含有共用运载体蛋白的联合脑膜炎球菌偶联物的制作方法
专利名称：含有共用运载体蛋白的联合脑膜炎球菌偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的疫苗。具体说，本发明涉及基于来自多种脑膜炎球菌血清组的偶联荚膜糖的疫苗。
背景技术：
根据生物的荚膜多糖，鉴定了12个脑膜炎奈瑟球菌血清组(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。A组是亚撒哈拉非洲流行病中最常见的病原体。血清组B和C引起美国和大部分发达国家中的大多数病例。血清组W135和Y引起美国和大部分发达国家中的其余病例。
血清组A+C的荚膜多糖的二价疫苗可以产品Mencevax ACTM购得，血清组A+C+Y+W135的糖的四价混合物可以产品Mencevax ACWYTM和MenomuneTM购得[1-3]。虽然这些疫苗在青少年和成年人中有效，但它们诱导的免疫应答差，保护时间短，因为未偶联的多糖是T细胞非依赖性抗原，它诱导的免疫应答弱，并且不可被增强。
为解决荚膜糖免疫差的问题，开发了将糖连接于运载体蛋白的偶联疫苗。对抗血清组C的偶联疫苗已批准用于人，包括MenjugateTM[4]、MeningitecTM和NeisVac-CTM。也测试了血清组A+C的偶联物的混合物[5，6]，已报道了血清组A+C+W135+Y的偶联物的混合物[7-10]。
虽然混合的偶联疫苗类似于混合的糖疫苗，但有一些关键差异。具体说，偶联物混合物中由于包括运载体蛋白而产生新的风险，特别是运载体诱导的表位抑制(或″运载体抑制″，如其通常的称谓)即用运载体蛋白免疫动物会阻止动物以后产生对抗该运载体上存在的抗原表位的免疫应答的现象[11]。当具有相同运载体蛋白的多种偶联物同时给予时这个问题尤其受到关注[12]。
研究了单价脑膜炎球菌偶联物的运载体抑制[13]，也有一些工作涉及混合的脑膜炎球菌偶联物。例如，参考文献14说明，百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)菌毛应该用作运载体以避免多价偶联疫苗中的运载体抑制。参考文献15说明，应该在疫苗中采用一种以上类型的运载体蛋白来对付运载体抑制，优选流感嗜血杆菌(H.influenzae)蛋白D和/或破伤风类毒素(Tt)。
本发明的一个目的是提供包含多种脑膜炎球菌血清组的偶联荚膜糖但避免运载体诱导的表位抑制风险的其它疫苗。
发明内容
与参考文献15中关于避免运载体抑制的方法，即采用一种以上类型的不同运载体蛋白相反，本发明对多种偶联物采用相同类型的运载体蛋白(′共用运载体′)，这简化了商业规模生产疫苗。然而，通过选择共用运载体，增加了运载体抑制的可能性。通常通过混合已经在单独的浓缩部分中制备的单个偶联物来制备疫苗，其中各块通常包括来自偶联反应的残留量未偶联运载体蛋白。未偶联运载体可产生运载体抑制，如果各浓缩部分包括x量的未偶联运载体，那么四价混合物将包括4x未偶联运载体。当仅在运载体存在特定阈值时(例如仅在未偶联运载体水平足够高，以饱和相关B细胞和/或T细胞，或仅在其足够高，以刺激相关抑制性T细胞)观察到运载体抑制，那么4x水平可导致抑制，即使各偶联物的水平低于阈值并且单独给予不会引起抑制。
因此，与单价疫苗相比或与采用不同运载体蛋白的偶联物相比，为多价疫苗选择共用运载体显著提高了运载体抑制风险。为了补偿此提高的风险，本发明控制疫苗中未偶联运载体蛋白的量。虽然参考文献13-15中通过关注用于脑膜炎球菌糖的收入蛋白(earner protein)的特性解决运载体抑制的可能性，但本发明关注所用运载体的量，更具体说是未偶联形式中存在的量。通过最大程度减少疫苗中未偶联运载体蛋白的量，可避免运载体抑制，即使采用共用运载体。
以前考虑了偶联疫苗中包括未偶联运载体蛋白[16]，但在以前工作中未偶联收入蛋白(破伤风类毒素)的浓度约为10Lf/剂。采用0.5ml剂量(所用转换因子为1Lf＝3μg)[12]，这些疫苗约含60μg/ml未偶联运载体蛋白。参考文献16未涉及避免运载体抑制。
因此，本发明提供了用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物，该组合物包含下组中的至少两种(a)(i)血清组A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)血清组C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)血清组W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)血清组Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其特征是(1)所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)，和(2)该组合物包含未偶联形式的共用运载体，其中所述未偶联共用运载体浓度小于10μg/ml。
本发明也提供用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)制备下组的至少两种(a)(i)血清组A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)血清组C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)血清组W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)血清组Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)；和(2)混合(1)中制备的至少两种偶联物，以产生包含未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。
该方法可包括测定未偶联共用运载体量的一个或多个步骤。可在混合前对单个偶联物进行所述测定和/或在混合后对混合的偶联物进行所述测定。可根据所述测定的结果拒绝或选择单个偶联物用以混合，可根据所述测定的结果简单地拒绝或选择最终组合物用以发布给医生。
本发明也提供用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(a)从A、C、W135和Y中选择n种不同的脑膜炎球菌血清组，其中n的值是2、3或4；(b)对于n种所选血清组中每个血清组，制备(i)该血清组的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中n种偶联物各自采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)；和(c)混合(b)中制备的n种偶联物，产生包含未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。n的值优选为4，以致于本发明能提供以下用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(a)制备各脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y，(i)该血清组的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中四种偶联物各自采用相同的运载体蛋白；和(b)混合这些偶联物产生包括未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。
同以前一样，此方法可包括在步骤(b)混合之前和/或之后测定未偶联共用运载体量的一个或多个步骤。
偶联物用偶联提高糖的免疫原性，因为它能将其从T非依赖性抗原转化为T依赖性抗原，从而可以引发免疫记忆。偶联在儿科疫苗中尤其有用[如参考文献17]，并且是熟知技术[如参考文献18-27中的综述]。
本发明组合物包含以下脑膜炎球菌偶联物的至少两种(即2、3或4种)(a)(i)血清组A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)血清组C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)血清组W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)血清组Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物。
这些偶联物中，至少两种(即2、3或4种)采用共用运载体蛋白。这并不意味着一个偶联分子包括一个以上血清组的糖(参考文献28和29)，而是一个偶联分子携带一个血清组的糖，但相同类型的运载体蛋白用于各不同血清组。然而，在一个偶联分子中，可能有一种以上类型的糖(如不同长度的片段)，但它们来自一个血清组。作为采用共用运载体的一个例子，可将蛋白质样品分为4份，然后用各份与一个血清组的荚膜糖片段制备偶联物，然后可组合偶联物以产生具有共用运载体的四价偶联物。
从脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y中选择荚膜糖，使该组合物包含2、3或全部4个血清组的糖。特定组合物包含以下来源的糖血清组A和C；血清组A和W135；血清组A和Y；血清组C和W135；血清组C和Y；血清组W135和Y；血清组A和C和W135；血清组A和C和Y；血清组A和W135和Y；血清组C和W135和Y；血清组A和C和W135和Y。优选至少包含血清组C(如A和C)的组合物，最优选包含所有4种血清组的糖的组合物。
这四个血清组各组的荚膜糖已良好表征。血清组A脑膜炎球菌的荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的同聚物，在C3和C4位置中发生部分O-乙酰化。可用保护基团取代乙酰基以防止水解[30]，这种修饰糖仍然是本发明范围内的血清组A糖。血清组C荚膜糖(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰神经氨酸或′NeuNAc′)的同聚物。大多数血清组C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8具有O-乙酰基，但约15％的临床分离物缺少这些O-乙酰基[31，32]。糖结构写作→9)-Neu p NAc 7/8OAc-(α2→。血清组W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。就象血清组C糖一样，它具有可变的O-乙酰化，但在唾液酸7和9位置上[33]。该结构写作→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。血清组Y糖类似于血清组W135糖，除了该二糖重复单元包括葡萄糖，而非半乳糖。就象血清组W135一样，它在唾液酸7和9位置上具有可变的O-乙酰化[33]。血清组Y结构写作→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。
用于本发明的糖可以是O-乙酰化的糖，如上所述(如具有与天然荚膜糖相同的O-乙酰化模式)，或者它们可以在糖环的一个或多个位置上部分或全部去-O-乙酰化，或者它们可以相对于天然荚膜糖超-O-乙酰化。
用于本发明的糖优选短于细菌中所见的天然荚膜糖。因此，该糖优选为解聚化糖，解聚发生在纯化后偶联前。解聚能减少糖链的长度。优选的解聚方法涉及采用过氧化氢[7]。将过氧化氢加入糖(如使H2O2终浓度为1％)，然后孵育该混合物(如约55℃)，直到获得所需的链长度减少。另一种解聚方法涉及酸水解[8]，本发明偶联物中优选的解聚化糖的平均聚合程度范围如下A＝10-20；C＝12-22；W135＝15-25；Y＝15-25。本领域技术人员了解其它解聚化方法。可用这些解聚方法中任一种获得用于制备本发明所用的偶联物的糖。可采用解聚来提供对免疫原性来说最优的链长度和/或降低链长度以易于对糖进行物理处理。
用于偶联物的运载体蛋白一般是细菌毒素，如白喉毒素(参见例如参考文献34的第13章；参考文献35-38)(或其CRM197突变体[39-42])和破伤风毒素，通常是类毒素的形式(如用灭活化学物质如福尔马林或甲醛处理获得的形式)。其它合适的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[43]、合成肽[44，45]、热激蛋白[46，47]、百日咳蛋白[48，49]、细胞因子[50]、淋巴因子[50]、激素[50]、生长因子[50]、包含来自各种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人造蛋白[51]、流感嗜血杆菌的蛋白D[52-54]、肺炎链球菌溶血素[55]、肺炎球菌表面蛋白PspA[56]、摄铁蛋白[57]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[58]等。
用作共用运载体的四种特别优选的运载体蛋白是白喉类毒素(Dt)、破伤风类毒素(Tt)、CRM197和流感嗜血杆菌(H.influenze)的蛋白D。优选这些蛋白的原因是它们是目前用于儿科疫苗的主要运载体，因此它们是(如)给予其它疫苗之前、同时或之后运载体抑制风险最高的运载体。Dt和蛋白D是最优选的共用运载体，因为这些蛋白用于现有儿科疫苗的频率低于CRM197和Tt，如GSK的Hib偶联物采用Tt作为运载体，HibTITERTM产品采用CRM197，PrevenarTM中的肺炎球菌偶联物采用CRM197，MeniugateTM和MeningitecTM产品采用CRM 197，NeisVac-CTM采用Tt。因此，为了进一步最大程度降低运载体抑制的风险，将Dt和流感嗜血杆菌蛋白D用作共用运载体。
优选将偶联物混合，以使比例基本上为1∶1∶1∶1(以糖的质量计)，如各血清组的糖的质量互相相差在+10％以内。组合物中每个血清组的脑膜炎球菌抗原的量一般为1μg-20μg，如2-10μg/血清组，或约4μg。作为比例1∶1∶1∶1的替代，可采用双倍血清组A的剂量(2∶1∶1∶1)。
优选糖∶蛋白比(w/w)为1∶15(即蛋白过量)-15∶1(即糖过量)，优选1∶5-5∶1的偶联物。优选运载体蛋白过量。优选糖∶蛋白比约为1∶12或约为1∶3的偶联物，尤其是当运载体是Dt时。
可采用任何合适的偶联反应，需要时可采用任何合适接头。
一般在偶联之前使糖活化或功能化。活化可包括(例如)氰化试剂(cyanylatingreagents)[59、60等])。其它合适技术采用活性酯、碳二亚胺、酰肼、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也参见参考文献24的引言)。
可用任何已知方法，例如参考文献61和62所述方法通过接头基团连接。一种连接类型包括多糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于己二酸接头基团的另一端[22、63、64]。其它接头包括B-丙酰胺基[65]、硝基苯基-乙基胺[66]、卤代酰基卤化物[67]、糖苷键连接[68]、6-氨基己酸[69]、ADH[70]、C4-C12部分[71]等。作为采用接头的替代方式，可采用直接连接。与蛋白质直接连接可包括氧化多糖，然后用蛋白质还原性胺化，例如参考文献72和73所述。
优选的偶联方法包括将氨基引入糖(如通过用-NH2取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化，与运载体蛋白(如CRM197)反应。该偶联方法的进一步详细情况可参见参考文献8。通过此方法获得的偶联物是用于本发明的优选偶联物。
在另一优选的偶联方法中，使糖与己二酸二酰肼反应。对于血清组A，也可在此阶段加入碳二亚胺(EDAC)。反应一段时间后，加入氰基硼氢化钠。然后，可通过(例如)超滤制备衍生糖。然后将该衍生糖与运载体蛋白(如白喉类毒素)混合，加入碳二亚胺。反应时间后，可回收偶联物。此偶联方法的进一步详细情况可参见参考文献8。用此方法获得的偶联物是用于本发明的优选偶联物，如包含白喉类毒素运载体和己二酸结构的偶联物。
在另一优选的偶联方法中，用氰化试剂使糖衍生化[60]，然后偶联于蛋白质(直接偶联，或将巯基或酰肼亲核基团引入运载体后)，无需使用接头。合适的氰化试剂包括1-氰基-4-(二甲基氨基)-四氟硼酸吡啶(′CDAP′)，氰酸对硝基苯酯和N-氰基三乙基四氟硼酸铵(′CTEA′)。优选CDAP，尤其是当流感嗜血杆菌蛋白D是共用运载体时。优选直接偶联。
优选分别制备偶联物，然后混合。混合后，可用(例如)无菌无热原的磷酸盐缓冲盐水调节混合的偶联物浓度。
除共用运载体外，本发明组合物中可存在与其它运载体蛋白的偶联物。然而通常，该组合物中的所有脑膜炎球菌偶联物优选采用相同的运载体。
在本发明组合物中，各偶联物中运载体(偶联和非偶联)的量优选各偶联物中运载体蛋白不大于100μg/ml，如＜30μg/ml。优选组合物中共用运载体(混合的脑膜炎球菌偶联物中单独的运载体，或优选以该组合物作为整体的运载体)的总浓度小于500μg/ml，如小于400μg/ml、小于300μg/ml、小于200μg/ml、小于100μg/ml、小于50μg/ml等。
未偶联共用运载体蛋白本发明组合物包含未偶联形式的共用运载体，但未偶联共用运载体存在的浓度小于10μg/ml。
通过控制诸如偶联条件、偶联后纯化、偶联后贮存条件(温度、pH、湿度等)等因素，本发明可确保未偶联共用运载体量可靠的保持在10μg/ml以下，一般可保持在甚至更低的水平，如9μg/ml以下，8μg/ml以下、7μg/ml以下、6μg/ml以下、5μg/ml以下、4μg/ml以下、3μg/ml以下、2μg/ml以下、1μg/ml以下、0.5μg/ml以下等。
然而，为了实际应用，最好包括低水平的未偶联共用运载体，以提供轻微的佐剂效果，而不导致运载体抑制问题。因此，本发明组合物中未偶联共用运载体的浓度优选≥aμg/ml而＜bμ/ml，其中b＞a，并且(i)a选自0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4和5；和(ii)b选自0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
本发明组合物中未偶联运载体具有两种来源。第一，它可能来自混合的单个偶联物。单个偶联物可包括偶联反应中未反应的残留运载体，并且可包括偶联材料降解释放的运载体。第二，它可来自混合后，如组合物贮存后偶联物的降解。通常不会作为制造中的单独步骤故意加入未偶联运载体。因此，组合物中未偶联共用运载体的浓度可随时间增加。优选组合物是在混合所有脑膜炎球菌偶联物6小时后测定时，含有＜10μg/ml未偶联共用运载体的组合物。其它优选组合物是从第一次偶联物混合的时间开始至少1个月(如2个月、3个月、6个月或更长时间)的时间中含有＜10μ/ml未偶联共用运载体的组合物。
