脑膜炎球菌缀合物疫苗的整合的制作方法
专利名称：脑膜炎球菌缀合物疫苗的整合的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的疫苗。具体地说，涉及以多种脑膜炎球菌血清型的缀合荚膜糖为基础的疫苗。
背景技术：
根据(微)生物的荚膜多糖，已鉴定了12种脑膜炎奈瑟球菌的血清型(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。A组是最常涉及撒哈拉沙漠(sub-saharan)以南非洲的流行病的病原体。血清型B和C是造成美国和大多数发达国家的绝大多数病例的原因。而血清型W135和Y是造成美国和发达国家的剩余病例的原因。
多年前已经知道血清群A、C、Y和W135的荚膜多糖的四价疫苗[1，2]。虽然在青少年和成年人中有效，但其诱导不佳的免疫应答和不长的保护时间并且不能用于婴儿[例如，参考文献3]，因为这些多糖是导致弱免疫应答且不能加强的T细胞不依赖性抗原。该疫苗中的多糖不能缀合[4]。
人用的血清群C的缀合物疫苗已得到批准，包括MenjugateTM[5]、MeningitecTM和NeisVac-CTM。血清群A+C的缀合物的混合物已知[6-8]，血清群A+C+W135+Y的缀合物的混合物已有报道[9-13]。
尽管脑膜炎球菌缀合物为人所熟知，它们不适用于现有的儿科免疫方案，该方案在发达国家通常包括在出生时(给予)乙肝疫苗，在2个月开始(给予)所有的白喉/破伤风/百日咳(D-T-P)、乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(Hib)缀合物、灭活的脊髓灰质炎病毒和肺炎球菌缀合物。
然而，当将缀合疫苗加入现有免疫方案时，必须解决运载体诱导的表位抑制的问题(或通常所知的“运载体抑制”)，特别是运载体引发产生的抑制。“运载体抑制”是运载体蛋白对动物的预免疫阻止了随后其引发针对该运载体上存在的新抗原性表位的免疫应答的现象[14]。
如参考文献15所报道的，当几种疫苗抗原含有相同的蛋白质组分时(用作缀合物中的免疫原和/或运载体蛋白)，则那些抗原之间可能相互干扰。在参考文献15中，预先存在的针对破伤风类毒素(Tt)的免疫力抑制了对缀合于Tt的抗原的免疫应答。
参考文献16报道了当Hib缀合物的运载体与D-T-P疫苗的破伤风抗原相同时，联用D-T-P疫苗与Hib缀合物是如何起相反作用的。这些作者得出结论当引入包含多种缀合物的疫苗时，应考虑共有蛋白质运载体的相互干扰产生的这种“运载体抑制”现象。
与参考文献15和16相反，参考文献17报道用破伤风类毒素引发对针对后给予的Hib-Tt缀合物的免疫应答无负面影响，但在具有母体获得性(maternally acquired)抗-Tt抗体的患者中观察到抑制作用。然而，参考文献18报道了Tt肽缀合物在因破伤风疫苗接种而具有现有的抗-Tt抗体的患者中有“表位抑制”作用。
参考文献19提示具有CRM197(白喉毒素的解毒突变体)作为运载体的缀合物在以前未接受作为疫苗一部分(例如，作为D-T-P或D-T疫苗的一部分)的白喉毒素的儿童中无效。该项工作在参考文献20中进一步展开，其中观察到D-T免疫所致的运载体引发作用持续至随后用Hib缀合物免疫。
参考文献21的作者发现用白喉或破伤风类毒素运载体蛋白预免疫降低了随后用与这些运载体缀合的Hib荚膜糖免疫所致的抗-Hib抗体水平上升，其对IgG1和IgG2的影响相同。对这些缀合物的运载体蛋白的应答也受到抑制。此外，由于观察到用一种缀合物预免疫影响了针对运载体和4周后给予的第二缀合物的糖部分的免疫应答，可观察到更常见的非表位特异性抑制。
参考文献22报道了不同的运载体蛋白在一种多价肺炎球菌缀合物疫苗中的应用，利用多种运载体是为避免运载体抑制。这些作者预计多价缀合物疫苗可允许而不产生负面干扰的运载体蛋白具有最大负荷量。参考文献23报道了混合有运载体蛋白的肺炎球菌缀合物疫苗在引发抗肺炎球菌应答的同时引发了针对运载体的无意加强应答。
参考文献24研究了白喉和破伤风加强物是否可与单价血清群C脑膜炎球菌缀合物一起给予，发现当运载体是破伤风类毒素运载体并且患者以前接受过含破伤风(抗原)的疫苗免疫时，针对脑膜炎球菌缀合物的滴度降低。
最后，参考文献25报道“以前接触过运载体蛋白质可提高或抑制针对以糖-蛋白质缀合物(形式)给予的多糖的抗体应答”。参考文献25所用的缀合物利用破伤风类毒素或CRM197突变体作为运载体蛋白。
这样混淆了关于运载体引发和/或抑制的情况，任何具体的缀合物是受运载体抑制还是从运载体引发增强中获益仍不清楚。如果该问题不解决，脑膜炎球菌缀合物疫苗不能整合入或加入现有的儿科免疫方案中。此外，因为脑膜炎球菌缀合物要作为四价混合物(即，四种不同的缀合物)给予，运载体抑制风险的可能性变得更甚。
除了用运载体引发对针对糖缀合物的免疫应答具有负面影响之外，也会发生相反的情况，即用缀合物免疫对针对运载体的免疫应答具有负面影响[26]。
发明内容
参考文献27提示应该利用多种类型的运载体蛋白来解决脑膜炎球菌缀合物疫苗中的运载体抑制。参考文献27特别提示应将流感嗜血菌的D蛋白用作脑膜炎球菌缀合物的运载体蛋白，也可用破伤风类毒素(Tt)。为避免表位抑制，D蛋白也是参考文献28所选择的运载体。类似地，参考文献29提示应该利用百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)菌毛作为运载体以避免多价缀合物疫苗中的运载体抑制。相比之下，发现白喉类毒素(Dt)及其衍生物可安全地用作脑膜炎球菌糖缀合物的运载体，即使在同时给予多种脑膜炎球菌缀合物的场合。参考文献24所研究的任一单价血清群C脑膜炎球菌缀合物未利用Dt运载体。
此外，参考文献27也提示脑膜炎球菌缀合物疫苗应作为D-T-P-Hib疫苗同时给予(例如，参见实施例3)，从而不会提前接触脑膜炎球菌缀合物的运载体蛋白。相反，现在发现即使患者早已接受过在前的免疫原形式(例如，在D-T-P或D-T免疫中)或作为以前的运载体蛋白(例如，在Hib缀合物或肺炎球菌缀合物疫苗中)的运载体蛋白，也可给予脑膜炎球菌缀合物。以前对单价血清群C缀合物疫苗中运载体诱导的表位抑制的研究[24]未考虑以前给予任一缀合物的作用。
即使患者早已接受了不同的缀合物，他们产生针对脑膜炎球菌缀合物的免疫应答的能力与参考文献21(所述)相反，也与参考文献27相反。
因此，本发明提供免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的方法，包括给予患者至少包含以下两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；其中患者用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的(微)生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。
本发明也提供了至少以下两种物质在制备用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的药物中的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；其中患者用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的(微)生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。
脑膜炎球菌疾病优选是脑膜炎，更优选是细菌性脑膜炎，最优选是脑膜炎球菌性脑膜炎。因此，本发明可用于保护(人们)免遭导致脑膜炎的脑膜炎球菌干扰。
当预免疫抗原是白喉类毒素的衍生物时，该衍生物优选保留了与Dt，优选CRM197的免疫学交叉反应性。
预免疫的患者待免疫的患者已用以下物质预免疫(a)白喉类毒素或其衍生物的缀合物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的(微)生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物。预免疫通常包括白喉类毒素抗原；利用白喉类毒素或CRM197运载体的Hib荚膜糖缀合物；和/或利用白喉类毒素或CRM197运载体的肺炎球菌荚膜糖缀合物。
患者接受至少一次(例如，1、2、3或多次)剂量的预免疫抗原，该剂量(或多次剂量中最早的一次)至少在用本发明的脑膜炎球菌缀合物免疫6个月前(例如，6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、120、180、240、300或更多个月前)给予。在优选的一组患者中，在出生3年内，例如出生2年内、出生1年内、出生6个月内、或甚至出生3个月、2个月或1个月内进行预免疫。
本发明的待免疫患者一般是人。所述的人通常至少1个月大，例如至少2个月大、至少3个月大、至少4个月大、至少6个月大、至少2岁、至少5岁、至少11岁、至少17岁、至少40岁、至少55岁等。优选的患者组是至少6个月大。另一优选的患者组是2-55岁的年龄组，另一优选的患者组是11-55岁的年龄组。其它优选的患者组是小于11岁，例如2-11岁大。然而，在所有情况中，无论年龄大小，患者将如本文所定义进行预免疫。
当预免疫抗原是白喉类毒素时，患者一般接受类毒素作为D-T-P或D-T预免疫(方案)中的“D”抗原。这种免疫(方案)通常给予2、3和4个月大的新生儿。当免疫(方案)包括百日咳疫苗时，该疫苗可以是完整的细胞或细胞性百日咳疫苗(“Pw”)，但优选无细胞百日咳疫苗(“Pa”)。预免疫Pa疫苗一般包含以下一种、两种或三种熟知并良好鉴定的百日咳博德特菌抗原(1)通过化学方法或定点诱变解毒的百日咳类毒素(“PT”)，例如“9K/129G”突变体[30]；(2)丝状血凝素(“FHA”)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为“69千道尔顿的外膜蛋白”)。无细胞百日咳疫苗也可包含凝集原2和/或凝集原3。D-T预免疫方案中的“T”抗原通常是破伤风类毒素。
当预免疫抗原是白喉类毒素时，患者也可接受或者已接受类毒素作为蛋白质-糖缀合物的运载体蛋白。这种缀合物包括“PRP-D”Hib缀合物[参见参考文献32的表14-7]，例如ProHIBITTM产品。
当预免疫抗原是CRM197时，一般可用Hib缀合物和/或多价肺炎球菌缀合物预免疫患者。这种预免疫通常给予2、3和4个月大的新生儿。利用CRM197运载体的Hib缀合物包括“HbOC”缀合物[参考文献32的表14-7]，例如HibTITERTM产品。利用CRM197运载体的肺炎球菌缀合物包括7-价PCV7混合物，例如PrevNarTM疫苗[31]。也可用血清群C脑膜炎球菌(“MenC”)缀合物预免疫患者。利用CRM197运载体的MenC缀合物包括MeninvactTM/MenjugateTM[5]和MeningitecTM。然而，优选用Hib和/或肺炎球菌缀合物而非MenC缀合物预免疫患者。如果已用MenC缀合物预免疫患者，则根据本发明给予的疫苗可以含有或不含有血清群C缀合物。
当用缀合的抗原预免疫时，由于缀合物的低水平污染(例如，缀合物在保藏期间水解所致)，患者几乎不可避免地也接受了少量的游离白喉类毒素(或衍生物)，但这些少量(污染物)一般足以造成显著的免疫应答。
白喉类毒素是熟知且充分鉴定的蛋白质[例如，参见参考文献32的第13章]，它可以通过用灭活性化学物质，例如福尔马林或甲醛处理白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的ADP-核糖基化外毒素获得。CRM197也是熟知且充分鉴定的[33-36]，并广泛用作缀合的糖疫苗中的运载体。CRM197和Dt共有许多运载体表位。
预免疫的结果是患者的免疫系统已与预免疫抗原接触。就用白喉类毒素(Dt)预免疫而言，患者将接受的该通用方法可产生抗-Dt抗体应答(一般产生＞0.01IU/ml的抗-Dt滴度)和具有对Dt特异的记忆B和/或T淋巴细胞，即用Dt预免疫一般足以在患者体内引发回忆抗-Dt免疫应答。就其中Dt(或衍生物)是缀合物中糖的运载体的预免疫而言，预免疫可产生抗-糖应答，患者将具有对糖特异的记忆B和/或T淋巴细胞，即预免疫一般足以在患者体内引发回忆抗-糖免疫应答。预免疫优选足以在患者体内引发保护性免疫力，例如针对白喉疾病。
因此，根据本发明免疫的患者不同于普通患者，因为他们是普通人群中免疫系统早已针对预免疫抗原产生免疫应答的亚组的成员，从而使得根据本发明用包含白喉类毒素(或其衍生物)运载体的脑膜炎球菌缀合物免疫在所述亚组中引发了与在以前未产生针对预免疫抗原的免疫应答的患者中不同的免疫应答。优选用Dt(或衍生物)作为缀合物(特别是Hib缀合物)的运载体来预免疫的患者。特别优选用Dt(或衍生物)作为缀合物的运载体，和也用Dt作为未缀合的免疫原来预免疫的患者。
患者可以用其它抗原，以及用缀合或非缀合形式的白喉类毒素(或衍生物)来预免疫。这种抗原包括但不限于上述的百日咳抗原；上述破伤风抗原；上述乙型流感嗜血菌；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；脊髓灰质炎病毒，例如灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)；上述的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；流感病毒；BCG；甲型肝炎病毒抗原；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒；水痘病毒等。
患者可用或未用一种或多种脑膜炎球菌缀合物预免疫。在一些优选的实施方案中，在患者第一次接受脑膜炎球菌缀合物之时，他们已用Dt(或衍生物)预免疫。在其它实施方案中，给予已用(i)Dt或衍生物和(ii)脑膜炎球菌缀合物预免疫的患者脑膜炎球菌缀合物。
缀合物(conjugate)本发明用缀合的糖免疫患者。缀合用于提高糖的免疫原性，因为缀合将糖从T-细胞不依赖性抗原转化为T-细胞依赖性抗原，从而可以引发免疫记忆。缀合对儿科疫苗特别有用[例如，参考文献37]，它是熟知的技术[例如，参考文献38-46的综述]。
