另外的本发明的实施方式中，组合物的大部分多糖的分子量至少是500Da，例如至少800Da，例如至少1000Da，例如至少5000Da，例如至少10000Da，例如至少20000Da，例如至少40000Da，例如至少50000Da，例如是至少60000Da 75000Da；例如至少85000Da，例如至少100000Da，最优选是至少1000Da，并且这里所说的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或如下的比例中的任何一个1∶0～25∶1～501∶0～20∶1～501∶0～15∶1～501∶0～10∶1～501∶0～5∶1～501∶10～25∶1～501∶10～15∶1～501∶15～25∶1～501∶17～25∶1～501∶10～18∶1～501∶0～25∶1～451∶0～25∶1～401∶0～25∶1～35
1∶0～25∶1～301∶0～25∶1～201∶0～25∶1～151∶0～25∶1～51∶0～25∶10～201∶0～25∶10～301∶0～25∶10～401∶0～25∶20～501∶0～25∶20～301∶0～25∶20～401∶0～25∶30～501∶0～25∶30～401∶0～25∶30～351∶0～25∶35～401∶0～25∶1～451∶0～20∶1～401∶0～15∶1～351∶0～10∶1～301∶0～5∶1～201∶10～25∶1～151∶10～15∶10～501∶15～25∶10～401∶17～25∶1～501∶10～18∶1～501∶8～15∶30～501∶11～13∶35～451∶11～13∶38～421∶1～5∶3～91∶2～4∶4～6
优选，所述比率是大约1∶12∶40或大约1∶3∶5。
多肽本发明的组合物中优选含有多肽。此处术语多肽包括蛋白质、肽和多肽。所述的多肽可以以游离形式存在，也可以共价地与多糖连接，或者它们可以非共价地与多糖或者前的混合物结合。
优选地，所述组合物含有足够的多肽使得可以口服给予该组合物。如果该组合物含有过少的多肽，当该组合物口服给予所述个体后，在个体中得不到或产生很低的免疫调节性。因此优选本发明的组合物含有至少10μg/L，更优选至少20μg/L，甚至更优选25μg/L。例如含量在10～1000μg/L的范围，如20～1000μg/L的范围，如25～1000μg/L的范围，如25～100μg/L的范围，如25～35μg/L的范围，优选可溶性多肽。优选含有上述浓度的多肽的组合物，包含范围在0.1～2，更优选在0.5～1.5范围，甚至更优选大约1mg/ml的多糖。如果该组合物含有多糖的含量有多有少，优选地成比例的降低或增加多肽的含量。
制备组合物的方法优选地，本发明的组合物的制备方法包括以下步骤i)在液体生长培养基中培养真菌，ii)从所述液体培养基中纯化所述组合物。
培养真菌的液体生长培养基中通常包括所述真菌在水中生长所需的溶解的营养成分，将溶液转移到生物反应器中，并在生物反应器中接种想要培养的真菌细胞或孢子，例如菌丝体或其片段(fraction)等。这些是在无菌环境中并且具有环境控制下进行的，以此为真菌提供适合的物理化学环境。在液体生长培养基中培养真菌也称为“液态”培养。
在“液态”培养中，具有真菌生物质的培养基优选进行搅拌以减少梯度的出现和确保浸没的细胞获得氧气。当菌体在生物反应器中生长时，为液体培养基提供氧气，用已知的方法控制提供的溶氧水平。
液体生长培养基是一种水溶液，优选是含有营养组合物的无菌水。该液体培养基支持真菌生长，并且优选能够刺激细胞外组合物的产生，例如免疫调节物。液体生长培养基中可以含有一种或多种微生物生物体生长所需要的典型成分，如麦芽提取物，酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、蔗糖、盐类提供磷酸盐、镁、钾、玉米浆、维生素如硫胺素。更优选地，含有用于菌丝体生长，产生多糖的含有蔗糖，玉米浆，磷、镁的培养基。
对于生长培养基的接种来说，可以用菌丝体，如从含有麦芽提取物，酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖的琼脂板上得到的香菇菌丝体。真菌最初可以在含有上述营养物质的琼脂板上培养，以支持该真菌的生长。用菌丝体接种平板，然后温育，到在平板上至少有肉眼可见的菌体。根据菌体不同，该温育通常可以进行大约7天～大约24天，或大约10天～大约30天，通常是14天或者高达20天。温度范围在18～32℃，优选是22℃～30℃之间，如约23℃～27℃，如在25℃左右等。
作为从琼脂板接种菌丝体的替代方式，生长培养基的接种可以用发酵液中的菌丝体，如含有支持细胞生长营养物质的摇瓶培养基。培养菌丝体的摇瓶培养基最初可以用在琼脂板培养的菌丝体接种。将菌丝体从琼脂板上取得，在无菌状态下转移到摇瓶中，摇瓶中含有支持真菌菌丝体生长的营养物质和营养盐的无菌水。典型的生长培养基含有蔗糖，玉米浆，磷和镁。能够提供最多的细胞外香菇多糖的产生的接种材料的量可以从下述初步试验中选出。
摇瓶温育时间根据菌种不同而不同，通常摇瓶可以通过摇动6～21天，优选7～18天，更优选8～14天；于温度在18～32℃的范围，优选22～30℃之间，如大约23℃，如24℃，如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃进行温育。摇瓶也有可以是8～25天，更优选10～20天，更优选12～18天进行温育。温度可以是18～37℃，优选23～32℃，如大约25℃。
摇瓶中的物质可以用于一个生物反应器的接种，在这种情况下，反应器含有营养混合物无菌溶液和在水中的营养盐，以单一培养担子菌丝体，或其片段，例如香菇菌丝体，如香菇。
通常生物反应器发酵周期在50小时～300小时的范围，优选是在80～270小时的范围，温度控制在连续的18～32℃的范围，优选在22～31℃的范围，例如大约23℃，例如24℃，例如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃。温度也可以在18～37℃，优选23～32℃，如大约25℃。
反应器上有一个小口为发酵液提供空气，并且发酵液最好保持连续搅拌状态或者是最终以加入空气作为结果的状态，可以通过向反应器中加入空气进行，或者通过使用适于提供反应器的内容物很好地混合的混合装置。
优选地，在用真菌菌丝体或其片段(如香菇菌丝体)接种前，调节生长培养基的pH值在大约3～大约7，例如，pH值在大约4.5～大约6.5，如在大约6。初次调节后，pH值可能随发酵的过程而降低，可以用其它合适的pH值调控剂(如酸和碱等)将培养基pH值调节在3～7的范围内的特定的值。生长培养基的温度优选在18～32℃的范围，优选在22～31℃的范围，如大约23℃，如24℃，如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃。温度可以在18～37℃，如优选23～32℃，如大约25℃。
可以从生物反应器中获得样品并且分析生物质、代谢产物、营养物质，分析结果可以在发酵过程中辅助生物反应器的操作者。典型的分析通常是进行生物质、残余糖浓度和细胞外多糖浓度的确定。针对这方面，可以使用本领域的技术人员知道的用于分析的方法。
优选地，制备本发明的组合物的方法包括从真菌菌丝体中纯化液体生长培养基中的细胞外部分。该液体发酵培养基的细胞外部分(extracellar fraction)也称为上清液，并且该部分可以通过离心或过滤从真菌菌丝体中分离出来，或能够获得基本上无任何菌丝体存在于其中的液体级分的任何其它方法。术语“基本上没有任何菌丝体”表明包括真菌菌丝体片段的菌丝体的浓度减少到至少103，如减少到104，如至少105，如减少到至少106。
在本发明优选的实施方式中，纯化包括至少一个按大小级分进行分离的步骤。优选地，该按大小级分进行分离的步骤是对细胞外级分进行的。该按大小级分进行分离的步骤可以确保每个组合物的多糖具有既定的数值(参见上文)。该按大小级分进行分离的步骤可以是任何本领域技术人员所知道的任何大小级分分离法。例如超速离心法、超滤法、微孔过滤法或凝胶过滤法。因此，在本发明优选的实施方式中，通过涉及下述一种或者多种纯化步骤的方法从液体生长培养基中纯化该组合物，所述的一种或者多种纯化步骤选自超速离心法、超滤法、微孔过滤法和凝胶过滤。优选地，该纯化步骤选自超滤法、微孔过滤法和/或超速离心法，甚至更优选超滤法和微孔过滤法。
超滤是一种膜过程，过滤膜根据液体中成分的大小进行分离。过滤膜结构通常是交互流通的，从而使得含有相关物质的液体能够流过其中。有些液体含有的物质比过滤膜的孔尺寸小则可以透过，大于过滤膜孔尺寸的分子则被截留，一般期望的物质在截留物中或在滤液中。如果为制备组合物进行超滤，在所述的组合物中的每个多糖具有高于既定值的分子量，期望的产物在截留物中。如果制备系列级分，该产物可以在截留物或者滤液中。微孔过滤是一个膜过程，类似于超滤，不过具有更大的膜的孔尺寸，可以允许更大的粒子通过。
凝胶过滤是一种色谱分析技术，该技术中，根据大小进行颗粒分离。过滤介质通常是小凝胶珠，该凝胶珠保留可以通过凝胶珠孔径的分子。较大的则被通过凝胶柱而不被凝胶珠保留。
凝胶过滤、超滤或微孔过滤可参考R Hatti-Kaul和B Mattiasson(2001)((2001)，Downstream Processing in Biotechnology，in BasicBiotechnology，eds C Ratledge and B Kristiansen，CambridgeUniversity Press)pp 189所述内容进行。
实施例1，7和8描述了制备本发明组合物的非限制性方法。
已经描述过对从液体生长培养基中纯化细胞外物质需要乙醇沉淀过程。然而，乙醇沉淀作用将降低免疫调节效果，因此在纯化过程中运用乙醇沉淀获得的组合物不是最优选的。在本发明的一种实施方式中，不包括乙醇沉淀的步骤，更优选的所述方法不涉及沉淀步骤。
药物组合物及其使用在本发明的一个实施方式中，提供了将本发明的组合物在需要这样的刺激的个体中刺激免疫系统的方法。该组合物可以通过例如对个体进行口服或皮下注射有效量的组合物来刺激其免疫系统。对免疫系统的刺激可以表现为例如抗体产量的增加、辅助T细胞的活化、或白细胞介素(如白细胞介素1和白细胞介素2)的量的增加。
本发明的另一个实施方式是本发明的组合物在制备用于治疗需要这样的治疗的个体的免疫受损疾病的药物中的用途。个体的免疫受损疾病可以表现为免疫系统因子，例如抗体数量不足，或抗体产生降低，表现为辅助T细胞数量不足，个体B细胞的产生降低，自然杀伤细胞(NK)数量不足，或个体NK细胞的产生降低，或个体中白介素(如白细胞介素1和白细胞介素2)的数量不足，或者白介素(如白细胞介素1和白细胞介素2)的产生降低。免疫受损疾病可以是下述中的任何一种。治疗可以是预防，缓解或治愈病症。
此处所述的“数量不足”和“产生降低”表现为通常是指医学专家认为这些数量和产生低于正常的健康个体的预定水平或数值。数量和/或产量通常与以下因素有关年龄、常规身体状况等。由于这个原因，医学专家会根据个体基础情况确定不同预定水平或数值。通常个体免疫受损疾病的表现是通过一段时间，如几天、几周、几个月或几年的测量，抗体数量逐渐出现降低，CD4(阳性)细胞的数量逐渐降低，或每单位(血液)样品中的辅助T细胞数量逐渐降低。
本发明的一方面涉及含有本发明的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物，本药物组合物可通过常规技术制备，如在RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy 1995，edited by E.W.Martin，Mack Publishing Company，19thedition Easton，Pa)所述的。组合物可以做成常规形式，如胶囊，片剂，粉状，糖浆，溶液或混悬液。
本发明另一方面涉及对诊断出患有免疫受损疾病的个体进行治疗的方法，所述的方法方法包括对所述个体给予有效剂量的本发明组合物或本发明药物组合物以治疗所述的免疫受损疾病。
给予剂量可以是对上述免疫受损疾病进行预防性治疗的有效剂量。
还提供了对由手术恢复的个体和处于患有免疫受损疾病的风险中的个体的治疗方法，所述方法包括对所述个体给予能激发所述个体的免疫系统的有效量的本发明的组合物和本发明药物组合物。
另外还提供了对诊断出患有或处于患上获得性免疫缺陷综合症的个体的治疗方法，所述方法包括对所述个体给予对所述综合症为治疗有效剂量的或预防性治疗有效剂量的的本发明组合物和本发明药物组合物。
可能引发免疫受损疾病的病症有传染性疾病，寄生性疾病，嗜血杆菌脑膜炎，肺炎双球菌脑膜炎，链状球菌脑膜炎，葡萄球菌脑膜炎，其它生物体引起的脑膜炎，脑炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，其它细菌性肺炎，除了细菌以外的的特定的生物体引起的肺炎，支气管肺炎，不明确生物体引起的肺炎，流行性感冒，不明确性腹泻，不明确性肝炎，急性和亚急性肝脏坏死，慢性肝炎，以及肝脏脓肿。
另外，免疫受损疾病可以是由感染性或寄生性疾病引起的，或者来自霍乱病菌，沙门氏菌，志贺氏菌，大肠埃希氏菌，其它的特定的细菌导致的肠道感染，艰难梭菌，病毒性肠胃炎，传染性结肠炎，肠炎和肠胃炎，感染性腹泻，结核病，李氏杆菌病，巴斯德氏菌病，分支杆菌病，白喉，百日咳，脑膜炎球菌，链球菌败血病，葡萄球菌败血病，肺炎球菌败血病，厌氧菌引起的败血病，其它革兰氏阴性生物体引起的败血病，放线菌感染，气性坏疽，中毒性休克综合征，坏死性筋膜炎，弗里德兰杆菌，流感杆菌，假单胞菌，AIDS/HIV感染，急性脊髓灰质炎，克-雅氏病，亚急性全脑炎硬化，进行性多病灶白质脑病，未明确的中枢神经系统慢病毒感染，柯萨奇病毒，未明确的病毒性脑膜炎，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎，未明确的病毒性脑炎，水痘，带状疱疹，单纯性疱疹，甲型病毒性肝炎，乙型病毒性肝炎，其它明确的病毒性肝炎，慢性肝炎，肝脏脓肿或急性坏死，传染性单核细胞增多症，传染性单核细胞增多症，巨大细胞包涵体病，衣原体，腺病毒，病毒感染，梅毒，念珠菌，未明确的组织胞浆菌病，曲霉病，隐球菌病，霉菌病，类圆线虫病，肠道寄生虫感染，弓形体病，肉状瘤病，卡氏肺囊虫，后脊髓灰质炎症，嗜血杆菌脑膜炎，肺炎球菌脑膜炎，链球菌性脑膜炎，葡萄球菌脑膜炎，脑炎，腺病毒引起的肺炎，呼吸道合胞病毒引起的肺炎，副流感病毒引起的肺炎，其它病毒引起的肺炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，肺炎克雷白菌引起的肺炎，假单胞菌引起的肺炎，流感嗜血杆菌引起的肺炎，链球菌引起的肺炎，葡萄球菌引起的肺炎，和细菌性肺炎。
个体可以是哺乳动物，如人类。
本发明组合物可以使用任何适合给药的形式进行给药，不过通常，给药方式为口服或者非肠道给药；口服给药优选含有该组合物的浆液形式，和/或包含含有该组合物的浆液的胶囊，或该组合物的粉末形式。
所需要的剂量根据所使用的特定的组合物、给药途径和所治疗的特定个体的情况而不同。最理想地，要通过本方法进行治疗的个体将接受最大耐受剂量的药物学有效量的化合物。
通常每日口服剂量相对于全部体重，为大约0.001～大约100mg/kg，优选在0.01～50mg/kg的范围，更优选在0.1～10mg/kg的范围，甚至更优选在1～2mg/kg的范围。本领域的技术人员也会清楚，该组合物的个体剂量的最佳量将取决于想要治疗的疾病的性质和程度、给药的形式、途径和位点以及所治疗的特定患者。可以通过传统技术确定这些最佳方案。也可以由本领域的技术人员确定最佳治疗疗程，即本领域的技术人员使用传统治疗疗程确定测试来决定在确定的天数里的每日的组合物的剂量数。
本发明的组合物和药物组合物也可以是包含所述组合物和带有给药剂量和时间的指导的剂量使用说明书的试剂盒的一部分。
功能性食品在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物用于生产功能性食品，因此在本发明的一个实施方式中，任何此处所述的组合物可以包括在功能性食品和营养添加剂中，优选是适用于人类的。所述的功能性食品优选使生存率提高、延长生命、促进健康和/或是微生物数量的调节剂。更优选，所述功能食品促进健康和/或是微生物数量的调节剂。优选该功能性食品适合至少每周口服摄取，例如每日口服摄取。或者，所述功能食品可以适合非肠道性或者肠道性营养使用，优选含有其他本领域的技术人员知道的营养物质的制剂联合。
由本发明生产的产品可以用于促进人体健康，如用于维持、强化或促进骨骼和心血管健康。在本发明优选的实施方式中，功能性食品能够用于预防或者降低骨质疏松症，在另外优选的本发明的实施方式中，所述的功能性食品是常规消费品，例如，一天一次或一天两次或一天三次，可以导致患如感冒、咳嗽的风险降低，以及减少倦怠疲劳。
尽管给药或消费的方法不同，功能性食品优选作为他或者她每日饮食的成分为人类所摄取。任何在此描述的组合物可以与液体载体，例如，水，牛奶，植物油，果汁等；或可摄取的固体或半固体食物联合。例如，它们可以混合到其它食物，如奶昔，奶昔混合物，早餐饮料，果汁，风味饮料，风味饮料的混合物，酸奶，布丁，冰激凌，冰牛奶，糖粉，冻酸奶，奶酪蛋糕馅，块糖，包括″健康棒″比如麦片或水果棒，口香糖，硬糖，蛋黄酱，蛋糕馅，如水果馅或者奶油馅，谷物，面包，填料，敷料和即食土豆混合物。本发明因而涉及生产功能性食品组合物的方法，该方法包括将任何此处所述的组合物(如从香菇中获得)与食品材料混合。
例如，所说的功能性食品可以选自膳食替代品，食品添加剂、冰淇淋、酱油、敷料、涂抹剂、压块、糖果、点心、谷类、饮料。
在另外优选的实施方式中，所述的功能性食品是食品添加剂，优选适合于摄取的药丸，胶囊，片剂或液体形式。
在一个实施方式中，制备本发明的产品，进而将此处所述的任何组合物(例如，来自香菇)加入到食品产品中，进而使组合物在食品中达到每100克产品含5～5000毫克的组合物的水平。
乳制品在本发明优选的实施方式中，功能性食品是乳制品，进而，所述的功能性食品可以例如选自下述的任何一种形式培养的乳制品、酸奶、白软干酪、奶油奶酪、奶片，酸奶酪，奶昔，黄油，蛋黄酱，低脂涂抹剂、奶酪、松软干酪、乳酪涂抹剂、儿童奶酪条″strings″，奶酪片、酸奶、基于酸奶的碳酸饮料、可饮用酸奶、低脂酸奶、冷冻浇汁，酸奶油、冰淇淋、奶油、低脂奶油替代物、发酵乳如酸乳酒。
在本发明优选的一个实施方式中，所述的乳制品是基于奶酪的制品，如选自低脂乳酪、硬奶酪，软奶酪、干酪、乳酪涂抹剂、儿童奶酪″strings″或用于三明治的奶酪片。
在本发明另外的优选的实施方式中，所述的乳制品是基于酸奶的制品，如选自酸奶组合，软的或者可流动的酸奶，以酸奶为基础的碳酸饮料，饮用或者可饮用的酸奶，低脂酸奶。所述的以酸奶为基础的制品可以例如是用保加利亚乳杆菌发酵和/或嗜热链球菌发酵生产的。