在本发明方法中，混合的偶联物可包含未偶联共用运载体，混合后存在的未偶联运载体将维持在该组分偶联物中。如果本发明组合物总共包含xμg脑膜炎球菌偶联物的未偶联共用运载体和n种不同的脑膜炎球菌偶联物，那么平均来说，各偶联物将产生x/nμg未偶联共用运载体。在本发明的优选方法中，当该组合物共包含xμg脑膜炎球菌偶联物的未偶联共用运载体，那么选择n种单独的脑膜炎球菌偶联物各自的量以使未偶联共用运载体量在x/n的±15％之间，如±10％、±7.5％或±5％范围内。在浓度方面，各单独偶联物优选产生小于2μg/ml的未偶联运载体。
组合物中的未偶联共用运载体可以存在于溶液中，它可以沉淀形式存在，或者它可吸附于可能存在的佐剂上。
可用标准和已知方法，如以前用于评价Hib偶联疫苗中未偶联运载体的方法测定未偶联运载体的水平。
为了将未偶联运载体与总运载体(或与偶联运载体)的水平进行比较，通常需要将未偶联运载体与偶联运载体分开，以便进行分别测定。由于偶联运载体比未偶联运载体大，实现这个目的的一种方式是通过大小分离，如大小排阻色谱、电泳等。典型运载体(单体形式)的MW约为CRM197＝58kDa；Dt＝63kDa；Tt＝150kDa；蛋白D＝42kDa。
测定未偶联运载体水平的一种方法包括电泳分离的步骤，将未偶联运载体水平与含有已知量的运载体的一种或多种标准品进行比较。蛋白质定量(如通过染色如银染)后，可测定相对于标准品的量。也可平行运行第三次分析，其中将未偶联运载体的样品与标准品混合，也将该混合物与之前的两个条带比较。
测定未偶联运载体蛋白的其它方法可包括毛细管电泳[74](如在游离溶液中)或胶束动电学色谱[75]，尤其是当共用运载体是白喉类毒素时。可通过在分析期间提高硼酸盐浓度改进对偶联物和运载体分辨率。
可在本发明方法的各个阶段进行测定未偶联运载体水平的试验。例如，可在混合前对一种或多种单独偶联物进行这些试验和/或可在混合后进行这些试验。本发明需要组合物包含小于10μg/ml非偶联共用脑膜炎球菌运载体，如上所述，可通过在混合后进行该试验证实该水平。然而，作为在混合后测定的替代方式，可以在混合前对单独偶联物进行该试验，然后用单独结果计算最终水平(考虑了稀释等)，条件是用于混合的条件己知不会引起未偶联运载体增加。
采用该测定试验和未偶联运载体蛋白的最大允许量(如10μg/ml，如上所述)，本领域技术人员可检查是否有任何具体组合物落入本发明范围。而且，本领域技术人员可根据未偶联运载体蛋白水平高于或低于最大允许量接受或拒绝(a)混合前的单个偶联物和/或(b)混合后的组合偶联物。因此，本发明提供了制备组合物的方法，该方法包括上述混合步骤，还包括以下步骤测定该组合物中未偶联共用运载体的浓度；和(i)如果未偶联运载体的浓度＜10μg/ml，接受该组合物作进一步疫苗生产和/或用于给予人；或(ii)如果未偶联运载体浓度＞10μg/ml，拒绝该组合物。
除了仅包含少量共用运载体外，本发明优选组合物还类似地仅包括少量非偶联脑膜炎球菌荚膜糖。因此，该组合物优选包含不多于2μg/ml(以糖计)非偶联糖如＜1.5μg/ml、＜1μg/ml、＜0.5μg/ml等。
组合物除了包含脑膜炎球菌偶联物和未偶联运载体蛋白外，本发明组合物一般还包含药学上可接受的运载体。这种运载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何运载体。合适的运载体一般是大且代谢慢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(如油珠或脂质体)。本领域普通技术人员熟知这些运载体。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的运载体。对药学上可接受的运载体和赋形剂的充分讨论参见参考文献76。
本发明所用的组合物可包含抗微生物剂，特别是如果包装在多剂形式中。
用于本发明的组合物可包含去污剂如吐温(聚山梨醇酯)，如吐温80。通常去污剂存在的水平低，如＜0.01％。
用于本发明的组合物可包含钠盐(如氯化钠)，以产生张力。浓度一般为10±2mg/ml NaCl。
用于本发明的组合物通常包含缓冲液如磷酸盐缓冲液。
细菌感染可能影响身体的各个区域，因此组合物可制备成各种形式。例如，该组合物可制备成液体溶液或悬液的可注射剂。也可制备成适合在注射前溶解于或悬浮于液体载体的固体形式(如冻干组合物)。可将该组合物制备成用于局部给药的(如)软膏、乳膏或粉末。可将该组合物制备成用于口服给药的(如)片剂或胶囊，或制备成糖浆(任选调味)。可将该组合物制备成用于以细粉或喷雾肺部给药的(如)吸入剂。可将该组合物制备成栓剂或子宫套。可将该组合物制备成用于鼻内、耳内或眼内给药的组合物，例如喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[如参考文献77和78]。然而，通常将脑膜炎球菌偶联物配制成用于肌肉内注射的形式。
用于本发明的组合物可以或可以不包含疫苗佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于A.含有矿物质的组合物本发明中合适用作佐剂的含有矿物质的组合物包含天然盐，例如铝盐和钙盐。本发明包含天然盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献79的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐的颗粒[80]。
尤其优选磷酸铝，佐剂一般是无定形羟基磷酸铝，PO4/Al摩尔比为0.84-0.92，包括约0.6mg Al3+/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如50-100μg Al3+/偶联物/剂。
偶联物可以或可以不吸附于(或可部分吸附于)存在的铝盐。当组合物包含来自多种细菌的偶联物时，并非所有偶联物都需要被吸附。
B.油乳剂适合用作发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献79的第10章；也参见参考文献81](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微流化机制成亚微米颗粒)。也可使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
C.皂苷制剂[参考文献79的第22章]皂苷制剂也能用作本发明的佐剂。皂苷是甾醇糖苷和三萜糖苷的异种组，在广范围的植物种类的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现。来自皂树(Quillaiasaponaria)Molina树皮的皂苷作为佐剂已广泛研究。皂苷也能商业获得自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
皂苷制剂用HPLC和RP-HPLC纯化。鉴定了使用这些技术的特定纯化部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选是QS21。生成QS21的方法参见参考文献82。皂苷制剂也可包括甾醇，如胆固醇[83]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合体(ISCOMs)的独特颗粒[参考文献79的第23章]。ISCOM通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用于ISCOM。ISCOM优选包括一种或多种QuilA、QHA和QHC。ISCOM进一步描述于参考文献83-85。ISCOM任选可不含另外的去垢剂[86]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献87和88。
D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)在本发明中也可用作佐剂。这些结构通常含有任选与磷脂组合或配制的病毒的一种或多种蛋白质。它们通常是非致病性、非复制的并且通常不含任何天然的病毒基因组。病毒蛋白可重组产生或从完整的病毒分离。适合用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括以下来源的蛋白流感病毒(例如，HA或NA)、乙肝病毒(例如，核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外被蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白p1)。参考文献89-94进一步讨论了VLP。病毒体在例如参考文献95中进一步讨论。
E.细菌或微生物衍生物适合用于本发明中的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌的脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素以及它们的解毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰化的MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。优选的“小颗粒”形式的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A公开于参考文献96。这种3dMPL的“小颗粒”要小到足以经0.22μm膜的无菌过滤[96]。其它LPS非毒性衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529[97，98]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Eseherichia coli)的脂质A的衍生物，例如OM-174。OM-174描述于参考文献99和100的实施例中。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激寡核苷酸包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟嘌呤相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示免疫刺激性。
CpG可包括核苷酸修饰物/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可是双链或单链的。参考文献101、102和103公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献104-109进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂效应。
CpG序列可定向于TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[110]。CpG序列可特异地用于诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或者可更特异地用于诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献111-113讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。
优选CpG寡核苷酸构建成使得5’端易于受体识别。可任选连接两条CpG寡核苷酸序列的3’端以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如参考文献110和114-116。
细菌ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物在本发明中可用作佐剂。蛋白质优选来源于大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。参考文献117和118分别描述了解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂和胃肠外佐剂的应用。毒素或类毒素优选含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒突变；B亚基优选未突变的。佐剂优选是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及它们的解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献119-126。氨基酸取代的数值参考优选基于参考文献127所示的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对，该文献特别地全文纳入本文作为参考。
F.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[128]等)[129]、干扰素(例如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂生物粘合剂和粘膜粘合剂在本发明中也可用作佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[130]或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。脱乙酰壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[131]。
H.微粒微粒也可用作本发明的佐剂。微粒(即，直径约100nm-150μm的颗粒，更优选直径约200nm-30μm，最优选直径约500nm-10μm)由生物可降解且非毒性的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)形成，其中优选聚(丙交酯-共-乙交酯)，微粒可任选处理使之具有带负电荷的表面(例如，用SDS处理)或带正电荷的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB处理)。
I.脂质体(参考文献79的第13和14章)适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献132-134。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[135]。这种制剂还含有组合辛苯黄醇(octoxynol)的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[136]以及组合至少一种额外的非离子表面活性剂，例如辛苯黄醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[137]。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制剂描述于，例如参考文献138和139中。
L.胞壁酰基肽适合用作本发明的佐剂的胞壁酰基肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
M.咪唑并喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括描述于参考文献140和141的咪喹莫特(Imiquamod)及其类似物(如“雷西喹莫特(Resiquimod)3M”)。
本发明也可包括一种或多种以上鉴定的佐剂的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳剂[142]；(2)皂苷(如QS21)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)[143]；(3)皂苷(如QS21)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[144]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[145]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或涡流产生较大颗粒的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁成分(RibiImmunochem)，细胞壁成分由单磷酰基脂质A(MPL)、二霉菌酸海藻糖(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一种或多种天然盐(例如铝盐)+LPS的非毒性衍生物(例如3dMPL)。
参考文献79的第7章公开了其它作为免疫刺激剂的物质。
尤其优选采用氢氧化铝或磷酸铝佐剂[如参考文献7的实施例7和8；参考文献8的实施例J](吸附或不吸附均可)。也可采用不含铝盐佐剂的组合物[参考文献15]。磷酸钙是另一种优选佐剂。可将偶联物与(并任选地吸附于)佐剂分别混合，然后将这些偶联物混合在一起，或可将偶联物混合在一起，然后再与佐剂混合。
用于本发明的组合物的pH优选为6-8，优选约为7。可用缓冲液维持稳定的pH。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[146]。该组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物可以是对人等渗的。
组合物可包含防腐剂(如硫柳汞、2-苯氧基乙醇)，或可不含防腐剂。本发明优选组合物不包含任何含汞物质，如它们不含硫柳汞。
组合物可装在小瓶中，或者可装在预先充满的注射器中。注射器可装有或不装针头。注射器将包含单剂量的组合物，而小瓶可包含单剂量或多剂量。可注射组合物通常是液体溶液或悬液。或者，它们可以是注射前溶解于或悬浮于液体载体的固体形式(如冻干)。
组合物可包装到单位剂量形式中或包装到多剂量形式中。对于多剂量形式，小瓶比预先充满的注射器更优选。可常规地建立有效剂量体积，但注射组合物的人用剂量的体积一般为0.5ml。
组合物包含免疫有效量的脑膜炎球菌偶联物，以及所需的任何其它组分。‘免疫有效量’指以单剂量或一系列剂量的一部分给予个体的量能在患者体内引发保护性抗脑膜炎球菌免疫应答。该量依待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的制剂、主治医生对医学状况的评价和其它相关因素而变。预计该量属于由常规试验确定的相对宽的范围，每剂量中每种脑膜炎球菌糖抗原的典型量是1μg-20μg/血清组(以糖计)，如2-10μg/血清组，或3-8μg/血清组。优选的剂量约为4μg/血清组(即四价混合物总共16μg)，或约5μ/血清组(即四价混合物总共20μg)。