本发明所用的组合物含有至少两种脑膜炎球菌缀合物，其中每种缀合物含有白喉类毒素(或其衍生物)运载体蛋白和荚膜糖。荚膜糖选自血清群A、C、W135和Y脑膜炎球菌，从而使组合物含有这四种血清群的2种、3种或所有4种的糖。具体的组合物含有以下糖血清群A和C；血清群A和W135；血清群A和Y；血清群C和W135；血清群C和Y；血清群W135和Y；血清群A和C和W135；血清群A和C和Y；血清群A和W135和Y；血清群C和W135和Y；血清群A和C和W135和Y。最优选含有所有四种血清群的糖的组合物。
这四种血清群中任一种的荚膜糖已充分鉴定。血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖是在C3和C4位有部分O-乙酰化的(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物可用阻断基团取代乙酰基以防水解[47]，这种修饰的糖仍是本发明意义内的血清群A糖。血清群C荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸或“NeuNAc”)的均聚物。大多数血清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8具有O-乙酰基，但约15％的临床分离物缺乏这些O-乙酰基[48、49]。糖结构为→9)-Neu p NAc 7/8OAc-(α2→。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单位的均聚物。与血清群C糖相似，它具有可变的O-乙酰化，但是在唾液酸7和9位[50]。其结构为→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。血清群Y糖与血清群W135糖类似，除了二糖重复单位含有葡萄糖而非半乳糖。与血清群W135相似，它在唾液酸7和9位具有可变的O-乙酰化[50]。血清群Y(糖)的结构为→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。
本发明所用的糖如上所述可以O-乙酰化(例如，与天然荚膜糖中观察到的O-乙酰化模式相同)，或者它们可在糖环的一个或多个位置部分或全部脱O-乙酰化，或者相对于天然荚膜糖，它们可以高度O-乙酰化。
本发明所用的糖优选比细菌中观察到的天然荚膜糖短。因此，这些糖优选是解聚的，解聚发生在纯化后缀合前。解聚降低了糖的链长。优选的解聚方法涉及利用过氧化氢[9]。向糖中加入过氧化氢(例如使最终H2O2浓度达1％)，然后温育混合物(例如，在约55℃)直至降低至所需链长，另一解聚方法涉及酸水解[10]。本领域技术人员已知其它解聚方法。用于制备本发明所用缀合物的糖可以通过任何这些解聚方法获得。可以利用解聚来为免疫原性提供最佳链长和/或为糖的物理可控性而降低链长。
用于缀合物中的典型运载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉毒素(或其CRM197突变体)和破伤风毒素。其它已知的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、合成的肽、热激蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白、流感嗜血菌的D蛋白、肺炎球菌表面蛋白PsPA、铁摄取蛋白、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B等。然而，本发明的脑膜炎球菌缀合物含有白喉类毒素(或其衍生物，例如CRM197)运载体蛋白。优选共价缀合。
组合物中可能利用多种运载体蛋白。因此，不同的运载体蛋白可用于不同的血清群，例如血清群A糖可以与CRM197缀合，而血清群C糖可以与白喉类毒素缀合。具体的糖抗原可利用多种运载体蛋白，例如血清群A糖可分为两部分，一些与CRM197缀合，其它与白喉类毒素缀合。然而，总体上优选组合物中的所有脑膜炎球菌糖，更优选所有糖(即，包含可能存在的任何非脑膜炎球菌缀合物)利用同一运载体蛋白。本发明组合物优选不含有任何破伤风类毒素运载体蛋白。当组合物含有白喉类毒素运载体蛋白时，优选不含有任何CRM197运载体蛋白。
一种运载体蛋白可以携带多种糖抗原[51]。例如，一种运载体蛋白可以与血清群A和C的糖缀合。为实现该目的，可以在缀合反应之前混合糖。然而，总体上优选每种血清群具有单独的缀合物。优选混合缀合物以得到基本上1∶1∶1∶1的比例(以糖的质量测定)，例如每种血清群的糖的质量在彼此的10％之内。组合物中每种血清群的脑膜炎球菌抗原的典型量在1μg和20μg之间，例如每种血清群在2和10μg之间，或约4μg。除了1∶1∶1∶1的比例之外，可利用双血清群A剂量(2∶1∶1∶1)。
优选糖∶蛋白之比(w/w)在1∶15(即，蛋白过量)和15∶1(即糖过量)之间的缀合物，更优选在1∶10和10∶1之间，还要优选在1∶5和5∶1之间。优选运载体蛋白过量。优选糖∶蛋白之比为约1∶12或约1∶6或约1∶3的缀合物，特别是当运载体是Dt时，最优选1∶3的比例。
缀合物可以与游离的运载体蛋白联用[52]。然而，当给定的运载体蛋白在本发明组合物中同时以游离和缀合的形式存在时，未缀合的形式优选不超过组合物中运载体蛋白总量的5％，更优选以重量计小于2％。类似地，未缀合的糖以重量计优选不超过糖总量的15％。
可利用任何合适的缀合反应，如果需要可以利用任何合适的接头。
糖在缀合前一般可以活化或功能化。活化可涉及，例如氰化试剂，如CDAP(如，四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶[53、54等])。其它合适的技术利用碳二亚胺、肼、活性酯、正硼烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也参见参考文献44的引言)。
可利用任何已知的方法，例如参考文献55和56所述的方法经接头基团制成连接键(linkage)。一种类型的连接键涉及多糖的还原性胺化、将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质与该己二酸接头基团的一端缀合[42、57、58]。其它接头包括B-丙酰胺基[59]、硝基苯基-乙胺[60]、卤代酰卤(haloacyl halide)[61]、糖苷键[62]、6-氨基己酸[63]、ADH[64]、C4到C12组分[65]等。除了利用接头之外，可利用直接连接。蛋白质的直接连接包括如参考文献66和67所述的多糖氧化，然后与蛋白质进行还原性胺化。
优选的方法包括将氨基引入糖(例如，通过用-NH2取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(例如，己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)进行衍生并与运载体蛋白反应。
在一优选的缀合方法中，糖与己二酸二酰肼(dihydrazide)反应。就血清群A而言，也可在此阶段加入碳二亚胺。反应一段时间后，加入氰基硼氢化钠。然后可通过，例如超滤制备衍生的糖。衍生的糖再与运载体蛋白(例如，与白喉类毒素)混合并加入碳二亚胺。反应一段时间后，回收缀合物。该缀合方法的其它细节见参考文献10。通过此方法得到的缀合物是本发明所用的优选缀合物，例如含有白喉类毒素运载体和己二酸接头的缀合物。
优选分开制备缀合物，然后混合。混合后，可用例如无菌的无热源磷酸缓冲盐水调节所混合缀合物的浓度。混合前，每种缀合物优选含有不超过15μg运载体。
就每种所给予的血清群而言，给予本发明脑膜炎球菌缀合物的结果优选为患者产生了血清杀细菌抗体(SBA)应答，SBA滴度增加了(与接受混合脑膜炎球菌缀合物之前的预免疫患者相比)至少4倍，优选至少8倍。SBA检验是对脑膜炎球菌保护(情况)的标准相关(因素)。脑膜炎球菌疫苗的血清学相关性的其它细节见参考文献68。
本发明所用组合物的其它抗原性组分除了脑膜炎球菌缀合物以外，本发明所用组合物可任选含有以下其它抗原的1、2或3种
1.肺炎链球菌的缀合的荚膜糖[例如，参考文献32的第23章；参考文献69-71]优选含有多种血清型的肺炎链球菌的糖。例如，如同含有5到11种不同血清型的多糖的缀合物疫苗一样，可以广泛利用23种不同血清型的多糖的混合物[72]。例如，PrevNarTM[31]含有7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，每种糖分别通过还原性胺化与CRM197缀合，每0.5ml剂量含2μg各种糖(4μg血清型6B)，缀合物吸附在磷酸铝佐剂上。当本发明所用的组合物含有肺炎球菌缀合物时，该组合物优选至少含有血清型6B、14、19F和23F。
2.流感嗜血菌B的缀合的荚膜糖[例如，参考文献32的第14章]用于缀合物的运载体蛋白可以是CRM137、Dt、破伤风类毒素或脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白复合物。缀合物的糖部分可以是多糖(例如，全长的聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP))，但优选解聚荚膜多糖以形成寡糖(例如，分子量为约1到约5kDa)。优选的Hib缀合物含有经己二酸接头与CRM197共价连接的寡糖[73、74]。给予Hib抗原优选导致抗-PRP抗体的浓度大于0.15μg/ml，更优选大于1μg/ml。当组合物含有Hib糖抗原时，其也优选不含有氢氧化铝佐剂。如果组合物含有磷酸铝佐剂，则Hib抗原可以吸附到佐剂上[75]或者可以是非吸附的[27]。可通过选择抗原/佐剂混合期间恰当的pH、具有合适零电荷点的佐剂和组合物中各种不同抗原的合适混合顺序来防止吸附[76]。
3.血清群B脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质抗原[例如，参考文献77]组合物可含有一种或多种这些抗原。
这种抗原可以吸附或不吸附到铝盐上。
如果以一系列剂量给予脑膜炎球菌缀合物，这些剂量中的一些或全部可含有这些额外的抗原。
含有脑膜炎球菌缀合物的组合物优选不含有破伤风类毒素。它们优选不含百日咳抗原。它们优选不含有乙肝病毒表面抗原。它们优选不含有脊髓灰质炎病毒。组合物优选在每种脑膜炎球菌缀合物中含有不超过50μg的白喉类毒素，更优选所有组合的脑膜炎球菌缀合物含有不超过50μg的白喉类毒素。
疫苗组合物本发明所用的组合物通常含有药学上可接受的运载体。这种运载体包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生的任何运载体。合适的运载体通常是大的，代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(例如，油滴或脂质体)。本领域的普通技术人员熟知这种运载体。这些疫苗也可以含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌的无热源磷酸缓冲生理盐水是典型的运载体。对药学上可接受的运载体和赋形剂的充分讨论见参考文献78。
本发明所用的组合物可含有抗微生物剂，特别是如果以多剂量形式包装。
本发明所用的组合物可含有洗涤剂，例如吐温(聚山梨酸酯)，例如吐温80。洗涤剂一般以低水平存在，例如＜0.01％。
本发明所用的组合物可含有钠盐(例如，氯化钠和/或磷酸钠)。这些钠盐可用于(调整)渗透性。NaCl的浓度一般为10±2mg/ml，例如约8.8mg/ml。磷酸钠的浓度一般为1.2mg/ml。
本发明所用的组合物一般含有缓冲液，例如磷酸缓冲液。
本发明所用的组合物可含有，例如约15-30mg/ml(如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，特别是如果组合物要冻干或者如果组合物含有从冻干材料重建的物质。然而，优选不冻干组合物，即所用的脑膜炎球菌缀合物在包装阶段到给药阶段以液体形式存在。
组合物通常直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射入组织的间隙空间)、或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼、耳、肺部或其它粘膜给药进行直接递送。优选肌肉内注射(例如注射到大腿或上肢)。可通过针头注射(例如，皮下注射针)，但也可利用无针注射。肌肉内注射剂量一般是0.5ml。
多种血清群的脑膜炎球菌缀合物混合在一种组合物中给予。组合物可以单剂量给予，或者可以在多剂量方案中多次给予。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案后可进行脑膜炎球菌缀合物的加强剂量方案。可惯常测定引发剂量之间(例如，4-16周之间)和引发与加强之间合适的时间间隔。缀合物可以方便地在其它疫苗(给药)的同时，例如在D-T-P疫苗(给药)的同时、或者在脑膜炎球菌缀合物疫苗(给药)的同时、或者在流感疫苗(给药)的同时、或者在MMR或MMRV疫苗(给药)的同时给予。这些疫苗一般分开给予，但要在同一就诊期间。
细菌感染可影响身体的各个区域，因此组合物可以制备成各种形式。例如，可将组合物制备成液体溶液或悬液的注射剂。也可制备成适合于在注射前溶解于或悬浮于液体载体中的固体形式(例如，冻干的组合物)。可将组合物制备成局部给药的形式，例如软膏、乳膏或粉末。可将组合物制备为口服给药的形式，例如片剂或胶囊，或糖浆(任选调味的)。可利用细粉末或喷雾将组合物制备为肺部给药的形式，例如吸入剂。可将组合物制备为栓剂或阴道栓剂。可将组合物制备为鼻部、耳部或眼部给药的形式，例如喷剂、滴剂、凝胶或粉末[参考文献79和80]。然而，一般将脑膜炎球菌缀合物配制为用于肌肉内注射。