在本发明的另外的优选的实施方式中，所述乳制品是培养的乳制品，如培养液(如可饮用的酸奶/酸奶思乐冰(yogurt/yogurtsmoothies)，酸乳酒、probiotic shots；非饮用型酸奶(例如在杯子或管中)；和/或另外的非流动性培养的乳制品(例如干酪、奶油乳酪、奶片或酸奶油)。
本发明另外的优选的实施方式中，所述的乳制品是其它类型的乳制品，如选自冷冻浇汁，酸牛奶，冰激凌，奶油，低脂奶油替代品，发酵牛奶如酸乳酒，发酵饮料，如可饮用酸奶和酸乳酒。
健康饮料在本发明另外的优选的实施方式中，本发明的功能性食品是健康饮料。所述健康饮料在一个实施方式中是基于果汁的，其可以浓缩为“squash”，可稀释成符合口味的。所述的果汁和浓缩汁优选含有浓缩果汁。优选的果汁包括但不限于柑橘汁如橙子，柚子，柠檬和酸柚，或它们的组合。在另外优选的实施方式中，所述的果汁或者浓缩汁包括(优选被浓缩的)浆果汁，如树莓、草莓、黑莓、罗甘莓，酸果蔓的果实，红浆果、黑浆果、蓝莓，或其组合，和/或与柑橘汁混合的果汁。在另外优选的实施方式中，所述的果汁或者浓缩汁包括来自凤梨、西番莲、芒果、苹果、梨、杏、石榴、番石榴、番茄和/或与任何其它类型的果汁的组合中的一种或者多种。优选果汁基于选自下述水果·苹果·杏·香蕉·黑莓·蓝莓·阳桃(杨桃)·樱桃·枣·无花果·什锦水果·葡萄·柚子·奇异果·柠檬·桔子·芒果·西瓜·油桃·橙子·番木瓜·桃子·梨
·菠萝·车前草·李子·树莓·草莓·橘子·西瓜或其组合进一步地，优选的果汁基于选自下述水果·苹果·胡萝卜·酸果蔓的果实·葡萄·柚子(粉红或白色)·柠檬·酸橙·橙子·菠萝·菠萝·李子·橘子·西红柿或其组合。
以上所说得健康饮品业可以是基于水的饮料，如基于矿泉水的产品，例如基于风味的矿泉水产品。所述的风味优选来自果汁和/或其它天然产品。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述的健康饮料是能量激发饮料，其中含有糖和其他的能量提供制品，例如含在25或30cl的瓶中。
在另外的本发明优选的实施方式中，所述的健康饮料是酒精饮料，例如基于乳品的酒精饮料。
在另外的本发明的优选的实施方式中，所述的健康饮料是膳食品替代性饮料。
这是可以想象到的，本发明的健康饮料也可以制成浓缩的或预混的，可以在下一阶段包装成饮料，由消费者自行决定。
固体功能性食品在本发明优选的实施方式中，功能性食品是固体功能性食品，例如选自下述的食品饼干，早餐麦片，汤，牛奶什锦早餐，口香糖，甜品(如煮沸的甜品)，新鲜烘培食品(新鲜面包，蛋糕，松饼，华夫饼等)，干烘培食品(薄脆饼干，小点心，饼干等)，谷物制品(早餐麦片，纤维和固醇丰富的面粉，牛奶什锦早餐，谷物与牛奶什锦早餐混合的食品块，这样的食品块可以含有巧克力块，意大利面食品，小吃等)，麸皮产品(颗粒和/或烘烤的麸皮产品，有特定口味的和/或涂有固醇类的麸产品和麸-麸混合产品等)。
在另外的本发明优选的实施方式中，所述的固体功能性食品是已经混合的(优选以粉的形式)，或者用于烘培(如面包，蛋糕，松饼，华夫，皮萨，烤薄饼)，或用于烹饪(如汤，调味料，甜点，布丁)，以用于制备或者生产食品。
在本发明另外的优选的实施方式中，所述的固体功能性食品是肉类产品(香肠，肉类球，冷盘等)。
在本发明另外的优选的实施方式中，所述的固体功能性食品是面包或者早餐/烘培点心，因此，所述的面包可以是白面包，黑面包或全麦面包。在本发明另外优选的实施方式中，所述的面包可以选自下属的面包类型麦芽面包，牛奶面包，麸皮强化面包和混合谷物面包。面包可以是任何形状，如圆形，十字花烤包，小屋形状，仙人掌形状，灯笼状，桶状，成批状，三明治状，罐状，维也纳面包或者农舍状。在本发明的一个优选的实施方式中，所述的面包可以选自任何下述的面包类型全麦面包，黑面包，小麦面包(面包中加工小麦的含量不少于10％)。
柔软谷物面包(由面粉制备，但与传统的白面包相比，添加了软化的黑麦颗粒和小麦以增加面包纤维含量(优选30％))。
谷物面包，麦芽面包。
在本发明另外的优选的实施方式中，所述的面包选自下述面包类型的任何一种皮塔饼圆盘烤饼仙人掌状面包苏打面包或者黑苏打面包(用全麦粉制备)黑麦面包，法国长棍面包，新月形面包，百吉饼在本发明的另外的优选的实施方式中，所述的面包是扁平的面包，例如选自下述面包类型中的任何一种恰巴提，Paratas and Roti，墨西哥玉米粉圆饼，囊或烤薄饼等。
在本发明的另外的优选的实施方式中，功能性食品是早餐小吃或烘培产品所述的烘培食品可以是甜味的或开胃味道的，如开胃食品。
优选的烘培产品包括但不限于卷和面包片卷，烤制产品例如松饼和松脆圆饼和厚松饼，烤饼，茶点饼干，小圆面包和其它加水果的产品，铁板类食品例如烤薄饼和热饼，松饼和土豆饼，热交叉小面包圈，新月形面包，奶油蛋卷，巧克力面包，百吉饼，美国甜松饼和其它半甜面包产品。
基于植物油的产品在本发明的其他的优选的实施方式中，功能性食品是基于植物油的产品(涂抹剂，色拉油，蛋黄酱等)。
冷冻糖果食品在本发明的其他的优选的实施方式中，功能性食品是冷冻糖果食品。就本发明的目的来说，术语冷冻糖果食品包括含乳的冷冻甜品，如冰激凌，冷冻酸奶，冰冻果子露，冰冻果子露，冰牛奶和奶油冻，刨冰，格兰尼塔冰品和冷冻水果汤。
优选冷冻糖果(如糖，油脂，调味剂等)中固体水平大于3wt％，最优选10～70wt％，如40～70wt％。
冰淇淋通常含有2～20wt％的油脂，0～20wt％甜味剂，2～20wt％非脂肪乳成分和其它任选的成分，如乳化剂、稳定剂、防腐剂、调味成分、维生素、矿物质等，余下为水。通常，冰激凌都会充气超过20～400％，更普遍地为40～200％。冷冻温度从-2～-200℃，更普遍为-10～-30℃。冰淇淋中含有的钙水平在大约为0.1wt％。
通常用于冷冻糖果的原料的平均规格为66g。本发明中的组合物可以被装入胶囊，或者与乳化剂，清洁剂或其它试剂联合应用以确保产品中的物质的可溶性和稳定性。
膳食替代品在本发明的其他的优选的实施方式中，该功能性食品是膳食替代物。膳食替代物饮料通常基于液体为基本成分，其可以被凝胶或纤维膳食稠化，并且向其中添加矿物质和维生素的混合物。该饮料可被调整风味成期望的口味，如水果味或可可味。典型的规格为330ml或330g。
本发明中的组合物可以被装入胶囊，或者与乳化剂，清洁剂或其它试剂联合应用以确保饮料中的物质的可溶性和稳定性。
膳食替代小吃或块状食品通常含有其中可以混合本发明的组合物的可食用性材料的混合物，例如该混合物可以是基于脂肪类的(如巧克力层或者巧克力)，或可以是基于烘培类的(面包，面团或饼干等)，或可以是基于成块的颗粒状的(米，谷子，坚果，葡萄干，水果粒等)。小吃或者膳食替代块状物的典型规格是20-200g，一般是40～100g。还可以加入其它成分，如风味材料，维生素，矿物质等。
组合物本发明的一个方面，该功能性食品含有本发明的组合物与其它添加剂的组合，所述的添加剂包括如提高生存的物质，促长寿物质，健康促进物质和/或微生物数量调解物。
例如，一个优选的实施方式中，所述的功能性食品是含有一种或多种本发明的组合物和益生菌的例如在益生菌丸中的食品，在另外的优选的实施方式中，所述的功能性食品是含有本发明的组合物以及共生菌的例如在共生菌丸中的食品。在本发明的一个优选的实施方式中，含有本发明组合物和一种共生菌的功能性食品。优选的用于上述的丸中的细菌可以是下述中任何一种乳酸菌，如嗜酸乳杆菌，干酪乳酸菌，发酵乳杆菌，唾液乳杆，乳酸乳球菌，植物乳杆菌素，罗伊氏乳杆菌，鼠李糖乳杆菌和/或唾液乳杆菌。在发明其他的优选的实施方式中，优选的用于上述的丸中的细菌可以是下述中的任何一种双歧杆菌，如双歧杆菌，短双歧杆菌，乳酸双歧杆菌和/或龙根双歧杆菌。本发明其他的优选的实施方式中，优选的用于上述的丸中的细菌可以是下述中的任何一种粪肠球菌、大肠杆菌、布拉第酵母、酿酒酵母和/或嗜热链球菌。
本发明的组合物还可以与其他成分在饮食添加剂中组合使用，所述的饮食添加剂例如植物性添加剂，和/或在维生素E胶囊中，或在硒药片中。在所述的饮食添加剂中的进一步优选的组合可以是与例如与下述的一种或者多种物质的组合抗氧化剂，维生素C、维生素E、β胡萝卜素。
本发明的功能性食品能够另外含有其它的健康性成分，如维生素A、B、C、D、E，矿物质如钙、钾、镁、铁、铜、锌、硒及抗氧化剂如维生素E、多酚。例如该功能性食品可以含有本发明的组合物(如香菇多糖)和维生素C，该组合可以使摄取所述食品的个体降低感冒和流感的发生。
在优选的实施方式中，本发明的组合物还可以含有被认为能够预防或降低骨质疏松的成分，例如食品添加剂，如钙、维生素D、镁等成分。
本发明的合适的功能性食品的优选的实施方式描述如下饮料含有任何本文所述的组合物量在0.1-5％，优选0.5-1％。
新鲜烘焙产品含有任何本文所述的组合物在量在0.9-16％，优选2.4-10％，并且更优选3-5％。
干烘焙品含有任何本文所述的组合物量在1.0-20％，优选3.2-15％，并且更优选4.4-10％。
谷类产品含有任何本文所述的组合物的量在0.8-20％，优选1.6-16％，更优选2-10％。
麸皮产品含有任何本文所述的组合物量在4％-25％，优选6-20％。
乳产品或非乳产品(如发酵的谷类产品)含有任何本文所述的组合物量在0.1-20％，优选0.8-8％。
基于植物油的产品含有任何本文所述的组合物量在0.6-16％，优选2.6-10％，更优选2.6-5％。
肉类产品含有任何本文所述的组合物量在0.1-16％，优选0.2-5％。
乳制品含有任何本文所述的组合物量在0.1-16％，优选0.2-5％。
因此，在一个实施方式中，本发明考虑了任何本文所述的组合物在制备功能性食品中的应用，例如任何本文所述的功能性食品。
实施例下面的实施例例示了本发明的实施方式，不能被认为是对本发明的范围的限制。
实施例1碳水化合物香菇在摇瓶的液体培养基中于25℃下培养，所述的培养基含有15克/升的葡萄糖，3克/升的麦芽提取物，3克/升的酵母提取物以及5克/升的蛋白胨。培养后的生物质用过滤方式从剩余的发酵液中分离出来，将上清液用标准孔大小为50000Da的膜进行超滤。残留物(此处称为MediMush产品)用于分析单糖成分。
为了比较，商业上可得到的香菇注射液(Eureka Bio-ChemicalsPty，Little Collins Street.Melbourne 3000，澳大利亚)被用于平行进行的参照试验中(下文中将本产品称为“Eureka”)。
样品在1N HCl 100℃下水解成构成它们的单糖，水解物用采用了Dionex MA-1柱，以600mM氢氧化钠作为流动相的HPLC进行分析。使用脉冲电流分析法检测。
MediMush产品的主要单糖是甘露糖、葡萄糖以及一些半乳糖。表A列出了MediMush产品及Eureka中的相对的含量。
表A
实施例2按分子量分级由于分子量表征它们的生物活性，将MediMush样本通过Microsep(Pall Life Sciences)离心超滤仪在6℃和7500xg的条件下进行离心，使用标准的MWCO值为50000-1000000的滤膜。分析结果(见表2)显示进行了酸水解产生的物质半乳糖、甘露糖以及葡萄糖，通过了所有使用的4个MWCO的膜。
表2
实施例3可溶性蛋白质样品中的可溶性蛋白通过微量型考马斯染料结合测定法进行测定。(Mousdale，D.M，Campbell，M.S.，Coggins，J.R.″Purificationand characterisation of bifunctional dehydroquinase-shikimateNADP dehydrogenase from pea seedlings″。Phytochemistry 367，217-222(1987)。可溶性蛋白在两种产品中的量如下所示
实施例4免疫刺激性组织培养P388细胞是老鼠的类巨噬细胞，该细胞受到刺激时分泌大量白细胞介素-1(白介素-1)(关于该细胞的详细信息可获自ECACC)。可用基于ELISA(酶联免疫吸附剂测定法)定量所分泌的IL-1的量，并以此测定细胞受到多大的刺激。请注意对于这种试验不存在用于校准的吸收值，因此优选平行分析参照样品，由此IL-1的产量的评价可以通过与参照样品所诱导的IL-1的比较来进行。IL-1有两种形式，即IL1-α和IL1-β。接种P388细胞在12孔培养板中，并使之培养过夜，添加不同浓度的不同的刺激物质，并且在37℃温育24小时。
ELISA
来自每孔的50μl的刺激培养基与包被缓冲液混合，再分成等份加入到96孔ELISA板中，使之在4℃包被过夜。这个步骤可以使抗原(IL-1)结合在ELISA板的表面。用两种产生自山羊的针对两种不同形式的IL-1的抗体(第一抗体)检测IL-1。在下一步中使用另一个抗体检测山羊抗体(第二抗体)。当底物加入时，与辣根过氧化物酶偶联的抗体提供了显色反应。通过分光光度计(ELISA读数器)检测出与存在的IL-1的量对应的颜色的量，因而定量对组织培养细胞的刺激程度。
结果所有样品测试两个产品在一浓度范围内被测试，发现最佳值对于IL1α而言是50g/ml，对于IL1β而言是100μg/ml。结果提供于表3。
表3
MediMush产品具有明显的免疫刺激性，Eureka产品显示出一定的免疫刺激性，但是远不如MediMush产品。MediMush产品诱导产生IL1α及IL1β的量分别是Eureka诱导产生的量的58倍和20倍。
级分检测检测滤液，因此大于滤膜截留值的分子不会存在于该检测中。结果以吸光度的形式显示，只是作为相对免疫刺激指标，没有绝对吸收值用于校准此类试验。
表4
所有过滤物质都表现出强烈的免疫刺激性。
实施例5为了比较两种不同的制备方法，将如实施例1所述而制备的MediMush产品的免疫刺激活性与由多糖组合物的免疫刺激活性相比较，其未进行大小级分分离。
本产品是通过如实施例1所述在液体培养基中培养香菇获得的。向由此获得的上清液中加入大约2倍体积的无水乙醇以沉淀该物质。取出沉淀用无水乙醇清洗，再放入蒸馏水中悬浮。
免疫刺激测试如实施例4所述进行。将使用MediMush产品的结果提供在表5中，并且将使用沉淀产品的结果提供在表6中。
表5
表6
测试并没有平行进行，所获得的数值进而无法比较。但是，由于Eureka被用作两项研究的参照，所以结果就可以作为例如相对于Eureka增加的倍数进行比较。这些数值在下表7中给出。显然，两项试验中组合物都显著地比Eureka的免疫刺激性强。但是MediMush产品比沉淀物有更高的免疫刺激性。
表7
实施例6为确定免疫刺激性的特点，可以运用下列方法在免疫2日前，12周龄的Sprague Dawley大鼠接受本发明的组合物(0.5毫升0.09的生理盐水)。对照动物接受1毫克酪蛋白。动物用含有0.25弗氏完全佐剂的BSA(0.5毫克)进行免疫，在免疫11天后获得血样以检测抗体反应。采用夹心酶联免疫分析(″sandwich″ELISA)测定针对绝对标准抗体BSA的特异性抗BSA抗体的浓度。
实施例7a伞菌培养方案培养条件温度25℃±1℃pH中性pH水自来水培养基葡萄糖30g/l真菌蛋白胨10g/l酵母提取物6g/l麦芽提取物6g/l发酵罐(3升)培养伞菌(Agaricus sp.)取1.7升培养基放入发酵罐，在121℃下灭菌20分钟。设置发酵条件25℃，200-300转/分，空气0.2-0.5vvm。用含有6-8天时间的发酵培养基或类似的能够促进良好生长的培养基的摇瓶接种发酵罐。需要时添加适当的消泡剂(通常在整个过程)。6-8天后收获。
收获伞菌生物质用孔径为45的尼龙布作为过滤介质从发酵液中滤出生物质，用水彻底清洗生物质，然后放入设定为解冻的微波炉烘干直至干燥(通常规格的样品需要大约15分钟)。储存在干燥器中冷却然后称重。
发酵液发酵液中免疫刺激剂的浓度是以ppt通过加入无水乙醇决定的。必要时可加入无菌蒸馏水调节浓度到所需水平。高压灭菌并保存获得的溶液。
医学分级将不含有生物质的发酵液通过具有截留分子量为例如300kD的超滤膜。当移去70％～80％的液体后，向残留物加水以洗涤溶液。重复这个过程直到溶液失去其(大部分)颜色直至表现为清澈。
实施例7b将伞菌(Agaricus blazei)如实施例7a所述在液体培养基中培养。培养好后将生物菌体用过滤方式从发酵液中分离出来，表层悬浮物取决于离心过滤用的截留不同分子量的滤器。去除所有低于100kD的成分后将获得最初的产品(即MediMush产品II)，即剩下的溶液中含有MediMush产品II；通过从表层去除所有低于1kD的成分后将获得第二产品(即MediMush产品III)，即剩余溶液中的物质含有“MediMush产品III”。
样品在1N HCl 100℃的条件下水解成构成它们的单糖，水解产物用HPLC方式分析，利用Dionex MA-1柱，以600mM氢氧化钠作为流动相，脉冲电流分析法检测。
MediMush产品II和III中主要单糖是甘露糖、葡萄糖以及一些半乳糖。表B列出了MediMush产品II和III相关单糖成分。
表B
实施例8灵芝孢子以与上述实施例7a中在液体培养基中培养伞菌类似的方式培养。通过过滤使培养后的生物质从残留的发酵液中分离出来，将上清液进行如实施例7a所述的离心过滤。去除所有低于100kD的成分后将获得第一产品(命名为MediMush产品IV)，即剩下溶液中含有MediMush产品IV；通过从上清液去除所有低于1kD的成分后获得第二产品(命名为MedidiMush产品V)，即剩余溶液中的物质含有“MediMush产品V”。
样品在1N HCl、100℃条件下水解成它们的构成单糖，水解产物用采用Dionex MA-1柱、以600mM氢氧化钠作为流动相的HPLC进行分析。以脉冲电流分析法检测。
MediMush产品IV和V的主要单糖是甘露糖、葡萄糖，以及一些半乳糖。表C列出了MediMush产品IV和V相对单糖含量。
表C
实施例9通过小鼠腹膜渗出细胞(PEC)及脾细胞研究口服及腹腔注射Medimush产品对致炎细胞因子产生的影响。
原料及方法小鼠本研究用24只5周龄的雄性小鼠，从路易斯安那州的实验动物医学系处购买。所有研究按照LSU IACUC规定04-120中描述的进行。
用Medimush产品治疗小鼠分成四组。第一组按照2毫克/公斤接受溶解在0.15M氯化钠中的香菇多糖(腹腔注射)第2组接受同等体积的生理盐水，腹腔注射，第3组按照10毫克/公斤灌胃接受Medimush产品(口腔)和4组给予同等数量水，口服。所有小鼠每天接受一次治疗，共5天。在最后一次治疗的24个小时后，放血处死小鼠进行细胞分离。
