一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(dnj)、黄酮的方法
专利名称：一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(dnj)、黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法。
背景技术：
桑叶为桑科植物桑的干燥叶，栽培或野生，对土壤适应性强，全国大部分地区多有 生产。味苦、甘，性寒。经研究发现，桑叶在药理上具有抗炎、降血糖作用，并能够降 血脂、利尿。桑叶具有上述活性和药理学作用，主要是因为其组分中含有1-脱氧野尻霉 素(DNJ)、黄酮等成分，因而将其从桑叶中提取出来以供集中使用是十分有必要的。
l-脱氧野尻霉素(DNJ)是一种强的cc-葡萄糖苷酶抑制剂，抑制小肠中的a-葡萄糖苷酶 将人体从淀粉类食物中所分解来的蔗糖、麦芽糖等二糖分解成葡萄糖，能明显抑制食后血糖 急剧上升；黄酮类化合物是一类天然抗氧化剂，能够清除人体中超氧化自由基和过氧化物， 具有软化毛细血管，改善血液循环系统的功能；1-脱氧野尻霉素(DNJ)和桑叶黄酮协同作用 能更有效抑制血糖上升，防治糖尿病及其并发的心脑血管疾病。
目前国内外对从桑叶中提取并分离1-脱氧野霉素(DNJ)、黄酮进行了一些研究。
中国专利200710060127.2公开了 一种从桑叶中提取生物碱、黄酮和多糖活性成分的方 法，其主要步骤为将干燥后的桑叶浸泡入乙醇或丙酮中后减压蒸发，并加入水后通过大孔树 脂用乙醇或丙酮洗脱，减压蒸发得到黄酮类化合物浸膏，再通过阳、阴离子交换树脂后先用 氨水后用水洗脱离子柱，然后减压蒸发得到生物碱浸膏。该方法不足之处在于，料液分离采 用高速离心机，在工业上成本较高；另外先使料液通过大孔树脂分离黄酮，后过阳离子树脂 提取生物碱，容易丢失贵重而含量又相对较低的活性成分1-脱氧野霉素(DNJ)(桑叶中含 0.2%—0.4% )。
中国专利200810236144. 1公开了另一种提取方法，将桑叶加入盐酸-乙醇-水溶液后获得 粗提物，并通过大孔吸附树脂再分别用水、乙醇、盐酸溶液提取并浓缩成粉末，其具有条件 温和，可重复使用的优点。但其不足之处在于，该工艺在制备生物碱时使用氯仿、正己烷等有机溶剂，有毒，且难以从产品中清除，而且不适合大规模工业生产。
中国专利200710067498. 3公开了一种从桑叶中提取l-脱氧野尻霉素的方法，其主要原 理为，将原料桑叶粉碎后用溶剂提取所需组分，再将其酸化后通过阳离子交换树脂，并用醇 溶液洗脱后将洗脱液浓缩成浸膏即可得到相应提取物。其好处为，可简单的获得所分离产品， 但缺点在于其生产步骤需要将提取液冷到10°C--30°C,条件较为苛刻，而且该工艺中用到 甲醇、二乙胺、三乙胺等有毒、易燃的有机溶剂，不利于清洁生产。 发明内容，
本发明的目的是提供一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法， 该方法提高了产品品质，并便于工业化生产。 本发明所述的方法由以下步骤组成
(a)将桑叶和40 - 80 /。的乙醇按料液比1: 6-40投料，混合后于50 - 7(TC搅拌1 -
3h，离心过滤得到滤液A; (h)滤渣按料液比l: 6~40加入40~80°/。的乙醇，混合后于50 ~ 7(TC搅拌1 ~ 3h，
离心过滤得到滤液B，'合并滤液A和B，在50 7(TC下减压浓缩制得浓缩液， .同时减压回收乙醇；
(c) 浓缩液按絮凝剂的使用方法加入絮凝剂进行絮凝沉淀；
(d) 压滤除去沉淀，滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱，并流经与该树脂柱串 连在一起的大孔吸附树脂柱；
(e) 滤液加入结東后用纯净水洗,待大孔树脂柱流出液无色时，将其断开，再用0. 1~ 0. 5mol/L的氨水或含氨0. 1-0. 5mol/L的5 /。 ~ 50%乙醇溶液从阳离子树脂柱上 洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ),将洗脱液用酸调节pH至3~5,再上阳离子树脂 柱，待洗脱液上完后，'用纯净水洗至流出液无色，再用]0%~70%的乙醇溶液洗；
(f) .乙醇洗涤后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0.1-0. 5moL/L的氨水或含
氨0. 1 ~ 0. 5mol/L的5%~50%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，用80D纳滤膜浓缩
