原花青素用于制备治疗抑郁症药物的用途的制作方法

专利名称：：原花青素用于制备治疗抑郁症药物的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及原花青素的一种新用途，特别是涉及原花青素用于制备治疗抑郁症药物的用途。
背景技术：
：随着社会现代化进程的加快，各种应激因素导致的抑郁症已成为现代社会的常见病和多发病，其发病率正在快速攀升。据统计，目前全世界罹患抑郁症的患者占总人口的3%_5%。发病率高且难以根治的抑郁症正悄悄地构建可观的抗抑郁药市场，这正是近年来国内外对中枢神经系统药物的研究和开发特别活跃的主要原因之一。所以，研究和开发新型、高效、低毒副作用的抗抑郁药始终是精神药理学领域的一个重要研究课题。现有的各类化学合成的抗抑郁药虽具有肯定的疗效，但大多数存在抗抑郁谱窄、副作用大、药价高和易复发等缺点。因此，从植物中尤其是传统中草药中寻找高效、低毒的抗抑郁药成为此领域的一个新的研究方向。原花青素(Proanthocyanidins)是一种多酚类化合物，由5，7，3，4，-四羟基黄烷-三醇(5，7，3'，4'-tetrahydroxyflavan-3-ol)聚合物构成，是由儿茶素、表儿茶素形成的聚合物。原花青素按其聚合度分为单聚体、低聚体和多聚体，其中二聚体至四聚体称低聚体(OlipomericProcyanidins，0PC)，五聚体到十聚体称多聚体(PolymericProcyanidinsPPC)。0PC为水溶性物质，易吸收；PPC为脂溶性物质，容易通过脑血屏障(bloodbrainbarrier,BBB)，水溶性较差。在各类原花青素中，二聚体分布最广，研究最多，是重要的一类原花青素。原花青素广泛存在于植物的种子、果实和树皮中。松树皮和葡萄籽中原花青素的含量最高，其中葡萄籽中可高达95%，目前对葡萄籽原花青素提取物的研究最多。药理学大量研究表明葡萄籽原花青素提取物具有抗氧化、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等生物活性，对数十种植物的原花青素的低聚体和高聚体进行的药理学研究发现不同聚合度的原花青素有不同的功效，低聚物能够预防海尔默兹病，改善学习记忆，具有神经保护的作用，而对多聚物的中枢研究甚少，目前尚未见将原花青素用于治疗抑郁症的研究报道。
发明内容本发明的目的提供原花青素的一种新用途。经过动物实验发现原花青素具有较好的抗抑郁作用，是一种较有发展前途的天然抗抑郁剂，可用于制备治疗抑郁症的药物。具体实施例方式以下通过实施例说明本发明。实施例1:小鼠悬尾实验，强迫游泳实验，自主活动实验1、受试药物名称原花青素(ProEmthocyanidin)性状褐色粉末，从葡萄籽中提取来源购自天津尖峰天然产物研究开发有限公司，纯度>95%药物的配置用0.5%浓度的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解原花青素，分别配成12.5mg/kg，25mg/kg和50mg/kg三个剂量，按0.lml/10g剂量给予小鼠灌胃口服。2、对照药物盐酸丙咪嗪(Imipramine):购自美国Sigma公司，临用前用双蒸水配置成10mg/kg浓度，按上述规格给予小鼠腹腔注射。3、动物及分组ICR雄性小鼠，体重20-24g。温州医学院实验动物中心提供。动物随机分为5组，正常对照组，原花青素12.5mg/kg，25mg/kg和50mg/kg三个剂量组以及阳性对照药丙咪嗪组，每组动物12只。4、实验方法①小鼠悬尾实验按照文献(SteruL，ChermatR，ThierryB，etal.Thetailsuspensiontest:anewmethodforscreeningantid印ressantsinmice[J].Psychopharmacol，1985,85:367.)进行，给药后60min(原花青素)或者30min(丙咪嗪，ip)，在距小鼠尾尖部末梢约2cm的部位用胶布固定于铁架台上，使小鼠头向下悬挂，倒挂于箱子(30cmX30cmX25cm)中，头部距离箱底15cm。开始时，小鼠头部上下左右活动，企图找到攀抓的地方，一段时间后因失望而活动次数减少，即出现间断性不动。观察6min内实验动物行为，并记录后4min内小鼠的不动时间。②小鼠强迫游泳实验按照文献(Porsolt，RD，Bertin，A，JalfreM，etal.Behavioraldespairinmice:aprimaryscreeningtestforantidepressants[J].ArchlntPharmacadynTher，1977，229:327.)