冻干一般通过注射，特别是肌肉内注射给予疫苗。本发明组合物通常在用作水性溶液或悬浮液时存在。在本发明一些实施方式中，该组合物是是从包装状态到给药状态的水性形式(′全液体′疫苗)。然而，在其它实施方式中，可将该组合物的一种或多种组分包装成冻干形式，可在需要时重建用于实际给药的疫苗。因此，可在包装阶段制备本发明组合物，或在临用前制备该组合物。本领域已知脑膜炎球菌偶联物的冻干，如MeηjugateTM产品是冻干形式，而NeisVac-CTM和MeningitecTM是全液体疫苗。
因此，在一些实施方式中，本发明组合物是冻干形式。可在混合之前冻干单个脑膜炎球菌偶联物，或可将单个偶联物混合成水性形式然后冻干。
本发明也提供制备本发明组合物的药盒，其中该药盒包括至少一种冻干形式的脑膜炎球菌偶联物和至少一种水性形式的脑膜炎球菌偶联物。该药盒可包括两个小瓶(一个含有水性材料，另一个含有冻干材料)，或该药盒可包括一个预先充满的注射器和一个小瓶，如注射器内容物用于在注射前重建小瓶内容物。对于包含血清组A偶联物的组合物，可冻干血清组A糖，而其它血清组的偶联物可以是液体形式。
本发明也提供制备本发明水性组合物的药盒，其中所述药盒包括(i)冻干的本发明组合物和(ii)水性材料，其中组分(ii)用于重建组分(i)，以提供水性组合物。组分(ii)优选无菌、无热原等，如上所述。
因此，本发明包括全冻干形式、全水性形式和用于重建以产生水性制剂的形式的组合物。
为了在冻干期间使偶联物稳定，组合物中优选包含(如)1mg/ml-30mg/ml(如约25mg/ml)糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)。优选在蔗糖存在下冻干。因此，本发明组合物可包含糖醇或二糖，特别是当它们是冻干形式或从冻干物质重建时。
当组合物是冻干形式(或包含冻干组分)时，冻干物质优选不包含铝佐剂。如果最终需要含有铝佐剂的水性组合物，那么该佐剂应该存在于用于重建冻干材料的材料中(参照MenjugateTM)。
患者本发明组合物用于保护患者抵御脑膜炎球菌疾病，如抵御脑膜炎，更优选为细菌性脑膜炎，最优选为脑膜炎球菌性脑膜炎。
被免疫的患者一般是人。人通常至少一月龄，如至少2月龄、至少4月龄、至少6月龄、至少2岁、至少5岁、至少11岁、至少17岁、至少40岁、至少55岁等。优选患者组是2-55岁年龄组，另一优选患者组是11-55岁年龄组。又一优选患者组是小于11岁，如2-11岁年龄组。又一优选患者组是小于2岁，如小于1岁年龄组。本发明组合物尤其可用于免疫在以前免疫中已经接受过共用运载体蛋白的患者。
在接受本发明组合物之前或基本同时，可用一种或多种其它疫苗免疫患者。可能已经或可以给予的其它疫苗包括但不限于白喉抗原如白喉类毒素；破伤风抗原如破伤风类毒素；百日咳抗原如全细胞百日咳疫苗(′Pw′)，或者优选为非细胞百日咳疫苗(′Pa′)；B型流感嗜血杆菌荚膜糖，一般为偶联的；乙肝表面抗原(HBsAg)；脊髓灰质炎病毒，如灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)或口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)；肺炎链球菌荚膜糖，一般是多价和偶联的；流感病毒；BCG；甲肝病毒抗原；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒；水痘病毒等。以下给出了这些其它疫苗中一些的详细说明。
给予本发明组合物的结果优选为，患者对各给予的血清组产生血清杀菌性抗体(SBA)应答，SBA滴度(与接受该组合物之前预先免疫的患者相比)增加至少4倍，优选至少8倍。SBA测定是与脑膜炎球菌保护有关的标准。参考文献147中给出了与脑膜炎球菌疫苗相关的血清学细节。
用于本发明的组合物的其它抗原组分可用本发明组合物免疫患者抵御脑膜炎球菌疾病，并可独立于其它疫苗组分单独使用。然而，此外，本发明组合物可与其它疫苗组分联用。这些其它组分可与本发明组合物分开，但基本上同时给予，或者本发明组合物可包含这些其它组分作为组合疫苗的一部分。
因此，除了脑膜炎球菌偶联物抗原外，本发明组合物可任选地包含以下其它抗原中的一种或多种1.B型流感嗜血杆菌的偶联荚膜糖(′Hib′)(如参考文献34的第14章)。该偶联物的运载体蛋白可以是CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素或脑膜炎奈瑟球菌的外膜复合物。该偶联物的糖部分可以是多糖(如全长聚核糖基核糖醇磷酸(PRP))，但优选使荚膜多糖解聚形成寡糖(如MW约为1-5kDa)。优选的Hib偶联物包含通过己二酸接头共价连接于CRM197的寡糖[148，149]。将Hib抗原给予患者优选导致抗-PRP抗体浓度＞0.15μg/ml，更优选＞1μg/ml。当组合物包含Hib糖抗原时，它优选不同时包含氢氧化铝佐剂。如果该组合物包含磷酸铝佐剂，那么Hib抗原可吸附于该佐剂[150]，或该抗原可以不吸附[15]。可通过选择抗原/佐剂混合期间的正确pH、具有合适零电点的佐剂和混合组合物中各种不同抗原的合适顺序来防止吸附[151]。
2.肺炎链球菌(S.pneumoniae)的偶联荚膜糖[如参考文献34的第23章；参考文献152-154]。优选包含来自肺炎链球菌的一种以上血清型的糖。例如，广泛采用23种不同血清型的多糖混合物，如含有5-11种不同血清型的多糖的偶联疫苗[155]。例如，PrevNarTM[156]含有7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，各糖通过还原性胺化单独偶联于CRM197，每0.5ml剂量中各糖为2μg(血清型6B 4μg)，偶联物吸附于磷酸铝佐剂。当用于本发明的组合物中包含肺炎球菌偶联物时，该组合物优选包含血清型6B、14、19F和23F中的至少一种。
3.脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白抗原[如参考文献157]。
4.白喉抗原，如白喉类毒素[如参考文献34的第13章]。
5.破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献34的第27章]。
6.细胞或全细胞百日咳(′Pw′)抗原[如参考文献34的第21章]。
7.一种或多种非细胞百日咳(′Pa′)抗原[如参考文献34的第21章]。
Pa组分通常包括以下良好表征的百日咳杆菌抗原中的一种、两种或三种(1)通过化学方法脱毒或通过定位诱变如′9K/129G′突变体脱毒的百日咳类毒素(′PT′)[158]；(2)丝状血细胞凝集素(′FHA′)；(3)百日咳杆菌粘附素(pertactin)(也称为′69千道尔顿外膜蛋白′)。Pa组分也可包括凝集原2和/或凝集原3。
8.乙肝病毒抗原，如表面抗原(′HBsAg′)和/或核心抗原[如参考文献159和164；参考文献34的第16章]，表面抗原优选吸附在磷酸铝上[160]。
9.一种或多种脊髓灰质炎病毒抗原[如161、162；参考文献34的第24章]如IPV。通常包括Mahoney毒株、MEF-I毒株和Saukett毒株。
10.甲肝病毒抗原，如灭活病毒[如163、164；参考文献34的第15章]。
该组合物可包含这些额外抗原的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)。在其它实施方式中，该组合物可特别地不包含这些抗原中的一种或多种。
当存在时，这些抗原可以或可以不吸附于铝盐。
当混合物中包含白喉抗原时，优选同时包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当包含破伤风抗原时，优选同时包含白喉抗原和百日咳抗原。类似地，当包含百日咳抗原时，优选同时包含白喉抗原和破伤风抗原。
混合物中各抗原的浓度一般为至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度足以引发抵抗该抗原的免疫应答。优选通过组合并不去除单个糖抗原的保护效力，但实际上可能降低免疫原性(如ELISA滴度)。
如果通过一系列剂量给予脑膜炎球菌偶联物，那么没有、一些或全部剂量可包含这些额外抗原。
作为包含这10种额外成分中一种或多种的组合物的替代方式，本发明提供了药盒，该药盒包括(i)水性形式或冻干形式的本发明组合物；和(ii)包含这10种额外成分中一种或多种的组合物。当组分(i)是冻干形式，那么组分(ii)优选为水性形式或可用于重建(i)。
因此，出售的本发明组合物可单独使用，或与其它疫苗材料联用，或作为疫苗药盒的一部分。
医学治疗本发明提供了治疗患者的方法，该方法包括给予患者免疫学有效量的本发明组合物。该患者可以是本身处于疾病风险中的患者或可以是怀孕妇女(′母体免疫′)。
本发明也提供用作药物的本发明组合物(如作为免疫原性组合物或疫苗)。
本发明也提供下组中至少两种在制造用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的药物中的应用(a)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组C的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组W135的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组Y的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其特征是(1)所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)，和(2)该药物包括未偶联形式的共用运载体，其中所述未偶联共用运载体浓度小于10μg/ml。
当该疫苗用于预防用途时，患者优选为儿童(如幼儿或婴儿)；当该疫苗用于治疗用途时，患者优选为成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，如用于评价安全性、剂量免疫原性等。
检查治疗处理的功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测脑膜炎球菌感染。检查预防性处理功效的一种方式包括给药后监测对所给予多肽的免疫应答。可通过将本发明组合物给予受试对象测定它们的免疫原性，参考文献147中说明了脑膜炎球菌疫苗相关的血清学内容。
通常将组合物直接给予患者。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙给药)，或通过直肠、口腔、阴道、局部、透皮、鼻内、眼内、耳内、肺部或其它粘膜给药完成直接递送。优选肌肉内给药(如给予股或上肢)。可通过针头(如皮下注射器针头)进行注射，但也可采用无针注射。肌肉内剂量一般是0.5ml。
将多种血清组的脑膜炎球菌偶联物混合在一种组合物中给药。该组合物可作为单一剂量给药，或可在多剂量方案中给予一次以上。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案后，可进行脑膜炎球菌偶联物的加强剂量方案。可常规地确定初敏剂量之间的合适时间(如4-16周)以及初敏和加强免疫之间的合适时间。
可用本发明引发全身性免疫和/或粘膜免疫。
特定的本发明组合物本发明优选实施方式包括1.包含血清组C、W135和Y的脑膜炎球菌偶联物的水性组合物，各自的运载体是CRM197。用己二酸接头将该糖连接于运载体。非偶联CRM197＜5μg/ml。各偶联物的浓度(以糖计)约为10μg/ml。该组合物包含磷酸铝佐剂，在制备期间没有吸附于佐剂的步骤。该组合物包含氯化钠、磷酸钠(一元碱和二元碱，用于缓冲)和少量聚山梨醇酯80。该组合物用于肌肉内注射，或可用于重建冻干的血清组A偶联物。
2.用上述实施方式1的组合物重建冻干的血清组A偶联物获得的水性组合物。血清组A偶联物也具有CRM197运载体。重建后，血清组A偶联物的浓度可以约为10μg/ml或20μg/ml(取决于稀释因数)。重建后，非偶联CRM197的浓度保持＜5μg/ml。
3.包含血清组A和C的脑膜炎球菌偶联物的水性组合物，其中运载体都是流感嗜血杆菌蛋白D，用CDAP化学将糖连接于运载体。非偶联蛋白D的浓度＜10μg/ml。该组合物也包含B型流感嗜血杆菌偶联物，其中Hib糖偶联偶联于破伤风类毒素运载体蛋白(参见例如参考文献错误！书签未定义的实施例1a)。这三种偶联物各自的浓度(以糖计)约为10μg/ml。该组合物不包含铝盐佐剂。该组合物包含蔗糖。该组合物的pH为6-6.5，如约6.1。该组合物用于冻干。
4.包含血清组A和C的脑膜炎球菌偶联物的冻干组合物，其中运载体都是流感嗜血杆菌蛋白D，用CDAP化学将糖连接于运载体。非偶联蛋白D的浓度＜10μg/ml。该组合物也包含B型流感嗜血杆菌偶联物，其中Hib糖偶联偶联于破伤风类毒素运载体蛋。该组合物不包含铝盐佐剂。该组合物包含蔗糖。用其它疫苗组分，尤其是非脑膜炎球菌疫苗组分重建该组合物。
5.用包含白喉、破伤风和百日咳抗原的疫苗组合物重建上述实施方式4的组合物产生的水性组合物，任选还包含HBsAg。重建疫苗包含氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂。
6.包含血清组A、C、W135和Y的脑膜炎球菌偶联物的水性组合物，各自的运载体是白喉类毒素。用己二酸接头将该糖连接于运载体。非偶联Dt的浓度＜5μg/ml。各偶联物的浓度(以糖计)约为8μg/ml。该组合物不包含铝盐。该组合物用于肌肉内注射。
概要术语“含有”包括“包含”以及“由…组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
上面给出的共用运载体浓度的单位是″μg/ml″(微克每毫升)，但在一组替代或平行的定义中，这些μg/ml浓度可由以单位″Lf/ml″(絮凝单位或“絮凝限制”[165])表示的浓度取代，它是定量破伤风和白喉类毒素的功能单位。在这组替换定义中，数值除以3(即3μg/ml变为1Lf/ml)，需要时，四舍五入为最接近的整数(即10μg/ml变为4Lf/ml)。给出这种替换定义仅仅是为了方便，不应该对本发明以μg/ml给出运载体浓度时有任何影响。
实施本发明的方式在未偶联运载体蛋白的存在下抗血清组C应答降低NeisVac-CTM包含偶联于破伤风类毒素运载体的血清组C(OAc-)荚膜糖，含有氢氧化铝佐剂，蛋白质∶糖重量比约为2∶1。将此疫苗单独或与非偶联破伤风和白喉类毒素同时给予年龄在3-6岁或13-18岁的儿童，如参考文献13所述。用OAc+ELISA、OAc-ELISA和高亲合力ELISA测定特定IgG GMC，也测定rSBA GMT(对抗毒株C11)[13]。与在相同时间内未接受Tt/Dt疫苗的患者的结果相比，这两组患者的结果如下
从这些结果来看，非偶联Tt对免疫应答的影响很清楚。为了避免含有一种以上脑膜炎球菌偶联物的疫苗的这种影响，根据本发明将未偶联运载体的水平保持在阈值水平以下。
组合型脑膜炎球菌偶联物可如参考文献7、8和15所述制备血清组A+C、C+W+Y或A+C+W+Y的脑膜炎球菌偶联物的混合物。这些疫苗的运载体蛋白是CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D或白喉类毒素(Dt)，运载体蛋白共价连接于糖。采用主要用参考文献8的方法生产的偶联物进行以下试验。
对于血清组A，水解纯化的干燥多糖，使平均聚合程度(avDP)为10-11。为了去除长多糖，采用30kDa超滤。然后用Q琼脂糖色谱去除短糖片段。对糖进行还原性胺化，然后是3kDa超滤以去除低分子量杂质。浓缩胺化糖，然后用己二酸的双N-羟基琥珀酰亚胺酯活化。此材料适合于制备偶联物。将活化酯与纯化的CRM197运载体以摩尔糖过量13∶1混合，运载体是45mg/ml的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)溶液。在室温下磁力搅拌8-24小时以进行偶联。通过加入NH4Cl(0.1M终浓度)以终止反应，然后用10mM磷酸钠pH7.2稀释该溶液。这些条件保证了有效偶联和最大程度降低了残留的未反应运载体蛋白水平。根据本发明，坚持去除任何残留的未反应物质，在上述稀释后2小时内进行其它步骤。用10mM磷酸钠(pH7.2)进行30kDa盒的超滤长达4小时。
对于血清组C，采用的方法基本相同，除了一开始水解使avDP为7-16；偶联反应在室温下进行14-22小时；在偶联和超滤步骤之间插入额外步骤用疏水作用层析(苯基琼脂糖快速流动柱；1M硫酸铵，10mM磷酸盐缓冲液pH7.2；通过加入不含硫酸铵的缓冲液洗脱)纯化偶联物；和超滤采用的截断值为10kDa。
对于血清组W135和Y，与血清组A所用方法基本相同，除了一开始水解使avDP为20；摩尔糖过量为12∶1。
通过这些方法，通常可实现各偶联物的未偶联运载体水平小于1μg(相对于CRM197总含量为50μg)。
可将这四组偶联物混合以产生本发明组合物。
在芬兰和德国进行的临床试验V59P2中，采用12-16月龄的620名对象，测试了这些混合偶联物的五种剂型。各血清组糖的剂量表示为混合和稀释后每0.5ml剂量中糖的μg数，如下所述
疫苗包含磷酸铝佐剂[8]。疫苗中非偶联CRM197的浓度低于2μg/ml。
对象在时间0点接受注射，然后25％对象在4周后接受第二个剂量的疫苗。
给予疫苗后1个月收集患者血清，在SBA试验中用人补体测定对各血清组的脑膜炎奈瑟球菌的抵抗。评价相对于时间零点SBA滴度增加，标准是≥1∶4和≥1∶8。也测定各血清组的抗胶囊(anti-capsule)滴度(GMT)。结果见下表1。
因此，三价和四价疫苗在幼儿中都有免疫原性。在糖剂量低至2.5μg/偶联物时该偶联物有免疫原性。免疫应答是可加强的，第二次剂量后SBA滴度增加了很多。在此试验中没有观察到运载体抑制的证据。
应理解，仅以举例的方式描述本发明，可在本发明范围和精神内进行修改。
表1-试验V59P2的结果
参考文献(这些内容纳入本文作为参考)[1]Baklaic等，(1983)Infect.Immun.42599-604。
Armand等，(1982)J.Biol.Stand.10335-339。
Cadoz等，(1985)Vaccine 3340-342。
Jones(2001)Curr Opin Investig Drugs 247-49。
Costantino等，(1992)Vaccine 10691-8。
Lieberman等，(1996)JAMA 2751499-503。
WO02/058737。
WO03/007985。
Rennels等，(2002)Pediatr Infect Dis J 21978-979。
Campbell等，(2002)J Infect Dis 1861848-1851。