并滤除氨等小分子杂质，浓缩液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素 (DNJ );(g) 在步骤(e)中断开的大孔树脂柱用3%~10%的乙醇洗涤以除去胶性杂质，再用 50%~70%乙醇洗脱黄酮，收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液喷雾 干燥，得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
在提取分离方法中，釆用对l-脱氧野霉素(DNJ)具有选择性吸附作用的阳离子树脂进 行两次吸附，第二次吸附后，先用乙醇溶液洗涤，这样可洗脱出大量的黏性杂质，便于得到 干燥的棕黄色粉末状1-脱氧野霉素(DNJ)产品，也提高了产品含量。(此段进行了修改)
在制备过程中，加入的絮凝剂为ZTC 1+1天然澄清剂、甲壳素、101果汁澄清剂、明胶 -丹宁或蛋清，均可在市面上购得；'吸附分离l-脱氧野霉素(DNJ)所用的阳离子树脂是指强 酸型阳离子交换树脂，为国产阳离子732树脂、美国Amberlite IR-120 、 Dowex-5G或德国 Lewatit-100;所述的大孔吸附树脂是指HPD-700、 HPD_600、 HPD-400、 D101或AB-8大孔吸 附树脂；歩骤(e)中所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或醋酸等，若采用盐酸调节pH值，可采 用检测C1 —的方式来判断离子柱水洗后是否达到终点，其检测试剂为硝酸银或硝酸亚汞。
本发明所述从桑叶中连续提取分离1-脱氧野霉素(DNJ)、黄酮和多糖的方法，具有以下 优点
1. 本发明釆用柱层析技术、膜分离技术相结合，除减压浓缩回收乙醇外，其他工艺过程 均采用常温过滤，常温浓缩，有利于保持产品的生物活性；同时简化了操作步骤，有利于降 低能耗；.
2. 本发明在生产l-脱氧野尻霉素时，釆用连续多次阳离子交换柱和大孔树脂柱层析， 并用乙醇洗涤以除去色素和胶性杂质，提高了产品质量，降低了产品的黏性和吸湿性，得以 顺利进行喷雾干燥制成1-脱氧野霉素(DNJ)和黄酮；
3.本发明所述的分离技术，使料液依次通过阳离子交换树脂柱和大孔吸附树脂柱，能够 首先富集最贵重而含量又极低的目标产物DNJ,以保障其不因路径过长而吸附流失；而后通 过洗脱大孔树脂柱得到第二个有用产品总黄酮。通过多次实施制备样品，并用高效液相色谱 法和紫外分光光度法测定含量，结果表明，1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量〉10%,总黄酮含量 》20°/。'
4.本发明除乙醇外不使用其他有机溶剂。处理柱子和膜所用的酸、碱液相互中和，通过反渗透膜再生成纯净水，可重复使用。膜截流物可制成动物饲料盐，不会造成环境污染；
本发明的实施例都是实际生产过程，事实证明该工艺过程简单、生产周期短，工艺条件 安全、宽松，便于工人搡作及推广为规模化工业生产。
具体实施例方式
本发明结合实施例作进一步说明，但本发明并非局限在实施例范围。 实施例l
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤
(a) 称取桑叶粉20Kg置于提取罐中，加入60°/。的乙醇160L,于60'C下搅拌2h,离心机过
滤得到滤液；
(b) 滤渣加入60%的乙醇160L,按上述条件重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液， 用真空浓缩罐在7(TC下减压浓缩，并回收乙醇；
(c) 浓缩液加水稀释至IOOL，用盐酸调节pH至3,加热至55'C保温，边搅拌边加入ZTC1+1 絮凝剂A组分(iy。)札，每隔半小时搅拌一次；2小时后，加入ZTC1+1絮凝剂B组分
(1%的粘胶液，用iy。醋酸配制)2L,搅拌均匀，半小时后，再搅拌一次，停止保温， 静置过夜；
(d) 压滤除去沉淀，滤液用泵打入3根并连在一起的732阳离子树脂柱(DxH=10cmx 100cm)，进而流经串连在后面的1根HPD-700大孔树脂柱(D x H=10cm x 100cm );
(e) 滤液上完后用纯净水洗柱子，待大孔树脂柱流出液无色、无cr时，将其断开，用
0.2mol/L的氨水洗脱732阳离子树脂柱，高效液相色谱在线监测l-脱氧野尻霉素，收 集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液；将该液用盐酸调节pH至4，再上1根732阳离 子树脂柱(DxH=10cmx 100cm),上完后，用纯净水洗至流出液无色、C1—后，再分别 用15%、 25°/。、 55%、 65%的乙醇各10L洗涤；