进行，正式测试前24h，将小鼠置于水深10cm的玻璃大烧杯(1500ml)中，水温(24士l)t:，作游泳训练15min。给药后60min(原花青素)或者30min(丙咪嗪，ip)，再次将小鼠置于水深10cm的玻璃大烧杯内强迫游泳6min，观察记录后4min内小鼠的不动时间。小鼠放入水中后即游泳，寻找栖息的地方，一段时间后便因失望而漂浮不动，当小老鼠停止挣扎，浮在水中保持不动，或仅作一些必要的轻微动作保持头部浮在水面上的时间视为不动时间。③小鼠自发活动实验按照文献(LiJX，ZhangQ，LiangJH，etal.Valproatepreventstheinductiong，butnottheexpresionofmorphinesensitizationinmice[J].BehavBrainRes，2004，52:251.)进行，给药后60min(原花青素，ig)或者30min(丙咪嗪，ip)后将小鼠放人自主活动测试仪的小室内，由内置的摄像头拍摄记录小鼠活动。小鼠适应环境10min后，记录lOmin内小鼠的活动次数作为自主活动的评价指标。5、数据统计处理结果数据用均数±标准差表示，用SPSSll.O统计软件，选用单因素方差分析(one-wayANOVA)，组间差异比较用Dunnett'stest检验。6、结果统计①小鼠悬尾实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01，微P<0.001②小鼠强迫游泳实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01，微P<0.001③小鼠自发活动实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2:小鼠单胺氧化酶，单胺递质及其代谢物含量测定1、受试药同实施例12、阳性对照药二氢溴犬脲胺，4-氢喹啉，司立吉林，氯吉林，5-羟色胺(5-HT)，去甲肾上腺素(NA)，多巴胺(DA)，5-羟基异丁酸(5-HIAA)，二羟苯乙酸(D0PAC)均购自美国Sigma公司。吗氯贝胺由军事医学科学院毒物与药物研究所提供，纯度为95%。3、实验方法①单胺氧化酶的测定给药后60min(原花青素，p.o.)或30min(丙咪嗪，i.p.)，将小鼠快速断头处死，在冰上迅速分离出脑组织，称重后加入4ml冰冷磷酸缓冲液(pH=7.8，0.05mol/l)制成匀浆液，在2.5ml磷酸缓冲液中加入20%曲通O.4ml和组织匀浆液O.2ml，溶液混合后38。C预孵育10min，在反应液中加入30iU2.19mmol/L底物(终浓度为22ymol/L)，37。C预孵育30min，在反应液中加入0.2ml5mol/L高氯酸溶液，冷却并离心(1500Xg，lOmin)，在0.5ml上清液中加入lmol/L氢氧化钠溶液2.5ml。通过荧光分光光度计在激发光318nm，发射光380nm处测定产物4-氢喹啉的荧光强度。单胺氧化酶活性以nmol/30min/mgprotein表示。采用Bradford法测定蛋白含量。②单胺递质及其代谢物含量测定给药后60min(原花青素，p.o.)或30min(丙咪嗪，i.p.)，将小鼠快速断头处死，在冰上迅速分离出额叶皮层、海马和下丘脑，称重后放入E卯endorf管中，置于_80°C冰箱中保存。每100mg脑组织中加入200y1冰冷A液(0.4mol/LHCL04)，冰浴中超声匀桨，4°C避光静置60min，离心20min(12，OOOrpm，4°C)，取上清液，加入半量体积的B液(0.2mol/L柠檬酸钾，0.3mol/LK2HP04和0.2mol/LEDTA)，涡旋混匀10min，4"C避光静置60min，再次离心20min(12，000rpm，4。C)，取上清液进行单胺测定。脑组织中5-HT、NA、DA、5-HIAA和DOPAC的含量采用高效液相电化学法测定。样品上清液过滤(孔径0.22iim)处理后，取20iU自动进样。色谱柱为DiamonsilimC18(150X4.6mmI.D.，5ym)，流动相组成125mmol/L枸橼酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=4.3)，0.lmmol/LEDTA，1.2mmol/L辛烷基磺酸钠，16%甲醇。