本发明所用的组合物可含有或不含有疫苗佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于A.含有矿物质的组合物适合用作本发明佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐、例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献81的第8和第9章]或不同矿物化合物与采用任何合适形式(例如凝胶、晶体、无定形等)的化合物的混合物，优选吸附(抗原)。也可将含有矿物质的组合物配制为金属盐的颗粒[82]。
特别优选磷酸铝，佐剂一般是PO4/Al之比在0.84-0.92之间，含有约0.6mgAl3+/ml的无定形羟基磷酸铝。可采用低剂量磷酸铝，例如每剂量每种缀合物为50和100μg之间的Al3+来吸附。当组合物含有多种细菌种类的缀合物时，无需吸附所有的缀合物。
B.油乳剂适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂、例如MF59[参考文献81的第10章；也参见参考文献83](5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，利用微流化剂配制成亚微米颗粒)。也可利用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
C.皂苷制剂[参考文献81的第22章]皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶子、茎、根和甚至是花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物。皂树(Quillaia saponaria Molina)的树皮中的皂苷是研究最广泛的佐剂。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)婚纱花(brides veil)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根(soap root))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及液体制剂，例如ISCOM。QS21的商品名为StimulonTM。
也可利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了利用这些技术具体纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。参考文献84公开了QS21的产生方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[85]。
可以联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献81的第23章]。ISCOM一般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用于ISCOM。ISCOM优选含有一种或多种QuilA、QHA和QHC。参考文献85-87进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它洗涤剂[88]。
皂苷佐剂开发的综述见参考文献89和90。
D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种与磷脂任选联用或用磷脂配制的病毒的蛋白质。它们通常是非病原性、非复制性，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白质。参考文献91-96进一步讨论了VLP。例如，参考文献97进一步讨论了病毒体。
E.细菌或微生物衍生物适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。参考文献98公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可通过0.22μm膜无菌过滤。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，例如RC-529[99，100]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A的衍生物，例如OM-174。例如，OM-174描述于参考文献101和102。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。
CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可以是双链或单链的。参考文献103、104和105公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献106-111进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[112]。CpG序列，例如CpG-A ODN特异地诱导Thl免疫应答，或者，例如CpG-B ODN更特异地诱导B细胞应答。参考文献113-115讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。
优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选在它们的3’端相连以形成“免疫聚物”(immunomer)。参见，例如参考文献112和116-118。
细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选来源于大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(病毒)(“CT”)或百日咳(病毒)(“PT”)。参考文献119和参考文献120分别描述了用作粘膜佐剂和胃肠外佐剂的解毒的ADP-核糖基化毒素。毒素或类毒素优选为含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒的突变；B亚基优选未突变。佐剂优选是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献121-128。氨基酸取代的数字参考优选专门全文纳入本文作为参考的参考文献129所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础。
F.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[130]等)[131]、干扰素(如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[132]，或者粘膜粘合剂例如有聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[131]。
H.微粒微粒也可用作本发明的佐剂。
从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。
I.脂质体(参考文献81的第13和14章)
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献134-136。
J.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[137]。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[138]以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[139]。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
L.胞壁酰基肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰基肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制剂描述于，例如参考文献140和141中。
M.咪唑并喹诺酮化合物适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物包括参考文献142和143中进一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，“雷西喹莫特(Resiquimod)3M”)。
N.缩氨基硫脲化合物缩氨基硫脲化合物以及配制、制备和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法包括参考文献144所述的。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有用。
O.色胺酮化合物色胺酮化合物以及配制、制备和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法包括参考文献145所述的。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有用。
本发明也包括联用一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面。例如，以下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳剂[146]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[147]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[148]；(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂[149]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或漩涡产生较大粒度的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)，其中含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(monophosphorylipid A)(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)组成的细菌细胞壁组分，；(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)；和(9)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+免疫刺激寡核苷酸(例如含有CpG基序的核苷酸序列)。
参考文献81的第7章公开了用作免疫刺激剂的其它物质。
特别优选利用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，佐剂通常吸附到这些盐上[例如，参考文献9的实施例7和8；参考文献10的实施例J]。也可能与铝盐混合而无吸附[27，76]。磷酸钙是另一种优选的佐剂。缀合物可以分别与佐剂混合(任选吸附到佐剂上)然后将缀合物混合到一起，或者可将缀合物混合到一起再与佐剂混合。
本发明所用组合物的pH优选在6和8之间，更优选约7。可通过利用缓冲液维持稳定的pH。当组合物含有氢氧化铝盐时，优选利用组氨酸缓冲液[150]。组合物可以是无菌和/或无热源的。组合物相对于人体可以是等渗的。
组合物可含有防腐剂(例如，乙基汞硫代水杨酸钠、2-苯氧基乙醇)或不含防腐剂。本发明的优选组合物不含任何汞的材料，例如它们是无乙基汞硫代水杨酸钠的。
为防止抗原，特别是缀合物抗原之间相互干扰，可以包含聚阴离子聚合物，例如聚-L-谷氨酸[151]。
组合物可存在于小瓶中，或者它们可以存在于预填充注射器中。注射器可装有或不装有针头。注射器含有单剂量的组合物，而小瓶可以含有单剂量或多次剂量。可注射的组合物通常可以是液体溶液或悬液。或者，它们可以固体形式(例如，冻干的)存放，在注射前用液体载体配制成溶液或悬液。
组合物可以包装为单位剂量或多剂量形式。就多剂量形式而言，小瓶优于预填充的注射器。可惯常制定有效的剂量体积，但用于注射的组合物的典型人用剂量体积是0.5ml。
当组合物要在使用前临时配制(例如当组分以冻干形式存在时)并以试剂盒形式存在时，试剂盒可含有两个小瓶，或者可以含有一个预填充注射器和一个小瓶，在注射前利用注射器的内含物再活化小瓶的内含物。就包含血清群A荚膜糖的组合物而言，血清群A糖可以是冻干的，而其它血清群的糖可以液体形式存在。
组合物可以含有免疫有效量的脑膜炎球菌缀合物以及任何其它组分(如果需要)。“免疫有效量”表示给予个体的用量，无论是单剂量或是一系列剂量的部分均能在患者中引发保护性抗-脑膜炎球菌免疫应答。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类学组(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而不同。期望该用量有可通过常规试验确定的相对较宽的范围，每剂量中每种脑膜炎球菌抗原的典型用量是每种血清群1μg和20μg之间(根据糖测定)，例如每种血清群2和10μg之间。优选每种血清群约4μg的剂量(即，四价混合物中共16μg)。
组合物中运载体蛋白的总量优选不超过100μg/剂量，例如≤90μg/剂量、≤80μg/剂量、≤70μg/剂量、≤60μg/剂量、≤50μg/剂量等。组合物中运载体蛋白的总量通常是至少10μg/剂量。
通用术语术语“含有”包括“包括”以及“包含”，例如“含有”X的组合物可排他性地由X组成或者可以包括其它的物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
词汇“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。如果需要，词汇“基本上”可从本发明的定义中省去。