(f) 釆用乙醇洗涤后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0. 2mol/L的氨水洗脱732阳离 子树脂柱，高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液，用80D纳滤膜浓縮并滤除氨等小分子杂质；浓缩液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ) 产品132. 8g 。高效液相色谱法测定l-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为11.9%; (g )步骤(e )断开的HPD-700大孔树脂柱，先用3%的乙醇40L洗涤，再用70%乙醇进行洗 脱，收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶 总黄酮234.3g。以芦丁为对照品，分光光度法测定总黄酮含量为22. 7%。 实施例2 '
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤
(a) 称取桑叶粉10Kg置于提取罐中，加入40°/。的乙醇400L,于70'C下搅拌lh,离心机过 滤得到滤液；
(b) 滤渣加入40%的乙醇，按上述条件重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液，用真 空浓缩罐在7(TC下真空浓缩，并回收乙醇；
(c) 浓缩液加水稀释至60L,用盐酸调节pH至5，加入r/。甲壳素溶液5L,搅拌均匀，静置
过夜；
(d) 压滤除去沉淀，滤液用泵打入2根串连在一起的Dowex-50阳离子树脂柱(DxH=10cm xl00cm),进而流经1根HPD-400大孔树脂柱(D x H=l0cm x 60cm );
(e) 滤液上完后用纯净水洗柱子，待大孔树脂柱流出液无色、Cl —时，将其断开。732阳离 子树脂柱用含氨0. lmol/L的50%乙醇溶液洗脱，高效液相在线监测收集含有1-脱氧野 尻霉素部分的洗脱液，将该液用盐酸调节PH至5,再上1根732阳离子树脂柱(Dx H=10cmx 100cm),上完后，用纯净水洗至流出液无C1—、无色后，再分别用10%、 30%、 50°/。、 70%的乙醇各30L依次洗涤；
(f) 70%乙醇洗后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0. 2mol/L的氨水洗脱732阳离子 树脂柱，高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液，过80D纳滤膜浓 缩并滤除氨等小分子杂质，浓縮液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ) 产品70. 8g，高效液相色谱法测定1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为13. 0 /。；
(g) 步骤(e)断开的HPD-400大孔树脂柱，先用5%的乙醇IOOL洗涤，再用50%乙醇洗脱， 收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇，浓縮液喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶总黄酮113.6g,以芦丁为对照品，分光光度法测定总黄酮含量为21.9%。 实施例3
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤
(a) 称取桑叶粉20Kg,置于提取罐中，加入80。/。的乙醇400L，于5(TC下搅拌2h,离心机
过滤得到滤液；
(b) 滤渣加入80%的乙醇200L,按上述条件重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液， 用真空浓缩罐在5(TC下真空浓缩，并回收乙醇；
(c) 浓缩液加水稀释至IOOL，用醋酸调节pH至5,加热至55'C保温，边搅拌边加入ZTC1+1 絮凝剂A组分(1%) 4L,每隔半小时搅拌一次；2小时后，加入ZTC1+1絮凝剂B组分
(ly。的粘胶液，用iy。醋酸配制)2L，搅拌均匀，半小时后，再搅拌一次，停止保温， 静置过夜；
(d) 压滤除去沉淀，滤液用泵打入3根串连在一起的Dowex-50阳离子树脂柱(DxH=10cm xlOOcm)，进而流经1根串连的HPD-400大孔树脂柱(D x H=10cm x 60cm );
(e) 滤液上完后用纯净水洗柱子，待大孔树脂柱流出液无色时，将其断开。732阳离子树 脂柱用0. 5mol/L的氨水洗脱，高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗 脱液，将其用盐酸调节PH至3，再上1根732阳离子树脂柱(Dx H=10cmx 100cm)， 上完后，用纯净水洗至流出液无色、Cr时，再分别用20%、 40%、 60%、 70%的乙醇各 4 0L依次洗涤；