流速1.Oml/min。检测器工作电压分别为50，100，200，300，400和500mV。脑组织中单胺及其代谢产物的含量以ng/g湿组织重表示。4、实验结果①小鼠脑内单胺氧化酶活性的测定(n=8，均数±标准差)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01，微P<0.001②小鼠不同脑区单胺递质及其代谢产物含量测定表一原花青素对小鼠额叶皮层脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n=8，均数±标准差)组别剂量额叶皮层(ng/g)(mg/kg)5-HT5-HIAA5-HIAA/5-HTNoradrenalineDopamine正常组515.3±28.2125.5±13.50.24±0.02273.9±15.517.4±3.3原花青素组12.5520.5±28.1123.2±9.40.24±0.02274.3±17.219.0±2.725605.6±22.2*125.1±14.20.21±0.02299.0±18.923.3±2.550628.8±24.0*'113.8±6.30.18±0.01'334.9士24,4'29.3±4.6'丙咪嗪组10609.9±24.4'112.4±6.40.18±0.0r338.5±21.8*19.6±2.1注与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01表二原花青素对小鼠海马脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n=8，均数±标准差)组别剂量(mg/kg)海马(ng/g)5-HT5-HIAA5-HIAA/5-HTNoradrenalineDopamine正常组615.9±22.1195.1±100.32±0.02283,7±12.423.6±4.1原花青素组12.5635.5±14.7184.7±90.29±0.01271.8±18.522.6±2.425692.0±24.3'174.8±90.25土0.01""281.5±19.730.5±3.650708.5±19.9'*179.9±13.60.25±0.01"342.0±15.9'36.1±3.3'丙咪嗪组10702.4±20.8"180.2±11.70.26±0.02*'349.6±27.8'34.1±2.4'注与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01表三原花青素对小鼠下丘脑脑区单胺递质及其代谢产物含量的影响(n=8，均数±标准差)组别剂量(mg/kg)下丘脑(ng/g)5-HT5-HIAA5-HIAA/5-HTNoradrenalineDopamine正常组424.4±23.394.9±7.40.22±0.01299.4±19.316.1±1.8原花青素组12.5426.3±26.792.6±11.70.22±0.02302.0±21.218.4±2.025493.8±13.7'103.5±8.60.21±0.02317.1±16.621.1±2.050549.5±20.5"96.8±6.30.18±0.03345.4±12.220.9±1.6丙咪嗪组10510.0±28.7*89.0±13.50.17±0.02'368.0±21.8'17.5±2.7注与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01上述实验采用小鼠悬尾和强迫游泳模型，测定不同脑区单胺氧化酶活性，从药理学和神经化学的角度探讨了原花青素的抗抑郁作用，结果显示，给药1天和7天后，原花青素的抗抑郁作用与经典抗抑郁药丙咪嗪作用相似，能显著减少小鼠在悬尾和强迫游泳实验中的不动时间，而对自主活动没有明显影响。原花青素能抑制单胺氧化酶A的活性，对单胺递质合成和代谢的影响是原花青素抗抑郁作用的机制之一。权利要求原花青素用于制备治疗抑郁症药物的用途。全文摘要本发明涉及原花青素用于制备治疗抑郁症药物的用途，经过动物实验证明原花青素具有较好的抗抑郁作用，是一种较有发展前途的天然抗抑郁剂，可用于制备治疗抑郁症的药物。文档编号A61P25/00GK101716170SQ20091015416公开日2010年6月2日申请日期2009年11月9日优先权日2009年11月9日发明者尤文挺,徐英,李善,李高文,潘建春申请人:温州医学院