实施本发明的方式利用四价A/C/W135/Y缀合物混合物没有运载体抑制可如参考文献9和10所述制备血清群A+C、C+W+Y或A+C+W+Y的脑膜炎球菌缀合物的混合物。如果需要也可如参考文献9和10所述将它们与氢氧化铝或磷酸铝佐剂混合。这些疫苗具有与糖共价连接的CRM197或白喉类毒素(Dt)作为运载体蛋白。
选择接受儿科D-T-P疫苗接种(D-T-Pa或D-T-Pw)，包括接受含有D-T-P和其它抗原(例如，D-T-P-Hib四价、D-T-P-HBsAg四价、D-T-P-Hib-HBsAg五价、D-T-P-Hib-HBsAg-IPV六价等)的患者接受含有Dt运载体的缀合物混合物。这些缀合物的该四价混合物在人体内是免疫原性的[9、11、13]。
选择接受儿科Hib疫苗接种(含或不含D-T-Pa或D-T-Pw的单价Hib；或例如D-T-P-Hib四价、D-T-P-Hib-HBsAg五价、D-T-P-Hib-HBsAg-IPV六价等的疫苗组合的一部分)的患者接受含有CRM197运载体的缀合物混合物。
选择患者的对照组接受两种缀合物混合物之一。对照患者以前未接受过作为单独抗原或作为缀合物中运载体蛋白的白喉类毒素或CRM197。
评估了四价缀合物在患者中引发免疫应答的能力。如果测试组的抗脑膜炎球菌免疫应答明显低于对照患者，特别是如果缀合物未能在患者中引发有用的SBA应答，则表明存在运载体抑制。
在芬兰和德国利用620名12-16个月大的对象进行的临床试验V59P2中测试了5种制剂。这些疫苗利用CRM197运载体和磷酸铝佐剂[10]。以(μg糖质量/0.5ml剂量)表示的每种血清群糖的剂量如下
对象在0时接受注射，然后25％的对象在4周后接受第二剂量的疫苗。
疫苗给予1个月后收集患者的血清并在利用人补体的针对每种血清群的脑膜炎奈瑟球菌的SBA试验中进行测试。以≥1∶4和≥1∶8为标准评估相对于0时血清的SBA滴度增加。也测定了每种血清群的抗荚膜滴度(GMT)。结果如下表1所示。
因此，三价和四价疫苗在初学走路的儿童体内均是免疫原性。缀合物在低至每种缀合物2.5μg的糖剂量时具有免疫原性。免疫应答可加强，第二剂量后SBA滴度大大增加。在该试验中未观察到运载体抑制的证据。
没有抗-Dt应答的抑制1999年起，比利时的研究[26]显示接受与破伤风类毒素缀合的Hib疫苗的初次疗程后，婴儿时期受损的破伤风免疫力可延续至幼年早期。因此，缀合物的运载体蛋白具有负面的免疫性影响。相反，在肺炎球菌缀合物疫苗的研究中观察到相反的作用[152]。利用血清群C脑膜炎球菌糖与CRM197运载体组成的缀合物(MenjugateTM)研究了脑膜炎球菌缀合物干扰白喉免疫力的可能性[153]。
将儿童分为5组，在出生的第一年按照如下进行免疫(1)四剂量的MenjugateTM；(2)三剂量的MenjugateTM加上一剂量的二价未缀合的A/C混合物；(3)三剂量的HBsAg疫苗，然后给予一剂量的MenjugateTM；(4)三剂量的HBsAg疫苗，然后给予一剂二价未缀合的A/C混合物；(5)对照组不接受脑膜炎球菌疫苗。所有的儿童在出生的头4个月期间也接受三剂量的白喉疫苗，但未接受学龄前(pre-school)白喉加强。
患者在4岁接受单剂量的MenjugateTM，MenjugateTM注射前后(约30天)采血。通过ELISA测定白喉抗体，估计几何平均浓度。也评估了抗体水平≥0.1IU/ml的对象的百分比。结果如下
以前接受过MenjugateTM的患者的基线抗-Dt滴度高于以前未接受过的患者(例如组1与组4比较)。简单的回归分析表明以前MenjugateTM的剂量数(组1、2、3和4分别是4、3、1和0)与(a)疫苗接种前抗-Dt滴度和(b)疫苗接种后抗-Dt滴度有明显的线性关系。
因此，在婴儿期间接受过4剂量MenjugateTM的儿童在4岁时对白喉的免疫力的持久性提高。此外，在婴儿期间接受过至少3剂量MenjugateTM的患者在接受一次加强剂量的MenjugateTM后易具有较高的抗-Dt抗体应答。未发现脑膜炎球菌缀合物和白喉免疫力之间有免疫相互干扰的证据。
二价A/C缀合物混合物显示与DTP无相互干扰血清群A和C的荚膜糖混合物[8]给予以前未接受过DTP疫苗的尼日尔婴儿(5到11周龄)。根据以下6种不同方案，给儿童接受未缀合的糖(每种血清群50μg)或未用佐剂的Dt-缀合糖(每种4μg)(1)4剂量缀合物6周、10周、14周、9个月。
(2)3剂量缀合物6周、10周、14周。
(3)2剂量缀合物14周、9个月。
(4)1剂量缀合物14周。
(5)1剂量缀合物9个月。
(6)1剂量未缀合的(糖)9个月。
儿童在6、10和14周时接受DTP并口服脊髓灰质炎疫苗，在9个月时加强，在与这些现有疫苗相同的时间给予脑膜炎球菌疫苗。为评估回忆应答，在24个月时也给予儿童未缀合的疫苗。
在18周(即，第三次接种DTP/脊髓灰质炎疫苗的4周后)、第10个月(即，在第9个月进行DTP/脊髓灰质炎疫苗加强的1个月后)和在第24个月给予未缀合物质的1周后测定血清杀细菌抗体应答。显示SBA滴度增加≥128倍的患者的百分比如下
在6组之间，针对白喉类毒素的抗体应答无差异[8]。
因此，没有利用白喉类毒素作为保护性抗原和作为缀合物的运载体会导致相互干扰的证据。例如，第5组中的患者在接受第一剂量脑膜炎球菌缀合物前的6、10和14周接受DTP疫苗中的白喉类毒素，但在24个月时显示＞99％的抗脑膜炎球菌SBA应答。
对抗白喉应答没有负面影响如上所述，在(给予)DTP疫苗的同时接受脑膜炎球菌缀合物疫苗的患者显示针对白喉类毒素的免疫应答没有降低。在另一项研究中，在不同时间给予脑膜炎球菌缀合物和DTP。在2、3和4个月大时进行3剂量DTP方案后给予含Dt缀合的糖或含未缀合的糖的单剂量二价A/C疫苗。通过ELISA测定针对白喉类毒素的免疫应答，GM滴度如下
未缀合的糖不引起任何抗-Dt应答(不出意料)，但缀合的糖导致强烈的抗-Dt应答。因此，给予这些缀合物可在初次接受试验的患者(naive patient)中提供抗-白喉免疫力，或者可以替代Dt加强。
应该理解，以上例子只是对本发明的描述，可以作出改进而保持在本发明的范围和构思内。
表1-试验V59P2的结果
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权利要求
1.免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的方法，包括给予人患者至少包含以下两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；其中所述患者用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。
2.免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的方法，包括给予人患者至少包含以下两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；其中所述患者用(a)白喉类毒素和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197的缀合物预免疫。
3.免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的方法，包括给予人患者至少包含以下两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；其中所述患者用(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)CRM197或白喉类毒素的缀合物预免疫。
4.至少以下两种物质在制备免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的药物中的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；其中患者用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。
5.至少以下两种物质在制备免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的药物中的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；其中所述患者用(a)白喉类毒素和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197的缀合物预免疫。
6.至少以下两种物质在制备免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的药物中的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；其中所述患者用(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)CRM197或白喉类毒素的缀合物预免疫。
7.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物含有(a)、(b)、(c)和(d)中的所有4种。
8.如权利要求4到6中任一项所述的应用，其特征在于，所述组合物含有(a)、(b)、(c)和(d)中的所有4种。
9.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者已用含有白喉类毒素的疫苗预免疫过。
10.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者已用含有Hib缀合物的疫苗预免疫过。
11.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者已用含有至少一种肺炎球菌缀合物的疫苗预免疫过。
12.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者在所述方法或应用的至少6个月前预免疫过。
13.如权利要求12所述的方法或应用，其特征在于，所述患者在所述方法或应用的至少8年前预免疫过。
14.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述预免疫在患者出生一年内发生。
15.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎球菌缀合物(a)到(d)中的糖比脑膜炎球菌中观察到的天然荚膜糖短。
16.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎球菌缀合物含有白喉类毒素运载体和己二酸接头。
17.如权利要求16所述的方法或应用，其特征在于，含有不超过60μg的白喉类毒素运载体。
18.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有缀合的肺炎链球菌的荚膜糖。
19.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有缀合的乙型流感嗜血菌的荚膜糖。
20.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有血清群B脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质抗原。
21.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物含有氢氧化铝佐剂和/或磷酸铝佐剂。
22.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟球菌所致疾病是脑膜炎球菌性脑膜炎。
23.如权利要求7所述的方法，或如权利要求8所述的应用，其特征在于-患者在所述方法或应用的至少5年前已用含有白喉类毒素的疫苗预免疫过；-所述脑膜炎球菌缀合物含有白喉类毒素运载体和任选的己二酸接头；-每种血清群的脑膜炎球菌缀合物约有8μg/ml(以脑膜炎球菌糖测定)；-每种缀合物的糖∶运载体重量比是约1∶3；-所述药物含有约96μg/ml的白喉类毒素；-所述药物含有约1.2μg/ml的磷酸钠；和-所述药物含有约8.8μg/ml的氯化钠。
全文摘要
在不远的将来，可将缀合的脑膜炎球菌荚膜糖引入免疫方案，但首先必须解决“运载体抑制”的现象，特别是在要利用多种缀合物的情况下。发现白喉类毒素及其衍生物(例如CRM197)可安全地用作运载体蛋白，即使在同时给予多种脑膜炎球菌缀合物和患者以前接触过该运载体蛋白的情况下，所述运载体蛋白是以前免疫原(例如，在DTP疫苗中)的形式或作为以前运载体蛋白(例如，在Hib或肺炎球菌缀合物疫苗中)。本发明提供免疫患者的方法，包括给予脑膜炎球菌荚膜糖的多种缀合物，其中每种缀合物含有白喉类毒素(或其衍生物)运载体蛋白和荚膜糖，其中所述患者已用白喉类毒素(或其衍生物)预免疫过。
文档编号A61K39/095GK1976724SQ200580013863
公开日2007年6月6日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月30日
发明者C·马歇尔 申请人:启龙有限公司
技术领域：
本发明涉及针对脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的疫苗。具体地说，涉及以多种脑膜炎球菌血清型的缀合荚膜糖为基础的疫苗。
背景技术：
根据(微)生物的荚膜多糖，已鉴定了12种脑膜炎奈瑟球菌的血清型(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。A组是最常涉及撒哈拉沙漠(sub-saharan)以南非洲的流行病的病原体。血清型B和C是造成美国和大多数发达国家的绝大多数病例的原因。而血清型W135和Y是造成美国和发达国家的剩余病例的原因。
多年前已经知道血清群A、C、Y和W135的荚膜多糖的四价疫苗[1，2]。虽然在青少年和成年人中有效，但其诱导不佳的免疫应答和不长的保护时间并且不能用于婴儿[例如，参考文献3]，因为这些多糖是导致弱免疫应答且不能加强的T细胞不依赖性抗原。该疫苗中的多糖不能缀合[4]。