腹膜腔渗出细胞(PEC)的分离和刺激如先述(1)所述进行腹腔灌洗收集PEC。细胞在RPMI1640中悬浮到1×106/毫升，所述RPMI1640含2Mm L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素和100μg/mL链霉素(中型)，并且将其按照1mL/孔分别加入到24孔组织培养板里。培养板在1200×g下离心10分钟，置于37℃、5％二氧化碳环境里2小时。弃去培养基，用温热的培养基洗孔一次，用1.5ml添加了10％胎牛血清(Hyclone，Inc.Logan，UT)(完全培养基)的温热培养基替换。每组一半的孔用10ng/ml大肠杆菌脂多糖(LPS；Sigma Chemical Co.，St。Louis，MO)处理，细胞放置在37℃、5％二氧化碳环境里12或24小时。使用针对藻红蛋白标记的CD3和CD14(eBioscience，SanDiego，CA)的抗体与用荧光素(Jackson ImmunoResearch，Avondale，PA)标记的小鼠抗IgG抗体，通过流式细胞计量术测定细胞类型。
脾细胞的分离与刺激从每只小鼠身上取下脾脏，一部分先速冻用于进一步的mRNA分析。剩余的脾脏集中起来分组、粉碎并通过一个70μm的尼龙滤网(Becton Dickenson Labware，Franklin Lakes，NJ)。洗涤一次脾细胞，将沉淀物重新悬浮于氯化铵缓冲溶液中，冰浴，5分钟。细胞洗涤两次，以4×107/mL重新悬浮于24孔组织培养板的完全培养基中，每孔放置1.5mL。用10ng/ml浓度的大肠杆菌脂多糖LPS或5μg/mL浓度的伴刀豆凝集素(Concanavilin)A(ConA；SigmaChemical Co.)刺激代表性的孔，细胞在37℃、5％二氧化碳环境里放置12或24小时。
细胞因子的ELISA(酶联免疫吸附)测定TNFα、IL-1β、IL-6和IL-12的细胞因子酶联免疫吸附测定在血清和培养上清液中进行，照厂家eBioscience)描述的精确操作。未稀释的上清液测定三次。血清按照1∶10稀释进行测定。
结果及讨论对于重量增加的测定，Medimush对它们的生长没有显著的统计学意义(表1)。但是，腹腔注射Medimush产品对从腹膜灌洗中分离出的细胞的数量和表型产生影响。口服药物的小鼠和那些腹腔注射盐水的小鼠类似，但是对于经过腹腔注射Medimush产品处理的小鼠，从腹膜分离出的细胞的总量激增(数据未显示)。细胞数量的增加主要是由于嗜中性粒细胞的增加(表2)。与巨噬细胞相比，PMN引起的实验结果此时还无法预计，但是也许与受腹腔注射Medimush产品处理的实验结果不同。相反的，口服药物组小鼠细胞数量和表型都很类似，因此它们比较的结果应该具有统计学意义。
腹腔注射Medimush产品处理的结果是12小时之内，腹膜渗出细胞(PEC)和脾细胞产生TNFα的量分别增加了4倍(表3)和3倍(表4)，受LPS处理的腹膜渗出细胞和脾细胞产生TNFα的量分别增加了30％和2倍。口服Medimush产品处理的腹膜渗出细胞和脾细胞产生TNFα的量变化不大，有趣的是接受LPS处理的腹膜渗出细胞产生TNFα的量降低了20％(表4)。这些结果反映出对TNFα的影响可能是从局部开始产生，并且/或需要直接接触Medimush产品。
口服Medimush产品和腹腔注射Medimush产品治疗效果都大大提高了。由PEC生产IL-1β(分别为18倍和6倍，表4)。此外，由腹腔经过TNF处理的小鼠的IL-1β对体外LPS的反应超过了3倍，口服Medimush产品并受体外LPS刺激的小鼠由PEC产生的IL-1β的量降低了2倍。
被处理的和未经过处理的小鼠的脾细胞在培养基的前12小时会产生少量IL-1β。当小鼠给予Medimush产品(无论口服还是腹腔注射)，小鼠脾细胞经过LPS或ConA的处理都会产生IL-1β(T细胞分裂素)。
一般而言，Medimush产品对腹膜渗出细胞的IL-6的产生有影响，尽管这对于非LPS处理细胞(表7)只有统计学上的意义。相反，在未受刺激的脾细胞中，IL-6的产生能够被中等程度地提高，但是，在口服和腹腔注射这两种处理中，由LPS或ConA刺激的脾细胞的IL-6的生成却被中等程度地降低。IL-6水平在后来的12个小时的培养中持续升高(表9，表10)。
除了ConA刺激的脾细胞培养，其他细胞的白细胞介素12在12小时的时候只达检测限水平(表12)。在腹腔注射Medimush产品的情况下，经过LPS的处理，小鼠产生了大量的IL-12。
口服Medimush产品能使腹膜渗出细胞逐渐降低促炎性细胞因子的产生，但在脾细胞中，能够逐渐增加促炎性细胞因子的生长，这说明口服Medimush产品的系统性应答可能不同于在之前研究的局部应答(nasal，i.p.，i.v.)。
Medimush产品口服用药与腹腔注射给药不能进行直接比较，因为所用的Medimush产品的给药剂量不同。
参考文献1.Coligan，JE，Kruisbeek，AM，Margulies，DH，Shevach，EM，Strober，W(eds.).1994.″In vitro assays for mouselymphocytes″in Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，Inc.，Indianapolis，IN，p 3.15.4。
表1Medimush产品治疗对重量增加的影响
a.0.15M盐水作为腹腔注射的对照，蒸馏水作为口服对照**表明治疗组与对照组有显著性差异表2培养中的细胞的表型
a.由CD3染色确定b.由表面免疫球蛋白染色确定c.基于流式细胞术的侧部分散d.基于CD14亮染色e.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照表3Medimush产品对腹膜渗出细胞(PEC)产生TNFα(在12小时培养后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表4Medimush产品处理对脾细胞产生TNFα(培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005表5Medimush产品处理对腹膜渗出细胞(PEC)产生IL-1β(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表6.Medimush产品处理对脾细胞产生IL-1β(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005表7.Medimush产品处理对用腹膜渗出细胞(PEC)产生IL-6(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.015M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表8.Medimush产品处理对脾细胞产生IL-6(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005表9Medimush产品处理对腹膜渗出细胞(PEC)产生IL-6(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表10 Medimush产品处理对脾细胞产生IL-6(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.015M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005表11.Medimush产品处理对腹膜渗出细胞(PEC)产生IL-12(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表12Medimush产品对脾细胞产生IL-12(培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005功能食品产品的实施例现在要通过介绍适合用于本发明的优选的功能性食品的实施方式来进一步说明本发明，可以确信本领域技术人员能够运用所提供的说明制备本发明的其它产品。
实施例10条块(Bar)将75克黑巧克力在70℃下熔化，然后与600毫克Medimush产品混合，将混合溶液倒入条状容器，冷却过夜。
实施例11奶昔将100毫升香草冰淇淋与100毫升冷牛奶，10毫升草莓糖浆和1毫升蘑菇培养物的提取液混合，将混合溶液投入搅拌器，搅拌好后即可食用。
实施例12奶油杏仁条成分重量(克)水70
Hyfoama(乳化剂)3.5明胶2.0糖515葡萄糖糖浆60DE 250葡萄糖糖浆35DE 250脱脂奶粉115脂肪501克蘑菇培养物的提取液制备方法将hyfoama和白明胶溶解在水中，加入150克糖，打泡。将剩余的糖加热至130℃，然后缓缓加入到刚才的泡沫溶液中，加入脂肪，葡萄糖糖浆，奶粉和1克蘑菇培养物的提取液。使之冷却后分成50克的小条。
实施例13-果汁饮料11种成分，200克水果浓缩汁(香蕉，菠萝，柑桔，葡萄，杏，柠檬，西番莲，番石榴，芒果)，5克果糖，1克菊粉，10克，0.1克Medimush产品IV，0.9克植物固醇脂肪酸脂(＝0.54克固醇等同物)5克卵磷脂，1.5克乳酸钙775克水。
权利要求
1.一种组合物，其中包含一种或多种多肽和多糖混合物a)组合物中多糖主要成分的分子量至少为30000Da，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)组合物中多糖主要成分的分子量至少是100000Da，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50；或c)组合物中多糖主要成分的分子量至少是1000Da，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是由真菌生产的。
3.根据权利要求1所述组合物，其中所述组合物是由包括下述步骤的方法生产的i)在液体生长培养基中培养真菌，和ii)从所述液体生长培养基分离所述组合物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中从液体生长培养基分离所述组合物的方式包括超速离心、超滤、微孔过滤或凝胶过滤。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述的真菌是真菌菌丝体。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述的真菌属于香菇属。
7.如权利要求2所述的组合物，其中所述真菌选自双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，冬虫夏草(Cordiceps sinensis)，金针菇(Flammulina velutipes)，灵芝(Ganoderma lucidum)，多叶奇果菌(Grifola frondosa)，香菇(Lentinus edodes)，糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)，裂褶菌(Schizophyllum commune)，核盘菌(Sclerotinasclerotium)，白腐担子菌(Trametes(coriolus)versicolor，采绒革盖菌)，银耳(Tremella fuciformis)，姬松茸(Agaricus blazei)，茶树菇(Agrocybe aegerita)，柱状田头菇(Agrocybe cylindracea)，地花菌(Albatrellus confluens)，蜜环菌(Armillariella mellea)，木耳(Auricularia auricular-judae)，毛木耳(Auriculariapolytricha)，Collybia maracula，蛹虫草(Cordiceps militari)，Dendropolyporus umbellatus，木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)，松生层孔菌(Fomes pinicola)，平盖灵芝(Ganoderma applanatum)，铁杉灵芝(Ganoderma tsμ gae)，猴头(Hericium erinaceus)，玉蕈(Hypsizygus marmoreus)，桦褐纤孔菌(Inonotus obliquus)，硫色绚孔菌(Laetiporus sulphurous)，桦革裥菌(Lenzites betulinus)，大白桩菇(Leucopaxilllus giganteus)，灰离褶伞(Lyophyllumcinerascens)，外溶亚脐菇(Omphalina epichysium)，霉状小奥德蘑(Oudemansiella mucida)，晚生扇菇(Panellus serotinus)，桦滴孔菌(Piptoporus betulinus)，裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)，松木层孔菌(Phellinus pini)，光帽鳞伞(Pholiota nameko)，金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus)，肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)，Sarcedon asparatus，香栓菌(Trametes suavolens)，草菇(Volvariella volvacea)和茯苓(Wolfiporia cocos)。
8.如权利要求2所述的组合物，其中所述的真菌选自双孢蘑菇，冬虫夏草，金针菇，灵芝，多叶奇果菌，香菇，糙皮侧耳，裂褶菌，核盘菌，白腐担子菌(采绒革盖菌)和银耳。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有免疫调节性。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有免疫刺激性。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物能够在体外试验中诱导至少一种白介素IL-1生产细胞产生白介素IL-1。
12.如权利要求1所述的组合物，其中当向所述哺乳动物给予时，所述组合物能够提高在该哺乳动物中的抗体产生。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶13.4+/-0.4∶12.6+/-1.3。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的每个多糖的分子量至少是10000Da。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的每个多糖的分子量至少是50000Da。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶7～11∶2.5～3.5。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖的分子量在50000Da～100000Da的范围，其含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶4～14∶1～5。
19.如权利要求18的组合物，其中所述的比例约为1∶8.9∶2.9。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖的分子量在100000Da～300000Da的范围，其含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶3～13∶1～5。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述的比例约为1∶7.3∶2.9。
22.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖的分子量在300000Da～1000000Da的范围，其含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～15∶1～5。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述的比例约为1∶9.9∶3.1。
24.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖的分子量大于1000000Da，其含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～15∶1～5。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述的比例约为1∶10.3∶2.9。
26.如权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物含有至少10μg/L的可溶性多肽。
27.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物含有在10～1000μg/L范围的可溶性多肽。
28.一种生产上述权利要求任一项所述的组合物的方法，该方法包括以下步骤i)在液体生长培养基中培养真菌，ii)从所述的液体生长培养基中纯化所述组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述的纯化包括将分子量至少为10000Da的多糖从其它多糖中分离出来。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述的分离通过超速离心法、超滤法、微孔过滤法或凝胶过滤法实施。
31.一种用作药物的药物组合物，包含权利要求1的组合物和药学上可接受的载体。
32.一种治疗下述个体的方法，所述个体为i)诊断具有免疫受损疾病，和/或ii)处于感染免疫受损疾病的风险，和/或iii)由手术或疾病中恢复，并且处于感染免疫受损疾病的风险，和/或iv)诊断具有或处于感染获得性免疫缺陷综合症的风险，所述方法包括给予所述个体有效量的权利要求1所述的组合物，以治疗或预防性治疗所述免疫受损疾病、或所述综合症、或刺激所述个体的免疫系统。
33.权利要求32所述的方法，其中的免疫受损疾病选自传染性疾病，寄生性疾病，嗜血杆菌脑膜炎，肺炎双球菌脑膜炎，链状球菌脑膜炎，葡萄球菌脑膜炎，其它生物体引起的脑膜炎，脑炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，其它细菌性肺炎，除了细菌以外的特定的生物体引起的肺炎，支气管肺炎，不明确生物体引起的肺炎，流行性感冒，不明确性腹泻，不明确性肝炎，急性和亚急性肝脏坏死，慢性肝炎，以及肝脏脓肿。
