白藜芦醇用于制备治疗抑郁症药物的用途的制作方法
专利名称：白藜芦醇用于制备治疗抑郁症药物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及白藜芦醇的一种新用途，特别是涉及白藜芦醇用于制备治疗抑郁症药物的用途。
背景技术：
抑郁症是一种中枢神经系统致残性疾病，随着社会现代化进程的加快，各种应激因素导致的抑郁症已成为现代社会的常见病和多发病。目前全世界约有3％-5％的人罹患抑郁症，位居致残性疾病的首位。发病率高且难以根治的抑郁症正悄悄地构建可观的抗抑郁药市场，这正是近年来国内外对中枢神经系统药物的研究和开发特别活跃的主要原因之一。所以，研究和开发新型、高效、低毒副作用的抗抑郁药始终是精神药理学领域的一个重要研究课题。由于抑郁症的病因复杂，涉及到交感神经、内分泌和免疫系统等机体多个方面。“单胺假说”是抑郁症机制研究的主流观点，认为单胺类神经递质(5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺神经递质)在抑郁症的病因、病理中起关键作用。目前临床上使用的抗抑郁药一般是通过影响单胺递质的重吸收、抑制单胺的代谢或阻断突触前抑制性自主或非自主受体而发挥作用。药物大致可分成三类1.单胺重摄取抑制剂；2.单胺氧化酶抑制剂；3.5-HT受体拮抗剂。由于临床上使用的这些药物大约只对65％的病人起效，而且许多药物疗效并不稳定，毒副作用较大，生物利用度不高，一般要在2-4周起效。因此，从天然植物中开发安全有效、毒副作用小，生物利用度高的天然抗抑郁药成为这一领域的研究方向。白藜芦醇(Resveratrol)是一种多酚类物质，其化学式为3，5，4′-三羟基二苯乙烯(3，5，4′-trihydroxysitlbene)，广泛存在于天然植物中，尤其在葡萄科植物果皮中含量最高。白藜芦醇为脂溶性物质，易通过血脑屏障。研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、免疫调节、抗衰老及预防神经退行性疾病等作用，目前尚未见将白藜芦醇用于治疗抑郁症的研究报道。
发明内容
本发明的目的提供白藜芦醇的一种新用途。
经过动物实验发现白藜芦醇具有较好的抗抑郁作用，是一种较有发展前途的天然抗抑郁剂，可用于制备治疗抑郁症的药物。
具体实施例方式 以下通过实施例说明本发明。
实施例1小鼠悬尾实验，强迫游泳实验，自主活动实验 1、受试药物 名称白藜芦醇(Resveratrol) 性状类白色精细粉末，气特殊，味淡，从虎杖中提取 来源购自陕西森佛生物技术有限公司，纯度为98％ 药物的配置用0.5％浓度的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解白藜芦醇，分别配成10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg和80mg/kg四个剂量，按0.1ml/10g剂量给予小鼠灌胃口服。
2、对照药物 盐酸丙咪嗪(Imipramine)购自美国Sigma公司，临用前用双蒸水配置成10mg/kg浓度，按上述规格给予小鼠腹腔注射。
3、动物及分组 ICR雄性小鼠，体重20-24g。温州医学院实验动物中心提供。
动物随机分为6组，正常对照组，白藜芦醇10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg和80mg/kg四个剂量组以及阳性对照药丙咪嗪组，每组动物12只。
4、实验方法 ①小鼠悬尾实验按照文献(SteruL，ChermatR，ThierryB，etal.Thetail suspensiontesta new method for screeningantidepressants in mice[J].Psychopharmacol，1985，85367.)进行，给药后60min(白藜芦醇i.g.)或者30min(丙咪嗪，i.p.)，在距小鼠尾尖部末梢约2cm的部位用胶布固定于铁架台上，使小鼠头向下悬挂，倒挂于箱子(30cm×30cm×25cm)中，头部距离箱底15cm。开始时，小鼠头部上下左右活动，企图找到攀抓的地方，一段时间后因失望而活动次数减少，即出现间断性不动。观察6min内实验动物行为，并记录后4min内小鼠的不动时间。