人用的血清群C的缀合物疫苗已得到批准，包括MenjugateTM[5]、MeningitecTM和NeisVac-CTM。血清群A+C的缀合物的混合物已知[6-8]，血清群A+C+W135+Y的缀合物的混合物已有报道[9-13]。
尽管脑膜炎球菌缀合物为人所熟知，它们不适用于现有的儿科免疫方案，该方案在发达国家通常包括在出生时(给予)乙肝疫苗，在2个月开始(给予)所有的白喉/破伤风/百日咳(D-T-P)、乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(Hib)缀合物、灭活的脊髓灰质炎病毒和肺炎球菌缀合物。
然而，当将缀合疫苗加入现有免疫方案时，必须解决运载体诱导的表位抑制的问题(或通常所知的“运载体抑制”)，特别是运载体引发产生的抑制。“运载体抑制”是运载体蛋白对动物的预免疫阻止了随后其引发针对该运载体上存在的新抗原性表位的免疫应答的现象[14]。
如参考文献15所报道的，当几种疫苗抗原含有相同的蛋白质组分时(用作缀合物中的免疫原和/或运载体蛋白)，则那些抗原之间可能相互干扰。在参考文献15中，预先存在的针对破伤风类毒素(Tt)的免疫力抑制了对缀合于Tt的抗原的免疫应答。
参考文献16报道了当Hib缀合物的运载体与D-T-P疫苗的破伤风抗原相同时，联用D-T-P疫苗与Hib缀合物是如何起相反作用的。这些作者得出结论当引入包含多种缀合物的疫苗时，应考虑共有蛋白质运载体的相互干扰产生的这种“运载体抑制”现象。
与参考文献15和16相反，参考文献17报道用破伤风类毒素引发对针对后给予的Hib-Tt缀合物的免疫应答无负面影响，但在具有母体获得性(maternally acquired)抗-Tt抗体的患者中观察到抑制作用。然而，参考文献18报道了Tt肽缀合物在因破伤风疫苗接种而具有现有的抗-Tt抗体的患者中有“表位抑制”作用。
参考文献19提示具有CRM197(白喉毒素的解毒突变体)作为运载体的缀合物在以前未接受作为疫苗一部分(例如，作为D-T-P或D-T疫苗的一部分)的白喉毒素的儿童中无效。该项工作在参考文献20中进一步展开，其中观察到D-T免疫所致的运载体引发作用持续至随后用Hib缀合物免疫。
参考文献21的作者发现用白喉或破伤风类毒素运载体蛋白预免疫降低了随后用与这些运载体缀合的Hib荚膜糖免疫所致的抗-Hib抗体水平上升，其对IgG1和IgG2的影响相同。对这些缀合物的运载体蛋白的应答也受到抑制。此外，由于观察到用一种缀合物预免疫影响了针对运载体和4周后给予的第二缀合物的糖部分的免疫应答，可观察到更常见的非表位特异性抑制。
参考文献22报道了不同的运载体蛋白在一种多价肺炎球菌缀合物疫苗中的应用，利用多种运载体是为避免运载体抑制。这些作者预计多价缀合物疫苗可允许而不产生负面干扰的运载体蛋白具有最大负荷量。参考文献23报道了混合有运载体蛋白的肺炎球菌缀合物疫苗在引发抗肺炎球菌应答的同时引发了针对运载体的无意加强应答。
参考文献24研究了白喉和破伤风加强物是否可与单价血清群C脑膜炎球菌缀合物一起给予，发现当运载体是破伤风类毒素运载体并且患者以前接受过含破伤风(抗原)的疫苗免疫时，针对脑膜炎球菌缀合物的滴度降低。
最后，参考文献25报道“以前接触过运载体蛋白质可提高或抑制针对以糖-蛋白质缀合物(形式)给予的多糖的抗体应答”。参考文献25所用的缀合物利用破伤风类毒素或CRM197突变体作为运载体蛋白。
这样混淆了关于运载体引发和/或抑制的情况，任何具体的缀合物是受运载体抑制还是从运载体引发增强中获益仍不清楚。如果该问题不解决，脑膜炎球菌缀合物疫苗不能整合入或加入现有的儿科免疫方案中。此外，因为脑膜炎球菌缀合物要作为四价混合物(即，四种不同的缀合物)给予，运载体抑制风险的可能性变得更甚。
除了用运载体引发对针对糖缀合物的免疫应答具有负面影响之外，也会发生相反的情况，即用缀合物免疫对针对运载体的免疫应答具有负面影响[26]。
发明内容
参考文献27提示应该利用多种类型的运载体蛋白来解决脑膜炎球菌缀合物疫苗中的运载体抑制。参考文献27特别提示应将流感嗜血菌的D蛋白用作脑膜炎球菌缀合物的运载体蛋白，也可用破伤风类毒素(Tt)。为避免表位抑制，D蛋白也是参考文献28所选择的运载体。类似地，参考文献29提示应该利用百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)菌毛作为运载体以避免多价缀合物疫苗中的运载体抑制。相比之下，发现白喉类毒素(Dt)及其衍生物可安全地用作脑膜炎球菌糖缀合物的运载体，即使在同时给予多种脑膜炎球菌缀合物的场合。参考文献24所研究的任一单价血清群C脑膜炎球菌缀合物未利用Dt运载体。
此外，参考文献27也提示脑膜炎球菌缀合物疫苗应作为D-T-P-Hib疫苗同时给予(例如，参见实施例3)，从而不会提前接触脑膜炎球菌缀合物的运载体蛋白。相反，现在发现即使患者早已接受过在前的免疫原形式(例如，在D-T-P或D-T免疫中)或作为以前的运载体蛋白(例如，在Hib缀合物或肺炎球菌缀合物疫苗中)的运载体蛋白，也可给予脑膜炎球菌缀合物。以前对单价血清群C缀合物疫苗中运载体诱导的表位抑制的研究[24]未考虑以前给予任一缀合物的作用。
即使患者早已接受了不同的缀合物，他们产生针对脑膜炎球菌缀合物的免疫应答的能力与参考文献21(所述)相反，也与参考文献27相反。
因此，本发明提供免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的方法，包括给予患者至少包含以下两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；其中患者用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的(微)生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。
本发明也提供了至少以下两种物质在制备用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的药物中的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；其中患者用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的(微)生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。
脑膜炎球菌疾病优选是脑膜炎，更优选是细菌性脑膜炎，最优选是脑膜炎球菌性脑膜炎。因此，本发明可用于保护(人们)免遭导致脑膜炎的脑膜炎球菌干扰。
当预免疫抗原是白喉类毒素的衍生物时，该衍生物优选保留了与Dt，优选CRM197的免疫学交叉反应性。
预免疫的患者待免疫的患者已用以下物质预免疫(a)白喉类毒素或其衍生物的缀合物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的(微)生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物。预免疫通常包括白喉类毒素抗原；利用白喉类毒素或CRM197运载体的Hib荚膜糖缀合物；和/或利用白喉类毒素或CRM197运载体的肺炎球菌荚膜糖缀合物。
患者接受至少一次(例如，1、2、3或多次)剂量的预免疫抗原，该剂量(或多次剂量中最早的一次)至少在用本发明的脑膜炎球菌缀合物免疫6个月前(例如，6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、120、180、240、300或更多个月前)给予。在优选的一组患者中，在出生3年内，例如出生2年内、出生1年内、出生6个月内、或甚至出生3个月、2个月或1个月内进行预免疫。
本发明的待免疫患者一般是人。所述的人通常至少1个月大，例如至少2个月大、至少3个月大、至少4个月大、至少6个月大、至少2岁、至少5岁、至少11岁、至少17岁、至少40岁、至少55岁等。优选的患者组是至少6个月大。另一优选的患者组是2-55岁的年龄组，另一优选的患者组是11-55岁的年龄组。其它优选的患者组是小于11岁，例如2-11岁大。然而，在所有情况中，无论年龄大小，患者将如本文所定义进行预免疫。
当预免疫抗原是白喉类毒素时，患者一般接受类毒素作为D-T-P或D-T预免疫(方案)中的“D”抗原。这种免疫(方案)通常给予2、3和4个月大的新生儿。当免疫(方案)包括百日咳疫苗时，该疫苗可以是完整的细胞或细胞性百日咳疫苗(“Pw”)，但优选无细胞百日咳疫苗(“Pa”)。预免疫Pa疫苗一般包含以下一种、两种或三种熟知并良好鉴定的百日咳博德特菌抗原(1)通过化学方法或定点诱变解毒的百日咳类毒素(“PT”)，例如“9K/129G”突变体[30]；(2)丝状血凝素(“FHA”)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为“69千道尔顿的外膜蛋白”)。无细胞百日咳疫苗也可包含凝集原2和/或凝集原3。D-T预免疫方案中的“T”抗原通常是破伤风类毒素。
当预免疫抗原是白喉类毒素时，患者也可接受或者已接受类毒素作为蛋白质-糖缀合物的运载体蛋白。这种缀合物包括“PRP-D”Hib缀合物[参见参考文献32的表14-7]，例如ProHIBITTM产品。
当预免疫抗原是CRM197时，一般可用Hib缀合物和/或多价肺炎球菌缀合物预免疫患者。这种预免疫通常给予2、3和4个月大的新生儿。利用CRM197运载体的Hib缀合物包括“HbOC”缀合物[参考文献32的表14-7]，例如HibTITERTM产品。利用CRM197运载体的肺炎球菌缀合物包括7-价PCV7混合物，例如PrevNarTM疫苗[31]。也可用血清群C脑膜炎球菌(“MenC”)缀合物预免疫患者。利用CRM197运载体的MenC缀合物包括MeninvactTM/MenjugateTM[5]和MeningitecTM。然而，优选用Hib和/或肺炎球菌缀合物而非MenC缀合物预免疫患者。如果已用MenC缀合物预免疫患者，则根据本发明给予的疫苗可以含有或不含有血清群C缀合物。
当用缀合的抗原预免疫时，由于缀合物的低水平污染(例如，缀合物在保藏期间水解所致)，患者几乎不可避免地也接受了少量的游离白喉类毒素(或衍生物)，但这些少量(污染物)一般足以造成显著的免疫应答。
白喉类毒素是熟知且充分鉴定的蛋白质[例如，参见参考文献32的第13章]，它可以通过用灭活性化学物质，例如福尔马林或甲醛处理白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的ADP-核糖基化外毒素获得。CRM197也是熟知且充分鉴定的[33-36]，并广泛用作缀合的糖疫苗中的运载体。CRM197和Dt共有许多运载体表位。
预免疫的结果是患者的免疫系统已与预免疫抗原接触。就用白喉类毒素(Dt)预免疫而言，患者将接受的该通用方法可产生抗-Dt抗体应答(一般产生＞0.01IU/ml的抗-Dt滴度)和具有对Dt特异的记忆B和/或T淋巴细胞，即用Dt预免疫一般足以在患者体内引发回忆抗-Dt免疫应答。就其中Dt(或衍生物)是缀合物中糖的运载体的预免疫而言，预免疫可产生抗-糖应答，患者将具有对糖特异的记忆B和/或T淋巴细胞，即预免疫一般足以在患者体内引发回忆抗-糖免疫应答。预免疫优选足以在患者体内引发保护性免疫力，例如针对白喉疾病。
因此，根据本发明免疫的患者不同于普通患者，因为他们是普通人群中免疫系统早已针对预免疫抗原产生免疫应答的亚组的成员，从而使得根据本发明用包含白喉类毒素(或其衍生物)运载体的脑膜炎球菌缀合物免疫在所述亚组中引发了与在以前未产生针对预免疫抗原的免疫应答的患者中不同的免疫应答。优选用Dt(或衍生物)作为缀合物(特别是Hib缀合物)的运载体来预免疫的患者。特别优选用Dt(或衍生物)作为缀合物的运载体，和也用Dt作为未缀合的免疫原来预免疫的患者。
患者可以用其它抗原，以及用缀合或非缀合形式的白喉类毒素(或衍生物)来预免疫。这种抗原包括但不限于上述的百日咳抗原；上述破伤风抗原；上述乙型流感嗜血菌；乙型肝炎表面抗原(HBsAg)；脊髓灰质炎病毒，例如灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)；上述的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；流感病毒；BCG；甲型肝炎病毒抗原；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒；水痘病毒等。
患者可用或未用一种或多种脑膜炎球菌缀合物预免疫。在一些优选的实施方案中，在患者第一次接受脑膜炎球菌缀合物之时，他们已用Dt(或衍生物)预免疫。在其它实施方案中，给予已用(i)Dt或衍生物和(ii)脑膜炎球菌缀合物预免疫的患者脑膜炎球菌缀合物。
缀合物(conjugate)本发明用缀合的糖免疫患者。缀合用于提高糖的免疫原性，因为缀合将糖从T-细胞不依赖性抗原转化为T-细胞依赖性抗原，从而可以引发免疫记忆。缀合对儿科疫苗特别有用[例如，参考文献37]，它是熟知的技术[例如，参考文献38-46的综述]。
本发明所用的组合物含有至少两种脑膜炎球菌缀合物，其中每种缀合物含有白喉类毒素(或其衍生物)运载体蛋白和荚膜糖。荚膜糖选自血清群A、C、W135和Y脑膜炎球菌，从而使组合物含有这四种血清群的2种、3种或所有4种的糖。具体的组合物含有以下糖血清群A和C；血清群A和W135；血清群A和Y；血清群C和W135；血清群C和Y；血清群W135和Y；血清群A和C和W135；血清群A和C和Y；血清群A和W135和Y；血清群C和W135和Y；血清群A和C和W135和Y。最优选含有所有四种血清群的糖的组合物。
