一种用于治疗肝纤维化的丹参总酚酸的制备方法

xiaoxiao2020-07-09  203

专利名称:一种用于治疗肝纤维化的丹参总酚酸的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新的从中药丹参中提取分离的用于治疗肝纤维化的丹参总酚酸的制备方法,以及用该方法制得的提取物及药物组合物。
背景技术
我国是肝炎病高发地区,据统计,我国慢性肝炎病毒携带者者数量已超过1.3亿,慢性乙肝病人约3000万。慢性肝炎患者若没有及时治疗或病情未能及时控制就有可能转化为肝纤维化,肝纤维化如不能得到有效治疗和控制,甚至可发展为肝硬化、肝癌。目前市场上可供临床选用预防和治疗慢性肝炎引起的肝纤维化或早期肝硬化的药物很少,而且大都疗效不确切且毒副作用较大。
丹参总酚酸是丹参水溶性成分,现代药理研究表明,丹参总酚酸作为丹参的水溶性成分,对肝细胞因四氯化碳(CCl4)或D-半乳糖胺所诱发的肝损伤模型有显著的保护作用;对CCl4诱发的大鼠肝纤维化模型,有显著的保护作用,其抗肝纤维化强度优于秋水仙碱;在大鼠肝硬化病理模型中,可促进已形成的胶原纤维降解以及肝纤维的重吸收。因此,应用现代方法,从丹参中提取分离出以丹参总酚酸为主的有效部位,并制成适宜剂型,将在治疗慢性肝炎肝纤维化(早期肝硬化)上具有重要意义。
目前有文献报道丹参多酚酸盐及丹参酚酸B盐的提取方法,其获得的成分均为丹参总酚酸的盐类混合物,提取成本高,收率低,含量相对较低,稳定性较差。
中国专利(公开号CN1459448)公开了丹参总酚酸的制备方法及其用途,在其制备工艺中先后采用了聚酰胺柱层析法和大孔树脂柱层析法,不但操作过程繁琐,耗时长,而且得到的样品含量不高,同时由于聚酰胺的再生过程非常难,使用周期短,因此生产成本很高,不适合工业化的生产。此外,研究还表明,丹参酚酸在碱性溶液中极不稳定,该工艺中将丹参提取液上聚酰胺柱后加碱水洗脱显然是不合理的,这样将会使大量酚酸遭到破坏,同时带入丹参酚酸的分解副产物,不但不利于提高丹酚酸的含量,而且会给药品的安全性带来隐患。
中国专利(公开号CN1384090)公开了丹参总酚酸的提取方法及其制剂的制法与用途,其工艺中采用了传统的水提醇沉和碱调的方法,由于丹参酚酸在植物体内是以盐的形式存在,所以在乙醇中溶解度很小,在醇沉的过程中,大量的丹参酚酸都被沉淀去除,因此丹参的水提醇沉工艺是目前已经被证明落后的工艺,除了在一些丹参较早的复方制剂中使用外,基本已经被淘汰,按此方法制备的丹参总酚酸不但得率低,性质也很不稳定。

发明内容
本发明的目的是提供一种从中药丹参中提取分离丹参总酚酸的制备方法。该方法能够大大提高丹参药材的利用率,节约宝贵的中药资源,并且克服了现有技术的不足,可使丹参总酚酸的含量和稳定性大大提高,同时工艺重复性好,简便易行,适合工业化生产。
本发明的方法,经过以下步骤(1)取丹参药材,用水提取,提取液过滤,滤液调pH至酸性,过滤;(2)滤液用大孔吸附树脂柱层析,用水洗脱,至流出液为中性且无还原糖反应后,再用乙醇洗脱,至洗脱液无三氯化铁(FeCl3)反应,收集乙醇洗脱液;(3)洗脱液浓缩,干燥,即得丹参总酚酸。
本发明的方法,优选的是经过以下步骤(1)取丹参药材,切成小段或粉碎,加热水提取,提取液乘热过滤后,放冷,滤液加酸调pH至酸性,过滤;(2)滤液上大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为中性且无还原糖反应后,再用乙醇洗脱至洗脱液无三氯化铁(FeCl3)反应,收集洗脱液;(3)洗脱液减压回收至干,干燥,即得丹参总酚酸。
在上述方法中,步骤(1)中,水提取可以用热水,加水量为丹参的6~8倍,提取2~3次,每次0.5~1小时,热水温度为60~100℃,最佳为60-80℃。滤液加酸调pH至2.0~6.0,最佳为3.5~5.0,酸可为盐酸、硫酸、磷酸等,优选为盐酸,使丹酚酸从多种盐的形式充分转化为单一的游离酚酸形式后,过滤。步骤(2)中,采用中极性大孔吸附树脂柱较佳,中极性大孔吸附树脂柱型号为HPD-400、D101、D-1300或AB-8型等。洗脱的乙醇浓度可为30-100%,最佳为50~75%乙醇。
经过本发明的制备方法制得的含有丹参总酚酸提取物,其中丹参总酚酸的含量大于90%,其中丹酚酸B的含量大于50%。