34.如权利要求32所述的方法，其中的免疫受损疾病是由下列传染性或寄生性疾病引起的，或者来自霍乱病菌，沙门氏菌，志贺氏菌，大肠埃希氏菌，其它的特定的细菌导致的肠道感染，艰难梭菌，病毒性肠胃炎，传染性结肠炎，肠炎和肠胃炎，感染性腹泻，结核病，李氏杆菌病，巴斯德氏菌病，分支杆菌病，白喉，百日咳，脑膜炎球菌，链球菌败血病，葡萄球菌败血病，肺炎球菌败血病，厌氧菌引起的败血病，其它革兰氏阴性生物体引起的败血病，放线菌感染，气性坏疽，中毒性休克综合征，坏死性筋膜炎，弗里德兰杆菌，流感杆菌，假单胞菌，AIDS/HIV感染，急性脊髓灰质炎，克-雅氏病，亚急性全脑炎硬化，进行性多病灶白质脑病，未明确的中枢神经系统慢病毒感染，柯萨奇病毒，未明确的病毒性脑膜炎，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎，未明确的病毒性脑炎，水痘，带状疱疹，单纯性疱疹，甲型病毒性肝炎，乙型病毒性肝炎，其它明确的病毒性肝炎，慢性肝炎，肝脏脓肿或急性坏死，传染性单核细胞增多症，传染性单核细胞增多症，巨大细胞包涵体病，衣原体，腺病毒，病毒感染，梅毒，念珠菌，未明确的组织胞浆菌病，曲霉病，隐球菌病，霉菌病，类圆线虫病，肠道寄生虫感染，弓形体病，肉状瘤病，卡氏肺囊虫，后脊髓灰质炎症，嗜血杆菌脑膜炎，肺炎球菌脑膜炎，链球菌性脑膜炎，葡萄球菌脑膜炎，脑炎，腺病毒引起的肺炎，呼吸道合胞病毒引起的肺炎，副流感病毒引起的肺炎，其它病毒引起的肺炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，肺炎克雷白菌引起的肺炎，假单胞菌引起的肺炎，流感嗜血杆菌引起的肺炎，链球菌引起的肺炎，葡萄球菌引起的肺炎，和细菌性肺炎。
35.如权利要求32所述的方法，其中的个体是包括人类的哺乳动物。
全文摘要
本发明涉及含有多肽和多糖的组合物，所述组合物通常可用于免疫调节。本发明还公开了使用在液体培养基中培养的丝状真菌生产这些组合物的方法。所述组合物可用于例如免疫受损疾病的治疗。
文档编号A61K36/06GK101018869SQ200580030988
公开日2007年8月15日 申请日期2005年7月15日 优先权日2004年7月16日
发明者B·克里斯蒂安森 申请人:药用菌类公司
技术领域：
本发明涉及免疫调节组合物，所述组合物含有可以从真菌的液体培养物中分离出来的多糖。
背景技术：
众所周知，来自真菌和酵母菌的葡聚糖能够促进健康。由于“香菇”真菌(Lentinus edodes)具有这种功效，其可以开发用于多种医药目的，如免疫刺激、抗病毒、抗肿瘤等。对香菇多糖的研究结果已经表明它从多种途径刺激宿主的免疫系统，例如活化辅助性T细胞，增强白细胞介素1以及白细胞介素2的产生，增强针对多种形式的癌的抗体的产生，以及降低血液中胆固醇水平。(Herbs for Health，jan/feb，1997；K.Jones，″ShiitakeMedicine in a mushroom″，p.40-50，54；Anticancer Res，Vol.17(4A)，1997；H.Matsouka，″Lentinan potentiates immunity and prolongs the survival timeof some patients″，p.2751-2755；Adv Appl Microbiol，Vol.39，1993；S.C.Jong，″Medicinal and therapeutic value of theshiitake mushroom″，p.153-184，Int J Immunopharmacol，Vol.14，1992；K.Irinoda，″Stimulation of microbiocidal host defencemechanism against aerosol influenza virus infection bylentinan，p.971-977.，Jpn J Cancer Res，Vol.76(1)，1985；D.Herlyn，″Monoclonal antibody-dependent murine macrophage-mediated cytotoxicity against human tumors is stimulated bylentinan，p.37-42)。
香菇的一个活性成分名为香菇多糖，是一种基于以β-(1，3)葡聚糖为骨架、带有β-(1，6)侧链的化合物的多糖。
″固体状态″反应器通常用于培养真菌，例如香菇。这一技术用于多种目的，如堆肥，生产生物制品，如酶、酱油、醋酸等。为了生产香菇多糖，可以将香菇培养在以树干或木片的方式提供的适宜的固体基质上，所述的基质上经常添加化学性化合物以促进菌丝体生长和子实体发育，大部分香菇多糖位于此处。子实体可以人工采收或机械采收，然后干燥研磨成粉末状，可以直接使用，也可以制成片剂使用，或用于进一步加工，例如提取香菇多糖。
由香菇制备的多糖产品作为″用于注射的香菇多糖″是商业上可以得到的(Eureka Bio-Chemicals Pty，澳大利亚)。该产品具有一些免疫刺激效果(请参见下文实施例)。
专利WO03/020944描述了多种从真菌纯化细胞外免疫刺激组合物的方法，通常这些方法中都包含沉淀步骤。
不过，尚未公开具有高的免疫刺激性活性的组合物。因此本发明的目的是提供新型组合物，优选来自具有高免疫调节活性的真菌的细胞外免疫刺激剂。
发明内容
本发明公开了含有具有显著免疫调节活性的多糖的组合物。有趣的是本发明公开了多糖组合物的特定单糖成分对于免疫调节活性非常重要。
因此本发明的一个目的是提供含有一种或多种多肽和多糖混合物的组合物，其中，组合物中的大部分多糖优选每个多糖的分子量至少为10000Da，且其中所述多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例为(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，优选比例为1∶0～25∶1～50，例如比例为∶1∶0～25∶1～50。
另一种实施方式是组合物含有一种或多种多肽和多糖混合物，其中a)组合物中大部分多糖的分子量至少为30000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)组合物中大部分多糖的分子量至少为100000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或c)组合物中大部分多糖的分子量至少为1000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
本发明的第二个目的是提供生产所述组合物的方法，所述方法包括下列步骤i)在液体生长培养基中培养真菌，ii)从所述液体生长培养基中纯化所述组合物。
本发明的第三个目的是提供用作药物的药物组合物，其中含有上述组合物以及药学上可接受的载体。
本发明进一步的目的是提供治疗个体的方法，所述方法包括给予所述个体有效量的本发明的组合物的步骤。
本发明的另外一个目的是提供本发明的组合物在制备用于治疗或者预防性治疗有此需要的个体的免疫受损性疾病的药物中的应用。
定义多糖本文中的“多糖”包括多糖，含有和/或共价地连接于肽、多肽或类似物质的多糖，例如蛋白多糖。
含有单糖的多糖多糖被称为含有单糖，其中所述的单糖共价地连接以形成多糖。多糖水解形成游离形式的形成所述多糖的单糖。多糖的单糖成分因而可以通过水解多糖和测定单独单糖的存在来确定。多糖混合物中的单糖成分通过检测全部多糖混合物中的单糖成分而确定。
比例多糖或多糖混合物被称为含有具有指定比例的半乳糖、甘露糖和葡萄糖，指的是当水解所述多糖或多糖混合物时会产生指定比例的半乳糖、甘露糖和葡萄糖。半乳糖、甘露糖和葡萄糖的比例为1∶a～b∶c～d的含义是对于每份半乳糖，含甘露糖在a～b份的范围，含葡萄糖在c～d份的范围，因此a，b，c和d代表数量值。因此，例如，多糖混合物含有半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50指的是对于每份半乳糖，该多糖混合物含5～25份范围的甘露糖，和1～50份范围的葡萄糖。
分子量组合物中每种多糖被称为具有至少一种指定数值的分子量。当上述组合物通过过滤方式进行纯化时，最终指定数值的分子量被截留。类似的，组合物中每个多糖被称为具有在指定范围内的分子量，当所述组合物经过一步或多步过滤纯化步骤时，最终截留低值范围的低分子量物质和高值范围的高分子量物质。上述过滤步骤可以例如是超滤、和同孔过滤、超速离心或凝胶过滤方式。但是，对于其中每个多糖都有最低指定分子量或每个多糖都被称为具有指定分子量范围的组合物，也可以通过其它方式制备。
多肽此处所用的术语“多肽”包括蛋白质、肽和多肽。其中，所述的蛋白质、肽或多肽可以也可以不经过转录后修饰。转录后修饰可以是例如磷酸化、甲基化或糖基化。
发明详述组合物本发明的组合物含有一种或多种多肽和多糖混合物。所述多肽可以任选地共价地与多糖连接。不过，所述的多肽或者不与所述多糖结合、或者以非共价键形式与所述多糖结合的情况也包括在本发明中。
因此，组合物含有可以是蛋白多糖、也可以不是蛋白多糖的多糖，或者该组合物可以含有二者的混合物。
本发明的组合物是分离或纯化的组合物，即它们经过一步或多步的纯化步骤。在优选的实施方式中，它们通过使用包括按大小分级的至少一个步骤从真菌菌丝体的液体生长培养基中纯化出来。下面详细介绍纯化方法。
在优选的实施方式中，该组合物基本上由多糖和任选的多肽组成，更优选该组合物基本上由多糖和多肽组成。经常地，该组合物为液体组合物，因此优选该组合物基本由多糖和溶解在任选的含有盐和缓冲液的水溶液中的任选的多肽组成。
本发明的组合物的多糖优选含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖。可以包括在本发明的组合物中的多糖和多肽的例子包括但不限于β-(1，3)，β-(1，6)D-葡聚糖，裂殖菌多糖(schizophyllan)，灰树花多糖(grifolan)，云芝多糖(coriolan)和杂色革盖菌糖基化多肽(Coriolus versicolor glycosylated polypeptides)(例如PSK和PSP)，与α-甘露聚糖结合的多肽(例如KS-2)(其可以通过从香菇(Lentinus edodes)中分离得到)，和灵芝多糖(reishi)(其可以从灵芝(Ganoderma lucidum)中分离得到)，葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖；甘露-葡聚糖；葡甘露聚糖；半乳糖葡聚糖和/或半乳糖葡萄糖甘露聚糖。
真菌在一种优选实施方式中，本发明的组合物是通过真菌生成的。优选地，组合物从真菌细胞外环境纯化得到。更优选的是真菌，最好是真菌菌丝体，培养在液体生长培养基中，然后从液体培养基中纯化得到上述组合物。
因此优选通过下述方法制备本发明的组合物，所述方法包括以下步骤i) 在液体生长培养基中培养真菌，例如真菌菌丝体，和
ii)从所述液体生长培养基中分离组合物。
真菌菌丝体可以是任何真菌生物质，其能在深层培养中生长。该真菌生物质可以是单个菌丝、孢子、菌丝体的集合、以及部分分化的菌丝体的形式。
液体生长培养基可以是任何以下描述的液体生长培养基。
真菌可以是任何真菌，优选形成真菌菌丝的、更优选丝状真菌、更加优选的是选自下述的真菌双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，冬虫夏草(Cordiceps sinensis)，金针菇(Flammulina velutipes)，灵芝(Ganoderma lucidum)，多叶奇果菌(Grifola frondosa)，香菇(Lentinus edodes)，糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)，裂褶菌(Schizophyllum commune)，核盘菌(Sclerotina sclerotium)，白腐担子菌(Trametes(Coriolus)versicolor，采绒革盖菌)，银耳(Tremella fuciformis)，姬松茸(Agaricus blazei)，茶树菇(Agrocybe aegerita)，柱状田头菇(Agrocybe cylindracea)，地花菌(Albatrellus confluens)，蜜环菌(Armillariella mellea)，木耳(Auricularia auricular-judae)，毛木耳(Auriculariapolytricha)，Collybia maracula，蛹虫草(Cordiceps militari)，Dendropolyporus umbellatus，木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)，松生层孔菌(Fomes pinicola)，平盖灵芝(Ganoderma applanatum)，铁杉灵芝(Ganoderma tsμgae)，猴头(Hericium erinaceus)，玉蕈(Hypsizygus marmoreus)，桦褐纤孔菌(Inonotus obliquus)，硫色绚孔菌(Laetiporus sulphurous)，桦革裥菌(Lenzites betulinus)，大白桩菇(Leucopaxilllus giganteus)，灰离褶伞(Lyophyllumcinerascens)，外溶亚脐菇(Omphaina epichysium)，霉状小奥德蘑(Oudemansiella mucida)，晚生扇菇(Panellus serotinus)，桦滴孔菌(Piptoporus betulinus)，裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)，松木层孔菌(Phellinus pini)，光帽鳞伞(Pholiota nameko)，金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus)，肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)，Sarcedon asparatus，香栓菌(Trametes suavolens)，草菇(Volvariella volvacea)和茯苓(Wolfiporia cocos)。
然而更优选的，真菌是从以下品种选出的双孢蘑菇，冬虫夏草，金针菇，灵芝，多叶奇果菌，香菇，糙皮侧耳，裂褶菌，核盘菌，白腐担子菌(采绒革盖菌)和银耳。在其它优选的实施方式中，所述真菌是姬松茸(Agaricus blazei)；在其它优选的实施方式中，所述真菌属于灵芝属，例如灵芝；在其它优选的实施方式中，所述真菌是伞状真菌，例如选自A.blazei，A.blazei Murill，A.bisporus，A.hortensis，A.campestris。
在非常优选的本发明的实施例中，所述真菌属于担子菌类，例如香菇属真菌，如香菇。
在比利时微生物保藏协调中心(BCCM)保藏的香菇IHEM 18992(14Rue J.Wytsman，B-1050 Bruxelles，比利时)提供了一种香菇的优选菌株，其它可用的香菇可以从下列机构获得，例如ATCC(AmericanType Culture Collection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)，CBC(Centraalbureau voor Schimmelcultures，PO Box 85167，3508 AD Utrecht，THE NETHERLANDS)和DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig GERMANY)。
另外有关的香菇属物种，除香菇(Lentinus edodes)外，香菇种类还包括Lentinus albovelutinus G.Stev.(1964)＝Rhodocybealbovelutina(G.Stev.)E.Horak(1971)；Lentinus anthocepha lus(Lév.)Pegler；Lentinus badius Bres.；Lentinus castoreus Fr.(1838)＝北方小香菇(Lentinellus ursinus)(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus chrysopeplus Berk.&M.A.Curtis(1869)＝Cyptotramaasprata(Berk.)Redhead & Ginns(1980)；Lentinus cochleatus Fr.；Lentinus concinnus Pat；Lentinus delicatus G.Stev.(1964)＝Marasmius delicatus(G.Stev.)E.Horak(1971)；Lentinusfasciatus Berk.；Lentinus hepatotrichus Berk.(1859)＝北方小香菇(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus hyracinus Kalchbr.(1880)＝北方小香菇(Fr.)Kühner(1926)；洁丽香菇(Lentinuslepideus)sensu Colenso(1891)；洁丽香菇(Fr.)Fr.(1825)＝Lentinus suffrutescens (Brot.)Fr.(1825)；Lentinusnovaezelandiae Berk.(1855)＝Lentinellus ursinus(Fr.)Kühner(1926)；Lentinus pulvinulus Berk.(1859)＝Lentinelluspulvinulus(Berk.)Pegler(1965)；Lentinus punctaticeps Berk.& Broome(1883)；Lentinus punctaticeps cf.sensu Petersen，Nicholl & Hμghes(1997)；Lentinus pygmaeus Colenso(1887)＝Lentinus zelandicus Sacc.& Cub.(1887)；Lentinus sajor-caju(Fr.)Fr.；Lentinus squarrulosus Mont.；Lentinus strigosus(Schwein.)Fr.(1825)；Lentinus suffrutescens(Brot.)Fr.(1825)；and Lentinus tuber-regium Fr.；Lentinus zelandicus Sacc.& Cub.(1887)(参考http://nzfungi. landcareresearch.co.nz).