Herzenberg等，(1980)Nature 285664-667。
Dagan等，(1998)Infect Immun 662093-2098。
Burrage等，(2002)Infect Immun 704946-4954。
Reddin等，(2001)FEMS Immunol Med Microbiol 31153-162。
WO02/00249。
EP-B-0831901。
Ramsay等，(2001)Lancet 357(9251)195-196。
Lindberg(1999)Vaccine 17Suppl2S28-36。
Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34163-168。
Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13113-33，vii。
Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47563-567。
欧洲专利0477508。
美国专利5,306,492。
WO98/42721。
Dick等，《偶联疫苗》(Conjugate Vaccines)(Cruse等编)Karger，Basel，1989，1048-114。
《疫苗方法》(Vaccine Protocols)第10章(第二版，2003).ISBN1-59259-399-2。
《Hermanson生物偶联技术》Hermanson Bioconjugate Techniques，AcademicPress，San Diego(1996)ISBN0123423368。
WO99/42130[29]美国专利4,711,779。
WO03/080678。
Glode等，(1979)J Infect Dis 13952-56。
WO94/05325；美国专利5,425,946。
英国专利申请0323103.2。
《疫苗》(Vaccines)(Plotkin和Orenstein编).第4版，2004，ISBN0-7216-9688-0。
美国专利4,709,017。
WO93/25210。
美国专利5,917,017。
WO00/48638。
Del Guidice等，(1998)Molecular Aspects of Medicine 191-70。
佚名(Jan 2002)Research Disclosure，453077。
Anderson(1983)Infect Immun 39(1)233-238。
Anderson等，(1985)J Clin Invest 76(1)52-59。
EP-A-0372501。
EP-A-0378881。
EP-A-0427347。
WO93/17712。
WO94/03208。
WO98/58668。
EP-A-0471177。
WO91/01146。
Falugi等，(2001)Eur J Immunol 313816-3824。
EP-A-0594610。
Ruan等，(1990)J Immunol1453379-3384。
WO00/56360。
Kuo等，(1995)Infect Immun 632706-13。
WO02/091998。
WO01/72337。
WO00/61761。
Lees等，(1996)Vaccine 14190-198。
WO95/08348。
美国专利4,882,317。
美国专利4,695,624。
Porro等，(1985)Mol Immunol 22907-919。
EP-A-0208375。
WO00/10599。
Gever等，Med.Microbiol.Immunol，165171-288(1979)。
美国专利4,057,685。
美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700。
美国专利4,459,286。
美国专利4,965,338。
美国专利4,663,160。
美国专利4,761,283。
美国专利4,356,170。
Lamb等，(2000)Dev Biol(Basel)103251-258。
Lamb等，(2000)Journal of Chromatography A 894311-318。
Gennaro(2000)《雷明顿药物科学和实践》(RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy).第20版，ISBN0683306472。
Almeida和Alpar(1996)J.Drug Targeting 3455-467。
Agarwal和Mishra(1999)Indian J Exp Biol 376-16。
《疫苗设计》(Vaccine Design…)(1995)，Powell和Newman编.ISBN030644867X.Plenum。
WO00/23105。
WO90/14837。
美国专利5,057,540。
WO96/33739。
EP-A-0109942。
WO96/11711。
WO00/07621。
Barr等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32247-271。
Sjolanderet等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32321-338。
Niikura等，(2002)Virology 293273-280。
Lenz等，(2001)J Immunol 1665346-5355。
Pinto等，(2003)J Infect Dis 188327-338。
Gerber等，(2001)Virol 754752-4760。
WO03/024480。
WO03/024481。
Gluck等，(2002)Vaccine 20B10-B16。
EP-A-0689454。
Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett 92273-2278。
Evans等，(2003)Expert Rev Vaccines 2219-229。
Meraldi等，(2003)Vaccine 212485-2491。
Pajak等，(2003)Vaccine 21836-842。
Kandimalla等，(2003)Nucleic Acids Research 312393-2400。
WO02/26757。
WO99/62923。
Krieg(2003)Nature Medicine 9831-835。
McCluskie等，(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32179-185。
WO98/40100。
美国专利6,207,646。
美国专利6,239,116。
美国专利6,429,199。
Kandimalla等，(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分)654-658。
Blackwell等，(2003) J Immunol 1704061-4068。
Krieg(2002)Trends Immunol 2364-65。
WO01/95935。
Kandimalla等，(2003)BBRC 306948-953。
Bhagat等，(2003)BBRC 300853-861。
WO03/035836。
WO95/17211。
WO98/42375。
Beignon等，(2002)Infect Immun 703012-3019。
Pizza等，(2001)Vaccine 192534-2541。
Pizza等，(2000)Int J Med Microbiol 290455-461。
Scharton-Kersten等，(2000)Infect Immun 685306-5313。
Ryan等，(1999)Infect Immun 676270-6280。
Partidos等，(1999)Immunol Lett 67209-216。
Peppoloni等，(2003)Expert Rev Vaccines 2285-293。
Pine等，(2002)J Control Release 85263-270。
Domenighini等，(1995)Mol Microbiol151165-1167。
WO99/40936。
WO99/44636。
Singh等，(2001)J Cont Release 70267-276。
WO99/27960。
美国专利6,090,406。
美国专利5,916,588。
EP-A-0626169。
WO99/52549。
WO01/21207。
WO01/21152。
Andrianov等，(1998)Biomaterials 19109-115。
Payne等，(1998)Adv Drug Delivery Review 31185-196。
Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27571-577。
Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs 4214-218。
WO99/11241。
WO94/00153。
WO98/57659。
欧洲专利申请0835318、0735898和0761231。
WO03/009869。
Balmer和Borrow(2004)Expert Rev Vaccines 377-87。
Kanra等，(1999)The Turkish Journal of Paediatrics 42421-427。
Ravenscrogft等，(2000)Dev Biol(Basel)10335-47。
WO97/00697。
WO96/37222；美国专利6,333,036。
Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19331-332。
Rubin(2000)Pediatr Clin North Am 47269-285，v。
Jedrzejas(2001)Microbiol MoI Biol Rev 65187-207。
Zielen等，(2000)Infect.Immun.681435-1440。
Darkes和Plosker(2002)Paediatr Drugs 4609-630。
WO2004/032958。
Podda等，(1991)Vaccine 9741-745。
Gerlich等，(1990)Vaccine 8增刊S63-68和79-80。
WO93/24148。
Sutter等，(2000)Pediatr Clin North Am 47287-308。
Zimmerman和Spann(1999)Am Fam Physician 59113-118，125-126。
Bell(2000)Pediatr Infect Dis J 191187-1188。
Iwarson(1995)APMIS 103321-326。
Lyng和Betzon(1987)J Biol Stand 1527-37。
权利要求
1.一种用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物，该组合物包含下组中的至少两种(a)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组C的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组W135的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组Y的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其特征是(1)所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)，和(2)该组合物包含未偶联形式的共用运载体，其中所述未偶联共用运载体浓度小于10μg/ml。
2.如权利要求1所述的组合物，其包含血清组A和C的偶联物。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其包含所有血清组A、C、W135和Y的偶联物。
4.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述脑膜炎球菌偶联物各自偶联于选自下组的共用运载体白喉类毒素；破伤风类毒素；CRM197和流感嗜血杆菌的蛋白D。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述共用运载体是白喉类毒素。
6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述共用运载体是流感嗜血杆菌蛋白D。
7.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，各血清组中糖的质量为2-10μg。
8.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，各血清组中糖的质量为互相相差在+10％以内。
9.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述未偶联共用运载体的浓度小于2μg/ml。
10.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，组合物中所述共用运载体的总浓度小于100μg/ml。
11.如之前任一项权利要求所述的组合物，将其配制成用于肌肉内注射的形式。
12.如之前任一项权利要求所述的组合物，还包含氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂。
13.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物不含任何含汞物质。
14.如之前任一项权利要求所述的组合物，还包含以下抗原中的一种或多种(i)偶联的B型流感嗜血杆菌荚膜糖；(ii)偶联的肺炎链球菌荚膜糖；(iii)脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白抗原；(iv)白喉抗原；(v)破伤风抗原；(vi)细胞或全细胞百日咳抗原；(vii)一种或多种非细胞百日咳抗原；(viii)乙肝病毒抗原；(ix)一种或多种脊髓灰质炎病毒抗原；(x)甲肝病毒抗原。
15.如之前任一项权利要求所述的组合物，该组合物为水性形式。
16.如之前任一项权利要求所述的组合物，该组合物为冻干形式。
17.如之前任一项权利要求所述的组合物，其包含糖醇或蔗糖。
18.一种含有之前任一项权利要求所述组合物的小瓶。
19.一种含有之前任一项权利要求所述组合物的注射器。
20.一种制备权利要求1-15中任一项所述组合物的试剂盒，其中该试剂盒包括至少一种冻干形式的脑膜炎球菌偶联物和至少一种水性形式的脑膜炎球菌偶联物。
21.一种制备权利要求1-15中任一项所述组合物的试剂盒，其中该试剂盒包括(i)权利要求15所述的冻干组合物和(ii)水性物质，其中组分(ii)用于重建(i)以提供水性组合物。
22.一种试剂盒，其包括(i)权利要求1-17中任一项所述的组合物和(ii)包含权利要求14所述的抗原(i)-(x)中一种或多种的组合物。
23.一种用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)制备下组的至少两种(a)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组C的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组W135的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组Y的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)；和(2)混合(1)中制备的至少两种偶联物，以产生包含未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。
24.一种用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)从A、C、W135和Y中选择n种不同的脑膜炎球菌血清组，其中n的值是2、3或4，然后对于n种所选血清组中每个血清组，制备(i)该血清组的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中n种偶联物各自采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)；和(2)混合步骤(1)中制备的n种偶联物，产生包含未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，n的值是2或4。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，还包括测定未偶联共用运载体量的一个或多个步骤。
27.如权利要求26所述的方法，其包括将所述偶联物混合之前的测定步骤和/或将混合物混合之后的测定步骤。
28.一种评价组合物在疫苗生产和/或给予人中的适用性的方法，该方法包括进行权利要求23-27中任一项所述的步骤(1)和(2)，还包括以下步骤(3)测定组合物中未偶联共用运载体的浓度；和(4-i)如果所述未偶联运载体的浓度＜10μg/ml，接受该组合物作进一步疫苗生产和/或用于给予人；或者(4-ii)如果未偶联运载体浓度≥10μg/ml，拒绝该组合物。
全文摘要
在同时给予具有相同运载体蛋白的多种偶联物时，运载体诱导的表位抑制尤其受到关注。为了避免这种抑制，本发明最大程度减少了疫苗中未偶联运载体蛋白的量。本发明提供了用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物，其中(1)该组合物包含四种脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种的偶联物，这至少两种偶联物具有共用运载体蛋白；和(2)该组合物包含的未偶联形式的共用运载体少于10μg/ml。
文档编号A61K47/48GK1976716SQ200580013875
公开日2007年6月6日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月30日
发明者P·科斯坦蒂诺 申请人:启龙有限公司
技术领域：
本发明涉及脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)的疫苗。具体说，本发明涉及基于来自多种脑膜炎球菌血清组的偶联荚膜糖的疫苗。