(f) 70%乙醇洗后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0. 2mol/L的氨水洗脱，高效液相 在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液，过80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分 子杂质，浓縮液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)产品132.2g,高 效液相色谱法测定1-脱氧野屁霉素(DNJ)的含量为12.6%;
(g) 步骤(e)断开的HPD-400大孔树脂柱，先用5%的乙醇40L洗涤，再用50%乙醇洗脱，
收集棕红色洗脱液，减压浓缩并回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶总 黄酮234.2g,以芦丁为对照品，分光光度法测定总黄酮含量为23.2%。 实施例4生产本发明所述桑叶提取物的方法，在歩骤(a)中按料液比1: 8加入5fW的乙醇，步 骤(c)中用'酸调节pH值至3,步骤(f)中用0. 4mol/L的氨水洗脱，步骤(g)中用含氨0. lmol/L 的5%乙醇溶液洗脱，其余与实施例1相同。 实施例5
生产本发明所述桑叶提取物的方法，在步骤(a)中按料液比为1: 40加入75%的乙醇， 步骤(c)中用酸调节pH值至5,步骤(f)中用0. 3mol/L的氨水洗脱，步骤(g)中用含氨0. 5mol/L
的5oy。乙醇溶液洗脱，其余与实施例l相同。
另外，阳离子树脂除了采用国产阳离子732树脂外，也可采用美国AmberlUe IR-120、 Dowex-50或德国Lewatit-100;所述的大孔吸附树脂除了 HPD-700之外，也可釆用HPD-60C)、 HPD-400、 D101或AB-8大孔吸附树脂；步骤(c)中加入的絮凝剂亦可为101果汁澄清剂、 明胶-丹宁或蛋清；步骤(e)中调节pH值所用的酸亦可为硫酸、磷酸或醋酸。
以上实施例，并非对本发明的组合物的含量作任何限制，凡是根据本发明的技术实质或 组合物成分或含量对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术 方案的范围内。
权利要求
1.一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，由以下步骤组成(a)将桑叶和40～80％的乙醇按料液比1∶6～40投料，混合后于50～70℃搅拌1～3h，离心过滤得到滤液A；(b)滤渣按料液比1∶6～40加入40～80％的乙醇，混合后于50～70℃搅拌1～3h，离心过滤得到滤液B，合并滤液A和B，在50～70℃下减压浓缩制得浓缩液，同时减压回收乙醇；(c)浓缩液按絮凝剂的使用方法加入絮凝剂进行絮凝沉淀；(d)压滤除去沉淀，滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱，并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱；(e)滤液加入结束后用纯净水洗，待大孔树脂柱流出液无色时，将其断开，再用0.1～0.5mol/L的氨水或含氨0.1～0.5mol/L的5％～50％乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ)，将洗脱液用酸调节pH至3～5，再上阳离子树脂柱，待洗脱液上完后，用纯净水洗至流出液无色，再用10％～70％的乙醇溶液洗；(f)乙醇洗涤后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0.1～0.5mol/L的氨水或含氨0.1～0.5mol/L的5％～50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，用80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质，浓缩液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)；(g)在步骤(e)中断开的大孔树脂柱用3％～10％的乙醇洗涤以除去胶性杂质，再用50％～70％乙醇洗脱黄酮，收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
2. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于加入的絮凝剂为ZTC l+l天然澄清剂、甲壳素、101果汁澄清剂、明胶-丹宁或蛋清。
3. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(d)使滤液流经阳离子树脂柱，流出液再进入与阳离子树脂柱串连在一起 的大孔树脂柱；阳离子树脂柱交换的是1-脱氧野尻霉素(DNJ);大孔树脂柱吸附的是黄酮。
4. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(d)所述的阳离子树脂是指强酸型阳离子交换树脂为国产阳离子732树脂、美国Amberlite IR-120 、 Dowex-50或德国Lewat i t-100;所述的大孔吸附树脂是指HPD-700、 HPD-600、 HPD-400、 D101或AB-8大孔吸附树脂。
5. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(c)和(e)所述的酸为盐酸、硫酸、嫌酸或醋酸。
6. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(e)所述的将从阳离子交换树脂柱流出的含有l-脱氧野尻霉素(DNJ)的 洗脱液，调节PH后，再过一次阳离子交换树脂柱，并用乙醇溶液洗涤柱子以除去杂质，提 高产品质量。
7. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(e)所述的乙醇洗涤是用10%~70%乙醇浓度中的一种浓度洗涤或几种浓度 间隔洗涤。
全文摘要
一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其方法要点为将桑叶和乙醇混合后提取，离心过滤，浓缩后加入絮凝剂絮凝沉淀；除去沉淀后将滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱，并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱；滤液加入结束后用纯净水洗至大孔树脂柱流出液无色时将其断开，再用氨水或含氨的乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ)；洗脱液再上阳离子树脂柱，重复操作后收集洗脱液，用80D纳滤膜浓缩过滤后喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)。用3％～10％的乙醇洗涤大孔树脂柱以除去胶性杂质，再用50％～70％乙醇洗脱黄酮，收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇后喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
文档编号A61P3/00GK101671294SQ20091019254
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者钢 刘, 张全才, 杭伟锋, 邓国江, 玲 鲍 申请人:广东太阳神集团有限公司
技术领域：
本发明涉及一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法。
背景技术：
桑叶为桑科植物桑的干燥叶，栽培或野生，对土壤适应性强，全国大部分地区多有 生产。味苦、甘，性寒。经研究发现，桑叶在药理上具有抗炎、降血糖作用，并能够降 血脂、利尿。桑叶具有上述活性和药理学作用，主要是因为其组分中含有1-脱氧野尻霉 素(DNJ)、黄酮等成分，因而将其从桑叶中提取出来以供集中使用是十分有必要的。
l-脱氧野尻霉素(DNJ)是一种强的cc-葡萄糖苷酶抑制剂，抑制小肠中的a-葡萄糖苷酶 将人体从淀粉类食物中所分解来的蔗糖、麦芽糖等二糖分解成葡萄糖，能明显抑制食后血糖 急剧上升；黄酮类化合物是一类天然抗氧化剂，能够清除人体中超氧化自由基和过氧化物， 具有软化毛细血管，改善血液循环系统的功能；1-脱氧野尻霉素(DNJ)和桑叶黄酮协同作用 能更有效抑制血糖上升，防治糖尿病及其并发的心脑血管疾病。
目前国内外对从桑叶中提取并分离1-脱氧野霉素(DNJ)、黄酮进行了一些研究。
中国专利200710060127.2公开了 一种从桑叶中提取生物碱、黄酮和多糖活性成分的方 法，其主要步骤为将干燥后的桑叶浸泡入乙醇或丙酮中后减压蒸发，并加入水后通过大孔树 脂用乙醇或丙酮洗脱，减压蒸发得到黄酮类化合物浸膏，再通过阳、阴离子交换树脂后先用 氨水后用水洗脱离子柱，然后减压蒸发得到生物碱浸膏。该方法不足之处在于，料液分离采 用高速离心机，在工业上成本较高；另外先使料液通过大孔树脂分离黄酮，后过阳离子树脂 提取生物碱，容易丢失贵重而含量又相对较低的活性成分1-脱氧野霉素(DNJ)(桑叶中含 0.2%—0.4% )。