免疫系统的调节本发明的组合物优选用于免疫调节，优选该组合物用于刺激免疫。例如通过增加抗体的产生或者通过辅助T细胞的激活，或通过白细胞介素如白细胞介素1和白细胞介素2的产量表现对免疫系统的刺激。
本领域技术人员知道的任何适用于检测组合物是否具有免疫调节性的测试都可以用于检测本发明中的组合物是否具有免疫调节性。这些测试可以是体内或体外测试。
一种优选的测试是检测该组合物是否能诱导IL-1的产生，如IL1-α和/或IL1-β的产生。因此，在本发明的优选的实施方式中，本发明的组合物能够通过体外试验从至少-种IL-1产生细胞诱导产生IL-1。该细胞可以是任何IL-1产生细胞，例如P388小鼠巨噬细胞，优选的所述的细胞是IL-1β产生细胞。IL-1的产量可以采用任何适当的方法检测。通常使用特定的IL-1抗体，如特定的IL1-α和/或IL1-β抗体都适用。这些检测可以是例如Western印迹，ELISA或其它类似的检测，检测可以通过实施例4所述的步骤进行。
因为难以校准白介素1的检测，检测时最好使用一个特定具体的组合物作参考。因此在本发明的优选的实施方式中，所述组合物能够诱导产生的IL1-α应该比用市售香菇注射剂(Eureka Bio-ChemicalsPty，Little Collins Street.Melbourne 3000，澳大利亚)在平行条件下进行的参考试验诱导的IL1-α的量多至少1.5倍，优选是至少2倍，例如至少4倍，例如至少6倍，例如至少8倍，例如至少10倍，例如至少15倍，例如至少20倍，例如至少30倍，例如至少40倍。在本发明的优选的实施方式中，该组合物能够诱导产生的IL1-β应该比用市售香菇注射剂(Eureka Biochemicals Pty)在平行条件下进行的参考试验诱导的IL1-β的量多至少1.5倍，优选至少2倍，例如至少4倍，例如至少6倍，例如至少8倍，例如至少10倍，例如至少15倍，例如至少20倍。优选地，上述试验按照实施例4所述的进行，最优选的是所述组合物如以上所述的诱导IL1-α和IL1-β二者的产生。
在本发明的另外的实施方式中，当给予所述哺乳动物时，所述组合物能够提高在哺乳动物中的抗体产生。哺乳动物可以是例如小鼠，大鼠，兔子甚至人。优选这样的检测通过在给予抗原(或者在佐剂的存在下)之前或同时向哺乳动物给予该组合物来进行。优选地，在给予抗原之前的1～30天范围，优选1～10天的范围，更优选1～3天的范围给予组合物。随后可以确定抗体在哺乳动物内的产生。与没有给予该组合物所诱导产生的抗体量相比，该组合物优选能够诱导产生至少1.5倍，更优选至少2倍，甚至更优选至少是2.5倍，例如3倍，例如至少4倍，例如6倍多的抗体。这样的试验的例子请参见实施例6。
优选该组合物在1个以上的检测系统中具有免疫调节性，例如上述任何检测系统的组合。
在优选的实施方式中，本发明的组合物的作用能提高TNF-α的产生，这可以通过实施例9所述的试验进行测定。
单糖成分本发明的组合物优选包括多糖，其中大部分的多糖，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选80％，当然更优选至少90％，甚至更优选95％，当然更优选基本上所有的多糖，最优选每个多糖的分子量大于10000Da，优选大于30000Da，更优选大于40000Da，甚至更优选大于50000Da，例如至少100000Da，例如至少300000Da，例如至少1000000Da。在本发明的一个具体实施方式
中，组合物的大部分的多糖，优选每个多糖的分子量在10000～3000000Da之间，例如30000～3000000之间，例如40000～3000000之间，例如50000～3000000之间，例如50000～100000之间，例如100000～300000的范围，例如300000～1000000的范围，例如1000000～3000000的范围。
优选地，该组合物通过涉及至少一个按大小分级的步骤进行纯化。因此优选，该组合物是经过至少一次分离步骤纯化的，其中，一些分子量高于截留(cut off)分子量的多糖与那些分子量低于截留分子量的多糖得到分离。例如，如果用超滤法或微孔过滤法进行分离，应使用与截留分子量相同的过滤膜；如果用凝胶过滤法，应使用与截留分子量相同的凝胶或使用某特定洗脱部分。在本发明的实施方式中，使用大分子量的级分，其中，截留分子量优选为10000Da，更优选是30000Da，甚至更优选是40000Da，当然更优选是50000Da。
在本发明的其他的实施方式中，组合物已经通过含有一个或多个大小分级的步骤纯化后，其中最终得到的级分含有分子量高于截留分子量的多糖和分子量低于截留分子量的多糖。例如，如果大小级分是通过超滤或微孔过滤，第一个级分步骤可以使用具有较低截留分子量的滤膜进行，可以收集大分子量片段并使之进行用具有较高的截留分子量的滤膜进行超滤或微孔过滤。在第二次分级步骤后，可以收集具有较低分子量的级分。如果用凝胶过滤，可以使用特定的洗脱级分；如果用超速离心法，可以使用具有较低截留分子量的滤膜和具有较高截留分子量的滤膜。
本发明的组合物含有多糖混合物，其中，所述的混合物含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例为1∶5～25∶1～50。这个比例反映了在全部多糖混合物中的比例。因此，在混合物中的每个多糖中含有不同比例的单糖是可行的。
通常，比例测定是通过将全部多糖混合物降解成单糖，然后确定每种所述单糖的浓度而确定的。多糖可以通过水解，例如强酸水解，比如用HCl降解成它们的组成单糖，本领域人员可以利用能采用的常规方法分析水解产物，例如HPLC，质谱法或NMR。
在本发明的一个实施方式中，多糖含有单糖葡萄糖和甘露糖。在另外的实施方式中，本发明的多糖含有单糖葡萄糖和半乳糖。在本发明优选的实施方式中，组合物的多糖含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖。
优选的多糖组合物中含有在5～25范围内，优选在5～20范围，更优选在5～17范围，甚至更优选在6～15范围，当然更优选在7～14，例如10～17的范围，例如11～16的范围，诸如12～15的范围，例如13～14的范围，诸如大约13.4+/-0.4，例如13.4+/-0.4份甘露糖，对应于每份葡萄糖。
优选的多糖组合物中含有在1～50范围，优选在1～40范围，更优选在1～30范围，甚至更优选在1～25范围，当然更优选在1～20范围，甚至更优选在2～15，当然更优选在2～14，例如8～17的范围，例如9～16的范围，例如10～15的范围，例如在11～14的范围，例如大约12.6+/-1.3，例如12.6+/-1.3份的葡萄糖，对应于每份半乳糖。
在更优选的多糖混合物中，含有的甘露糖和葡萄糖的比例如上所述，含有葡萄糖和半乳糖的比例如上所述。
在本发明的具体实施方式
中，其中多糖包含甘露糖和葡萄糖，并且含有它们的范围优选为0.1～30，例如在0.1～0.25的范围，例如在0.25～0.5的范围，例如在0.5～0.75的范围，例如在0.75～1的范围，诸如1～5的范围，例如5～10的范围，10～20的范围，例如20～30范围份的葡萄糖，对应于每份甘露糖。优选地，多糖含有0.5～2份葡萄糖，对应于每份甘露糖，更优选地，13.4+/-0.4份甘露糖，对应于12.6+/--1.3份葡萄糖。
本发明非常优选的组合物包含的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50，更优选1∶13.4+/-0.4∶12.6+/-1.3。
本发明其它的实施方式中，该组合物含有多糖混合物，其中在所述混合物中的该多糖的分子量在50000～100000范围，含有3～15份，优选地在4～14的范围，更优选地在5～13的范围，甚至更优选地在6～12的范围，当然更优选地在7～11的范围，甚至更优选地在7.9～9.9的范围，例如大约8.9份甘露糖，对应于每份半乳糖在该实施方式中，优选多糖的分子量在50000～100000的范围，含有1～5份范围，优选地在2～4的范围，更优选地在2.5～3.5的范围，例如大约2.9份葡萄糖，对应于每份半乳糖。更优选地，所述组合物的多糖分子量范围在50000～100000Da，含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖的比例在1∶4～14∶1～5，优选地比例大约为1∶8.9∶2.9。
本发明另外的实施方式中，组合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量范围在100000～300000，含有3～15份，优选地3～14的范围，更优选地3～13的范围，甚至更优选地3～12的范围，当然更优选地4～11的范围，甚至更优选地5～10的范围，当然更优选地在6.3～8.3的范围，例如大约7.3份甘露糖，对应于每份半乳糖。在该实施方式中，多糖的分子量优选100000～300000，含有1～5份范围，优选地2～4的范围，甚至更优选地2.5～3.5的范围，例如大约2.9份葡萄糖，对应于每份半乳糖。更优选地，所述组合物的多糖的分子量范围在50000～100000Da，含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例在1∶3～13∶1～5，优选比例是大约1∶7.3∶2.9。
本发明另外的实施方式中，组合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量范围在300000～1000000，含有3～16份范围，优选地5～15的范围，更优选地5～14的范围，甚至更优选地6～13的范围，当然更优选的7～12的范围，甚至更优选地8.9～10.9的范围，例如大约9.9份甘露糖，对应于每份半乳糖。在该实施方式中，优选多糖的分子量在300000～1000000的范围，其中含有1～5份，优选地2～4的范围，甚至更优选地2.5～3.5的范围，例如大约3.1份葡萄糖，对应于每份半乳糖。优选地，所述组合物的多糖的分子量范围在300000～1000000Da，含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例在1∶5～15∶1～5，优选地比例大约是1∶9.9∶3.1。
在本发明另外的实施方式中，组合物含有多糖混合物，其中所述混合物中的多糖的分子量至少1000000，含有3～17份范围，优选地4～16的范围，更优选地5～15的范围，甚至更优选地6～14的范围，当然更优选地7～13的范围，甚至更优选地8～12的范围，甚至9.3～11.3份，例如大约10.3份甘露糖，对应于每份半乳糖。在该实施方式中，多糖的分子量优选分子量至少1000000，其中含有1～5份，优选的2～4份，更优选的2.5～3.5份，例如大约2.9份葡萄糖，对应于每份半乳糖。优选地，所述组合物中的多糖的分子量至少在1000000Da，含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例是1∶4～1∶5～15∶1～5，优选比例大约是1∶10.3∶2.9。
在一个实施方式中，本发明含有摩尔比为半乳糖甘露糖葡萄糖为1∶10～20∶30～50，例如1∶12～18∶35～45，例如1∶14～16∶38～42，例如1约15∶约40，如1∶15∶40。
因而，在一个组合物的实施方式中，多肽含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，它们的比例(半乳糖甘露糖葡萄糖)为1∶0～25∶1～50，例如1∶10～20∶30～50，例如1∶12～18∶35～45，例如1∶14～16∶38～42，例如1∶约15∶约40，例如1∶15∶40。
在另外一个实施方式中，本发明的多糖含有摩尔比为半乳糖甘露糖葡萄糖为1∶0.5～5∶6～12，例如1∶1～4∶7～11，例如1∶1.5～3.5∶7.5～10，例如1∶2.0～3.0∶7.5～9.5，例如1∶2.2～2.8∶8.0～9.0，例如1∶约2.5∶8.0～9.0，例如1∶2.5∶8.0～9.0，例如1∶2.5∶8.6。
本发明两个优选的组合物的实施方式中，含有乳糖甘露糖葡萄糖的摩尔比为1∶12∶40和1∶3∶5。
在本发明的一个优选的实施方式中，糖组合物获自姬松茸(Ganoderma)，并且含有10～20份甘露糖，30～50份葡萄糖和0～2份半乳糖，例如11～17份甘露糖，35～45份葡萄糖和0～1份半乳糖。更优选地，糖组合物获自姬松茸，并且含有约15份甘露糖，约40份葡萄糖和约1份半乳糖，这里的“约”指与所述的数值相差在20％之内，例如与所述的数值相差在10％之内，例如与所述的数值相差在5％之内。
在本发明另外的优选的实施方式中，糖组合物获自灵芝，并且含有0.5～5份甘露糖，4～15份葡萄糖和0～2份半乳糖，例如2～3份甘露糖，7～9.5份葡萄糖和0.5～1.5份半乳糖。更优选地，该糖组合物获自灵芝，含有约2.5份甘露糖，约8.6份葡萄糖和约1份半乳糖，这里的“约”指与所述的数值相差在20％之内，例如与所述的数值相差在10％之内，例如与所述的数值相差在5％之内。
具有指定范围内的分子量的多糖的单糖成分含量的确定可以通过对于组合物的分子大小的分级，例如通过超滤、微孔过滤、超速离心或凝胶过滤来确定，例如，这可以如实施例2中所述的进行。
优选多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖、葡萄糖，比例为(0～1.5)∶(0～0.5)～(15～35)∶(0.5～1.5)～(45～55)，例如下面所述的任何一个(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)，
(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0-1.5)∶(0-0.1)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0.8-1.2)∶(0-0.1)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(45-55)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(48-52)，(0-1.5)∶(0-0.5)～(15-35)∶(0.5-1.5)～(49-51)，(0.8-1.2)∶(0-0.5)～(20-30)∶(0.5-1.5)～(49-51)。
在本发明另外一种实施方式中，本发明的组合物的糖组合物含有1-25份甘露糖，5-45份葡萄糖和0-1.5份半乳糖，(这里的“份”指相对摩尔比，即每1-25摩尔甘露糖，有5-45摩尔的葡萄糖和0-1.5摩尔的半乳糖)，进而糖组合物可含有A)，B)和C)，如下A)从如下组中选出的1个数量的甘露糖1-25份1-20份1-15份1-10份1-4份1-3份1.5-2.5份4-6份7-15份7-23份9-19份12-20份10-25份12-17份
14-16份和B)从如下组中选出1个数量的葡萄糖5-45份5-13份7-13份7-15份8-15份8-12份8-10份8-9份8.4-8.7份8.6份10-20份20-30份30-40份30-45份35-45份35-42份37-45份39-41份40份以及C)从如下组中选出1个数量的半乳糖0-1.5份0.2-1.2份0.7-1.5份
0-0.2份0-1份0份1份1-1.5份。
具体实施例方式
在本发明一个实施方式中，提供了下述组合物其含有一种或多种多肽和一种多糖混合物，其中a)组合物的大部分多糖的分子量至少是30000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)组合物的大部分多糖的分子量至少是100000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或c)组合物的大部分多糖的分子量至少是1000Da，并且，其中所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
因此，在本发明的一个实施方式中，组合物的大部分多糖的分子量至少为10000Da，优选至少30000Da，并且所述的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例为1∶0～25∶1～50，也可以为如下比例中的任何一个1∶0～15∶1～251∶15～25∶1～251∶0～25∶25～501∶15～25∶25～501∶0～7∶1～501∶0～7∶1～251∶7～15∶1～50
1∶7～15∶40～501∶0～25∶1～401∶0～25∶25～401∶0～10∶1～50。
本发明的另一个实施方式中，组合物的大部分多糖的分子量至少是1000Da，例如至少5000Da，例如至少10000Da，例如至少20000Da，例如至少40000Da，例如至少50000Da，例如至少60000Da，75000Da，例如至少85000Da，最优选的是至少100000Da；并且这里所说的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50，或如下比例中的任何一个0～0.5∶0.5～7∶0.5～500～0.5∶0.5～4∶0.5～500～0.5∶0.5～2∶0.5～500～0.5∶3～10∶0.5～500～0.5∶5～10∶0.5～500～0.5∶3～7∶0.5～500～0.1∶0.5～7∶0.5～500～0.1∶0.5～4∶0.5～500～0.1∶0.5～2∶0.5～500～0.1∶3～10∶0.5～500～0.1∶5～10∶0.5～500～0.1∶3～7∶0.5～500～0.5∶0.5～7∶0.5～250～0.5∶0.5～4∶0.5～120～0.5∶0.5～2∶10～500～0.5∶3～10∶0.5～50～0.5∶5～10∶15～400～0.5∶3～7∶25～500～0.1∶0.5～7∶45～50
0～0.1∶0.5～4∶40～500～0.1∶0.5～2∶35～500～0.1∶3～10∶20～300～0.1∶5～10∶15～450～0.1∶3～7∶25～300～0.1∶0.5～1.5∶15～200～0.1∶0.5～1.5∶0.5～1.5优选地，所述比例是大约0∶1∶18或大约0∶1∶1。
在另外的本发明的实施方式中，组合物的大部分多糖的分子量至少是500Da，例如至少800Da，例如至少1000Da，例如至少5000Da，例如至少10000Da，例如至少20000Da，例如至少40000Da，例如至少50000Da，例如是至少60000Da 75000Da；例如至少85000Da，例如至少100000Da，最优选是至少1000Da，并且这里所说的多糖混合物含有单糖半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或如下的比例中的任何一个1∶0～25∶1～501∶0～20∶1～501∶0～15∶1～501∶0～10∶1～501∶0～5∶1～501∶10～25∶1～501∶10～15∶1～501∶15～25∶1～501∶17～25∶1～501∶10～18∶1～501∶0～25∶1～451∶0～25∶1～401∶0～25∶1～35