②小鼠强迫游泳实验按照文献(Porsolt，RD，Bertin，A，JalfreM，etal.Behavioral despair in micea primary screening test forantidepressants[J].Arch lnt Pharmacadyn Ther，1977，229327.)进行，正式测试前24h，将小鼠置于水深10cm的玻璃大烧杯(1500ml)中，水温(24±1)℃，作游泳训练15min。给药后60min(白藜芦醇，i.g.)或者30min(丙咪嗪，i.p.)，再次将小鼠置于水深10cm的玻璃大烧杯内强迫游泳6min，观察记录后4min内小鼠的不动时间。小鼠放入水中后即游泳，寻找栖息的地方，一段时间后便因失望而漂浮不动，当小老鼠停止挣扎，浮在水中保持不动，或仅作一些必要的轻微动作保持头部浮在水面上的时间视为不动时间。
③小鼠自发活动实验按照文献(Li J X，Zhang Q，Liang J H，etal.Valproate prevents the inductiong，but not the expresionof morphine sensitization in mice[J].Behav Brain Res，2004，52251.)进行，给药后60min(白藜芦醇，i.g.)或者30min(丙咪嗪，i.p.)后将小鼠放人自主活动测试仪的小室内，由内置的摄像头拍摄记录小鼠活动。小鼠适应环境10min后，记录10min内小鼠的活动次数作为自主活动的评价指标。
5、数据统计处理 结果数据用均数±标准差表示，用SPSS11.0统计软件，选用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间差异比较用Dunnett’s test检验。
6、结果统计 ①小鼠悬尾实验结果
注与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01 ②小鼠强迫游泳实验结果
注与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 ③小鼠自发活动实验结果
实施例2小鼠单胺氧化酶，单胺递质及其代谢物含量测定 1、受试药同实施例1 2、阳性对照药二氢溴犬脲胺，4-氢喹啉，司立吉林，氯吉林，5-羟色胺(5-HT)，去甲肾上腺素(NA)，多巴胺(DA)，5-羟基异丁酸(5-HIAA)，二羟苯乙酸(DOPAC)均购自美国Sigma公司。吗氯贝胺由军事医学科学院毒物与药物研究所提供，纯度为95％。
3、实验方法 ①单胺氧化酶的测定 给药后60min(白藜芦醇，i.g.)或30min(丙咪嗪，i.p.)，将小鼠快速断头处死，在冰上迅速分离出脑组织，称重后加入4ml冰冷磷酸缓冲液(pH＝7.8，0.05mol/l)制成匀浆液，在2.5ml磷酸缓冲液中加入20％曲通0.4ml和组织匀浆液0.2ml，溶液混合后38℃预孵育10min，在反应液中加入30μl 2.19mmol/L底物(终浓度为22μmol/L)，37℃预孵育30min，在反应液中加入0.2ml 5mol/L高氯酸溶液，冷却并离心(1500×g，10min)，在0.5ml上清液中加入1mol/L氢氧化钠溶液2.5ml。通过荧光分光光度计在激发光318nm，发射光380nm处测定产物4-氢喹啉的荧光强度。单胺氧化酶活性以nmol/30min/mg protein表示。采用Bradford法测定蛋白含量。
②单胺递质及其代谢物含量测定 给药后60min(白藜芦醇，i.g.)或30min(丙咪嗪，i.p.)，将小鼠快速断头处死，在冰上迅速分离出额叶皮层、海马和下丘脑，称重后放入Eppendorf管中，置于-80℃冰箱中保存。
每100mg脑组织中加入200μl冰冷A液(0.4mol/L HCLO4)，冰浴中超声匀浆，4℃避光静置60min，离心20min(12,000rpm，4℃)，取上清液，加入半量体积的B液(0.2mol/L柠檬酸钾，0.3mol/L K2HPO4和0.2mol/L EDTA)，涡旋混匀10min，4℃避光静置60min，再次离心20min(12,000rpm，4℃)，取上清液进行单胺测定。
脑组织中5-HT、NA、DA、5-HIAA和DOPAC的含量采用高效液相电化学法测定。样品上清液过滤(孔径0.22μm)处理后，取20μl自动进样。色谱柱为Diamonsilim C18(150×4.6mm I.D.，5μm)，流动相组成125mmol/L枸橼酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.3)，0.1mmol/LEDTA，1.2mmol/L辛烷基磺酸钠，16％甲醇。流速1.0ml/min。检测器工作电压分别为50，100，200，300，400和500mV。脑组织中单胺及其代谢产物的含量以ng/g湿组织重表示。