本发明还提供含有本发明丹参总酚酸提取物的药物组合物,该组合物含有生理上有效量的丹参总酚酸提取物和药学上可接受的辅料,该组合物可以是任何一种可供服用的药物制剂形式。
本发明还包括用本发明丹参总酚酸提取物或其的药物组合物在制备治疗和/或预防肝脏纤维化的药物中的应用。
本发明的药物组合物可制成的适合服用的制剂形式选自片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液注射剂、干燥的粉针剂。
本发明的药物组合物制剂以传统方式服用,包括口服和注射以保持药物的活性。
本发明的药物制剂在制成制剂时可以加入与生理上可接受的载体(辅料)。所述生理上可接受的载体选自以下物质甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠,一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的制剂,如果是口服,含有常用的赋形剂,诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂、防腐剂、助溶剂。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物,例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括,例如硬脂酸镁、滑石粉。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合,填充,压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性成分分布在整个使用大量填充剂的那些制剂中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂,或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂,诸如悬浮剂,例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪,乳化剂,例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶;非水性载体(它们可以包括食用油),例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇;防腐剂,例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸,并且如果需要,可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂,制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度,可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将药物溶解在一种载体中,在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒,然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性,可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻,并在真空下将水除去。
用基本相同的方式制备胃肠外悬浮液,除了是将活性化合物悬浮在载体而不是将其溶解,而且在将其悬浮于无菌载体之前,用环氧乙烷对其进行消毒。表面活性剂或湿润剂可包括在此制剂中,以利于这种活性化合物的均匀分布。
本发明的药物制剂,优选是片剂或胶囊制剂,每一片/粒含有1-1000mg本发明丹参总酚酸提取物,优选100mg本发明丹参总酚酸提取物,其余为药物可接受的载体。
本发明与现有技术相比,具有明显的优点(1)丹参药材中的丹参酚酸主要是以多种盐的形式存在,主要为镁盐、铵钾盐等,并且丹参酚酸具有临二酚羟基,极易被氧化,稳定性很差;同时丹参中还存在大量的多糖类、蛋白质类、丹参酮类等成分。本发明结果表明,将丹参酚酸盐转化为游离酸之后,丹参酚酸稳定性大大提高,同时酸化处理,也大大去除了丹参中的多糖类、蛋白质类等杂质,疗效有所提高。
(2)丹参酚酸盐类成分很难被大孔树脂吸附纯化,本发明中经过酸碱转化后的游离丹酚酸则可以被大孔树脂很好的吸附,从而可以被纯化,除杂。