这四种血清群中任一种的荚膜糖已充分鉴定。血清群A脑膜炎球菌的荚膜糖是在C3和C4位有部分O-乙酰化的(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的均聚物可用阻断基团取代乙酰基以防水解[47]，这种修饰的糖仍是本发明意义内的血清群A糖。血清群C荚膜糖是(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰基神经氨酸或“NeuNAc”)的均聚物。大多数血清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8具有O-乙酰基，但约15％的临床分离物缺乏这些O-乙酰基[48、49]。糖结构为→9)-Neu p NAc 7/8OAc-(α2→。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单位的均聚物。与血清群C糖相似，它具有可变的O-乙酰化，但是在唾液酸7和9位[50]。其结构为→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。血清群Y糖与血清群W135糖类似，除了二糖重复单位含有葡萄糖而非半乳糖。与血清群W135相似，它在唾液酸7和9位具有可变的O-乙酰化[50]。血清群Y(糖)的结构为→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。
本发明所用的糖如上所述可以O-乙酰化(例如，与天然荚膜糖中观察到的O-乙酰化模式相同)，或者它们可在糖环的一个或多个位置部分或全部脱O-乙酰化，或者相对于天然荚膜糖，它们可以高度O-乙酰化。
本发明所用的糖优选比细菌中观察到的天然荚膜糖短。因此，这些糖优选是解聚的，解聚发生在纯化后缀合前。解聚降低了糖的链长。优选的解聚方法涉及利用过氧化氢[9]。向糖中加入过氧化氢(例如使最终H2O2浓度达1％)，然后温育混合物(例如，在约55℃)直至降低至所需链长，另一解聚方法涉及酸水解[10]。本领域技术人员已知其它解聚方法。用于制备本发明所用缀合物的糖可以通过任何这些解聚方法获得。可以利用解聚来为免疫原性提供最佳链长和/或为糖的物理可控性而降低链长。
用于缀合物中的典型运载体蛋白是细菌毒素或类毒素，例如白喉毒素(或其CRM197突变体)和破伤风毒素。其它已知的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白、合成的肽、热激蛋白、百日咳蛋白、细胞因子、淋巴因子、激素、生长因子、包含来自各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白、流感嗜血菌的D蛋白、肺炎球菌表面蛋白PsPA、铁摄取蛋白、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B等。然而，本发明的脑膜炎球菌缀合物含有白喉类毒素(或其衍生物，例如CRM197)运载体蛋白。优选共价缀合。
组合物中可能利用多种运载体蛋白。因此，不同的运载体蛋白可用于不同的血清群，例如血清群A糖可以与CRM197缀合，而血清群C糖可以与白喉类毒素缀合。具体的糖抗原可利用多种运载体蛋白，例如血清群A糖可分为两部分，一些与CRM197缀合，其它与白喉类毒素缀合。然而，总体上优选组合物中的所有脑膜炎球菌糖，更优选所有糖(即，包含可能存在的任何非脑膜炎球菌缀合物)利用同一运载体蛋白。本发明组合物优选不含有任何破伤风类毒素运载体蛋白。当组合物含有白喉类毒素运载体蛋白时，优选不含有任何CRM197运载体蛋白。
一种运载体蛋白可以携带多种糖抗原[51]。例如，一种运载体蛋白可以与血清群A和C的糖缀合。为实现该目的，可以在缀合反应之前混合糖。然而，总体上优选每种血清群具有单独的缀合物。优选混合缀合物以得到基本上1∶1∶1∶1的比例(以糖的质量测定)，例如每种血清群的糖的质量在彼此的10％之内。组合物中每种血清群的脑膜炎球菌抗原的典型量在1μg和20μg之间，例如每种血清群在2和10μg之间，或约4μg。除了1∶1∶1∶1的比例之外，可利用双血清群A剂量(2∶1∶1∶1)。
优选糖∶蛋白之比(w/w)在1∶15(即，蛋白过量)和15∶1(即糖过量)之间的缀合物，更优选在1∶10和10∶1之间，还要优选在1∶5和5∶1之间。优选运载体蛋白过量。优选糖∶蛋白之比为约1∶12或约1∶6或约1∶3的缀合物，特别是当运载体是Dt时，最优选1∶3的比例。
缀合物可以与游离的运载体蛋白联用[52]。然而，当给定的运载体蛋白在本发明组合物中同时以游离和缀合的形式存在时，未缀合的形式优选不超过组合物中运载体蛋白总量的5％，更优选以重量计小于2％。类似地，未缀合的糖以重量计优选不超过糖总量的15％。
可利用任何合适的缀合反应，如果需要可以利用任何合适的接头。
糖在缀合前一般可以活化或功能化。活化可涉及，例如氰化试剂，如CDAP(如，四氟硼酸1-氰基-4-二甲基氨基吡啶[53、54等])。其它合适的技术利用碳二亚胺、肼、活性酯、正硼烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也参见参考文献44的引言)。
可利用任何已知的方法，例如参考文献55和56所述的方法经接头基团制成连接键(linkage)。一种类型的连接键涉及多糖的还原性胺化、将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质与该己二酸接头基团的一端缀合[42、57、58]。其它接头包括B-丙酰胺基[59]、硝基苯基-乙胺[60]、卤代酰卤(haloacyl halide)[61]、糖苷键[62]、6-氨基己酸[63]、ADH[64]、C4到C12组分[65]等。除了利用接头之外，可利用直接连接。蛋白质的直接连接包括如参考文献66和67所述的多糖氧化，然后与蛋白质进行还原性胺化。
优选的方法包括将氨基引入糖(例如，通过用-NH2取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(例如，己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)进行衍生并与运载体蛋白反应。
在一优选的缀合方法中，糖与己二酸二酰肼(dihydrazide)反应。就血清群A而言，也可在此阶段加入碳二亚胺。反应一段时间后，加入氰基硼氢化钠。然后可通过，例如超滤制备衍生的糖。衍生的糖再与运载体蛋白(例如，与白喉类毒素)混合并加入碳二亚胺。反应一段时间后，回收缀合物。该缀合方法的其它细节见参考文献10。通过此方法得到的缀合物是本发明所用的优选缀合物，例如含有白喉类毒素运载体和己二酸接头的缀合物。
优选分开制备缀合物，然后混合。混合后，可用例如无菌的无热源磷酸缓冲盐水调节所混合缀合物的浓度。混合前，每种缀合物优选含有不超过15μg运载体。
就每种所给予的血清群而言，给予本发明脑膜炎球菌缀合物的结果优选为患者产生了血清杀细菌抗体(SBA)应答，SBA滴度增加了(与接受混合脑膜炎球菌缀合物之前的预免疫患者相比)至少4倍，优选至少8倍。SBA检验是对脑膜炎球菌保护(情况)的标准相关(因素)。脑膜炎球菌疫苗的血清学相关性的其它细节见参考文献68。
本发明所用组合物的其它抗原性组分除了脑膜炎球菌缀合物以外，本发明所用组合物可任选含有以下其它抗原的1、2或3种
1.肺炎链球菌的缀合的荚膜糖[例如，参考文献32的第23章；参考文献69-71]优选含有多种血清型的肺炎链球菌的糖。例如，如同含有5到11种不同血清型的多糖的缀合物疫苗一样，可以广泛利用23种不同血清型的多糖的混合物[72]。例如，PrevNarTM[31]含有7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，每种糖分别通过还原性胺化与CRM197缀合，每0.5ml剂量含2μg各种糖(4μg血清型6B)，缀合物吸附在磷酸铝佐剂上。当本发明所用的组合物含有肺炎球菌缀合物时，该组合物优选至少含有血清型6B、14、19F和23F。
2.流感嗜血菌B的缀合的荚膜糖[例如，参考文献32的第14章]用于缀合物的运载体蛋白可以是CRM137、Dt、破伤风类毒素或脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白复合物。缀合物的糖部分可以是多糖(例如，全长的聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP))，但优选解聚荚膜多糖以形成寡糖(例如，分子量为约1到约5kDa)。优选的Hib缀合物含有经己二酸接头与CRM197共价连接的寡糖[73、74]。给予Hib抗原优选导致抗-PRP抗体的浓度大于0.15μg/ml，更优选大于1μg/ml。当组合物含有Hib糖抗原时，其也优选不含有氢氧化铝佐剂。如果组合物含有磷酸铝佐剂，则Hib抗原可以吸附到佐剂上[75]或者可以是非吸附的[27]。可通过选择抗原/佐剂混合期间恰当的pH、具有合适零电荷点的佐剂和组合物中各种不同抗原的合适混合顺序来防止吸附[76]。
3.血清群B脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质抗原[例如，参考文献77]组合物可含有一种或多种这些抗原。
这种抗原可以吸附或不吸附到铝盐上。
如果以一系列剂量给予脑膜炎球菌缀合物，这些剂量中的一些或全部可含有这些额外的抗原。
含有脑膜炎球菌缀合物的组合物优选不含有破伤风类毒素。它们优选不含百日咳抗原。它们优选不含有乙肝病毒表面抗原。它们优选不含有脊髓灰质炎病毒。组合物优选在每种脑膜炎球菌缀合物中含有不超过50μg的白喉类毒素，更优选所有组合的脑膜炎球菌缀合物含有不超过50μg的白喉类毒素。
疫苗组合物本发明所用的组合物通常含有药学上可接受的运载体。这种运载体包括本身不诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生的任何运载体。合适的运载体通常是大的，代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(例如，油滴或脂质体)。本领域的普通技术人员熟知这种运载体。这些疫苗也可以含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。此外，可以存在辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌的无热源磷酸缓冲生理盐水是典型的运载体。对药学上可接受的运载体和赋形剂的充分讨论见参考文献78。
本发明所用的组合物可含有抗微生物剂，特别是如果以多剂量形式包装。
本发明所用的组合物可含有洗涤剂，例如吐温(聚山梨酸酯)，例如吐温80。洗涤剂一般以低水平存在，例如＜0.01％。
本发明所用的组合物可含有钠盐(例如，氯化钠和/或磷酸钠)。这些钠盐可用于(调整)渗透性。NaCl的浓度一般为10±2mg/ml，例如约8.8mg/ml。磷酸钠的浓度一般为1.2mg/ml。
本发明所用的组合物一般含有缓冲液，例如磷酸缓冲液。
本发明所用的组合物可含有，例如约15-30mg/ml(如25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)，特别是如果组合物要冻干或者如果组合物含有从冻干材料重建的物质。然而，优选不冻干组合物，即所用的脑膜炎球菌缀合物在包装阶段到给药阶段以液体形式存在。
组合物通常直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或注射入组织的间隙空间)、或通过直肠、口服、阴道、局部、透皮、鼻内、眼、耳、肺部或其它粘膜给药进行直接递送。优选肌肉内注射(例如注射到大腿或上肢)。可通过针头注射(例如，皮下注射针)，但也可利用无针注射。肌肉内注射剂量一般是0.5ml。
多种血清群的脑膜炎球菌缀合物混合在一种组合物中给予。组合物可以单剂量给予，或者可以在多剂量方案中多次给予。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案后可进行脑膜炎球菌缀合物的加强剂量方案。可惯常测定引发剂量之间(例如，4-16周之间)和引发与加强之间合适的时间间隔。缀合物可以方便地在其它疫苗(给药)的同时，例如在D-T-P疫苗(给药)的同时、或者在脑膜炎球菌缀合物疫苗(给药)的同时、或者在流感疫苗(给药)的同时、或者在MMR或MMRV疫苗(给药)的同时给予。这些疫苗一般分开给予，但要在同一就诊期间。
细菌感染可影响身体的各个区域，因此组合物可以制备成各种形式。例如，可将组合物制备成液体溶液或悬液的注射剂。也可制备成适合于在注射前溶解于或悬浮于液体载体中的固体形式(例如，冻干的组合物)。可将组合物制备成局部给药的形式，例如软膏、乳膏或粉末。可将组合物制备为口服给药的形式，例如片剂或胶囊，或糖浆(任选调味的)。可利用细粉末或喷雾将组合物制备为肺部给药的形式，例如吸入剂。可将组合物制备为栓剂或阴道栓剂。可将组合物制备为鼻部、耳部或眼部给药的形式，例如喷剂、滴剂、凝胶或粉末[参考文献79和80]。然而，一般将脑膜炎球菌缀合物配制为用于肌肉内注射。
本发明所用的组合物可含有或不含有疫苗佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于A.含有矿物质的组合物适合用作本发明佐剂的含矿物质的组合物包括矿物盐、例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献81的第8和第9章]或不同矿物化合物与采用任何合适形式(例如凝胶、晶体、无定形等)的化合物的混合物，优选吸附(抗原)。也可将含有矿物质的组合物配制为金属盐的颗粒[82]。
特别优选磷酸铝，佐剂一般是PO4/Al之比在0.84-0.92之间，含有约0.6mgAl3+/ml的无定形羟基磷酸铝。可采用低剂量磷酸铝，例如每剂量每种缀合物为50和100μg之间的Al3+来吸附。当组合物含有多种细菌种类的缀合物时，无需吸附所有的缀合物。
B.油乳剂适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包括角鲨烯-水乳剂、例如MF59[参考文献81的第10章；也参见参考文献83](5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，利用微流化剂配制成亚微米颗粒)。也可利用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