1∶0～25∶1～301∶0～25∶1～201∶0～25∶1～151∶0～25∶1～51∶0～25∶10～201∶0～25∶10～301∶0～25∶10～401∶0～25∶20～501∶0～25∶20～301∶0～25∶20～401∶0～25∶30～501∶0～25∶30～401∶0～25∶30～351∶0～25∶35～401∶0～25∶1～451∶0～20∶1～401∶0～15∶1～351∶0～10∶1～301∶0～5∶1～201∶10～25∶1～151∶10～15∶10～501∶15～25∶10～401∶17～25∶1～501∶10～18∶1～501∶8～15∶30～501∶11～13∶35～451∶11～13∶38～421∶1～5∶3～91∶2～4∶4～6
优选，所述比率是大约1∶12∶40或大约1∶3∶5。
多肽本发明的组合物中优选含有多肽。此处术语多肽包括蛋白质、肽和多肽。所述的多肽可以以游离形式存在，也可以共价地与多糖连接，或者它们可以非共价地与多糖或者前的混合物结合。
优选地，所述组合物含有足够的多肽使得可以口服给予该组合物。如果该组合物含有过少的多肽，当该组合物口服给予所述个体后，在个体中得不到或产生很低的免疫调节性。因此优选本发明的组合物含有至少10μg/L，更优选至少20μg/L，甚至更优选25μg/L。例如含量在10～1000μg/L的范围，如20～1000μg/L的范围，如25～1000μg/L的范围，如25～100μg/L的范围，如25～35μg/L的范围，优选可溶性多肽。优选含有上述浓度的多肽的组合物，包含范围在0.1～2，更优选在0.5～1.5范围，甚至更优选大约1mg/ml的多糖。如果该组合物含有多糖的含量有多有少，优选地成比例的降低或增加多肽的含量。
制备组合物的方法优选地，本发明的组合物的制备方法包括以下步骤i)在液体生长培养基中培养真菌，ii)从所述液体培养基中纯化所述组合物。
培养真菌的液体生长培养基中通常包括所述真菌在水中生长所需的溶解的营养成分，将溶液转移到生物反应器中，并在生物反应器中接种想要培养的真菌细胞或孢子，例如菌丝体或其片段(fraction)等。这些是在无菌环境中并且具有环境控制下进行的，以此为真菌提供适合的物理化学环境。在液体生长培养基中培养真菌也称为“液态”培养。
在“液态”培养中，具有真菌生物质的培养基优选进行搅拌以减少梯度的出现和确保浸没的细胞获得氧气。当菌体在生物反应器中生长时，为液体培养基提供氧气，用已知的方法控制提供的溶氧水平。
液体生长培养基是一种水溶液，优选是含有营养组合物的无菌水。该液体培养基支持真菌生长，并且优选能够刺激细胞外组合物的产生，例如免疫调节物。液体生长培养基中可以含有一种或多种微生物生物体生长所需要的典型成分，如麦芽提取物，酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、蔗糖、盐类提供磷酸盐、镁、钾、玉米浆、维生素如硫胺素。更优选地，含有用于菌丝体生长，产生多糖的含有蔗糖，玉米浆，磷、镁的培养基。
对于生长培养基的接种来说，可以用菌丝体，如从含有麦芽提取物，酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖的琼脂板上得到的香菇菌丝体。真菌最初可以在含有上述营养物质的琼脂板上培养，以支持该真菌的生长。用菌丝体接种平板，然后温育，到在平板上至少有肉眼可见的菌体。根据菌体不同，该温育通常可以进行大约7天～大约24天，或大约10天～大约30天，通常是14天或者高达20天。温度范围在18～32℃，优选是22℃～30℃之间，如约23℃～27℃，如在25℃左右等。
作为从琼脂板接种菌丝体的替代方式，生长培养基的接种可以用发酵液中的菌丝体，如含有支持细胞生长营养物质的摇瓶培养基。培养菌丝体的摇瓶培养基最初可以用在琼脂板培养的菌丝体接种。将菌丝体从琼脂板上取得，在无菌状态下转移到摇瓶中，摇瓶中含有支持真菌菌丝体生长的营养物质和营养盐的无菌水。典型的生长培养基含有蔗糖，玉米浆，磷和镁。能够提供最多的细胞外香菇多糖的产生的接种材料的量可以从下述初步试验中选出。
摇瓶温育时间根据菌种不同而不同，通常摇瓶可以通过摇动6～21天，优选7～18天，更优选8～14天；于温度在18～32℃的范围，优选22～30℃之间，如大约23℃，如24℃，如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃进行温育。摇瓶也有可以是8～25天，更优选10～20天，更优选12～18天进行温育。温度可以是18～37℃，优选23～32℃，如大约25℃。
摇瓶中的物质可以用于一个生物反应器的接种，在这种情况下，反应器含有营养混合物无菌溶液和在水中的营养盐，以单一培养担子菌丝体，或其片段，例如香菇菌丝体，如香菇。
通常生物反应器发酵周期在50小时～300小时的范围，优选是在80～270小时的范围，温度控制在连续的18～32℃的范围，优选在22～31℃的范围，例如大约23℃，例如24℃，例如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃。温度也可以在18～37℃，优选23～32℃，如大约25℃。
反应器上有一个小口为发酵液提供空气，并且发酵液最好保持连续搅拌状态或者是最终以加入空气作为结果的状态，可以通过向反应器中加入空气进行，或者通过使用适于提供反应器的内容物很好地混合的混合装置。
优选地，在用真菌菌丝体或其片段(如香菇菌丝体)接种前，调节生长培养基的pH值在大约3～大约7，例如，pH值在大约4.5～大约6.5，如在大约6。初次调节后，pH值可能随发酵的过程而降低，可以用其它合适的pH值调控剂(如酸和碱等)将培养基pH值调节在3～7的范围内的特定的值。生长培养基的温度优选在18～32℃的范围，优选在22～31℃的范围，如大约23℃，如24℃，如25℃，如26℃，如27℃，如28℃，如29℃，如30℃。温度可以在18～37℃，如优选23～32℃，如大约25℃。
可以从生物反应器中获得样品并且分析生物质、代谢产物、营养物质，分析结果可以在发酵过程中辅助生物反应器的操作者。典型的分析通常是进行生物质、残余糖浓度和细胞外多糖浓度的确定。针对这方面，可以使用本领域的技术人员知道的用于分析的方法。
优选地，制备本发明的组合物的方法包括从真菌菌丝体中纯化液体生长培养基中的细胞外部分。该液体发酵培养基的细胞外部分(extracellar fraction)也称为上清液，并且该部分可以通过离心或过滤从真菌菌丝体中分离出来，或能够获得基本上无任何菌丝体存在于其中的液体级分的任何其它方法。术语“基本上没有任何菌丝体”表明包括真菌菌丝体片段的菌丝体的浓度减少到至少103，如减少到104，如至少105，如减少到至少106。
在本发明优选的实施方式中，纯化包括至少一个按大小级分进行分离的步骤。优选地，该按大小级分进行分离的步骤是对细胞外级分进行的。该按大小级分进行分离的步骤可以确保每个组合物的多糖具有既定的数值(参见上文)。该按大小级分进行分离的步骤可以是任何本领域技术人员所知道的任何大小级分分离法。例如超速离心法、超滤法、微孔过滤法或凝胶过滤法。因此，在本发明优选的实施方式中，通过涉及下述一种或者多种纯化步骤的方法从液体生长培养基中纯化该组合物，所述的一种或者多种纯化步骤选自超速离心法、超滤法、微孔过滤法和凝胶过滤。优选地，该纯化步骤选自超滤法、微孔过滤法和/或超速离心法，甚至更优选超滤法和微孔过滤法。
超滤是一种膜过程，过滤膜根据液体中成分的大小进行分离。过滤膜结构通常是交互流通的，从而使得含有相关物质的液体能够流过其中。有些液体含有的物质比过滤膜的孔尺寸小则可以透过，大于过滤膜孔尺寸的分子则被截留，一般期望的物质在截留物中或在滤液中。如果为制备组合物进行超滤，在所述的组合物中的每个多糖具有高于既定值的分子量，期望的产物在截留物中。如果制备系列级分，该产物可以在截留物或者滤液中。微孔过滤是一个膜过程，类似于超滤，不过具有更大的膜的孔尺寸，可以允许更大的粒子通过。
凝胶过滤是一种色谱分析技术，该技术中，根据大小进行颗粒分离。过滤介质通常是小凝胶珠，该凝胶珠保留可以通过凝胶珠孔径的分子。较大的则被通过凝胶柱而不被凝胶珠保留。
凝胶过滤、超滤或微孔过滤可参考R Hatti-Kaul和B Mattiasson(2001)((2001)，Downstream Processing in Biotechnology，in BasicBiotechnology，eds C Ratledge and B Kristiansen，CambridgeUniversity Press)pp 189所述内容进行。
实施例1，7和8描述了制备本发明组合物的非限制性方法。
已经描述过对从液体生长培养基中纯化细胞外物质需要乙醇沉淀过程。然而，乙醇沉淀作用将降低免疫调节效果，因此在纯化过程中运用乙醇沉淀获得的组合物不是最优选的。在本发明的一种实施方式中，不包括乙醇沉淀的步骤，更优选的所述方法不涉及沉淀步骤。
药物组合物及其使用在本发明的一个实施方式中，提供了将本发明的组合物在需要这样的刺激的个体中刺激免疫系统的方法。该组合物可以通过例如对个体进行口服或皮下注射有效量的组合物来刺激其免疫系统。对免疫系统的刺激可以表现为例如抗体产量的增加、辅助T细胞的活化、或白细胞介素(如白细胞介素1和白细胞介素2)的量的增加。
本发明的另一个实施方式是本发明的组合物在制备用于治疗需要这样的治疗的个体的免疫受损疾病的药物中的用途。个体的免疫受损疾病可以表现为免疫系统因子，例如抗体数量不足，或抗体产生降低，表现为辅助T细胞数量不足，个体B细胞的产生降低，自然杀伤细胞(NK)数量不足，或个体NK细胞的产生降低，或个体中白介素(如白细胞介素1和白细胞介素2)的数量不足，或者白介素(如白细胞介素1和白细胞介素2)的产生降低。免疫受损疾病可以是下述中的任何一种。治疗可以是预防，缓解或治愈病症。
此处所述的“数量不足”和“产生降低”表现为通常是指医学专家认为这些数量和产生低于正常的健康个体的预定水平或数值。数量和/或产量通常与以下因素有关年龄、常规身体状况等。由于这个原因，医学专家会根据个体基础情况确定不同预定水平或数值。通常个体免疫受损疾病的表现是通过一段时间，如几天、几周、几个月或几年的测量，抗体数量逐渐出现降低，CD4(阳性)细胞的数量逐渐降低，或每单位(血液)样品中的辅助T细胞数量逐渐降低。
本发明的一方面涉及含有本发明的组合物和药学上可接受的载体的药物组合物，本药物组合物可通过常规技术制备，如在RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy 1995，edited by E.W.Martin，Mack Publishing Company，19thedition Easton，Pa)所述的。组合物可以做成常规形式，如胶囊，片剂，粉状，糖浆，溶液或混悬液。
本发明另一方面涉及对诊断出患有免疫受损疾病的个体进行治疗的方法，所述的方法方法包括对所述个体给予有效剂量的本发明组合物或本发明药物组合物以治疗所述的免疫受损疾病。
给予剂量可以是对上述免疫受损疾病进行预防性治疗的有效剂量。
还提供了对由手术恢复的个体和处于患有免疫受损疾病的风险中的个体的治疗方法，所述方法包括对所述个体给予能激发所述个体的免疫系统的有效量的本发明的组合物和本发明药物组合物。
另外还提供了对诊断出患有或处于患上获得性免疫缺陷综合症的个体的治疗方法，所述方法包括对所述个体给予对所述综合症为治疗有效剂量的或预防性治疗有效剂量的的本发明组合物和本发明药物组合物。
可能引发免疫受损疾病的病症有传染性疾病，寄生性疾病，嗜血杆菌脑膜炎，肺炎双球菌脑膜炎，链状球菌脑膜炎，葡萄球菌脑膜炎，其它生物体引起的脑膜炎，脑炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，其它细菌性肺炎，除了细菌以外的的特定的生物体引起的肺炎，支气管肺炎，不明确生物体引起的肺炎，流行性感冒，不明确性腹泻，不明确性肝炎，急性和亚急性肝脏坏死，慢性肝炎，以及肝脏脓肿。
另外，免疫受损疾病可以是由感染性或寄生性疾病引起的，或者来自霍乱病菌，沙门氏菌，志贺氏菌，大肠埃希氏菌，其它的特定的细菌导致的肠道感染，艰难梭菌，病毒性肠胃炎，传染性结肠炎，肠炎和肠胃炎，感染性腹泻，结核病，李氏杆菌病，巴斯德氏菌病，分支杆菌病，白喉，百日咳，脑膜炎球菌，链球菌败血病，葡萄球菌败血病，肺炎球菌败血病，厌氧菌引起的败血病，其它革兰氏阴性生物体引起的败血病，放线菌感染，气性坏疽，中毒性休克综合征，坏死性筋膜炎，弗里德兰杆菌，流感杆菌，假单胞菌，AIDS/HIV感染，急性脊髓灰质炎，克-雅氏病，亚急性全脑炎硬化，进行性多病灶白质脑病，未明确的中枢神经系统慢病毒感染，柯萨奇病毒，未明确的病毒性脑膜炎，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎，未明确的病毒性脑炎，水痘，带状疱疹，单纯性疱疹，甲型病毒性肝炎，乙型病毒性肝炎，其它明确的病毒性肝炎，慢性肝炎，肝脏脓肿或急性坏死，传染性单核细胞增多症，传染性单核细胞增多症，巨大细胞包涵体病，衣原体，腺病毒，病毒感染，梅毒，念珠菌，未明确的组织胞浆菌病，曲霉病，隐球菌病，霉菌病，类圆线虫病，肠道寄生虫感染，弓形体病，肉状瘤病，卡氏肺囊虫，后脊髓灰质炎症，嗜血杆菌脑膜炎，肺炎球菌脑膜炎，链球菌性脑膜炎，葡萄球菌脑膜炎，脑炎，腺病毒引起的肺炎，呼吸道合胞病毒引起的肺炎，副流感病毒引起的肺炎，其它病毒引起的肺炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，肺炎克雷白菌引起的肺炎，假单胞菌引起的肺炎，流感嗜血杆菌引起的肺炎，链球菌引起的肺炎，葡萄球菌引起的肺炎，和细菌性肺炎。
个体可以是哺乳动物，如人类。
本发明组合物可以使用任何适合给药的形式进行给药，不过通常，给药方式为口服或者非肠道给药；口服给药优选含有该组合物的浆液形式，和/或包含含有该组合物的浆液的胶囊，或该组合物的粉末形式。
所需要的剂量根据所使用的特定的组合物、给药途径和所治疗的特定个体的情况而不同。最理想地，要通过本方法进行治疗的个体将接受最大耐受剂量的药物学有效量的化合物。
通常每日口服剂量相对于全部体重，为大约0.001～大约100mg/kg，优选在0.01～50mg/kg的范围，更优选在0.1～10mg/kg的范围，甚至更优选在1～2mg/kg的范围。本领域的技术人员也会清楚，该组合物的个体剂量的最佳量将取决于想要治疗的疾病的性质和程度、给药的形式、途径和位点以及所治疗的特定患者。可以通过传统技术确定这些最佳方案。也可以由本领域的技术人员确定最佳治疗疗程，即本领域的技术人员使用传统治疗疗程确定测试来决定在确定的天数里的每日的组合物的剂量数。
本发明的组合物和药物组合物也可以是包含所述组合物和带有给药剂量和时间的指导的剂量使用说明书的试剂盒的一部分。
功能性食品在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物用于生产功能性食品，因此在本发明的一个实施方式中，任何此处所述的组合物可以包括在功能性食品和营养添加剂中，优选是适用于人类的。所述的功能性食品优选使生存率提高、延长生命、促进健康和/或是微生物数量的调节剂。更优选，所述功能食品促进健康和/或是微生物数量的调节剂。优选该功能性食品适合至少每周口服摄取，例如每日口服摄取。或者，所述功能食品可以适合非肠道性或者肠道性营养使用，优选含有其他本领域的技术人员知道的营养物质的制剂联合。
由本发明生产的产品可以用于促进人体健康，如用于维持、强化或促进骨骼和心血管健康。在本发明优选的实施方式中，功能性食品能够用于预防或者降低骨质疏松症，在另外优选的本发明的实施方式中，所述的功能性食品是常规消费品，例如，一天一次或一天两次或一天三次，可以导致患如感冒、咳嗽的风险降低，以及减少倦怠疲劳。
尽管给药或消费的方法不同，功能性食品优选作为他或者她每日饮食的成分为人类所摄取。任何在此描述的组合物可以与液体载体，例如，水，牛奶，植物油，果汁等；或可摄取的固体或半固体食物联合。例如，它们可以混合到其它食物，如奶昔，奶昔混合物，早餐饮料，果汁，风味饮料，风味饮料的混合物，酸奶，布丁，冰激凌，冰牛奶，糖粉，冻酸奶，奶酪蛋糕馅，块糖，包括″健康棒″比如麦片或水果棒，口香糖，硬糖，蛋黄酱，蛋糕馅，如水果馅或者奶油馅，谷物，面包，填料，敷料和即食土豆混合物。本发明因而涉及生产功能性食品组合物的方法，该方法包括将任何此处所述的组合物(如从香菇中获得)与食品材料混合。
例如，所说的功能性食品可以选自膳食替代品，食品添加剂、冰淇淋、酱油、敷料、涂抹剂、压块、糖果、点心、谷类、饮料。
在另外优选的实施方式中，所述的功能性食品是食品添加剂，优选适合于摄取的药丸，胶囊，片剂或液体形式。
在一个实施方式中，制备本发明的产品，进而将此处所述的任何组合物(例如，来自香菇)加入到食品产品中，进而使组合物在食品中达到每100克产品含5～5000毫克的组合物的水平。
乳制品在本发明优选的实施方式中，功能性食品是乳制品，进而，所述的功能性食品可以例如选自下述的任何一种形式培养的乳制品、酸奶、白软干酪、奶油奶酪、奶片，酸奶酪，奶昔，黄油，蛋黄酱，低脂涂抹剂、奶酪、松软干酪、乳酪涂抹剂、儿童奶酪条″strings″，奶酪片、酸奶、基于酸奶的碳酸饮料、可饮用酸奶、低脂酸奶、冷冻浇汁，酸奶油、冰淇淋、奶油、低脂奶油替代物、发酵乳如酸乳酒。
在本发明优选的一个实施方式中，所述的乳制品是基于奶酪的制品，如选自低脂乳酪、硬奶酪，软奶酪、干酪、乳酪涂抹剂、儿童奶酪″strings″或用于三明治的奶酪片。
在本发明另外的优选的实施方式中，所述的乳制品是基于酸奶的制品，如选自酸奶组合，软的或者可流动的酸奶，以酸奶为基础的碳酸饮料，饮用或者可饮用的酸奶，低脂酸奶。所述的以酸奶为基础的制品可以例如是用保加利亚乳杆菌发酵和/或嗜热链球菌发酵生产的。
在本发明的另外的优选的实施方式中，所述乳制品是培养的乳制品，如培养液(如可饮用的酸奶/酸奶思乐冰(yogurt/yogurtsmoothies)，酸乳酒、probiotic shots；非饮用型酸奶(例如在杯子或管中)；和/或另外的非流动性培养的乳制品(例如干酪、奶油乳酪、奶片或酸奶油)。
本发明另外的优选的实施方式中，所述的乳制品是其它类型的乳制品，如选自冷冻浇汁，酸牛奶，冰激凌，奶油，低脂奶油替代品，发酵牛奶如酸乳酒，发酵饮料，如可饮用酸奶和酸乳酒。
健康饮料在本发明另外的优选的实施方式中，本发明的功能性食品是健康饮料。所述健康饮料在一个实施方式中是基于果汁的，其可以浓缩为“squash”，可稀释成符合口味的。所述的果汁和浓缩汁优选含有浓缩果汁。优选的果汁包括但不限于柑橘汁如橙子，柚子，柠檬和酸柚，或它们的组合。在另外优选的实施方式中，所述的果汁或者浓缩汁包括(优选被浓缩的)浆果汁，如树莓、草莓、黑莓、罗甘莓，酸果蔓的果实，红浆果、黑浆果、蓝莓，或其组合，和/或与柑橘汁混合的果汁。在另外优选的实施方式中，所述的果汁或者浓缩汁包括来自凤梨、西番莲、芒果、苹果、梨、杏、石榴、番石榴、番茄和/或与任何其它类型的果汁的组合中的一种或者多种。优选果汁基于选自下述水果·苹果·杏·香蕉·黑莓·蓝莓·阳桃(杨桃)·樱桃·枣·无花果·什锦水果·葡萄·柚子·奇异果·柠檬·桔子·芒果·西瓜·油桃·橙子·番木瓜·桃子·梨