4、实验结果 ①小鼠脑内单胺氧化酶活性的测定(n＝8，均数±标准差)
注与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 ②小鼠不同脑区单胺递质及其代谢产物含量测定 表一白藜芦醇对小鼠额叶皮层脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n＝8，均数±标准差)
注与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 表二白藜芦醇对小鼠海马脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n＝8，均数±标准差)
注与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 表三白藜芦醇对小鼠下丘脑脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n＝8，均数±标准差)
注与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 本实验已对白藜芦醇的抗抑郁作用做了初步研究，采用经典小鼠行为绝望实验模型(悬尾和强迫游泳实验)，从行为药理学和神经化学的角度探讨了白藜芦醇的抗抑郁作用。结果显示，白藜芦醇具有一定的抗抑郁作用，能显著减少小鼠在悬尾和强迫游泳实验中的不动时间。研究显示白藜芦醇能明显增加小鼠额叶皮层和海马中5-HT含量，下丘脑和纹状体中NA和DA含量也有一定增加。单胺氧化酶活性测定实验发现，白藜芦醇能明显抑制单胺氧化酶活性A的活性，对单胺氧化酶B活性也有一定抑制作用。
权利要求
1.白藜芦醇用于制备治疗抑郁症药物的用途。
全文摘要
本发明涉及白藜芦醇用于制备治疗抑郁症药物的用途，经过动物实验证明白藜芦醇具有较好的抗抑郁作用，是一种较有发展前途的天然抗抑郁剂，可用于制备治疗抑郁症的药物。
文档编号A61P25/24GK101721396SQ200910154160
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月9日 优先权日2009年11月9日
发明者徐英, 潘建春, 李高文, 李 善, 尤文挺 申请人:温州医学院
技术领域：
本发明涉及白藜芦醇的一种新用途，特别是涉及白藜芦醇用于制备治疗抑郁症药物的用途。
背景技术：
抑郁症是一种中枢神经系统致残性疾病，随着社会现代化进程的加快，各种应激因素导致的抑郁症已成为现代社会的常见病和多发病。目前全世界约有3％-5％的人罹患抑郁症，位居致残性疾病的首位。发病率高且难以根治的抑郁症正悄悄地构建可观的抗抑郁药市场，这正是近年来国内外对中枢神经系统药物的研究和开发特别活跃的主要原因之一。所以，研究和开发新型、高效、低毒副作用的抗抑郁药始终是精神药理学领域的一个重要研究课题。由于抑郁症的病因复杂，涉及到交感神经、内分泌和免疫系统等机体多个方面。“单胺假说”是抑郁症机制研究的主流观点，认为单胺类神经递质(5-羟色胺、去甲肾上腺素和多巴胺神经递质)在抑郁症的病因、病理中起关键作用。目前临床上使用的抗抑郁药一般是通过影响单胺递质的重吸收、抑制单胺的代谢或阻断突触前抑制性自主或非自主受体而发挥作用。药物大致可分成三类1.单胺重摄取抑制剂；2.单胺氧化酶抑制剂；3.5-HT受体拮抗剂。由于临床上使用的这些药物大约只对65％的病人起效，而且许多药物疗效并不稳定，毒副作用较大，生物利用度不高，一般要在2-4周起效。因此，从天然植物中开发安全有效、毒副作用小，生物利用度高的天然抗抑郁药成为这一领域的研究方向。白藜芦醇(Resveratrol)是一种多酚类物质，其化学式为3，5，4′-三羟基二苯乙烯(3，5，4′-trihydroxysitlbene)，广泛存在于天然植物中，尤其在葡萄科植物果皮中含量最高。白藜芦醇为脂溶性物质，易通过血脑屏障。研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、免疫调节、抗衰老及预防神经退行性疾病等作用，目前尚未见将白藜芦醇用于治疗抑郁症的研究报道。
发明内容
本发明的目的提供白藜芦醇的一种新用途。
经过动物实验发现白藜芦醇具有较好的抗抑郁作用，是一种较有发展前途的天然抗抑郁剂，可用于制备治疗抑郁症的药物。
具体实施例方式 以下通过实施例说明本发明。