C.皂苷制剂[参考文献81的第22章]皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在许多植物种类的树皮、叶子、茎、根和甚至是花中发现的固醇糖苷和三萜系糖苷的异质混合物。皂树(Quillaia saponaria Molina)的树皮中的皂苷是研究最广泛的佐剂。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜(sarsaprilla))、锥花丝石竹(Gypsophilla paniculata)婚纱花(brides veil)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根(soap root))。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及液体制剂，例如ISCOM。QS21的商品名为StimulonTM。
也可利用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已经鉴定了利用这些技术具体纯化的部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。参考文献84公开了QS21的产生方法。皂苷制剂也可含有固醇，例如胆固醇[85]。
可以联用皂苷和胆固醇来形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献81的第23章]。ISCOM一般也含有磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用于ISCOM。ISCOM优选含有一种或多种QuilA、QHA和QHC。参考文献85-87进一步描述了ISCOM。ISCOM任选不含其它洗涤剂[88]。
皂苷佐剂开发的综述见参考文献89和90。
D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常含有一种或多种与磷脂任选联用或用磷脂配制的病毒的蛋白质。它们通常是非病原性、非复制性，通常不含有任何天然病毒基因组。可重组产生或从完整病毒分离病毒蛋白。适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括来源于流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如逆转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白质。参考文献91-96进一步讨论了VLP。例如，参考文献97进一步讨论了病毒体。
E.细菌或微生物衍生物适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。参考文献98公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的优选“小颗粒”形式。3dMPL的这种“小颗粒”足够小从而可通过0.22μm膜无菌过滤。其它无毒的LPS衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，例如RC-529[99，100]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)的脂质A的衍生物，例如OM-174。例如，OM-174描述于参考文献101和102。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。
CpG可含有核苷酸修饰/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可以是双链或单链的。参考文献103、104和105公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献106-111进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[112]。CpG序列，例如CpG-A ODN特异地诱导Thl免疫应答，或者，例如CpG-B ODN更特异地诱导B细胞应答。参考文献113-115讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。
优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。两条CpG寡核苷酸序列任选在它们的3’端相连以形成“免疫聚物”(immunomer)。参见，例如参考文献112和116-118。
细菌ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物可用作本发明的佐剂。蛋白质优选来源于大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定肠毒素“LT”)、霍乱(病毒)(“CT”)或百日咳(病毒)(“PT”)。参考文献119和参考文献120分别描述了用作粘膜佐剂和胃肠外佐剂的解毒的ADP-核糖基化毒素。毒素或类毒素优选为含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒的突变；B亚基优选未突变。佐剂优选是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及其解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献121-128。氨基酸取代的数字参考优选专门全文纳入本文作为参考的参考文献129所述的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对为基础。
F.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[130]等)[131]、干扰素(如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂生物粘合剂(bioadhesive)和粘膜粘合剂(mucoadhesive)也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[132]，或者粘膜粘合剂例如有聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[131]。
H.微粒微粒也可用作本发明的佐剂。
从生物可降解和无毒的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选聚(丙交酯-共-乙交酯)形成微粒(即，直径约100nm到150μm，优选约200nm到约30μm，最优选约500nm到约10μm的颗粒)，任选将这些微粒处理成带负电的表面(例如，用SDS)或带正电的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。
I.脂质体(参考文献81的第13和14章)
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献134-136。
J.聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯制剂适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[137]。这种制剂还包括联用辛苯聚醇的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[138]以及联用至少一种其它非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[139]。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
L.胞壁酰基肽适合用作本发明佐剂的胞壁酰基肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制剂描述于，例如参考文献140和141中。
M.咪唑并喹诺酮化合物适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物包括参考文献142和143中进一步描述的咪喹莫特(Imiquamod)及其同系物(例如，“雷西喹莫特(Resiquimod)3M”)。
N.缩氨基硫脲化合物缩氨基硫脲化合物以及配制、制备和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法包括参考文献144所述的。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有用。
O.色胺酮化合物色胺酮化合物以及配制、制备和筛选所有适合用作本发明佐剂的化合物的方法包括参考文献145所述的。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子，例如TNF-α中特别有用。
本发明也包括联用一种或多种以上鉴定的佐剂的各方面。例如，以下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳剂[146]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)[147]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒的LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[148]；(5)联用3dMPL与例如QS21和/或水包油乳剂[149]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或漩涡产生较大粒度的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem)，其中含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种由单磷酸酰脂质A(monophosphorylipid A)(MPL)、海藻糖二分枝菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)组成的细菌细胞壁组分，；(8)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+LPS的无毒衍生物(例如3dMPL)；和(9)一种或多种矿物盐(例如铝盐)+免疫刺激寡核苷酸(例如含有CpG基序的核苷酸序列)。
参考文献81的第7章公开了用作免疫刺激剂的其它物质。
特别优选利用氢氧化铝或磷酸铝佐剂，佐剂通常吸附到这些盐上[例如，参考文献9的实施例7和8；参考文献10的实施例J]。也可能与铝盐混合而无吸附[27，76]。磷酸钙是另一种优选的佐剂。缀合物可以分别与佐剂混合(任选吸附到佐剂上)然后将缀合物混合到一起，或者可将缀合物混合到一起再与佐剂混合。
本发明所用组合物的pH优选在6和8之间，更优选约7。可通过利用缓冲液维持稳定的pH。当组合物含有氢氧化铝盐时，优选利用组氨酸缓冲液[150]。组合物可以是无菌和/或无热源的。组合物相对于人体可以是等渗的。
组合物可含有防腐剂(例如，乙基汞硫代水杨酸钠、2-苯氧基乙醇)或不含防腐剂。本发明的优选组合物不含任何汞的材料，例如它们是无乙基汞硫代水杨酸钠的。
为防止抗原，特别是缀合物抗原之间相互干扰，可以包含聚阴离子聚合物，例如聚-L-谷氨酸[151]。
组合物可存在于小瓶中，或者它们可以存在于预填充注射器中。注射器可装有或不装有针头。注射器含有单剂量的组合物，而小瓶可以含有单剂量或多次剂量。可注射的组合物通常可以是液体溶液或悬液。或者，它们可以固体形式(例如，冻干的)存放，在注射前用液体载体配制成溶液或悬液。
组合物可以包装为单位剂量或多剂量形式。就多剂量形式而言，小瓶优于预填充的注射器。可惯常制定有效的剂量体积，但用于注射的组合物的典型人用剂量体积是0.5ml。
当组合物要在使用前临时配制(例如当组分以冻干形式存在时)并以试剂盒形式存在时，试剂盒可含有两个小瓶，或者可以含有一个预填充注射器和一个小瓶，在注射前利用注射器的内含物再活化小瓶的内含物。就包含血清群A荚膜糖的组合物而言，血清群A糖可以是冻干的，而其它血清群的糖可以液体形式存在。
组合物可以含有免疫有效量的脑膜炎球菌缀合物以及任何其它组分(如果需要)。“免疫有效量”表示给予个体的用量，无论是单剂量或是一系列剂量的部分均能在患者中引发保护性抗-脑膜炎球菌免疫应答。该量取决于待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的年龄、分类学组(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体的免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的制剂、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而不同。期望该用量有可通过常规试验确定的相对较宽的范围，每剂量中每种脑膜炎球菌抗原的典型用量是每种血清群1μg和20μg之间(根据糖测定)，例如每种血清群2和10μg之间。优选每种血清群约4μg的剂量(即，四价混合物中共16μg)。
组合物中运载体蛋白的总量优选不超过100μg/剂量，例如≤90μg/剂量、≤80μg/剂量、≤70μg/剂量、≤60μg/剂量、≤50μg/剂量等。组合物中运载体蛋白的总量通常是至少10μg/剂量。
通用术语术语“含有”包括“包括”以及“包含”，例如“含有”X的组合物可排他性地由X组成或者可以包括其它的物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