·菠萝·车前草·李子·树莓·草莓·橘子·西瓜或其组合进一步地，优选的果汁基于选自下述水果·苹果·胡萝卜·酸果蔓的果实·葡萄·柚子(粉红或白色)·柠檬·酸橙·橙子·菠萝·菠萝·李子·橘子·西红柿或其组合。
以上所说得健康饮品业可以是基于水的饮料，如基于矿泉水的产品，例如基于风味的矿泉水产品。所述的风味优选来自果汁和/或其它天然产品。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述的健康饮料是能量激发饮料，其中含有糖和其他的能量提供制品，例如含在25或30cl的瓶中。
在另外的本发明优选的实施方式中，所述的健康饮料是酒精饮料，例如基于乳品的酒精饮料。
在另外的本发明的优选的实施方式中，所述的健康饮料是膳食品替代性饮料。
这是可以想象到的，本发明的健康饮料也可以制成浓缩的或预混的，可以在下一阶段包装成饮料，由消费者自行决定。
固体功能性食品在本发明优选的实施方式中，功能性食品是固体功能性食品，例如选自下述的食品饼干，早餐麦片，汤，牛奶什锦早餐，口香糖，甜品(如煮沸的甜品)，新鲜烘培食品(新鲜面包，蛋糕，松饼，华夫饼等)，干烘培食品(薄脆饼干，小点心，饼干等)，谷物制品(早餐麦片，纤维和固醇丰富的面粉，牛奶什锦早餐，谷物与牛奶什锦早餐混合的食品块，这样的食品块可以含有巧克力块，意大利面食品，小吃等)，麸皮产品(颗粒和/或烘烤的麸皮产品，有特定口味的和/或涂有固醇类的麸产品和麸-麸混合产品等)。
在另外的本发明优选的实施方式中，所述的固体功能性食品是已经混合的(优选以粉的形式)，或者用于烘培(如面包，蛋糕，松饼，华夫，皮萨，烤薄饼)，或用于烹饪(如汤，调味料，甜点，布丁)，以用于制备或者生产食品。
在本发明另外的优选的实施方式中，所述的固体功能性食品是肉类产品(香肠，肉类球，冷盘等)。
在本发明另外的优选的实施方式中，所述的固体功能性食品是面包或者早餐/烘培点心，因此，所述的面包可以是白面包，黑面包或全麦面包。在本发明另外优选的实施方式中，所述的面包可以选自下属的面包类型麦芽面包，牛奶面包，麸皮强化面包和混合谷物面包。面包可以是任何形状，如圆形，十字花烤包，小屋形状，仙人掌形状，灯笼状，桶状，成批状，三明治状，罐状，维也纳面包或者农舍状。在本发明的一个优选的实施方式中，所述的面包可以选自任何下述的面包类型全麦面包，黑面包，小麦面包(面包中加工小麦的含量不少于10％)。
柔软谷物面包(由面粉制备，但与传统的白面包相比，添加了软化的黑麦颗粒和小麦以增加面包纤维含量(优选30％))。
谷物面包，麦芽面包。
在本发明另外的优选的实施方式中，所述的面包选自下述面包类型的任何一种皮塔饼圆盘烤饼仙人掌状面包苏打面包或者黑苏打面包(用全麦粉制备)黑麦面包，法国长棍面包，新月形面包，百吉饼在本发明的另外的优选的实施方式中，所述的面包是扁平的面包，例如选自下述面包类型中的任何一种恰巴提，Paratas and Roti，墨西哥玉米粉圆饼，囊或烤薄饼等。
在本发明的另外的优选的实施方式中，功能性食品是早餐小吃或烘培产品所述的烘培食品可以是甜味的或开胃味道的，如开胃食品。
优选的烘培产品包括但不限于卷和面包片卷，烤制产品例如松饼和松脆圆饼和厚松饼，烤饼，茶点饼干，小圆面包和其它加水果的产品，铁板类食品例如烤薄饼和热饼，松饼和土豆饼，热交叉小面包圈，新月形面包，奶油蛋卷，巧克力面包，百吉饼，美国甜松饼和其它半甜面包产品。
基于植物油的产品在本发明的其他的优选的实施方式中，功能性食品是基于植物油的产品(涂抹剂，色拉油，蛋黄酱等)。
冷冻糖果食品在本发明的其他的优选的实施方式中，功能性食品是冷冻糖果食品。就本发明的目的来说，术语冷冻糖果食品包括含乳的冷冻甜品，如冰激凌，冷冻酸奶，冰冻果子露，冰冻果子露，冰牛奶和奶油冻，刨冰，格兰尼塔冰品和冷冻水果汤。
优选冷冻糖果(如糖，油脂，调味剂等)中固体水平大于3wt％，最优选10～70wt％，如40～70wt％。
冰淇淋通常含有2～20wt％的油脂，0～20wt％甜味剂，2～20wt％非脂肪乳成分和其它任选的成分，如乳化剂、稳定剂、防腐剂、调味成分、维生素、矿物质等，余下为水。通常，冰激凌都会充气超过20～400％，更普遍地为40～200％。冷冻温度从-2～-200℃，更普遍为-10～-30℃。冰淇淋中含有的钙水平在大约为0.1wt％。
通常用于冷冻糖果的原料的平均规格为66g。本发明中的组合物可以被装入胶囊，或者与乳化剂，清洁剂或其它试剂联合应用以确保产品中的物质的可溶性和稳定性。
膳食替代品在本发明的其他的优选的实施方式中，该功能性食品是膳食替代物。膳食替代物饮料通常基于液体为基本成分，其可以被凝胶或纤维膳食稠化，并且向其中添加矿物质和维生素的混合物。该饮料可被调整风味成期望的口味，如水果味或可可味。典型的规格为330ml或330g。
本发明中的组合物可以被装入胶囊，或者与乳化剂，清洁剂或其它试剂联合应用以确保饮料中的物质的可溶性和稳定性。
膳食替代小吃或块状食品通常含有其中可以混合本发明的组合物的可食用性材料的混合物，例如该混合物可以是基于脂肪类的(如巧克力层或者巧克力)，或可以是基于烘培类的(面包，面团或饼干等)，或可以是基于成块的颗粒状的(米，谷子，坚果，葡萄干，水果粒等)。小吃或者膳食替代块状物的典型规格是20-200g，一般是40～100g。还可以加入其它成分，如风味材料，维生素，矿物质等。
组合物本发明的一个方面，该功能性食品含有本发明的组合物与其它添加剂的组合，所述的添加剂包括如提高生存的物质，促长寿物质，健康促进物质和/或微生物数量调解物。
例如，一个优选的实施方式中，所述的功能性食品是含有一种或多种本发明的组合物和益生菌的例如在益生菌丸中的食品，在另外的优选的实施方式中，所述的功能性食品是含有本发明的组合物以及共生菌的例如在共生菌丸中的食品。在本发明的一个优选的实施方式中，含有本发明组合物和一种共生菌的功能性食品。优选的用于上述的丸中的细菌可以是下述中任何一种乳酸菌，如嗜酸乳杆菌，干酪乳酸菌，发酵乳杆菌，唾液乳杆，乳酸乳球菌，植物乳杆菌素，罗伊氏乳杆菌，鼠李糖乳杆菌和/或唾液乳杆菌。在发明其他的优选的实施方式中，优选的用于上述的丸中的细菌可以是下述中的任何一种双歧杆菌，如双歧杆菌，短双歧杆菌，乳酸双歧杆菌和/或龙根双歧杆菌。本发明其他的优选的实施方式中，优选的用于上述的丸中的细菌可以是下述中的任何一种粪肠球菌、大肠杆菌、布拉第酵母、酿酒酵母和/或嗜热链球菌。
本发明的组合物还可以与其他成分在饮食添加剂中组合使用，所述的饮食添加剂例如植物性添加剂，和/或在维生素E胶囊中，或在硒药片中。在所述的饮食添加剂中的进一步优选的组合可以是与例如与下述的一种或者多种物质的组合抗氧化剂，维生素C、维生素E、β胡萝卜素。
本发明的功能性食品能够另外含有其它的健康性成分，如维生素A、B、C、D、E，矿物质如钙、钾、镁、铁、铜、锌、硒及抗氧化剂如维生素E、多酚。例如该功能性食品可以含有本发明的组合物(如香菇多糖)和维生素C，该组合可以使摄取所述食品的个体降低感冒和流感的发生。
在优选的实施方式中，本发明的组合物还可以含有被认为能够预防或降低骨质疏松的成分，例如食品添加剂，如钙、维生素D、镁等成分。
本发明的合适的功能性食品的优选的实施方式描述如下饮料含有任何本文所述的组合物量在0.1-5％，优选0.5-1％。
新鲜烘焙产品含有任何本文所述的组合物在量在0.9-16％，优选2.4-10％，并且更优选3-5％。
干烘焙品含有任何本文所述的组合物量在1.0-20％，优选3.2-15％，并且更优选4.4-10％。
谷类产品含有任何本文所述的组合物的量在0.8-20％，优选1.6-16％，更优选2-10％。
麸皮产品含有任何本文所述的组合物量在4％-25％，优选6-20％。
乳产品或非乳产品(如发酵的谷类产品)含有任何本文所述的组合物量在0.1-20％，优选0.8-8％。
基于植物油的产品含有任何本文所述的组合物量在0.6-16％，优选2.6-10％，更优选2.6-5％。
肉类产品含有任何本文所述的组合物量在0.1-16％，优选0.2-5％。
乳制品含有任何本文所述的组合物量在0.1-16％，优选0.2-5％。
因此，在一个实施方式中，本发明考虑了任何本文所述的组合物在制备功能性食品中的应用，例如任何本文所述的功能性食品。
实施例下面的实施例例示了本发明的实施方式，不能被认为是对本发明的范围的限制。
实施例1碳水化合物香菇在摇瓶的液体培养基中于25℃下培养，所述的培养基含有15克/升的葡萄糖，3克/升的麦芽提取物，3克/升的酵母提取物以及5克/升的蛋白胨。培养后的生物质用过滤方式从剩余的发酵液中分离出来，将上清液用标准孔大小为50000Da的膜进行超滤。残留物(此处称为MediMush产品)用于分析单糖成分。
为了比较，商业上可得到的香菇注射液(Eureka Bio-ChemicalsPty，Little Collins Street.Melbourne 3000，澳大利亚)被用于平行进行的参照试验中(下文中将本产品称为“Eureka”)。
样品在1N HCl 100℃下水解成构成它们的单糖，水解物用采用了Dionex MA-1柱，以600mM氢氧化钠作为流动相的HPLC进行分析。使用脉冲电流分析法检测。
MediMush产品的主要单糖是甘露糖、葡萄糖以及一些半乳糖。表A列出了MediMush产品及Eureka中的相对的含量。
表A
实施例2按分子量分级由于分子量表征它们的生物活性，将MediMush样本通过Microsep(Pall Life Sciences)离心超滤仪在6℃和7500xg的条件下进行离心，使用标准的MWCO值为50000-1000000的滤膜。分析结果(见表2)显示进行了酸水解产生的物质半乳糖、甘露糖以及葡萄糖，通过了所有使用的4个MWCO的膜。
表2
实施例3可溶性蛋白质样品中的可溶性蛋白通过微量型考马斯染料结合测定法进行测定。(Mousdale，D.M，Campbell，M.S.，Coggins，J.R.″Purificationand characterisation of bifunctional dehydroquinase-shikimateNADP dehydrogenase from pea seedlings″。Phytochemistry 367，217-222(1987)。可溶性蛋白在两种产品中的量如下所示
实施例4免疫刺激性组织培养P388细胞是老鼠的类巨噬细胞，该细胞受到刺激时分泌大量白细胞介素-1(白介素-1)(关于该细胞的详细信息可获自ECACC)。可用基于ELISA(酶联免疫吸附剂测定法)定量所分泌的IL-1的量，并以此测定细胞受到多大的刺激。请注意对于这种试验不存在用于校准的吸收值，因此优选平行分析参照样品，由此IL-1的产量的评价可以通过与参照样品所诱导的IL-1的比较来进行。IL-1有两种形式，即IL1-α和IL1-β。接种P388细胞在12孔培养板中，并使之培养过夜，添加不同浓度的不同的刺激物质，并且在37℃温育24小时。
ELISA
来自每孔的50μl的刺激培养基与包被缓冲液混合，再分成等份加入到96孔ELISA板中，使之在4℃包被过夜。这个步骤可以使抗原(IL-1)结合在ELISA板的表面。用两种产生自山羊的针对两种不同形式的IL-1的抗体(第一抗体)检测IL-1。在下一步中使用另一个抗体检测山羊抗体(第二抗体)。当底物加入时，与辣根过氧化物酶偶联的抗体提供了显色反应。通过分光光度计(ELISA读数器)检测出与存在的IL-1的量对应的颜色的量，因而定量对组织培养细胞的刺激程度。
结果所有样品测试两个产品在一浓度范围内被测试，发现最佳值对于IL1α而言是50g/ml，对于IL1β而言是100μg/ml。结果提供于表3。
表3
MediMush产品具有明显的免疫刺激性，Eureka产品显示出一定的免疫刺激性，但是远不如MediMush产品。MediMush产品诱导产生IL1α及IL1β的量分别是Eureka诱导产生的量的58倍和20倍。
级分检测检测滤液，因此大于滤膜截留值的分子不会存在于该检测中。结果以吸光度的形式显示，只是作为相对免疫刺激指标，没有绝对吸收值用于校准此类试验。
表4
所有过滤物质都表现出强烈的免疫刺激性。
实施例5为了比较两种不同的制备方法，将如实施例1所述而制备的MediMush产品的免疫刺激活性与由多糖组合物的免疫刺激活性相比较，其未进行大小级分分离。
本产品是通过如实施例1所述在液体培养基中培养香菇获得的。向由此获得的上清液中加入大约2倍体积的无水乙醇以沉淀该物质。取出沉淀用无水乙醇清洗，再放入蒸馏水中悬浮。
免疫刺激测试如实施例4所述进行。将使用MediMush产品的结果提供在表5中，并且将使用沉淀产品的结果提供在表6中。
表5
表6
测试并没有平行进行，所获得的数值进而无法比较。但是，由于Eureka被用作两项研究的参照，所以结果就可以作为例如相对于Eureka增加的倍数进行比较。这些数值在下表7中给出。显然，两项试验中组合物都显著地比Eureka的免疫刺激性强。但是MediMush产品比沉淀物有更高的免疫刺激性。
表7
实施例6为确定免疫刺激性的特点，可以运用下列方法在免疫2日前，12周龄的Sprague Dawley大鼠接受本发明的组合物(0.5毫升0.09的生理盐水)。对照动物接受1毫克酪蛋白。动物用含有0.25弗氏完全佐剂的BSA(0.5毫克)进行免疫，在免疫11天后获得血样以检测抗体反应。采用夹心酶联免疫分析(″sandwich″ELISA)测定针对绝对标准抗体BSA的特异性抗BSA抗体的浓度。
实施例7a伞菌培养方案培养条件温度25℃±1℃pH中性pH水自来水培养基葡萄糖30g/l真菌蛋白胨10g/l酵母提取物6g/l麦芽提取物6g/l发酵罐(3升)培养伞菌(Agaricus sp.)取1.7升培养基放入发酵罐，在121℃下灭菌20分钟。设置发酵条件25℃，200-300转/分，空气0.2-0.5vvm。用含有6-8天时间的发酵培养基或类似的能够促进良好生长的培养基的摇瓶接种发酵罐。需要时添加适当的消泡剂(通常在整个过程)。6-8天后收获。
收获伞菌生物质用孔径为45的尼龙布作为过滤介质从发酵液中滤出生物质，用水彻底清洗生物质，然后放入设定为解冻的微波炉烘干直至干燥(通常规格的样品需要大约15分钟)。储存在干燥器中冷却然后称重。
发酵液发酵液中免疫刺激剂的浓度是以ppt通过加入无水乙醇决定的。必要时可加入无菌蒸馏水调节浓度到所需水平。高压灭菌并保存获得的溶液。
医学分级将不含有生物质的发酵液通过具有截留分子量为例如300kD的超滤膜。当移去70％～80％的液体后，向残留物加水以洗涤溶液。重复这个过程直到溶液失去其(大部分)颜色直至表现为清澈。
实施例7b将伞菌(Agaricus blazei)如实施例7a所述在液体培养基中培养。培养好后将生物菌体用过滤方式从发酵液中分离出来，表层悬浮物取决于离心过滤用的截留不同分子量的滤器。去除所有低于100kD的成分后将获得最初的产品(即MediMush产品II)，即剩下的溶液中含有MediMush产品II；通过从表层去除所有低于1kD的成分后将获得第二产品(即MediMush产品III)，即剩余溶液中的物质含有“MediMush产品III”。
样品在1N HCl 100℃的条件下水解成构成它们的单糖，水解产物用HPLC方式分析，利用Dionex MA-1柱，以600mM氢氧化钠作为流动相，脉冲电流分析法检测。
MediMush产品II和III中主要单糖是甘露糖、葡萄糖以及一些半乳糖。表B列出了MediMush产品II和III相关单糖成分。
表B
实施例8灵芝孢子以与上述实施例7a中在液体培养基中培养伞菌类似的方式培养。通过过滤使培养后的生物质从残留的发酵液中分离出来，将上清液进行如实施例7a所述的离心过滤。去除所有低于100kD的成分后将获得第一产品(命名为MediMush产品IV)，即剩下溶液中含有MediMush产品IV；通过从上清液去除所有低于1kD的成分后获得第二产品(命名为MedidiMush产品V)，即剩余溶液中的物质含有“MediMush产品V”。
样品在1N HCl、100℃条件下水解成它们的构成单糖，水解产物用采用Dionex MA-1柱、以600mM氢氧化钠作为流动相的HPLC进行分析。以脉冲电流分析法检测。
MediMush产品IV和V的主要单糖是甘露糖、葡萄糖，以及一些半乳糖。表C列出了MediMush产品IV和V相对单糖含量。
表C
实施例9通过小鼠腹膜渗出细胞(PEC)及脾细胞研究口服及腹腔注射Medimush产品对致炎细胞因子产生的影响。
原料及方法小鼠本研究用24只5周龄的雄性小鼠，从路易斯安那州的实验动物医学系处购买。所有研究按照LSU IACUC规定04-120中描述的进行。
用Medimush产品治疗小鼠分成四组。第一组按照2毫克/公斤接受溶解在0.15M氯化钠中的香菇多糖(腹腔注射)第2组接受同等体积的生理盐水，腹腔注射，第3组按照10毫克/公斤灌胃接受Medimush产品(口腔)和4组给予同等数量水，口服。所有小鼠每天接受一次治疗，共5天。在最后一次治疗的24个小时后，放血处死小鼠进行细胞分离。
腹膜腔渗出细胞(PEC)的分离和刺激如先述(1)所述进行腹腔灌洗收集PEC。细胞在RPMI1640中悬浮到1×106/毫升，所述RPMI1640含2Mm L-谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素和100μg/mL链霉素(中型)，并且将其按照1mL/孔分别加入到24孔组织培养板里。培养板在1200×g下离心10分钟，置于37℃、5％二氧化碳环境里2小时。弃去培养基，用温热的培养基洗孔一次，用1.5ml添加了10％胎牛血清(Hyclone，Inc.Logan，UT)(完全培养基)的温热培养基替换。每组一半的孔用10ng/ml大肠杆菌脂多糖(LPS；Sigma Chemical Co.，St。Louis，MO)处理，细胞放置在37℃、5％二氧化碳环境里12或24小时。使用针对藻红蛋白标记的CD3和CD14(eBioscience，SanDiego，CA)的抗体与用荧光素(Jackson ImmunoResearch，Avondale，PA)标记的小鼠抗IgG抗体，通过流式细胞计量术测定细胞类型。
脾细胞的分离与刺激从每只小鼠身上取下脾脏，一部分先速冻用于进一步的mRNA分析。剩余的脾脏集中起来分组、粉碎并通过一个70μm的尼龙滤网(Becton Dickenson Labware，Franklin Lakes，NJ)。洗涤一次脾细胞，将沉淀物重新悬浮于氯化铵缓冲溶液中，冰浴，5分钟。细胞洗涤两次，以4×107/mL重新悬浮于24孔组织培养板的完全培养基中，每孔放置1.5mL。用10ng/ml浓度的大肠杆菌脂多糖LPS或5μg/mL浓度的伴刀豆凝集素(Concanavilin)A(ConA；SigmaChemical Co.)刺激代表性的孔，细胞在37℃、5％二氧化碳环境里放置12或24小时。
细胞因子的ELISA(酶联免疫吸附)测定TNFα、IL-1β、IL-6和IL-12的细胞因子酶联免疫吸附测定在血清和培养上清液中进行，照厂家eBioscience)描述的精确操作。未稀释的上清液测定三次。血清按照1∶10稀释进行测定。