背景技术：
根据生物的荚膜多糖，鉴定了12个脑膜炎奈瑟球菌血清组(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。A组是亚撒哈拉非洲流行病中最常见的病原体。血清组B和C引起美国和大部分发达国家中的大多数病例。血清组W135和Y引起美国和大部分发达国家中的其余病例。
血清组A+C的荚膜多糖的二价疫苗可以产品Mencevax ACTM购得，血清组A+C+Y+W135的糖的四价混合物可以产品Mencevax ACWYTM和MenomuneTM购得[1-3]。虽然这些疫苗在青少年和成年人中有效，但它们诱导的免疫应答差，保护时间短，因为未偶联的多糖是T细胞非依赖性抗原，它诱导的免疫应答弱，并且不可被增强。
为解决荚膜糖免疫差的问题，开发了将糖连接于运载体蛋白的偶联疫苗。对抗血清组C的偶联疫苗已批准用于人，包括MenjugateTM[4]、MeningitecTM和NeisVac-CTM。也测试了血清组A+C的偶联物的混合物[5，6]，已报道了血清组A+C+W135+Y的偶联物的混合物[7-10]。
虽然混合的偶联疫苗类似于混合的糖疫苗，但有一些关键差异。具体说，偶联物混合物中由于包括运载体蛋白而产生新的风险，特别是运载体诱导的表位抑制(或″运载体抑制″，如其通常的称谓)即用运载体蛋白免疫动物会阻止动物以后产生对抗该运载体上存在的抗原表位的免疫应答的现象[11]。当具有相同运载体蛋白的多种偶联物同时给予时这个问题尤其受到关注[12]。
研究了单价脑膜炎球菌偶联物的运载体抑制[13]，也有一些工作涉及混合的脑膜炎球菌偶联物。例如，参考文献14说明，百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)菌毛应该用作运载体以避免多价偶联疫苗中的运载体抑制。参考文献15说明，应该在疫苗中采用一种以上类型的运载体蛋白来对付运载体抑制，优选流感嗜血杆菌(H.influenzae)蛋白D和/或破伤风类毒素(Tt)。
本发明的一个目的是提供包含多种脑膜炎球菌血清组的偶联荚膜糖但避免运载体诱导的表位抑制风险的其它疫苗。
发明内容
与参考文献15中关于避免运载体抑制的方法，即采用一种以上类型的不同运载体蛋白相反，本发明对多种偶联物采用相同类型的运载体蛋白(′共用运载体′)，这简化了商业规模生产疫苗。然而，通过选择共用运载体，增加了运载体抑制的可能性。通常通过混合已经在单独的浓缩部分中制备的单个偶联物来制备疫苗，其中各块通常包括来自偶联反应的残留量未偶联运载体蛋白。未偶联运载体可产生运载体抑制，如果各浓缩部分包括x量的未偶联运载体，那么四价混合物将包括4x未偶联运载体。当仅在运载体存在特定阈值时(例如仅在未偶联运载体水平足够高，以饱和相关B细胞和/或T细胞，或仅在其足够高，以刺激相关抑制性T细胞)观察到运载体抑制，那么4x水平可导致抑制，即使各偶联物的水平低于阈值并且单独给予不会引起抑制。
因此，与单价疫苗相比或与采用不同运载体蛋白的偶联物相比，为多价疫苗选择共用运载体显著提高了运载体抑制风险。为了补偿此提高的风险，本发明控制疫苗中未偶联运载体蛋白的量。虽然参考文献13-15中通过关注用于脑膜炎球菌糖的收入蛋白(earner protein)的特性解决运载体抑制的可能性，但本发明关注所用运载体的量，更具体说是未偶联形式中存在的量。通过最大程度减少疫苗中未偶联运载体蛋白的量，可避免运载体抑制，即使采用共用运载体。
以前考虑了偶联疫苗中包括未偶联运载体蛋白[16]，但在以前工作中未偶联收入蛋白(破伤风类毒素)的浓度约为10Lf/剂。采用0.5ml剂量(所用转换因子为1Lf＝3μg)[12]，这些疫苗约含60μg/ml未偶联运载体蛋白。参考文献16未涉及避免运载体抑制。
因此，本发明提供了用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物，该组合物包含下组中的至少两种(a)(i)血清组A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)血清组C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)血清组W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)血清组Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其特征是(1)所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)，和(2)该组合物包含未偶联形式的共用运载体，其中所述未偶联共用运载体浓度小于10μg/ml。
本发明也提供用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)制备下组的至少两种(a)(i)血清组A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)血清组C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)血清组W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)血清组Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)；和(2)混合(1)中制备的至少两种偶联物，以产生包含未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。
该方法可包括测定未偶联共用运载体量的一个或多个步骤。可在混合前对单个偶联物进行所述测定和/或在混合后对混合的偶联物进行所述测定。可根据所述测定的结果拒绝或选择单个偶联物用以混合，可根据所述测定的结果简单地拒绝或选择最终组合物用以发布给医生。
本发明也提供用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(a)从A、C、W135和Y中选择n种不同的脑膜炎球菌血清组，其中n的值是2、3或4；(b)对于n种所选血清组中每个血清组，制备(i)该血清组的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中n种偶联物各自采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)；和(c)混合(b)中制备的n种偶联物，产生包含未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。n的值优选为4，以致于本发明能提供以下用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(a)制备各脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y，(i)该血清组的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中四种偶联物各自采用相同的运载体蛋白；和(b)混合这些偶联物产生包括未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。
同以前一样，此方法可包括在步骤(b)混合之前和/或之后测定未偶联共用运载体量的一个或多个步骤。
偶联物用偶联提高糖的免疫原性，因为它能将其从T非依赖性抗原转化为T依赖性抗原，从而可以引发免疫记忆。偶联在儿科疫苗中尤其有用[如参考文献17]，并且是熟知技术[如参考文献18-27中的综述]。
本发明组合物包含以下脑膜炎球菌偶联物的至少两种(即2、3或4种)(a)(i)血清组A脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)血清组C脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)血清组W135脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)血清组Y脑膜炎奈瑟球菌的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物。
这些偶联物中，至少两种(即2、3或4种)采用共用运载体蛋白。这并不意味着一个偶联分子包括一个以上血清组的糖(参考文献28和29)，而是一个偶联分子携带一个血清组的糖，但相同类型的运载体蛋白用于各不同血清组。然而，在一个偶联分子中，可能有一种以上类型的糖(如不同长度的片段)，但它们来自一个血清组。作为采用共用运载体的一个例子，可将蛋白质样品分为4份，然后用各份与一个血清组的荚膜糖片段制备偶联物，然后可组合偶联物以产生具有共用运载体的四价偶联物。
从脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y中选择荚膜糖，使该组合物包含2、3或全部4个血清组的糖。特定组合物包含以下来源的糖血清组A和C；血清组A和W135；血清组A和Y；血清组C和W135；血清组C和Y；血清组W135和Y；血清组A和C和W135；血清组A和C和Y；血清组A和W135和Y；血清组C和W135和Y；血清组A和C和W135和Y。优选至少包含血清组C(如A和C)的组合物，最优选包含所有4种血清组的糖的组合物。
这四个血清组各组的荚膜糖已良好表征。血清组A脑膜炎球菌的荚膜糖是(α1→6)-连接的N-乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸的同聚物，在C3和C4位置中发生部分O-乙酰化。可用保护基团取代乙酰基以防止水解[30]，这种修饰糖仍然是本发明范围内的血清组A糖。血清组C荚膜糖(α2→9)-连接的唾液酸(N-乙酰神经氨酸或′NeuNAc′)的同聚物。大多数血清组C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8具有O-乙酰基，但约15％的临床分离物缺少这些O-乙酰基[31，32]。糖结构写作→9)-Neu p NAc 7/8OAc-(α2→。血清组W135糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的聚合物。就象血清组C糖一样，它具有可变的O-乙酰化，但在唾液酸7和9位置上[33]。该结构写作→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。血清组Y糖类似于血清组W135糖，除了该二糖重复单元包括葡萄糖，而非半乳糖。就象血清组W135一样，它在唾液酸7和9位置上具有可变的O-乙酰化[33]。血清组Y结构写作→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。
用于本发明的糖可以是O-乙酰化的糖，如上所述(如具有与天然荚膜糖相同的O-乙酰化模式)，或者它们可以在糖环的一个或多个位置上部分或全部去-O-乙酰化，或者它们可以相对于天然荚膜糖超-O-乙酰化。
用于本发明的糖优选短于细菌中所见的天然荚膜糖。因此，该糖优选为解聚化糖，解聚发生在纯化后偶联前。解聚能减少糖链的长度。优选的解聚方法涉及采用过氧化氢[7]。将过氧化氢加入糖(如使H2O2终浓度为1％)，然后孵育该混合物(如约55℃)，直到获得所需的链长度减少。另一种解聚方法涉及酸水解[8]，本发明偶联物中优选的解聚化糖的平均聚合程度范围如下A＝10-20；C＝12-22；W135＝15-25；Y＝15-25。本领域技术人员了解其它解聚化方法。可用这些解聚方法中任一种获得用于制备本发明所用的偶联物的糖。可采用解聚来提供对免疫原性来说最优的链长度和/或降低链长度以易于对糖进行物理处理。
用于偶联物的运载体蛋白一般是细菌毒素，如白喉毒素(参见例如参考文献34的第13章；参考文献35-38)(或其CRM197突变体[39-42])和破伤风毒素，通常是类毒素的形式(如用灭活化学物质如福尔马林或甲醛处理获得的形式)。其它合适的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[43]、合成肽[44，45]、热激蛋白[46，47]、百日咳蛋白[48，49]、细胞因子[50]、淋巴因子[50]、激素[50]、生长因子[50]、包含来自各种病原体衍生抗原的多个人CD4+T细胞表位的人造蛋白[51]、流感嗜血杆菌的蛋白D[52-54]、肺炎链球菌溶血素[55]、肺炎球菌表面蛋白PspA[56]、摄铁蛋白[57]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[58]等。
用作共用运载体的四种特别优选的运载体蛋白是白喉类毒素(Dt)、破伤风类毒素(Tt)、CRM197和流感嗜血杆菌(H.influenze)的蛋白D。优选这些蛋白的原因是它们是目前用于儿科疫苗的主要运载体，因此它们是(如)给予其它疫苗之前、同时或之后运载体抑制风险最高的运载体。Dt和蛋白D是最优选的共用运载体，因为这些蛋白用于现有儿科疫苗的频率低于CRM197和Tt，如GSK的Hib偶联物采用Tt作为运载体，HibTITERTM产品采用CRM197，PrevenarTM中的肺炎球菌偶联物采用CRM197，MeniugateTM和MeningitecTM产品采用CRM 197，NeisVac-CTM采用Tt。因此，为了进一步最大程度降低运载体抑制的风险，将Dt和流感嗜血杆菌蛋白D用作共用运载体。
优选将偶联物混合，以使比例基本上为1∶1∶1∶1(以糖的质量计)，如各血清组的糖的质量互相相差在+10％以内。组合物中每个血清组的脑膜炎球菌抗原的量一般为1μg-20μg，如2-10μg/血清组，或约4μg。作为比例1∶1∶1∶1的替代，可采用双倍血清组A的剂量(2∶1∶1∶1)。
优选糖∶蛋白比(w/w)为1∶15(即蛋白过量)-15∶1(即糖过量)，优选1∶5-5∶1的偶联物。优选运载体蛋白过量。优选糖∶蛋白比约为1∶12或约为1∶3的偶联物，尤其是当运载体是Dt时。
可采用任何合适的偶联反应，需要时可采用任何合适接头。
一般在偶联之前使糖活化或功能化。活化可包括(例如)氰化试剂(cyanylatingreagents)[59、60等])。其它合适技术采用活性酯、碳二亚胺、酰肼、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU；也参见参考文献24的引言)。
可用任何已知方法，例如参考文献61和62所述方法通过接头基团连接。一种连接类型包括多糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于己二酸接头基团的另一端[22、63、64]。其它接头包括B-丙酰胺基[65]、硝基苯基-乙基胺[66]、卤代酰基卤化物[67]、糖苷键连接[68]、6-氨基己酸[69]、ADH[70]、C4-C12部分[71]等。作为采用接头的替代方式，可采用直接连接。与蛋白质直接连接可包括氧化多糖，然后用蛋白质还原性胺化，例如参考文献72和73所述。
优选的偶联方法包括将氨基引入糖(如通过用-NH2取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯)衍生化，与运载体蛋白(如CRM197)反应。该偶联方法的进一步详细情况可参见参考文献8。通过此方法获得的偶联物是用于本发明的优选偶联物。
在另一优选的偶联方法中，使糖与己二酸二酰肼反应。对于血清组A，也可在此阶段加入碳二亚胺(EDAC)。反应一段时间后，加入氰基硼氢化钠。然后，可通过(例如)超滤制备衍生糖。然后将该衍生糖与运载体蛋白(如白喉类毒素)混合，加入碳二亚胺。反应时间后，可回收偶联物。此偶联方法的进一步详细情况可参见参考文献8。用此方法获得的偶联物是用于本发明的优选偶联物，如包含白喉类毒素运载体和己二酸结构的偶联物。
在另一优选的偶联方法中，用氰化试剂使糖衍生化[60]，然后偶联于蛋白质(直接偶联，或将巯基或酰肼亲核基团引入运载体后)，无需使用接头。合适的氰化试剂包括1-氰基-4-(二甲基氨基)-四氟硼酸吡啶(′CDAP′)，氰酸对硝基苯酯和N-氰基三乙基四氟硼酸铵(′CTEA′)。优选CDAP，尤其是当流感嗜血杆菌蛋白D是共用运载体时。优选直接偶联。
优选分别制备偶联物，然后混合。混合后，可用(例如)无菌无热原的磷酸盐缓冲盐水调节混合的偶联物浓度。
除共用运载体外，本发明组合物中可存在与其它运载体蛋白的偶联物。然而通常，该组合物中的所有脑膜炎球菌偶联物优选采用相同的运载体。
在本发明组合物中，各偶联物中运载体(偶联和非偶联)的量优选各偶联物中运载体蛋白不大于100μg/ml，如＜30μg/ml。优选组合物中共用运载体(混合的脑膜炎球菌偶联物中单独的运载体，或优选以该组合物作为整体的运载体)的总浓度小于500μg/ml，如小于400μg/ml、小于300μg/ml、小于200μg/ml、小于100μg/ml、小于50μg/ml等。
未偶联共用运载体蛋白本发明组合物包含未偶联形式的共用运载体，但未偶联共用运载体存在的浓度小于10μg/ml。
通过控制诸如偶联条件、偶联后纯化、偶联后贮存条件(温度、pH、湿度等)等因素，本发明可确保未偶联共用运载体量可靠的保持在10μg/ml以下，一般可保持在甚至更低的水平，如9μg/ml以下，8μg/ml以下、7μg/ml以下、6μg/ml以下、5μg/ml以下、4μg/ml以下、3μg/ml以下、2μg/ml以下、1μg/ml以下、0.5μg/ml以下等。
然而，为了实际应用，最好包括低水平的未偶联共用运载体，以提供轻微的佐剂效果，而不导致运载体抑制问题。因此，本发明组合物中未偶联共用运载体的浓度优选≥aμg/ml而＜bμ/ml，其中b＞a，并且(i)a选自0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4和5；和(ii)b选自0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
本发明组合物中未偶联运载体具有两种来源。第一，它可能来自混合的单个偶联物。单个偶联物可包括偶联反应中未反应的残留运载体，并且可包括偶联材料降解释放的运载体。第二，它可来自混合后，如组合物贮存后偶联物的降解。通常不会作为制造中的单独步骤故意加入未偶联运载体。因此，组合物中未偶联共用运载体的浓度可随时间增加。优选组合物是在混合所有脑膜炎球菌偶联物6小时后测定时，含有＜10μg/ml未偶联共用运载体的组合物。其它优选组合物是从第一次偶联物混合的时间开始至少1个月(如2个月、3个月、6个月或更长时间)的时间中含有＜10μ/ml未偶联共用运载体的组合物。