中国专利200810236144. 1公开了另一种提取方法，将桑叶加入盐酸-乙醇-水溶液后获得 粗提物，并通过大孔吸附树脂再分别用水、乙醇、盐酸溶液提取并浓缩成粉末，其具有条件 温和，可重复使用的优点。但其不足之处在于，该工艺在制备生物碱时使用氯仿、正己烷等有机溶剂，有毒，且难以从产品中清除，而且不适合大规模工业生产。
中国专利200710067498. 3公开了一种从桑叶中提取l-脱氧野尻霉素的方法，其主要原 理为，将原料桑叶粉碎后用溶剂提取所需组分，再将其酸化后通过阳离子交换树脂，并用醇 溶液洗脱后将洗脱液浓缩成浸膏即可得到相应提取物。其好处为，可简单的获得所分离产品， 但缺点在于其生产步骤需要将提取液冷到10°C--30°C,条件较为苛刻，而且该工艺中用到 甲醇、二乙胺、三乙胺等有毒、易燃的有机溶剂，不利于清洁生产。 发明内容，
本发明的目的是提供一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法， 该方法提高了产品品质，并便于工业化生产。 本发明所述的方法由以下步骤组成
(a)将桑叶和40 - 80 /。的乙醇按料液比1: 6-40投料，混合后于50 - 7(TC搅拌1 -
3h，离心过滤得到滤液A; (h)滤渣按料液比l: 6~40加入40~80°/。的乙醇，混合后于50 ~ 7(TC搅拌1 ~ 3h，
离心过滤得到滤液B，'合并滤液A和B，在50 7(TC下减压浓缩制得浓缩液， .同时减压回收乙醇；
(c) 浓缩液按絮凝剂的使用方法加入絮凝剂进行絮凝沉淀；
(d) 压滤除去沉淀，滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱，并流经与该树脂柱串 连在一起的大孔吸附树脂柱；
(e) 滤液加入结東后用纯净水洗,待大孔树脂柱流出液无色时，将其断开，再用0. 1~ 0. 5mol/L的氨水或含氨0. 1-0. 5mol/L的5 /。 ~ 50%乙醇溶液从阳离子树脂柱上 洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ),将洗脱液用酸调节pH至3~5,再上阳离子树脂 柱，待洗脱液上完后，'用纯净水洗至流出液无色，再用]0%~70%的乙醇溶液洗；
(f) .乙醇洗涤后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0.1-0. 5moL/L的氨水或含
氨0. 1 ~ 0. 5mol/L的5%~50%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，用80D纳滤膜浓缩
并滤除氨等小分子杂质，浓缩液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素 (DNJ );(g) 在步骤(e)中断开的大孔树脂柱用3%~10%的乙醇洗涤以除去胶性杂质，再用 50%~70%乙醇洗脱黄酮，收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液喷雾 干燥，得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
在提取分离方法中，釆用对l-脱氧野霉素(DNJ)具有选择性吸附作用的阳离子树脂进 行两次吸附，第二次吸附后，先用乙醇溶液洗涤，这样可洗脱出大量的黏性杂质，便于得到 干燥的棕黄色粉末状1-脱氧野霉素(DNJ)产品，也提高了产品含量。(此段进行了修改)
在制备过程中，加入的絮凝剂为ZTC 1+1天然澄清剂、甲壳素、101果汁澄清剂、明胶 -丹宁或蛋清，均可在市面上购得；'吸附分离l-脱氧野霉素(DNJ)所用的阳离子树脂是指强 酸型阳离子交换树脂，为国产阳离子732树脂、美国Amberlite IR-120 、 Dowex-5G或德国 Lewatit-100;所述的大孔吸附树脂是指HPD-700、 HPD_600、 HPD-400、 D101或AB-8大孔吸 附树脂；歩骤(e)中所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸或醋酸等，若采用盐酸调节pH值，可采 用检测C1 —的方式来判断离子柱水洗后是否达到终点，其检测试剂为硝酸银或硝酸亚汞。
本发明所述从桑叶中连续提取分离1-脱氧野霉素(DNJ)、黄酮和多糖的方法，具有以下 优点
1. 本发明釆用柱层析技术、膜分离技术相结合，除减压浓缩回收乙醇外，其他工艺过程 均采用常温过滤，常温浓缩，有利于保持产品的生物活性；同时简化了操作步骤，有利于降 低能耗；.