结果及讨论对于重量增加的测定，Medimush对它们的生长没有显著的统计学意义(表1)。但是，腹腔注射Medimush产品对从腹膜灌洗中分离出的细胞的数量和表型产生影响。口服药物的小鼠和那些腹腔注射盐水的小鼠类似，但是对于经过腹腔注射Medimush产品处理的小鼠，从腹膜分离出的细胞的总量激增(数据未显示)。细胞数量的增加主要是由于嗜中性粒细胞的增加(表2)。与巨噬细胞相比，PMN引起的实验结果此时还无法预计，但是也许与受腹腔注射Medimush产品处理的实验结果不同。相反的，口服药物组小鼠细胞数量和表型都很类似，因此它们比较的结果应该具有统计学意义。
腹腔注射Medimush产品处理的结果是12小时之内，腹膜渗出细胞(PEC)和脾细胞产生TNFα的量分别增加了4倍(表3)和3倍(表4)，受LPS处理的腹膜渗出细胞和脾细胞产生TNFα的量分别增加了30％和2倍。口服Medimush产品处理的腹膜渗出细胞和脾细胞产生TNFα的量变化不大，有趣的是接受LPS处理的腹膜渗出细胞产生TNFα的量降低了20％(表4)。这些结果反映出对TNFα的影响可能是从局部开始产生，并且/或需要直接接触Medimush产品。
口服Medimush产品和腹腔注射Medimush产品治疗效果都大大提高了。由PEC生产IL-1β(分别为18倍和6倍，表4)。此外，由腹腔经过TNF处理的小鼠的IL-1β对体外LPS的反应超过了3倍，口服Medimush产品并受体外LPS刺激的小鼠由PEC产生的IL-1β的量降低了2倍。
被处理的和未经过处理的小鼠的脾细胞在培养基的前12小时会产生少量IL-1β。当小鼠给予Medimush产品(无论口服还是腹腔注射)，小鼠脾细胞经过LPS或ConA的处理都会产生IL-1β(T细胞分裂素)。
一般而言，Medimush产品对腹膜渗出细胞的IL-6的产生有影响，尽管这对于非LPS处理细胞(表7)只有统计学上的意义。相反，在未受刺激的脾细胞中，IL-6的产生能够被中等程度地提高，但是，在口服和腹腔注射这两种处理中，由LPS或ConA刺激的脾细胞的IL-6的生成却被中等程度地降低。IL-6水平在后来的12个小时的培养中持续升高(表9，表10)。
除了ConA刺激的脾细胞培养，其他细胞的白细胞介素12在12小时的时候只达检测限水平(表12)。在腹腔注射Medimush产品的情况下，经过LPS的处理，小鼠产生了大量的IL-12。
口服Medimush产品能使腹膜渗出细胞逐渐降低促炎性细胞因子的产生，但在脾细胞中，能够逐渐增加促炎性细胞因子的生长，这说明口服Medimush产品的系统性应答可能不同于在之前研究的局部应答(nasal，i.p.，i.v.)。
Medimush产品口服用药与腹腔注射给药不能进行直接比较，因为所用的Medimush产品的给药剂量不同。
参考文献1.Coligan，JE，Kruisbeek，AM，Margulies，DH，Shevach，EM，Strober，W(eds.).1994.″In vitro assays for mouselymphocytes″in Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，Inc.，Indianapolis，IN，p 3.15.4。
表1Medimush产品治疗对重量增加的影响
a.0.15M盐水作为腹腔注射的对照，蒸馏水作为口服对照**表明治疗组与对照组有显著性差异表2培养中的细胞的表型
a.由CD3染色确定b.由表面免疫球蛋白染色确定c.基于流式细胞术的侧部分散d.基于CD14亮染色e.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照表3Medimush产品对腹膜渗出细胞(PEC)产生TNFα(在12小时培养后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表4Medimush产品处理对脾细胞产生TNFα(培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005表5Medimush产品处理对腹膜渗出细胞(PEC)产生IL-1β(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表6.Medimush产品处理对脾细胞产生IL-1β(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005表7.Medimush产品处理对用腹膜渗出细胞(PEC)产生IL-6(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.015M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表8.Medimush产品处理对脾细胞产生IL-6(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005表9Medimush产品处理对腹膜渗出细胞(PEC)产生IL-6(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表10 Medimush产品处理对脾细胞产生IL-6(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.015M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005表11.Medimush产品处理对腹膜渗出细胞(PEC)产生IL-12(在培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005
表12Medimush产品对脾细胞产生IL-12(培养12小时后)的影响
a.检测限8pg/mlb.0.15M盐水作为腹腔注射对照，蒸馏水作为口服对照c.使用StatXact v 6.0，Cytel Sudio，2004进行的双t测试**统计学上的显著性差异达到p＜0.005功能食品产品的实施例现在要通过介绍适合用于本发明的优选的功能性食品的实施方式来进一步说明本发明，可以确信本领域技术人员能够运用所提供的说明制备本发明的其它产品。
实施例10条块(Bar)将75克黑巧克力在70℃下熔化，然后与600毫克Medimush产品混合，将混合溶液倒入条状容器，冷却过夜。
实施例11奶昔将100毫升香草冰淇淋与100毫升冷牛奶，10毫升草莓糖浆和1毫升蘑菇培养物的提取液混合，将混合溶液投入搅拌器，搅拌好后即可食用。
实施例12奶油杏仁条成分重量(克)水70
Hyfoama(乳化剂)3.5明胶2.0糖515葡萄糖糖浆60DE 250葡萄糖糖浆35DE 250脱脂奶粉115脂肪501克蘑菇培养物的提取液制备方法将hyfoama和白明胶溶解在水中，加入150克糖，打泡。将剩余的糖加热至130℃，然后缓缓加入到刚才的泡沫溶液中，加入脂肪，葡萄糖糖浆，奶粉和1克蘑菇培养物的提取液。使之冷却后分成50克的小条。
实施例13-果汁饮料11种成分，200克水果浓缩汁(香蕉，菠萝，柑桔，葡萄，杏，柠檬，西番莲，番石榴，芒果)，5克果糖，1克菊粉，10克，0.1克Medimush产品IV，0.9克植物固醇脂肪酸脂(＝0.54克固醇等同物)5克卵磷脂，1.5克乳酸钙775克水。
权利要求
1.一种组合物，其中包含一种或多种多肽和多糖混合物a)组合物中多糖主要成分的分子量至少为30000Da，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50，或b)组合物中多糖主要成分的分子量至少是100000Da，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是0～0.5∶0.5～10∶0.5～50；或c)组合物中多糖主要成分的分子量至少是1000Da，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖和葡萄糖，比例是1∶0～25∶1～50。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是由真菌生产的。
3.根据权利要求1所述组合物，其中所述组合物是由包括下述步骤的方法生产的i)在液体生长培养基中培养真菌，和ii)从所述液体生长培养基分离所述组合物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中从液体生长培养基分离所述组合物的方式包括超速离心、超滤、微孔过滤或凝胶过滤。
5.如权利要求2所述的组合物，其中所述的真菌是真菌菌丝体。
6.如权利要求2所述的组合物，其中所述的真菌属于香菇属。
7.如权利要求2所述的组合物，其中所述真菌选自双孢蘑菇(Agaricus bisporus)，冬虫夏草(Cordiceps sinensis)，金针菇(Flammulina velutipes)，灵芝(Ganoderma lucidum)，多叶奇果菌(Grifola frondosa)，香菇(Lentinus edodes)，糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)，裂褶菌(Schizophyllum commune)，核盘菌(Sclerotinasclerotium)，白腐担子菌(Trametes(coriolus)versicolor，采绒革盖菌)，银耳(Tremella fuciformis)，姬松茸(Agaricus blazei)，茶树菇(Agrocybe aegerita)，柱状田头菇(Agrocybe cylindracea)，地花菌(Albatrellus confluens)，蜜环菌(Armillariella mellea)，木耳(Auricularia auricular-judae)，毛木耳(Auriculariapolytricha)，Collybia maracula，蛹虫草(Cordiceps militari)，Dendropolyporus umbellatus，木蹄层孔菌(Fomes fomentarius)，松生层孔菌(Fomes pinicola)，平盖灵芝(Ganoderma applanatum)，铁杉灵芝(Ganoderma tsμ gae)，猴头(Hericium erinaceus)，玉蕈(Hypsizygus marmoreus)，桦褐纤孔菌(Inonotus obliquus)，硫色绚孔菌(Laetiporus sulphurous)，桦革裥菌(Lenzites betulinus)，大白桩菇(Leucopaxilllus giganteus)，灰离褶伞(Lyophyllumcinerascens)，外溶亚脐菇(Omphalina epichysium)，霉状小奥德蘑(Oudemansiella mucida)，晚生扇菇(Panellus serotinus)，桦滴孔菌(Piptoporus betulinus)，裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)，松木层孔菌(Phellinus pini)，光帽鳞伞(Pholiota nameko)，金顶侧耳(Pleurotus citrinopileatus)，肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)，Sarcedon asparatus，香栓菌(Trametes suavolens)，草菇(Volvariella volvacea)和茯苓(Wolfiporia cocos)。
8.如权利要求2所述的组合物，其中所述的真菌选自双孢蘑菇，冬虫夏草，金针菇，灵芝，多叶奇果菌，香菇，糙皮侧耳，裂褶菌，核盘菌，白腐担子菌(采绒革盖菌)和银耳。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有免疫调节性。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有免疫刺激性。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物能够在体外试验中诱导至少一种白介素IL-1生产细胞产生白介素IL-1。
12.如权利要求1所述的组合物，其中当向所述哺乳动物给予时，所述组合物能够提高在该哺乳动物中的抗体产生。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～25∶1～50。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述多糖混合物含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶13.4+/-0.4∶12.6+/-1.3。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的每个多糖的分子量至少是10000Da。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的每个多糖的分子量至少是50000Da。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶7～11∶2.5～3.5。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖的分子量在50000Da～100000Da的范围，其含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶4～14∶1～5。
19.如权利要求18的组合物，其中所述的比例约为1∶8.9∶2.9。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖的分子量在100000Da～300000Da的范围，其含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶3～13∶1～5。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述的比例约为1∶7.3∶2.9。
22.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖的分子量在300000Da～1000000Da的范围，其含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～15∶1～5。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述的比例约为1∶9.9∶3.1。
24.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的多糖的分子量大于1000000Da，其含有单糖∶半乳糖、甘露糖及葡萄糖，比例是1∶5～15∶1～5。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述的比例约为1∶10.3∶2.9。
26.如权利要求1所述的组合物，其中所述的组合物含有至少10μg/L的可溶性多肽。
27.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物含有在10～1000μg/L范围的可溶性多肽。
28.一种生产上述权利要求任一项所述的组合物的方法，该方法包括以下步骤i)在液体生长培养基中培养真菌，ii)从所述的液体生长培养基中纯化所述组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述的纯化包括将分子量至少为10000Da的多糖从其它多糖中分离出来。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述的分离通过超速离心法、超滤法、微孔过滤法或凝胶过滤法实施。
31.一种用作药物的药物组合物，包含权利要求1的组合物和药学上可接受的载体。
32.一种治疗下述个体的方法，所述个体为i)诊断具有免疫受损疾病，和/或ii)处于感染免疫受损疾病的风险，和/或iii)由手术或疾病中恢复，并且处于感染免疫受损疾病的风险，和/或iv)诊断具有或处于感染获得性免疫缺陷综合症的风险，所述方法包括给予所述个体有效量的权利要求1所述的组合物，以治疗或预防性治疗所述免疫受损疾病、或所述综合症、或刺激所述个体的免疫系统。
33.权利要求32所述的方法，其中的免疫受损疾病选自传染性疾病，寄生性疾病，嗜血杆菌脑膜炎，肺炎双球菌脑膜炎，链状球菌脑膜炎，葡萄球菌脑膜炎，其它生物体引起的脑膜炎，脑炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，其它细菌性肺炎，除了细菌以外的特定的生物体引起的肺炎，支气管肺炎，不明确生物体引起的肺炎，流行性感冒，不明确性腹泻，不明确性肝炎，急性和亚急性肝脏坏死，慢性肝炎，以及肝脏脓肿。
34.如权利要求32所述的方法，其中的免疫受损疾病是由下列传染性或寄生性疾病引起的，或者来自霍乱病菌，沙门氏菌，志贺氏菌，大肠埃希氏菌，其它的特定的细菌导致的肠道感染，艰难梭菌，病毒性肠胃炎，传染性结肠炎，肠炎和肠胃炎，感染性腹泻，结核病，李氏杆菌病，巴斯德氏菌病，分支杆菌病，白喉，百日咳，脑膜炎球菌，链球菌败血病，葡萄球菌败血病，肺炎球菌败血病，厌氧菌引起的败血病，其它革兰氏阴性生物体引起的败血病，放线菌感染，气性坏疽，中毒性休克综合征，坏死性筋膜炎，弗里德兰杆菌，流感杆菌，假单胞菌，AIDS/HIV感染，急性脊髓灰质炎，克-雅氏病，亚急性全脑炎硬化，进行性多病灶白质脑病，未明确的中枢神经系统慢病毒感染，柯萨奇病毒，未明确的病毒性脑膜炎，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎，未明确的病毒性脑炎，水痘，带状疱疹，单纯性疱疹，甲型病毒性肝炎，乙型病毒性肝炎，其它明确的病毒性肝炎，慢性肝炎，肝脏脓肿或急性坏死，传染性单核细胞增多症，传染性单核细胞增多症，巨大细胞包涵体病，衣原体，腺病毒，病毒感染，梅毒，念珠菌，未明确的组织胞浆菌病，曲霉病，隐球菌病，霉菌病，类圆线虫病，肠道寄生虫感染，弓形体病，肉状瘤病，卡氏肺囊虫，后脊髓灰质炎症，嗜血杆菌脑膜炎，肺炎球菌脑膜炎，链球菌性脑膜炎，葡萄球菌脑膜炎，脑炎，腺病毒引起的肺炎，呼吸道合胞病毒引起的肺炎，副流感病毒引起的肺炎，其它病毒引起的肺炎，病毒性肺炎，肺炎球菌性肺炎，肺炎克雷白菌引起的肺炎，假单胞菌引起的肺炎，流感嗜血杆菌引起的肺炎，链球菌引起的肺炎，葡萄球菌引起的肺炎，和细菌性肺炎。
35.如权利要求32所述的方法，其中的个体是包括人类的哺乳动物。
全文摘要
本发明涉及含有多肽和多糖的组合物，所述组合物通常可用于免疫调节。本发明还公开了使用在液体培养基中培养的丝状真菌生产这些组合物的方法。所述组合物可用于例如免疫受损疾病的治疗。
文档编号A61K36/06GK101018869SQ200580030988
公开日2007年8月15日 申请日期2005年7月15日 优先权日2004年7月16日
发明者B·克里斯蒂安森 申请人:药用菌类公司
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