在本发明方法中，混合的偶联物可包含未偶联共用运载体，混合后存在的未偶联运载体将维持在该组分偶联物中。如果本发明组合物总共包含xμg脑膜炎球菌偶联物的未偶联共用运载体和n种不同的脑膜炎球菌偶联物，那么平均来说，各偶联物将产生x/nμg未偶联共用运载体。在本发明的优选方法中，当该组合物共包含xμg脑膜炎球菌偶联物的未偶联共用运载体，那么选择n种单独的脑膜炎球菌偶联物各自的量以使未偶联共用运载体量在x/n的±15％之间，如±10％、±7.5％或±5％范围内。在浓度方面，各单独偶联物优选产生小于2μg/ml的未偶联运载体。
组合物中的未偶联共用运载体可以存在于溶液中，它可以沉淀形式存在，或者它可吸附于可能存在的佐剂上。
可用标准和已知方法，如以前用于评价Hib偶联疫苗中未偶联运载体的方法测定未偶联运载体的水平。
为了将未偶联运载体与总运载体(或与偶联运载体)的水平进行比较，通常需要将未偶联运载体与偶联运载体分开，以便进行分别测定。由于偶联运载体比未偶联运载体大，实现这个目的的一种方式是通过大小分离，如大小排阻色谱、电泳等。典型运载体(单体形式)的MW约为CRM197＝58kDa；Dt＝63kDa；Tt＝150kDa；蛋白D＝42kDa。
测定未偶联运载体水平的一种方法包括电泳分离的步骤，将未偶联运载体水平与含有已知量的运载体的一种或多种标准品进行比较。蛋白质定量(如通过染色如银染)后，可测定相对于标准品的量。也可平行运行第三次分析，其中将未偶联运载体的样品与标准品混合，也将该混合物与之前的两个条带比较。
测定未偶联运载体蛋白的其它方法可包括毛细管电泳[74](如在游离溶液中)或胶束动电学色谱[75]，尤其是当共用运载体是白喉类毒素时。可通过在分析期间提高硼酸盐浓度改进对偶联物和运载体分辨率。
可在本发明方法的各个阶段进行测定未偶联运载体水平的试验。例如，可在混合前对一种或多种单独偶联物进行这些试验和/或可在混合后进行这些试验。本发明需要组合物包含小于10μg/ml非偶联共用脑膜炎球菌运载体，如上所述，可通过在混合后进行该试验证实该水平。然而，作为在混合后测定的替代方式，可以在混合前对单独偶联物进行该试验，然后用单独结果计算最终水平(考虑了稀释等)，条件是用于混合的条件己知不会引起未偶联运载体增加。
采用该测定试验和未偶联运载体蛋白的最大允许量(如10μg/ml，如上所述)，本领域技术人员可检查是否有任何具体组合物落入本发明范围。而且，本领域技术人员可根据未偶联运载体蛋白水平高于或低于最大允许量接受或拒绝(a)混合前的单个偶联物和/或(b)混合后的组合偶联物。因此，本发明提供了制备组合物的方法，该方法包括上述混合步骤，还包括以下步骤测定该组合物中未偶联共用运载体的浓度；和(i)如果未偶联运载体的浓度＜10μg/ml，接受该组合物作进一步疫苗生产和/或用于给予人；或(ii)如果未偶联运载体浓度＞10μg/ml，拒绝该组合物。
除了仅包含少量共用运载体外，本发明优选组合物还类似地仅包括少量非偶联脑膜炎球菌荚膜糖。因此，该组合物优选包含不多于2μg/ml(以糖计)非偶联糖如＜1.5μg/ml、＜1μg/ml、＜0.5μg/ml等。
组合物除了包含脑膜炎球菌偶联物和未偶联运载体蛋白外，本发明组合物一般还包含药学上可接受的运载体。这种运载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何运载体。合适的运载体一般是大且代谢慢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体(如油珠或脂质体)。本领域普通技术人员熟知这些运载体。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的运载体。对药学上可接受的运载体和赋形剂的充分讨论参见参考文献76。
本发明所用的组合物可包含抗微生物剂，特别是如果包装在多剂形式中。
用于本发明的组合物可包含去污剂如吐温(聚山梨醇酯)，如吐温80。通常去污剂存在的水平低，如＜0.01％。
用于本发明的组合物可包含钠盐(如氯化钠)，以产生张力。浓度一般为10±2mg/ml NaCl。
用于本发明的组合物通常包含缓冲液如磷酸盐缓冲液。
细菌感染可能影响身体的各个区域，因此组合物可制备成各种形式。例如，该组合物可制备成液体溶液或悬液的可注射剂。也可制备成适合在注射前溶解于或悬浮于液体载体的固体形式(如冻干组合物)。可将该组合物制备成用于局部给药的(如)软膏、乳膏或粉末。可将该组合物制备成用于口服给药的(如)片剂或胶囊，或制备成糖浆(任选调味)。可将该组合物制备成用于以细粉或喷雾肺部给药的(如)吸入剂。可将该组合物制备成栓剂或子宫套。可将该组合物制备成用于鼻内、耳内或眼内给药的组合物，例如喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[如参考文献77和78]。然而，通常将脑膜炎球菌偶联物配制成用于肌肉内注射的形式。
用于本发明的组合物可以或可以不包含疫苗佐剂。可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于A.含有矿物质的组合物本发明中合适用作佐剂的含有矿物质的组合物包含天然盐，例如铝盐和钙盐。本发明包含天然盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献79的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)。含有矿物质的组合物也可配制为金属盐的颗粒[80]。
尤其优选磷酸铝，佐剂一般是无定形羟基磷酸铝，PO4/Al摩尔比为0.84-0.92，包括约0.6mg Al3+/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如50-100μg Al3+/偶联物/剂。
偶联物可以或可以不吸附于(或可部分吸附于)存在的铝盐。当组合物包含来自多种细菌的偶联物时，并非所有偶联物都需要被吸附。
B.油乳剂适合用作发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献79的第10章；也参见参考文献81](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85，用微流化机制成亚微米颗粒)。也可使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
C.皂苷制剂[参考文献79的第22章]皂苷制剂也能用作本发明的佐剂。皂苷是甾醇糖苷和三萜糖苷的异种组，在广范围的植物种类的树皮、叶、茎干、根和甚至花中发现。来自皂树(Quillaiasaponaria)Molina树皮的皂苷作为佐剂已广泛研究。皂苷也能商业获得自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以StimulonTM出售。
皂苷制剂用HPLC和RP-HPLC纯化。鉴定了使用这些技术的特定纯化部分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选是QS21。生成QS21的方法参见参考文献82。皂苷制剂也可包括甾醇，如胆固醇[83]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合体(ISCOMs)的独特颗粒[参考文献79的第23章]。ISCOM通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷可用于ISCOM。ISCOM优选包括一种或多种QuilA、QHA和QHC。ISCOM进一步描述于参考文献83-85。ISCOM任选可不含另外的去垢剂[86]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献87和88。
D.病毒体和病毒样颗粒病毒体和病毒样颗粒(VLP)在本发明中也可用作佐剂。这些结构通常含有任选与磷脂组合或配制的病毒的一种或多种蛋白质。它们通常是非致病性、非复制的并且通常不含任何天然的病毒基因组。病毒蛋白可重组产生或从完整的病毒分离。适合用于病毒体或VLP中的这些病毒蛋白包括以下来源的蛋白流感病毒(例如，HA或NA)、乙肝病毒(例如，核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(例如外被蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(例如反转录转座子Ty蛋白p1)。参考文献89-94进一步讨论了VLP。病毒体在例如参考文献95中进一步讨论。
E.细菌或微生物衍生物适合用于本发明中的佐剂包括细菌或微生物衍生物，例如肠细菌的脂多糖(LPS)的非毒性衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素以及它们的解毒衍生物。
LPS的非毒性衍生物包括单磷酰基脂质A(MPL)和3-O-脱酰化的MPL(3dMPL)。3dMPL是具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。优选的“小颗粒”形式的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A公开于参考文献96。这种3dMPL的“小颗粒”要小到足以经0.22μm膜的无菌过滤[96]。其它LPS非毒性衍生物包括单磷酰基脂质A模拟物，例如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，例如RC-529[97，98]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Eseherichia coli)的脂质A的衍生物，例如OM-174。OM-174描述于参考文献99和100的实施例中。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激寡核苷酸包括含有CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟嘌呤相连的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含有回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示免疫刺激性。
CpG可包括核苷酸修饰物/类似物，例如硫代磷酸酯修饰物并且可是双链或单链的。参考文献101、102和103公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献104-109进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂效应。
CpG序列可定向于TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[110]。CpG序列可特异地用于诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN，或者可更特异地用于诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献111-113讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。
优选CpG寡核苷酸构建成使得5’端易于受体识别。可任选连接两条CpG寡核苷酸序列的3’端以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如参考文献110和114-116。
细菌ADP-核糖基化毒素和它们的解毒衍生物在本发明中可用作佐剂。蛋白质优选来源于大肠杆菌(大肠杆菌热不稳定毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。参考文献117和118分别描述了解毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂和胃肠外佐剂的应用。毒素或类毒素优选含有A和B亚基的全毒素形式。A亚基优选含有解毒突变；B亚基优选未突变的。佐剂优选是解毒的LT突变体，例如LT-K63、LT-R72和LT-G192。ADP-核糖基化毒素及它们的解毒衍生物，特别是LT-K63和LT-R72作为佐剂的应用见参考文献119-126。氨基酸取代的数值参考优选基于参考文献127所示的ADP-核糖基化毒素的A和B亚基比对，该文献特别地全文纳入本文作为参考。
F.人免疫调节剂适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[128]等)[129]、干扰素(例如，干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘合剂和粘膜粘合剂生物粘合剂和粘膜粘合剂在本发明中也可用作佐剂。合适的生物粘合剂包括酯化的透明质酸微球[130]或者粘膜粘合剂，例如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。脱乙酰壳多糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[131]。
H.微粒微粒也可用作本发明的佐剂。微粒(即，直径约100nm-150μm的颗粒，更优选直径约200nm-30μm，最优选直径约500nm-10μm)由生物可降解且非毒性的材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐、聚己内酯等)形成，其中优选聚(丙交酯-共-乙交酯)，微粒可任选处理使之具有带负电荷的表面(例如，用SDS处理)或带正电荷的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB处理)。
I.脂质体(参考文献79的第13和14章)适合用作佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献132-134。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[135]。这种制剂还含有组合辛苯黄醇(octoxynol)的聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂[136]以及组合至少一种额外的非离子表面活性剂，例如辛苯黄醇的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[137]。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth 9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。
K.聚磷腈(PCPP)PCPP制剂描述于，例如参考文献138和139中。
L.胞壁酰基肽适合用作本发明的佐剂的胞壁酰基肽包括N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)和N-乙酰基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。
M.咪唑并喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括描述于参考文献140和141的咪喹莫特(Imiquamod)及其类似物(如“雷西喹莫特(Resiquimod)3M”)。
本发明也可包括一种或多种以上鉴定的佐剂的组合。例如，以下佐剂组合物可用于本发明(1)皂苷和水包油乳剂[142]；(2)皂苷(如QS21)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)[143]；(3)皂苷(如QS21)+非毒性LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[144]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[145]；(6)含有10％角鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，微流化为亚微米乳剂或涡流产生较大颗粒的乳剂；(7)RibiTM佐剂系统(RAS)，含有2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁成分(RibiImmunochem)，细胞壁成分由单磷酰基脂质A(MPL)、二霉菌酸海藻糖(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组成，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一种或多种天然盐(例如铝盐)+LPS的非毒性衍生物(例如3dMPL)。
参考文献79的第7章公开了其它作为免疫刺激剂的物质。
尤其优选采用氢氧化铝或磷酸铝佐剂[如参考文献7的实施例7和8；参考文献8的实施例J](吸附或不吸附均可)。也可采用不含铝盐佐剂的组合物[参考文献15]。磷酸钙是另一种优选佐剂。可将偶联物与(并任选地吸附于)佐剂分别混合，然后将这些偶联物混合在一起，或可将偶联物混合在一起，然后再与佐剂混合。
用于本发明的组合物的pH优选为6-8，优选约为7。可用缓冲液维持稳定的pH。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[146]。该组合物可以是无菌和/或无热原的。组合物可以是对人等渗的。
组合物可包含防腐剂(如硫柳汞、2-苯氧基乙醇)，或可不含防腐剂。本发明优选组合物不包含任何含汞物质，如它们不含硫柳汞。
组合物可装在小瓶中，或者可装在预先充满的注射器中。注射器可装有或不装针头。注射器将包含单剂量的组合物，而小瓶可包含单剂量或多剂量。可注射组合物通常是液体溶液或悬液。或者，它们可以是注射前溶解于或悬浮于液体载体的固体形式(如冻干)。
组合物可包装到单位剂量形式中或包装到多剂量形式中。对于多剂量形式，小瓶比预先充满的注射器更优选。可常规地建立有效剂量体积，但注射组合物的人用剂量的体积一般为0.5ml。
组合物包含免疫有效量的脑膜炎球菌偶联物，以及所需的任何其它组分。‘免疫有效量’指以单剂量或一系列剂量的一部分给予个体的量能在患者体内引发保护性抗脑膜炎球菌免疫应答。该量依待治疗个体的健康和身体状况、年龄、待治疗个体的分类组(例如，非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的制剂、主治医生对医学状况的评价和其它相关因素而变。预计该量属于由常规试验确定的相对宽的范围，每剂量中每种脑膜炎球菌糖抗原的典型量是1μg-20μg/血清组(以糖计)，如2-10μg/血清组，或3-8μg/血清组。优选的剂量约为4μg/血清组(即四价混合物总共16μg)，或约5μ/血清组(即四价混合物总共20μg)。