实施例1小鼠悬尾实验，强迫游泳实验，自主活动实验 1、受试药物 名称白藜芦醇(Resveratrol) 性状类白色精细粉末，气特殊，味淡，从虎杖中提取 来源购自陕西森佛生物技术有限公司，纯度为98％ 药物的配置用0.5％浓度的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解白藜芦醇，分别配成10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg和80mg/kg四个剂量，按0.1ml/10g剂量给予小鼠灌胃口服。
2、对照药物 盐酸丙咪嗪(Imipramine)购自美国Sigma公司，临用前用双蒸水配置成10mg/kg浓度，按上述规格给予小鼠腹腔注射。
3、动物及分组 ICR雄性小鼠，体重20-24g。温州医学院实验动物中心提供。
动物随机分为6组，正常对照组，白藜芦醇10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg和80mg/kg四个剂量组以及阳性对照药丙咪嗪组，每组动物12只。
4、实验方法 ①小鼠悬尾实验按照文献(SteruL，ChermatR，ThierryB，etal.Thetail suspensiontesta new method for screeningantidepressants in mice[J].Psychopharmacol，1985，85367.)进行，给药后60min(白藜芦醇i.g.)或者30min(丙咪嗪，i.p.)，在距小鼠尾尖部末梢约2cm的部位用胶布固定于铁架台上，使小鼠头向下悬挂，倒挂于箱子(30cm×30cm×25cm)中，头部距离箱底15cm。开始时，小鼠头部上下左右活动，企图找到攀抓的地方，一段时间后因失望而活动次数减少，即出现间断性不动。观察6min内实验动物行为，并记录后4min内小鼠的不动时间。
②小鼠强迫游泳实验按照文献(Porsolt，RD，Bertin，A，JalfreM，etal.Behavioral despair in micea primary screening test forantidepressants[J].Arch lnt Pharmacadyn Ther，1977，229327.)进行，正式测试前24h，将小鼠置于水深10cm的玻璃大烧杯(1500ml)中，水温(24±1)℃，作游泳训练15min。给药后60min(白藜芦醇，i.g.)或者30min(丙咪嗪，i.p.)，再次将小鼠置于水深10cm的玻璃大烧杯内强迫游泳6min，观察记录后4min内小鼠的不动时间。小鼠放入水中后即游泳，寻找栖息的地方，一段时间后便因失望而漂浮不动，当小老鼠停止挣扎，浮在水中保持不动，或仅作一些必要的轻微动作保持头部浮在水面上的时间视为不动时间。
③小鼠自发活动实验按照文献(Li J X，Zhang Q，Liang J H，etal.Valproate prevents the inductiong，but not the expresionof morphine sensitization in mice[J].Behav Brain Res，2004，52251.)进行，给药后60min(白藜芦醇，i.g.)或者30min(丙咪嗪，i.p.)后将小鼠放人自主活动测试仪的小室内，由内置的摄像头拍摄记录小鼠活动。小鼠适应环境10min后，记录10min内小鼠的活动次数作为自主活动的评价指标。
5、数据统计处理 结果数据用均数±标准差表示，用SPSS11.0统计软件，选用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间差异比较用Dunnett’s test检验。
6、结果统计 ①小鼠悬尾实验结果
注与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01 ②小鼠强迫游泳实验结果
注与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 ③小鼠自发活动实验结果
实施例2小鼠单胺氧化酶，单胺递质及其代谢物含量测定 1、受试药同实施例1 2、阳性对照药二氢溴犬脲胺，4-氢喹啉，司立吉林，氯吉林，5-羟色胺(5-HT)，去甲肾上腺素(NA)，多巴胺(DA)，5-羟基异丁酸(5-HIAA)，二羟苯乙酸(DOPAC)均购自美国Sigma公司。吗氯贝胺由军事医学科学院毒物与药物研究所提供，纯度为95％。