(3)本发明采用的大孔树脂纯化技术,分离纯化得到的丹参总酚酸得率高、含量高,其中丹参总酚酸的含量大于90%,通过大生产验证,各批样品的平均含量为98.5%,其中丹酚酸B的含量超过50%,得率大于4%。本发明大大提高丹参药材的利用率,节约宝贵的中药资源,(4)本发明操作简便,降低了成本,而且非常适合工业化生产。
下面通过丹参总酚酸的动物药效试验来进一步说明本发明的有益效果。
1、本发明丹参总酚酸对CCl4致大鼠肝纤维化模型的影响1.1模型制备110只大鼠随机分组,除正常组外,其余各组大鼠首次以纯CCl40.5ml/100g体重,以后以40%CCl4的橄榄油溶液0.3ml/100g体重,在大鼠背部后侧皮下注射,每周两次,至第4周,第5周后以20%CCl4的橄榄油溶液0.15ml/100g体重,同法皮下注射,每周两次,至第12周。造模的第1-2周饲以高脂玉米粉饲料(80%玉米粉,20%猪油,0.5%胆固醇),第3周后饲以普通饲料;自由饮水。正常组大鼠以普通饲料喂养。
1.2 给药从第5周起,给药组大鼠分别每日灌胃给予丹参总酚酸25,50,100mg/kg,阳性对照组每日灌胃给予马洛替酯100mg/kg,至第13周。末次给药后1小时采血测血清生化指标,取肝、脾称重。肝组织一部分制成肝匀浆,用于测定脂质过氧化水平及羟脯氨酸含量;其余肝组织用10%福尔马林液固定,石蜡包埋切片,HE染色,用于组织病理学检查。根据每种病变程度,记为“-”、“+”、“++”、“+++”,分别换算成0、1、2、3分,计算每组的平均积分值。
1.3 血清生化指标检查、肝组织脂质过氧化水平及羟脯氨酸含量测定白蛋白(Alb),溴钾酚绿比色法;总蛋白(TP),考马氏亮蓝法;门冬氨酸氨基转移酶(AST),丙氨酸氨基转移酶(ALT),赖氏法;均按试剂盒说明书进行。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、羟脯氨酸(Hyp)的测定均按试剂盒说明书进行。
1.4 试验结果1.4.1 对大鼠体重、肝脾重量变化的影响如表1所示,模型组大鼠体重减轻,肝脾肿大,肝脾指数明显增加,药物组有恢复的趋势。
表1 丹参总酚酸对CCl4致肝纤维化大鼠体重、肝脾重量的影响(X±SD)剂量 动物数体重 肝重 肝指数 脾重 脾指数组别(mg/kg)(只) (g)(g)(mg/g) (g) (mg/g)正常组 - 10340±939.0±1.8 27.1±4.40.55±0.131.6±0.2模型对照组 - 18315±789.8±1.3 32.1±5.2*0.83±0.482.7±1.6*
丹酚酸低剂量组25 18 317±77 9.1±1.9 29.4±5.9 0.78±0.6 2.7±3.1丹酚酸中剂量组50 18 314±72 9.2±1.4 30.1±5.1 0.72±0.19 2.3±0.4丹酚酸高剂量组10013 335±78 9.9±1.6 30.2±3.5 0.88±0.44 2.6±1.1马洛替酯组10016 324±52 10.1±2.0 31.2±2.8 0.72±0.25 2.2±0.8*P<0.05,**P<0.01,与正常组相比;#P<0.05,##P<0.01,与对照组相比。
1.4.2 对大鼠血清生化指标的影响如表2所示,模型大鼠白蛋白、总蛋白及白/球比值均显著下降,丹酚酸低剂量组及马洛替酯组对白/球比值有恢复的趋势,丹酚酸中剂量组则显著地提高了白/球比值。
表2 丹参总酚酸对CCl4致肝纤维化大鼠血清生化指标的影响(X±SD)剂量 动物数 ALTASTAlb TPA/G组别(mg/kg) (只) (Karmen Unit) (Karmen Unit) (mg/ml) (mg/ml) 比值正常组-10 20.7±13.7 114.5±16.935.3±10.8 118.0±25.8 0.524±0.382模型对照组-18 27.3±11.6 104.9±22.027.5±6.5*97.3±20.0*0.406±0.096丹酚酸低剂量组25 18 25.5±14.5 110.8±16.027.0±7.689.6±17.20.455±0.175丹酚酸中剂量组50 18 24.2±15.3 107.8±24.230.3±10.6 85.3±18.10.588±0.275#丹酚酸高剂量组100 13 27.5±18.9 103.3±20.925±3.5 91.1±17.10.393±0.092马洛替酯组100 16 27.2±14.4 121.5±29.029.5±9.492.9±20.70.487±0.188*P<0.05,**P<0.01,与正常组相比;#P<0.05,##P<0.01,与对照组相比。