冻干一般通过注射，特别是肌肉内注射给予疫苗。本发明组合物通常在用作水性溶液或悬浮液时存在。在本发明一些实施方式中，该组合物是是从包装状态到给药状态的水性形式(′全液体′疫苗)。然而，在其它实施方式中，可将该组合物的一种或多种组分包装成冻干形式，可在需要时重建用于实际给药的疫苗。因此，可在包装阶段制备本发明组合物，或在临用前制备该组合物。本领域已知脑膜炎球菌偶联物的冻干，如MeηjugateTM产品是冻干形式，而NeisVac-CTM和MeningitecTM是全液体疫苗。
因此，在一些实施方式中，本发明组合物是冻干形式。可在混合之前冻干单个脑膜炎球菌偶联物，或可将单个偶联物混合成水性形式然后冻干。
本发明也提供制备本发明组合物的药盒，其中该药盒包括至少一种冻干形式的脑膜炎球菌偶联物和至少一种水性形式的脑膜炎球菌偶联物。该药盒可包括两个小瓶(一个含有水性材料，另一个含有冻干材料)，或该药盒可包括一个预先充满的注射器和一个小瓶，如注射器内容物用于在注射前重建小瓶内容物。对于包含血清组A偶联物的组合物，可冻干血清组A糖，而其它血清组的偶联物可以是液体形式。
本发明也提供制备本发明水性组合物的药盒，其中所述药盒包括(i)冻干的本发明组合物和(ii)水性材料，其中组分(ii)用于重建组分(i)，以提供水性组合物。组分(ii)优选无菌、无热原等，如上所述。
因此，本发明包括全冻干形式、全水性形式和用于重建以产生水性制剂的形式的组合物。
为了在冻干期间使偶联物稳定，组合物中优选包含(如)1mg/ml-30mg/ml(如约25mg/ml)糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)。优选在蔗糖存在下冻干。因此，本发明组合物可包含糖醇或二糖，特别是当它们是冻干形式或从冻干物质重建时。
当组合物是冻干形式(或包含冻干组分)时，冻干物质优选不包含铝佐剂。如果最终需要含有铝佐剂的水性组合物，那么该佐剂应该存在于用于重建冻干材料的材料中(参照MenjugateTM)。
患者本发明组合物用于保护患者抵御脑膜炎球菌疾病，如抵御脑膜炎，更优选为细菌性脑膜炎，最优选为脑膜炎球菌性脑膜炎。
被免疫的患者一般是人。人通常至少一月龄，如至少2月龄、至少4月龄、至少6月龄、至少2岁、至少5岁、至少11岁、至少17岁、至少40岁、至少55岁等。优选患者组是2-55岁年龄组，另一优选患者组是11-55岁年龄组。又一优选患者组是小于11岁，如2-11岁年龄组。又一优选患者组是小于2岁，如小于1岁年龄组。本发明组合物尤其可用于免疫在以前免疫中已经接受过共用运载体蛋白的患者。
在接受本发明组合物之前或基本同时，可用一种或多种其它疫苗免疫患者。可能已经或可以给予的其它疫苗包括但不限于白喉抗原如白喉类毒素；破伤风抗原如破伤风类毒素；百日咳抗原如全细胞百日咳疫苗(′Pw′)，或者优选为非细胞百日咳疫苗(′Pa′)；B型流感嗜血杆菌荚膜糖，一般为偶联的；乙肝表面抗原(HBsAg)；脊髓灰质炎病毒，如灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)或口服脊髓灰质炎病毒疫苗(OPV)；肺炎链球菌荚膜糖，一般是多价和偶联的；流感病毒；BCG；甲肝病毒抗原；麻疹病毒；腮腺炎病毒；风疹病毒；水痘病毒等。以下给出了这些其它疫苗中一些的详细说明。
给予本发明组合物的结果优选为，患者对各给予的血清组产生血清杀菌性抗体(SBA)应答，SBA滴度(与接受该组合物之前预先免疫的患者相比)增加至少4倍，优选至少8倍。SBA测定是与脑膜炎球菌保护有关的标准。参考文献147中给出了与脑膜炎球菌疫苗相关的血清学细节。
用于本发明的组合物的其它抗原组分可用本发明组合物免疫患者抵御脑膜炎球菌疾病，并可独立于其它疫苗组分单独使用。然而，此外，本发明组合物可与其它疫苗组分联用。这些其它组分可与本发明组合物分开，但基本上同时给予，或者本发明组合物可包含这些其它组分作为组合疫苗的一部分。
因此，除了脑膜炎球菌偶联物抗原外，本发明组合物可任选地包含以下其它抗原中的一种或多种1.B型流感嗜血杆菌的偶联荚膜糖(′Hib′)(如参考文献34的第14章)。该偶联物的运载体蛋白可以是CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素或脑膜炎奈瑟球菌的外膜复合物。该偶联物的糖部分可以是多糖(如全长聚核糖基核糖醇磷酸(PRP))，但优选使荚膜多糖解聚形成寡糖(如MW约为1-5kDa)。优选的Hib偶联物包含通过己二酸接头共价连接于CRM197的寡糖[148，149]。将Hib抗原给予患者优选导致抗-PRP抗体浓度＞0.15μg/ml，更优选＞1μg/ml。当组合物包含Hib糖抗原时，它优选不同时包含氢氧化铝佐剂。如果该组合物包含磷酸铝佐剂，那么Hib抗原可吸附于该佐剂[150]，或该抗原可以不吸附[15]。可通过选择抗原/佐剂混合期间的正确pH、具有合适零电点的佐剂和混合组合物中各种不同抗原的合适顺序来防止吸附[151]。
2.肺炎链球菌(S.pneumoniae)的偶联荚膜糖[如参考文献34的第23章；参考文献152-154]。优选包含来自肺炎链球菌的一种以上血清型的糖。例如，广泛采用23种不同血清型的多糖混合物，如含有5-11种不同血清型的多糖的偶联疫苗[155]。例如，PrevNarTM[156]含有7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，各糖通过还原性胺化单独偶联于CRM197，每0.5ml剂量中各糖为2μg(血清型6B 4μg)，偶联物吸附于磷酸铝佐剂。当用于本发明的组合物中包含肺炎球菌偶联物时，该组合物优选包含血清型6B、14、19F和23F中的至少一种。
3.脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白抗原[如参考文献157]。
4.白喉抗原，如白喉类毒素[如参考文献34的第13章]。
5.破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献34的第27章]。
6.细胞或全细胞百日咳(′Pw′)抗原[如参考文献34的第21章]。
7.一种或多种非细胞百日咳(′Pa′)抗原[如参考文献34的第21章]。
Pa组分通常包括以下良好表征的百日咳杆菌抗原中的一种、两种或三种(1)通过化学方法脱毒或通过定位诱变如′9K/129G′突变体脱毒的百日咳类毒素(′PT′)[158]；(2)丝状血细胞凝集素(′FHA′)；(3)百日咳杆菌粘附素(pertactin)(也称为′69千道尔顿外膜蛋白′)。Pa组分也可包括凝集原2和/或凝集原3。
8.乙肝病毒抗原，如表面抗原(′HBsAg′)和/或核心抗原[如参考文献159和164；参考文献34的第16章]，表面抗原优选吸附在磷酸铝上[160]。
9.一种或多种脊髓灰质炎病毒抗原[如161、162；参考文献34的第24章]如IPV。通常包括Mahoney毒株、MEF-I毒株和Saukett毒株。
10.甲肝病毒抗原，如灭活病毒[如163、164；参考文献34的第15章]。
该组合物可包含这些额外抗原的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)。在其它实施方式中，该组合物可特别地不包含这些抗原中的一种或多种。
当存在时，这些抗原可以或可以不吸附于铝盐。
当混合物中包含白喉抗原时，优选同时包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似地，当包含破伤风抗原时，优选同时包含白喉抗原和百日咳抗原。类似地，当包含百日咳抗原时，优选同时包含白喉抗原和破伤风抗原。
混合物中各抗原的浓度一般为至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度足以引发抵抗该抗原的免疫应答。优选通过组合并不去除单个糖抗原的保护效力，但实际上可能降低免疫原性(如ELISA滴度)。
如果通过一系列剂量给予脑膜炎球菌偶联物，那么没有、一些或全部剂量可包含这些额外抗原。
作为包含这10种额外成分中一种或多种的组合物的替代方式，本发明提供了药盒，该药盒包括(i)水性形式或冻干形式的本发明组合物；和(ii)包含这10种额外成分中一种或多种的组合物。当组分(i)是冻干形式，那么组分(ii)优选为水性形式或可用于重建(i)。
因此，出售的本发明组合物可单独使用，或与其它疫苗材料联用，或作为疫苗药盒的一部分。
医学治疗本发明提供了治疗患者的方法，该方法包括给予患者免疫学有效量的本发明组合物。该患者可以是本身处于疾病风险中的患者或可以是怀孕妇女(′母体免疫′)。
本发明也提供用作药物的本发明组合物(如作为免疫原性组合物或疫苗)。
本发明也提供下组中至少两种在制造用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的药物中的应用(a)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组C的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组W135的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组Y的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其特征是(1)所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)，和(2)该药物包括未偶联形式的共用运载体，其中所述未偶联共用运载体浓度小于10μg/ml。
当该疫苗用于预防用途时，患者优选为儿童(如幼儿或婴儿)；当该疫苗用于治疗用途时，患者优选为成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，如用于评价安全性、剂量免疫原性等。
检查治疗处理的功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测脑膜炎球菌感染。检查预防性处理功效的一种方式包括给药后监测对所给予多肽的免疫应答。可通过将本发明组合物给予受试对象测定它们的免疫原性，参考文献147中说明了脑膜炎球菌疫苗相关的血清学内容。
通常将组合物直接给予患者。可通过胃肠道外注射(如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或组织间隙给药)，或通过直肠、口腔、阴道、局部、透皮、鼻内、眼内、耳内、肺部或其它粘膜给药完成直接递送。优选肌肉内给药(如给予股或上肢)。可通过针头(如皮下注射器针头)进行注射，但也可采用无针注射。肌肉内剂量一般是0.5ml。
将多种血清组的脑膜炎球菌偶联物混合在一种组合物中给药。该组合物可作为单一剂量给药，或可在多剂量方案中给予一次以上。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次剂量方案后，可进行脑膜炎球菌偶联物的加强剂量方案。可常规地确定初敏剂量之间的合适时间(如4-16周)以及初敏和加强免疫之间的合适时间。
可用本发明引发全身性免疫和/或粘膜免疫。
特定的本发明组合物本发明优选实施方式包括1.包含血清组C、W135和Y的脑膜炎球菌偶联物的水性组合物，各自的运载体是CRM197。用己二酸接头将该糖连接于运载体。非偶联CRM197＜5μg/ml。各偶联物的浓度(以糖计)约为10μg/ml。该组合物包含磷酸铝佐剂，在制备期间没有吸附于佐剂的步骤。该组合物包含氯化钠、磷酸钠(一元碱和二元碱，用于缓冲)和少量聚山梨醇酯80。该组合物用于肌肉内注射，或可用于重建冻干的血清组A偶联物。
2.用上述实施方式1的组合物重建冻干的血清组A偶联物获得的水性组合物。血清组A偶联物也具有CRM197运载体。重建后，血清组A偶联物的浓度可以约为10μg/ml或20μg/ml(取决于稀释因数)。重建后，非偶联CRM197的浓度保持＜5μg/ml。
3.包含血清组A和C的脑膜炎球菌偶联物的水性组合物，其中运载体都是流感嗜血杆菌蛋白D，用CDAP化学将糖连接于运载体。非偶联蛋白D的浓度＜10μg/ml。该组合物也包含B型流感嗜血杆菌偶联物，其中Hib糖偶联偶联于破伤风类毒素运载体蛋白(参见例如参考文献错误！书签未定义的实施例1a)。这三种偶联物各自的浓度(以糖计)约为10μg/ml。该组合物不包含铝盐佐剂。该组合物包含蔗糖。该组合物的pH为6-6.5，如约6.1。该组合物用于冻干。
4.包含血清组A和C的脑膜炎球菌偶联物的冻干组合物，其中运载体都是流感嗜血杆菌蛋白D，用CDAP化学将糖连接于运载体。非偶联蛋白D的浓度＜10μg/ml。该组合物也包含B型流感嗜血杆菌偶联物，其中Hib糖偶联偶联于破伤风类毒素运载体蛋。该组合物不包含铝盐佐剂。该组合物包含蔗糖。用其它疫苗组分，尤其是非脑膜炎球菌疫苗组分重建该组合物。
5.用包含白喉、破伤风和百日咳抗原的疫苗组合物重建上述实施方式4的组合物产生的水性组合物，任选还包含HBsAg。重建疫苗包含氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂。
6.包含血清组A、C、W135和Y的脑膜炎球菌偶联物的水性组合物，各自的运载体是白喉类毒素。用己二酸接头将该糖连接于运载体。非偶联Dt的浓度＜5μg/ml。各偶联物的浓度(以糖计)约为8μg/ml。该组合物不包含铝盐。该组合物用于肌肉内注射。
概要术语“含有”包括“包含”以及“由…组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。“基本上”可视需要从本发明定义中省去。
上面给出的共用运载体浓度的单位是″μg/ml″(微克每毫升)，但在一组替代或平行的定义中，这些μg/ml浓度可由以单位″Lf/ml″(絮凝单位或“絮凝限制”[165])表示的浓度取代，它是定量破伤风和白喉类毒素的功能单位。在这组替换定义中，数值除以3(即3μg/ml变为1Lf/ml)，需要时，四舍五入为最接近的整数(即10μg/ml变为4Lf/ml)。给出这种替换定义仅仅是为了方便，不应该对本发明以μg/ml给出运载体浓度时有任何影响。
实施本发明的方式在未偶联运载体蛋白的存在下抗血清组C应答降低NeisVac-CTM包含偶联于破伤风类毒素运载体的血清组C(OAc-)荚膜糖，含有氢氧化铝佐剂，蛋白质∶糖重量比约为2∶1。将此疫苗单独或与非偶联破伤风和白喉类毒素同时给予年龄在3-6岁或13-18岁的儿童，如参考文献13所述。用OAc+ELISA、OAc-ELISA和高亲合力ELISA测定特定IgG GMC，也测定rSBA GMT(对抗毒株C11)[13]。与在相同时间内未接受Tt/Dt疫苗的患者的结果相比，这两组患者的结果如下
从这些结果来看，非偶联Tt对免疫应答的影响很清楚。为了避免含有一种以上脑膜炎球菌偶联物的疫苗的这种影响，根据本发明将未偶联运载体的水平保持在阈值水平以下。
组合型脑膜炎球菌偶联物可如参考文献7、8和15所述制备血清组A+C、C+W+Y或A+C+W+Y的脑膜炎球菌偶联物的混合物。这些疫苗的运载体蛋白是CRM197、流感嗜血杆菌蛋白D或白喉类毒素(Dt)，运载体蛋白共价连接于糖。采用主要用参考文献8的方法生产的偶联物进行以下试验。
对于血清组A，水解纯化的干燥多糖，使平均聚合程度(avDP)为10-11。为了去除长多糖，采用30kDa超滤。然后用Q琼脂糖色谱去除短糖片段。对糖进行还原性胺化，然后是3kDa超滤以去除低分子量杂质。浓缩胺化糖，然后用己二酸的双N-羟基琥珀酰亚胺酯活化。此材料适合于制备偶联物。将活化酯与纯化的CRM197运载体以摩尔糖过量13∶1混合，运载体是45mg/ml的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.2)溶液。在室温下磁力搅拌8-24小时以进行偶联。通过加入NH4Cl(0.1M终浓度)以终止反应，然后用10mM磷酸钠pH7.2稀释该溶液。这些条件保证了有效偶联和最大程度降低了残留的未反应运载体蛋白水平。根据本发明，坚持去除任何残留的未反应物质，在上述稀释后2小时内进行其它步骤。用10mM磷酸钠(pH7.2)进行30kDa盒的超滤长达4小时。
对于血清组C，采用的方法基本相同，除了一开始水解使avDP为7-16；偶联反应在室温下进行14-22小时；在偶联和超滤步骤之间插入额外步骤用疏水作用层析(苯基琼脂糖快速流动柱；1M硫酸铵，10mM磷酸盐缓冲液pH7.2；通过加入不含硫酸铵的缓冲液洗脱)纯化偶联物；和超滤采用的截断值为10kDa。
对于血清组W135和Y，与血清组A所用方法基本相同，除了一开始水解使avDP为20；摩尔糖过量为12∶1。
通过这些方法，通常可实现各偶联物的未偶联运载体水平小于1μg(相对于CRM197总含量为50μg)。
可将这四组偶联物混合以产生本发明组合物。
在芬兰和德国进行的临床试验V59P2中，采用12-16月龄的620名对象，测试了这些混合偶联物的五种剂型。各血清组糖的剂量表示为混合和稀释后每0.5ml剂量中糖的μg数，如下所述
疫苗包含磷酸铝佐剂[8]。疫苗中非偶联CRM197的浓度低于2μg/ml。
对象在时间0点接受注射，然后25％对象在4周后接受第二个剂量的疫苗。
给予疫苗后1个月收集患者血清，在SBA试验中用人补体测定对各血清组的脑膜炎奈瑟球菌的抵抗。评价相对于时间零点SBA滴度增加，标准是≥1∶4和≥1∶8。也测定各血清组的抗胶囊(anti-capsule)滴度(GMT)。结果见下表1。
因此，三价和四价疫苗在幼儿中都有免疫原性。在糖剂量低至2.5μg/偶联物时该偶联物有免疫原性。免疫应答是可加强的，第二次剂量后SBA滴度增加了很多。在此试验中没有观察到运载体抑制的证据。
应理解，仅以举例的方式描述本发明，可在本发明范围和精神内进行修改。
表1-试验V59P2的结果
参考文献(这些内容纳入本文作为参考)[1]Baklaic等，(1983)Infect.Immun.42599-604。
Armand等，(1982)J.Biol.Stand.10335-339。
Cadoz等，(1985)Vaccine 3340-342。
Jones(2001)Curr Opin Investig Drugs 247-49。
Costantino等，(1992)Vaccine 10691-8。
Lieberman等，(1996)JAMA 2751499-503。
WO02/058737。
WO03/007985。
Rennels等，(2002)Pediatr Infect Dis J 21978-979。
Campbell等，(2002)J Infect Dis 1861848-1851。
Herzenberg等，(1980)Nature 285664-667。
Dagan等，(1998)Infect Immun 662093-2098。
Burrage等，(2002)Infect Immun 704946-4954。