2. 本发明在生产l-脱氧野尻霉素时，釆用连续多次阳离子交换柱和大孔树脂柱层析， 并用乙醇洗涤以除去色素和胶性杂质，提高了产品质量，降低了产品的黏性和吸湿性，得以 顺利进行喷雾干燥制成1-脱氧野霉素(DNJ)和黄酮；
3.本发明所述的分离技术，使料液依次通过阳离子交换树脂柱和大孔吸附树脂柱，能够 首先富集最贵重而含量又极低的目标产物DNJ,以保障其不因路径过长而吸附流失；而后通 过洗脱大孔树脂柱得到第二个有用产品总黄酮。通过多次实施制备样品，并用高效液相色谱 法和紫外分光光度法测定含量，结果表明，1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量〉10%,总黄酮含量 》20°/。'
4.本发明除乙醇外不使用其他有机溶剂。处理柱子和膜所用的酸、碱液相互中和，通过反渗透膜再生成纯净水，可重复使用。膜截流物可制成动物饲料盐，不会造成环境污染；
本发明的实施例都是实际生产过程，事实证明该工艺过程简单、生产周期短，工艺条件 安全、宽松，便于工人搡作及推广为规模化工业生产。
具体实施例方式
本发明结合实施例作进一步说明，但本发明并非局限在实施例范围。 实施例l
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤
(a) 称取桑叶粉20Kg置于提取罐中，加入60°/。的乙醇160L,于60'C下搅拌2h,离心机过
滤得到滤液；
(b) 滤渣加入60%的乙醇160L,按上述条件重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液， 用真空浓缩罐在7(TC下减压浓缩，并回收乙醇；
(c) 浓缩液加水稀释至IOOL，用盐酸调节pH至3,加热至55'C保温，边搅拌边加入ZTC1+1 絮凝剂A组分(iy。)札，每隔半小时搅拌一次；2小时后，加入ZTC1+1絮凝剂B组分
(1%的粘胶液，用iy。醋酸配制)2L,搅拌均匀，半小时后，再搅拌一次，停止保温， 静置过夜；
(d) 压滤除去沉淀，滤液用泵打入3根并连在一起的732阳离子树脂柱(DxH=10cmx 100cm)，进而流经串连在后面的1根HPD-700大孔树脂柱(D x H=10cm x 100cm );
(e) 滤液上完后用纯净水洗柱子，待大孔树脂柱流出液无色、无cr时，将其断开，用
0.2mol/L的氨水洗脱732阳离子树脂柱，高效液相色谱在线监测l-脱氧野尻霉素，收 集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液；将该液用盐酸调节pH至4，再上1根732阳离 子树脂柱(DxH=10cmx 100cm),上完后，用纯净水洗至流出液无色、C1—后，再分别 用15%、 25°/。、 55%、 65%的乙醇各10L洗涤；
(f) 釆用乙醇洗涤后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0. 2mol/L的氨水洗脱732阳离 子树脂柱，高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液，用80D纳滤膜浓縮并滤除氨等小分子杂质；浓缩液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ) 产品132. 8g 。高效液相色谱法测定l-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为11.9%; (g )步骤(e )断开的HPD-700大孔树脂柱，先用3%的乙醇40L洗涤，再用70%乙醇进行洗 脱，收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶 总黄酮234.3g。以芦丁为对照品，分光光度法测定总黄酮含量为22. 7%。 实施例2 '
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤
(a) 称取桑叶粉10Kg置于提取罐中，加入40°/。的乙醇400L,于70'C下搅拌lh,离心机过 滤得到滤液；
(b) 滤渣加入40%的乙醇，按上述条件重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液，用真 空浓缩罐在7(TC下真空浓缩，并回收乙醇；
(c) 浓缩液加水稀释至60L,用盐酸调节pH至5，加入r/。甲壳素溶液5L,搅拌均匀，静置
过夜；
(d) 压滤除去沉淀，滤液用泵打入2根串连在一起的Dowex-50阳离子树脂柱(DxH=10cm xl00cm),进而流经1根HPD-400大孔树脂柱(D x H=l0cm x 60cm );
(e) 滤液上完后用纯净水洗柱子，待大孔树脂柱流出液无色、Cl —时，将其断开。732阳离 子树脂柱用含氨0. lmol/L的50%乙醇溶液洗脱，高效液相在线监测收集含有1-脱氧野 尻霉素部分的洗脱液，将该液用盐酸调节PH至5,再上1根732阳离子树脂柱(Dx H=10cmx 100cm),上完后，用纯净水洗至流出液无C1—、无色后，再分别用10%、 30%、 50°/。、 70%的乙醇各30L依次洗涤；
(f) 70%乙醇洗后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0. 2mol/L的氨水洗脱732阳离子 树脂柱，高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液，过80D纳滤膜浓 缩并滤除氨等小分子杂质，浓縮液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ) 产品70. 8g，高效液相色谱法测定1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为13. 0 /。；