3、实验方法 ①单胺氧化酶的测定 给药后60min(白藜芦醇，i.g.)或30min(丙咪嗪，i.p.)，将小鼠快速断头处死，在冰上迅速分离出脑组织，称重后加入4ml冰冷磷酸缓冲液(pH＝7.8，0.05mol/l)制成匀浆液，在2.5ml磷酸缓冲液中加入20％曲通0.4ml和组织匀浆液0.2ml，溶液混合后38℃预孵育10min，在反应液中加入30μl 2.19mmol/L底物(终浓度为22μmol/L)，37℃预孵育30min，在反应液中加入0.2ml 5mol/L高氯酸溶液，冷却并离心(1500×g，10min)，在0.5ml上清液中加入1mol/L氢氧化钠溶液2.5ml。通过荧光分光光度计在激发光318nm，发射光380nm处测定产物4-氢喹啉的荧光强度。单胺氧化酶活性以nmol/30min/mg protein表示。采用Bradford法测定蛋白含量。
②单胺递质及其代谢物含量测定 给药后60min(白藜芦醇，i.g.)或30min(丙咪嗪，i.p.)，将小鼠快速断头处死，在冰上迅速分离出额叶皮层、海马和下丘脑，称重后放入Eppendorf管中，置于-80℃冰箱中保存。
每100mg脑组织中加入200μl冰冷A液(0.4mol/L HCLO4)，冰浴中超声匀浆，4℃避光静置60min，离心20min(12,000rpm，4℃)，取上清液，加入半量体积的B液(0.2mol/L柠檬酸钾，0.3mol/L K2HPO4和0.2mol/L EDTA)，涡旋混匀10min，4℃避光静置60min，再次离心20min(12,000rpm，4℃)，取上清液进行单胺测定。
脑组织中5-HT、NA、DA、5-HIAA和DOPAC的含量采用高效液相电化学法测定。样品上清液过滤(孔径0.22μm)处理后，取20μl自动进样。色谱柱为Diamonsilim C18(150×4.6mm I.D.，5μm)，流动相组成125mmol/L枸橼酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.3)，0.1mmol/LEDTA，1.2mmol/L辛烷基磺酸钠，16％甲醇。流速1.0ml/min。检测器工作电压分别为50，100，200，300，400和500mV。脑组织中单胺及其代谢产物的含量以ng/g湿组织重表示。
4、实验结果 ①小鼠脑内单胺氧化酶活性的测定(n＝8，均数±标准差)
注与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 ②小鼠不同脑区单胺递质及其代谢产物含量测定 表一白藜芦醇对小鼠额叶皮层脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n＝8，均数±标准差)
注与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 表二白藜芦醇对小鼠海马脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n＝8，均数±标准差)
注与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 表三白藜芦醇对小鼠下丘脑脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n＝8，均数±标准差)
注与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 本实验已对白藜芦醇的抗抑郁作用做了初步研究，采用经典小鼠行为绝望实验模型(悬尾和强迫游泳实验)，从行为药理学和神经化学的角度探讨了白藜芦醇的抗抑郁作用。结果显示，白藜芦醇具有一定的抗抑郁作用，能显著减少小鼠在悬尾和强迫游泳实验中的不动时间。研究显示白藜芦醇能明显增加小鼠额叶皮层和海马中5-HT含量，下丘脑和纹状体中NA和DA含量也有一定增加。单胺氧化酶活性测定实验发现，白藜芦醇能明显抑制单胺氧化酶活性A的活性，对单胺氧化酶B活性也有一定抑制作用。
权利要求
1.白藜芦醇用于制备治疗抑郁症药物的用途。
全文摘要
本发明涉及白藜芦醇用于制备治疗抑郁症药物的用途，经过动物实验证明白藜芦醇具有较好的抗抑郁作用，是一种较有发展前途的天然抗抑郁剂，可用于制备治疗抑郁症的药物。
文档编号A61P25/24GK101721396SQ200910154160
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月9日 优先权日2009年11月9日
发明者徐英, 潘建春, 李高文, 李 善, 尤文挺 申请人:温州医学院
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