从以上结果可知,对于CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,丹参总酚酸能使肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量下降,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及超氧化物岐化酶(SOD)含量升高,病理组织学检查结果还表明,丹酚酸能使CCl4肝纤维化模型大鼠的纤维化程度减轻,使肝细胞脂肪变性减轻,肝小叶结构破坏程度减轻,假小叶形成减少,结缔组织增生减轻。结果提示,丹酚酸具有明显的抗肝纤维化作用。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明的实用性,而不是以任何方式限制本发明。
检测方法试验材料丹参,购自安徽亳州,产地为安徽;丹酚酸B对照品,自制,含量大于98.5%。
检测方法
1.丹参总酚酸对照品溶液的制备 精密称取经60℃减压干燥至恒重的丹酚酸B对照品适量,加甲醇制成每1ml含25μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备 取本品约25mg,精密称定,置25ml的量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过;精密量取续滤液3ml,置100ml的量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
测定法 分别取对照品溶液和供试品溶液适量,照紫外分光光度法(中国药典2000年版一部附录V A)分别在287nm波长处测定吸收度,计算,即得。
2.丹酚酸B照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水-冰醋酸(40∶60∶0.5,内含3mmol/L四丁基溴化铵)为流动相,流速1.0ml/min;检测波长285nm。理论板数按丹酚酸B计算应不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取经60℃减压干燥至恒重的丹酚酸B对照品适量,加流动相溶解并制成每1ml含50μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备取本品约25mg,精密称定,置于25ml的量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液5ml,置50ml的量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
实施例1取丹参药材100kg,加6倍量的水于60℃提取2次,每次1小时,提取液乘热过滤后,放冷,滤液加盐酸调pH至2.0,过滤后上AB-8大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为中性且无还原糖反应后,再用30%的乙醇洗脱至洗脱液无FeCl3反应,收集洗脱液并回收至干,干燥,即得丹参酚酸4.1kg。
经测定,上述丹参酚酸中总酚酸含量含量为98.5%,其中丹酚酸B含量67.9%。
实施例2取丹参药材100kg,加8倍量的水于80℃提取2次,每次1小时,提取液乘热过滤后,放冷,滤液加盐酸调pH至4.5,过滤后上HPD-400大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为中性且无还原糖反应后,再用60%的乙醇洗脱至洗脱液无FeCl3反应,收集洗脱液并回收至干,干燥,即得丹参酚酸4.3kg。
经测定,上述丹参酚酸中总酚酸含量为99.6%,其中丹酚酸B含量71.3%。
实施例3取丹参药材150kg,加8倍量的水于80℃提取3次,每次0.5小时,提取液乘热过滤后,放冷,滤液加盐酸调pH至5.0,过滤后上D-101大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为中性且无还原糖反应后,再用75%的乙醇洗脱至洗脱液无FeCl3反应,收集洗脱液并回收至干,干燥,即得丹参酚酸6.4kg。