词汇“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。如果需要，词汇“基本上”可从本发明的定义中省去。
实施本发明的方式利用四价A/C/W135/Y缀合物混合物没有运载体抑制可如参考文献9和10所述制备血清群A+C、C+W+Y或A+C+W+Y的脑膜炎球菌缀合物的混合物。如果需要也可如参考文献9和10所述将它们与氢氧化铝或磷酸铝佐剂混合。这些疫苗具有与糖共价连接的CRM197或白喉类毒素(Dt)作为运载体蛋白。
选择接受儿科D-T-P疫苗接种(D-T-Pa或D-T-Pw)，包括接受含有D-T-P和其它抗原(例如，D-T-P-Hib四价、D-T-P-HBsAg四价、D-T-P-Hib-HBsAg五价、D-T-P-Hib-HBsAg-IPV六价等)的患者接受含有Dt运载体的缀合物混合物。这些缀合物的该四价混合物在人体内是免疫原性的[9、11、13]。
选择接受儿科Hib疫苗接种(含或不含D-T-Pa或D-T-Pw的单价Hib；或例如D-T-P-Hib四价、D-T-P-Hib-HBsAg五价、D-T-P-Hib-HBsAg-IPV六价等的疫苗组合的一部分)的患者接受含有CRM197运载体的缀合物混合物。
选择患者的对照组接受两种缀合物混合物之一。对照患者以前未接受过作为单独抗原或作为缀合物中运载体蛋白的白喉类毒素或CRM197。
评估了四价缀合物在患者中引发免疫应答的能力。如果测试组的抗脑膜炎球菌免疫应答明显低于对照患者，特别是如果缀合物未能在患者中引发有用的SBA应答，则表明存在运载体抑制。
在芬兰和德国利用620名12-16个月大的对象进行的临床试验V59P2中测试了5种制剂。这些疫苗利用CRM197运载体和磷酸铝佐剂[10]。以(μg糖质量/0.5ml剂量)表示的每种血清群糖的剂量如下
对象在0时接受注射，然后25％的对象在4周后接受第二剂量的疫苗。
疫苗给予1个月后收集患者的血清并在利用人补体的针对每种血清群的脑膜炎奈瑟球菌的SBA试验中进行测试。以≥1∶4和≥1∶8为标准评估相对于0时血清的SBA滴度增加。也测定了每种血清群的抗荚膜滴度(GMT)。结果如下表1所示。
因此，三价和四价疫苗在初学走路的儿童体内均是免疫原性。缀合物在低至每种缀合物2.5μg的糖剂量时具有免疫原性。免疫应答可加强，第二剂量后SBA滴度大大增加。在该试验中未观察到运载体抑制的证据。
没有抗-Dt应答的抑制1999年起，比利时的研究[26]显示接受与破伤风类毒素缀合的Hib疫苗的初次疗程后，婴儿时期受损的破伤风免疫力可延续至幼年早期。因此，缀合物的运载体蛋白具有负面的免疫性影响。相反，在肺炎球菌缀合物疫苗的研究中观察到相反的作用[152]。利用血清群C脑膜炎球菌糖与CRM197运载体组成的缀合物(MenjugateTM)研究了脑膜炎球菌缀合物干扰白喉免疫力的可能性[153]。
将儿童分为5组，在出生的第一年按照如下进行免疫(1)四剂量的MenjugateTM；(2)三剂量的MenjugateTM加上一剂量的二价未缀合的A/C混合物；(3)三剂量的HBsAg疫苗，然后给予一剂量的MenjugateTM；(4)三剂量的HBsAg疫苗，然后给予一剂二价未缀合的A/C混合物；(5)对照组不接受脑膜炎球菌疫苗。所有的儿童在出生的头4个月期间也接受三剂量的白喉疫苗，但未接受学龄前(pre-school)白喉加强。
患者在4岁接受单剂量的MenjugateTM，MenjugateTM注射前后(约30天)采血。通过ELISA测定白喉抗体，估计几何平均浓度。也评估了抗体水平≥0.1IU/ml的对象的百分比。结果如下
以前接受过MenjugateTM的患者的基线抗-Dt滴度高于以前未接受过的患者(例如组1与组4比较)。简单的回归分析表明以前MenjugateTM的剂量数(组1、2、3和4分别是4、3、1和0)与(a)疫苗接种前抗-Dt滴度和(b)疫苗接种后抗-Dt滴度有明显的线性关系。
因此，在婴儿期间接受过4剂量MenjugateTM的儿童在4岁时对白喉的免疫力的持久性提高。此外，在婴儿期间接受过至少3剂量MenjugateTM的患者在接受一次加强剂量的MenjugateTM后易具有较高的抗-Dt抗体应答。未发现脑膜炎球菌缀合物和白喉免疫力之间有免疫相互干扰的证据。
二价A/C缀合物混合物显示与DTP无相互干扰血清群A和C的荚膜糖混合物[8]给予以前未接受过DTP疫苗的尼日尔婴儿(5到11周龄)。根据以下6种不同方案，给儿童接受未缀合的糖(每种血清群50μg)或未用佐剂的Dt-缀合糖(每种4μg)(1)4剂量缀合物6周、10周、14周、9个月。
(2)3剂量缀合物6周、10周、14周。
(3)2剂量缀合物14周、9个月。
(4)1剂量缀合物14周。
(5)1剂量缀合物9个月。
(6)1剂量未缀合的(糖)9个月。
儿童在6、10和14周时接受DTP并口服脊髓灰质炎疫苗，在9个月时加强，在与这些现有疫苗相同的时间给予脑膜炎球菌疫苗。为评估回忆应答，在24个月时也给予儿童未缀合的疫苗。
在18周(即，第三次接种DTP/脊髓灰质炎疫苗的4周后)、第10个月(即，在第9个月进行DTP/脊髓灰质炎疫苗加强的1个月后)和在第24个月给予未缀合物质的1周后测定血清杀细菌抗体应答。显示SBA滴度增加≥128倍的患者的百分比如下
在6组之间，针对白喉类毒素的抗体应答无差异[8]。
因此，没有利用白喉类毒素作为保护性抗原和作为缀合物的运载体会导致相互干扰的证据。例如，第5组中的患者在接受第一剂量脑膜炎球菌缀合物前的6、10和14周接受DTP疫苗中的白喉类毒素，但在24个月时显示＞99％的抗脑膜炎球菌SBA应答。
对抗白喉应答没有负面影响如上所述，在(给予)DTP疫苗的同时接受脑膜炎球菌缀合物疫苗的患者显示针对白喉类毒素的免疫应答没有降低。在另一项研究中，在不同时间给予脑膜炎球菌缀合物和DTP。在2、3和4个月大时进行3剂量DTP方案后给予含Dt缀合的糖或含未缀合的糖的单剂量二价A/C疫苗。通过ELISA测定针对白喉类毒素的免疫应答，GM滴度如下
未缀合的糖不引起任何抗-Dt应答(不出意料)，但缀合的糖导致强烈的抗-Dt应答。因此，给予这些缀合物可在初次接受试验的患者(naive patient)中提供抗-白喉免疫力，或者可以替代Dt加强。
应该理解，以上例子只是对本发明的描述，可以作出改进而保持在本发明的范围和构思内。
表1-试验V59P2的结果
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权利要求
1.免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的方法，包括给予人患者至少包含以下两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；其中所述患者用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。
2.免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的方法，包括给予人患者至少包含以下两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；其中所述患者用(a)白喉类毒素和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197的缀合物预免疫。
3.免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的方法，包括给予人患者至少包含以下两种物质的组合物的步骤(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；其中所述患者用(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)CRM197或白喉类毒素的缀合物预免疫。
4.至少以下两种物质在制备免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的药物中的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物；其中患者用(a)白喉类毒素或其衍生物和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或其衍生物的缀合物预免疫。
5.至少以下两种物质在制备免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的药物中的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)白喉类毒素的缀合物；其中所述患者用(a)白喉类毒素和/或(b)(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)白喉类毒素或CRM197的缀合物预免疫。
6.至少以下两种物质在制备免疫人患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌所致疾病的药物中的应用(a)(i)血清群A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；(b)(i)血清群C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；(c)(i)血清群W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；和(d)(i)血清群Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)CRM197的缀合物；其中所述患者用(i)除脑膜炎奈瑟球菌以外的生物的荚膜糖和(ii)CRM197或白喉类毒素的缀合物预免疫。
7.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其特征在于，所述组合物含有(a)、(b)、(c)和(d)中的所有4种。
8.如权利要求4到6中任一项所述的应用，其特征在于，所述组合物含有(a)、(b)、(c)和(d)中的所有4种。
9.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者已用含有白喉类毒素的疫苗预免疫过。
10.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者已用含有Hib缀合物的疫苗预免疫过。
11.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者已用含有至少一种肺炎球菌缀合物的疫苗预免疫过。
12.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述患者在所述方法或应用的至少6个月前预免疫过。
13.如权利要求12所述的方法或应用，其特征在于，所述患者在所述方法或应用的至少8年前预免疫过。
14.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述预免疫在患者出生一年内发生。
15.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎球菌缀合物(a)到(d)中的糖比脑膜炎球菌中观察到的天然荚膜糖短。
16.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎球菌缀合物含有白喉类毒素运载体和己二酸接头。
17.如权利要求16所述的方法或应用，其特征在于，含有不超过60μg的白喉类毒素运载体。
18.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有缀合的肺炎链球菌的荚膜糖。
19.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有缀合的乙型流感嗜血菌的荚膜糖。
20.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物还含有血清群B脑膜炎奈瑟球菌的蛋白质抗原。
21.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述组合物或药物含有氢氧化铝佐剂和/或磷酸铝佐剂。
22.以上任一项权利要求所述的方法或应用，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟球菌所致疾病是脑膜炎球菌性脑膜炎。
23.如权利要求7所述的方法，或如权利要求8所述的应用，其特征在于-患者在所述方法或应用的至少5年前已用含有白喉类毒素的疫苗预免疫过；-所述脑膜炎球菌缀合物含有白喉类毒素运载体和任选的己二酸接头；-每种血清群的脑膜炎球菌缀合物约有8μg/ml(以脑膜炎球菌糖测定)；-每种缀合物的糖∶运载体重量比是约1∶3；-所述药物含有约96μg/ml的白喉类毒素；-所述药物含有约1.2μg/ml的磷酸钠；和-所述药物含有约8.8μg/ml的氯化钠。
全文摘要
在不远的将来，可将缀合的脑膜炎球菌荚膜糖引入免疫方案，但首先必须解决“运载体抑制”的现象，特别是在要利用多种缀合物的情况下。发现白喉类毒素及其衍生物(例如CRM197)可安全地用作运载体蛋白，即使在同时给予多种脑膜炎球菌缀合物和患者以前接触过该运载体蛋白的情况下，所述运载体蛋白是以前免疫原(例如，在DTP疫苗中)的形式或作为以前运载体蛋白(例如，在Hib或肺炎球菌缀合物疫苗中)。本发明提供免疫患者的方法，包括给予脑膜炎球菌荚膜糖的多种缀合物，其中每种缀合物含有白喉类毒素(或其衍生物)运载体蛋白和荚膜糖，其中所述患者已用白喉类毒素(或其衍生物)预免疫过。
文档编号A61K39/095GK1976724SQ200580013863
公开日2007年6月6日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月30日
发明者C·马歇尔 申请人:启龙有限公司
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