Reddin等，(2001)FEMS Immunol Med Microbiol 31153-162。
WO02/00249。
EP-B-0831901。
Ramsay等，(2001)Lancet 357(9251)195-196。
Lindberg(1999)Vaccine 17Suppl2S28-36。
Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34163-168。
Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13113-33，vii。
Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47563-567。
欧洲专利0477508。
美国专利5,306,492。
WO98/42721。
Dick等，《偶联疫苗》(Conjugate Vaccines)(Cruse等编)Karger，Basel，1989，1048-114。
《疫苗方法》(Vaccine Protocols)第10章(第二版，2003).ISBN1-59259-399-2。
《Hermanson生物偶联技术》Hermanson Bioconjugate Techniques，AcademicPress，San Diego(1996)ISBN0123423368。
WO99/42130[29]美国专利4,711,779。
WO03/080678。
Glode等，(1979)J Infect Dis 13952-56。
WO94/05325；美国专利5,425,946。
英国专利申请0323103.2。
《疫苗》(Vaccines)(Plotkin和Orenstein编).第4版，2004，ISBN0-7216-9688-0。
美国专利4,709,017。
WO93/25210。
美国专利5,917,017。
WO00/48638。
Del Guidice等，(1998)Molecular Aspects of Medicine 191-70。
佚名(Jan 2002)Research Disclosure，453077。
Anderson(1983)Infect Immun 39(1)233-238。
Anderson等，(1985)J Clin Invest 76(1)52-59。
EP-A-0372501。
EP-A-0378881。
EP-A-0427347。
WO93/17712。
WO94/03208。
WO98/58668。
EP-A-0471177。
WO91/01146。
Falugi等，(2001)Eur J Immunol 313816-3824。
EP-A-0594610。
Ruan等，(1990)J Immunol1453379-3384。
WO00/56360。
Kuo等，(1995)Infect Immun 632706-13。
WO02/091998。
WO01/72337。
WO00/61761。
Lees等，(1996)Vaccine 14190-198。
WO95/08348。
美国专利4,882,317。
美国专利4,695,624。
Porro等，(1985)Mol Immunol 22907-919。
EP-A-0208375。
WO00/10599。
Gever等，Med.Microbiol.Immunol，165171-288(1979)。
美国专利4,057,685。
美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700。
美国专利4,459,286。
美国专利4,965,338。
美国专利4,663,160。
美国专利4,761,283。
美国专利4,356,170。
Lamb等，(2000)Dev Biol(Basel)103251-258。
Lamb等，(2000)Journal of Chromatography A 894311-318。
Gennaro(2000)《雷明顿药物科学和实践》(RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy).第20版，ISBN0683306472。
Almeida和Alpar(1996)J.Drug Targeting 3455-467。
Agarwal和Mishra(1999)Indian J Exp Biol 376-16。
《疫苗设计》(Vaccine Design…)(1995)，Powell和Newman编.ISBN030644867X.Plenum。
WO00/23105。
WO90/14837。
美国专利5,057,540。
WO96/33739。
EP-A-0109942。
WO96/11711。
WO00/07621。
Barr等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32247-271。
Sjolanderet等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32321-338。
Niikura等，(2002)Virology 293273-280。
Lenz等，(2001)J Immunol 1665346-5355。
Pinto等，(2003)J Infect Dis 188327-338。
Gerber等，(2001)Virol 754752-4760。
WO03/024480。
WO03/024481。
Gluck等，(2002)Vaccine 20B10-B16。
EP-A-0689454。
Johnson等，(1999)Bioorg Med Chem Lett 92273-2278。
Evans等，(2003)Expert Rev Vaccines 2219-229。
Meraldi等，(2003)Vaccine 212485-2491。
Pajak等，(2003)Vaccine 21836-842。
Kandimalla等，(2003)Nucleic Acids Research 312393-2400。
WO02/26757。
WO99/62923。
Krieg(2003)Nature Medicine 9831-835。
McCluskie等，(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32179-185。
WO98/40100。
美国专利6,207,646。
美国专利6,239,116。
美国专利6,429,199。
Kandimalla等，(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分)654-658。
Blackwell等，(2003) J Immunol 1704061-4068。
Krieg(2002)Trends Immunol 2364-65。
WO01/95935。
Kandimalla等，(2003)BBRC 306948-953。
Bhagat等，(2003)BBRC 300853-861。
WO03/035836。
WO95/17211。
WO98/42375。
Beignon等，(2002)Infect Immun 703012-3019。
Pizza等，(2001)Vaccine 192534-2541。
Pizza等，(2000)Int J Med Microbiol 290455-461。
Scharton-Kersten等，(2000)Infect Immun 685306-5313。
Ryan等，(1999)Infect Immun 676270-6280。
Partidos等，(1999)Immunol Lett 67209-216。
Peppoloni等，(2003)Expert Rev Vaccines 2285-293。
Pine等，(2002)J Control Release 85263-270。
Domenighini等，(1995)Mol Microbiol151165-1167。
WO99/40936。
WO99/44636。
Singh等，(2001)J Cont Release 70267-276。
WO99/27960。
美国专利6,090,406。
美国专利5,916,588。
EP-A-0626169。
WO99/52549。
WO01/21207。
WO01/21152。
Andrianov等，(1998)Biomaterials 19109-115。
Payne等，(1998)Adv Drug Delivery Review 31185-196。
Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27571-577。
Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs 4214-218。
WO99/11241。
WO94/00153。
WO98/57659。
欧洲专利申请0835318、0735898和0761231。
WO03/009869。
Balmer和Borrow(2004)Expert Rev Vaccines 377-87。
Kanra等，(1999)The Turkish Journal of Paediatrics 42421-427。
Ravenscrogft等，(2000)Dev Biol(Basel)10335-47。
WO97/00697。
WO96/37222；美国专利6,333,036。
Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19331-332。
Rubin(2000)Pediatr Clin North Am 47269-285，v。
Jedrzejas(2001)Microbiol MoI Biol Rev 65187-207。
Zielen等，(2000)Infect.Immun.681435-1440。
Darkes和Plosker(2002)Paediatr Drugs 4609-630。
WO2004/032958。
Podda等，(1991)Vaccine 9741-745。
Gerlich等，(1990)Vaccine 8增刊S63-68和79-80。
WO93/24148。
Sutter等，(2000)Pediatr Clin North Am 47287-308。
Zimmerman和Spann(1999)Am Fam Physician 59113-118，125-126。
Bell(2000)Pediatr Infect Dis J 191187-1188。
Iwarson(1995)APMIS 103321-326。
Lyng和Betzon(1987)J Biol Stand 1527-37。
权利要求
1.一种用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物，该组合物包含下组中的至少两种(a)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组C的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组W135的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组Y的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其特征是(1)所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)，和(2)该组合物包含未偶联形式的共用运载体，其中所述未偶联共用运载体浓度小于10μg/ml。
2.如权利要求1所述的组合物，其包含血清组A和C的偶联物。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其包含所有血清组A、C、W135和Y的偶联物。
4.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述脑膜炎球菌偶联物各自偶联于选自下组的共用运载体白喉类毒素；破伤风类毒素；CRM197和流感嗜血杆菌的蛋白D。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述共用运载体是白喉类毒素。
6.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述共用运载体是流感嗜血杆菌蛋白D。
7.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，各血清组中糖的质量为2-10μg。
8.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，各血清组中糖的质量为互相相差在+10％以内。
9.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述未偶联共用运载体的浓度小于2μg/ml。
10.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，组合物中所述共用运载体的总浓度小于100μg/ml。
11.如之前任一项权利要求所述的组合物，将其配制成用于肌肉内注射的形式。
12.如之前任一项权利要求所述的组合物，还包含氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂。
13.如之前任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物不含任何含汞物质。
14.如之前任一项权利要求所述的组合物，还包含以下抗原中的一种或多种(i)偶联的B型流感嗜血杆菌荚膜糖；(ii)偶联的肺炎链球菌荚膜糖；(iii)脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白抗原；(iv)白喉抗原；(v)破伤风抗原；(vi)细胞或全细胞百日咳抗原；(vii)一种或多种非细胞百日咳抗原；(viii)乙肝病毒抗原；(ix)一种或多种脊髓灰质炎病毒抗原；(x)甲肝病毒抗原。
15.如之前任一项权利要求所述的组合物，该组合物为水性形式。
16.如之前任一项权利要求所述的组合物，该组合物为冻干形式。
17.如之前任一项权利要求所述的组合物，其包含糖醇或蔗糖。
18.一种含有之前任一项权利要求所述组合物的小瓶。
19.一种含有之前任一项权利要求所述组合物的注射器。
20.一种制备权利要求1-15中任一项所述组合物的试剂盒，其中该试剂盒包括至少一种冻干形式的脑膜炎球菌偶联物和至少一种水性形式的脑膜炎球菌偶联物。
21.一种制备权利要求1-15中任一项所述组合物的试剂盒，其中该试剂盒包括(i)权利要求15所述的冻干组合物和(ii)水性物质，其中组分(ii)用于重建(i)以提供水性组合物。
22.一种试剂盒，其包括(i)权利要求1-17中任一项所述的组合物和(ii)包含权利要求14所述的抗原(i)-(x)中一种或多种的组合物。
23.一种用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)制备下组的至少两种(a)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(b)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组C的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(c)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组W135的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物；(d)(i)脑膜炎奈瑟球菌血清组Y的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中所述偶联物(a)、(b)、(c)和(d)中至少两种采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)；和(2)混合(1)中制备的至少两种偶联物，以产生包含未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。
24.一种用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物的制备方法，该方法包括以下步骤(1)从A、C、W135和Y中选择n种不同的脑膜炎球菌血清组，其中n的值是2、3或4，然后对于n种所选血清组中每个血清组，制备(i)该血清组的荚膜糖和(ii)运载体蛋白的偶联物，其中n种偶联物各自采用相同的运载体蛋白(′共用运载体′)；和(2)混合步骤(1)中制备的n种偶联物，产生包含未偶联形式的共用运载体的组合物，其中所述未偶联共用运载体的浓度小于10μg/ml。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，n的值是2或4。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，还包括测定未偶联共用运载体量的一个或多个步骤。
27.如权利要求26所述的方法，其包括将所述偶联物混合之前的测定步骤和/或将混合物混合之后的测定步骤。
28.一种评价组合物在疫苗生产和/或给予人中的适用性的方法，该方法包括进行权利要求23-27中任一项所述的步骤(1)和(2)，还包括以下步骤(3)测定组合物中未偶联共用运载体的浓度；和(4-i)如果所述未偶联运载体的浓度＜10μg/ml，接受该组合物作进一步疫苗生产和/或用于给予人；或者(4-ii)如果未偶联运载体浓度≥10μg/ml，拒绝该组合物。
全文摘要
在同时给予具有相同运载体蛋白的多种偶联物时，运载体诱导的表位抑制尤其受到关注。为了避免这种抑制，本发明最大程度减少了疫苗中未偶联运载体蛋白的量。本发明提供了用于免疫患者以抵御脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病的组合物，其中(1)该组合物包含四种脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y中至少两种的偶联物，这至少两种偶联物具有共用运载体蛋白；和(2)该组合物包含的未偶联形式的共用运载体少于10μg/ml。
文档编号A61K47/48GK1976716SQ200580013875
公开日2007年6月6日 申请日期2005年4月29日 优先权日2004年4月30日
发明者P·科斯坦蒂诺 申请人:启龙有限公司
最新回复(0)