经测定,上述丹参酚酸中总酚酸含量为97.9%,其中丹酚酸B含量59.1%。
实施例4取丹参药材120kg,加8倍量的水于100℃提取2次,每次1小时,提取液乘热过滤后,放冷,滤液加盐酸调pH至6.0,过滤后上D-1300大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为中性且无还原糖反应后,再用100%的乙醇洗脱至洗脱液无FeCl3反应,收集洗脱液并回收至干,干燥,即得丹参酚酸5.1kg。
经测定,上述丹参酚酸中总酚酸含量为99.1%,其中丹酚酸B含量76.6%。
实施例5每片含有100mg丹参酚酸提取物的片剂的制备取实施例1方法得到的丹参酚酸提取物100g,加入淀粉50g,羧甲基纤维素50g、用累进法混合均匀,75%乙醇为润湿剂,混匀,湿法制粒,烘干、整粒,加入1%硬酯酸镁,混匀压片,压出1000片。
实施例6每片含有100mg丹参酚酸提取物的胶囊的制备取实施例1方法得到的丹参酚酸提取物100g,加入淀粉50g,羧甲基纤维素50g、用累进法混合均匀,75%乙醇为润湿剂,混匀,湿法制粒,烘干、整粒,加入1%硬酯酸镁,混匀装胶囊1000粒。
权利要求
1.一种丹参总酚酸提取物,其特征在于,丹参总酚酸的含量大于90%,丹酚酸B的含量大于50%。
2.权利要求1的丹参总酚酸提取物,其特征在于,是经过以下步骤制备的(1)取丹参药材,用水提取,提取液过滤,滤液调pH至酸性,过滤;(2)滤液用大孔吸附树脂柱层析,用水洗脱,至流出液为中性且无还原糖反应后,再用乙醇洗脱,至洗脱液无三氯化铁反应,收集乙醇洗脱液;(3)洗脱液浓缩,干燥,即得丹参总酚酸提取物。
3.权利要求1的丹参总酚酸提取物,其特征在于,是经过以下步骤制备的(1)取丹参药材,切成小段或粉碎,加热水提取,提取液乘热过滤后,放冷,滤液加酸调pH至酸性,过滤;(2)滤液上大孔吸附树脂柱,用水充分洗脱至流出液为中性且无还原糖反应后,再用乙醇洗脱至洗脱液无三氯化铁(FeCl3)反应,收集洗脱液;(3)洗脱液减压回收至干,干燥,即得丹参总酚酸。
4.以权利要求1-3的丹参总酚酸提取物为药物活性成分的药物组合物。
5.权利要求4的组合物,是适合服用的药物制剂形式,所述药物制剂形式选自片剂、胶囊、软胶囊、滴丸、注射液或粉针剂。
6.权利要求1-3的丹参总酚酸提取物或权利要求4的药物组合物在制备治疗和/或预防肝脏纤维化的药物中的应用。
7.权利要求1的丹参总酚酸提取物的制备方法,其特征在于经过以下步骤(1)取丹参药材,用水提取,提取液过滤,滤液调pH至酸性,过滤;(2)滤液用大孔吸附树脂柱层析,用水洗脱,至流出液为中性且无还原糖反应后,再用乙醇洗脱,至洗脱液无三氯化铁反应,收集乙醇洗脱液;(3)洗脱液浓缩,干燥,即得丹参总酚酸提取物。
8.根据权利要求7的制备方法,其特征在于步骤(1)中,所述用水提取是用热水提取2~3次,每次0.5~1小时;热水温度为60~100℃;所述滤液调pH至酸性是滤液加酸调pH至2.0~6.0。
9.根据权利要求8的制备方法,其特征在于所述加酸调PH所用酸选自盐酸、硫酸或磷酸,所述热水温度为60~80℃。
10.根据权利要求7的制备方法,其特征在于步骤(2)中,所述滤液用大孔吸附树脂柱层析是采用中极性大孔吸附树脂柱;所述用乙醇洗脱是用浓度为30-100%的乙醇洗脱。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗肝纤维化的丹参总酚酸的制备方法以及用该方法制得的提取物及药物组合物,本发明的方法,经过以下步骤(1)取丹参药材,用水提取,提取液过滤,滤液调pH至酸性,过滤;(2)滤液用大孔吸附树脂柱层析,用水洗脱,至流出液为中性且无还原糖反应后,再用乙醇洗脱,至洗脱液无三氯化铁(FeCl
文档编号C07J73/00GK1563075SQ20041003064
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月2日 优先权日2004年4月2日
发明者杨永安, 张喜全, 陈智林, 贺彦宇, 李东方 申请人:江苏正大天晴药业股份有限公司

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