(g) 步骤(e)断开的HPD-400大孔树脂柱，先用5%的乙醇IOOL洗涤，再用50%乙醇洗脱， 收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇，浓縮液喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶总黄酮113.6g,以芦丁为对照品，分光光度法测定总黄酮含量为21.9%。 实施例3
生产本发明所述桑叶提取物的方法有以下步骤
(a) 称取桑叶粉20Kg,置于提取罐中，加入80。/。的乙醇400L，于5(TC下搅拌2h,离心机
过滤得到滤液；
(b) 滤渣加入80%的乙醇200L,按上述条件重复提取一次并过滤，合并两次得到的滤液， 用真空浓缩罐在5(TC下真空浓缩，并回收乙醇；
(c) 浓缩液加水稀释至IOOL，用醋酸调节pH至5,加热至55'C保温，边搅拌边加入ZTC1+1 絮凝剂A组分(1%) 4L,每隔半小时搅拌一次；2小时后，加入ZTC1+1絮凝剂B组分
(ly。的粘胶液，用iy。醋酸配制)2L，搅拌均匀，半小时后，再搅拌一次，停止保温， 静置过夜；
(d) 压滤除去沉淀，滤液用泵打入3根串连在一起的Dowex-50阳离子树脂柱(DxH=10cm xlOOcm)，进而流经1根串连的HPD-400大孔树脂柱(D x H=10cm x 60cm );
(e) 滤液上完后用纯净水洗柱子，待大孔树脂柱流出液无色时，将其断开。732阳离子树 脂柱用0. 5mol/L的氨水洗脱，高效液相在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗 脱液，将其用盐酸调节PH至3，再上1根732阳离子树脂柱(Dx H=10cmx 100cm)， 上完后，用纯净水洗至流出液无色、Cr时，再分别用20%、 40%、 60%、 70%的乙醇各 4 0L依次洗涤；
(f) 70%乙醇洗后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0. 2mol/L的氨水洗脱，高效液相 在线监测收集含有1-脱氧野尻霉素部分的洗脱液，过80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分 子杂质，浓縮液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)产品132.2g,高 效液相色谱法测定1-脱氧野屁霉素(DNJ)的含量为12.6%;
(g) 步骤(e)断开的HPD-400大孔树脂柱，先用5%的乙醇40L洗涤，再用50%乙醇洗脱，
收集棕红色洗脱液，减压浓缩并回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶总 黄酮234.2g,以芦丁为对照品，分光光度法测定总黄酮含量为23.2%。 实施例4生产本发明所述桑叶提取物的方法，在歩骤(a)中按料液比1: 8加入5fW的乙醇，步 骤(c)中用'酸调节pH值至3,步骤(f)中用0. 4mol/L的氨水洗脱，步骤(g)中用含氨0. lmol/L 的5%乙醇溶液洗脱，其余与实施例1相同。 实施例5
生产本发明所述桑叶提取物的方法，在步骤(a)中按料液比为1: 40加入75%的乙醇， 步骤(c)中用酸调节pH值至5,步骤(f)中用0. 3mol/L的氨水洗脱，步骤(g)中用含氨0. 5mol/L
的5oy。乙醇溶液洗脱，其余与实施例l相同。
另外，阳离子树脂除了采用国产阳离子732树脂外，也可采用美国AmberlUe IR-120、 Dowex-50或德国Lewatit-100;所述的大孔吸附树脂除了 HPD-700之外，也可釆用HPD-60C)、 HPD-400、 D101或AB-8大孔吸附树脂；步骤(c)中加入的絮凝剂亦可为101果汁澄清剂、 明胶-丹宁或蛋清；步骤(e)中调节pH值所用的酸亦可为硫酸、磷酸或醋酸。
以上实施例，并非对本发明的组合物的含量作任何限制，凡是根据本发明的技术实质或 组合物成分或含量对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术 方案的范围内。
权利要求
1.一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，由以下步骤组成(a)将桑叶和40～80％的乙醇按料液比1∶6～40投料，混合后于50～70℃搅拌1～3h，离心过滤得到滤液A；(b)滤渣按料液比1∶6～40加入40～80％的乙醇，混合后于50～70℃搅拌1～3h，离心过滤得到滤液B，合并滤液A和B，在50～70℃下减压浓缩制得浓缩液，同时减压回收乙醇；(c)浓缩液按絮凝剂的使用方法加入絮凝剂进行絮凝沉淀；(d)压滤除去沉淀，滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱，并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱；(e)滤液加入结束后用纯净水洗，待大孔树脂柱流出液无色时，将其断开，再用0.1～0.5mol/L的氨水或含氨0.1～0.5mol/L的5％～50％乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ)，将洗脱液用酸调节pH至3～5，再上阳离子树脂柱，待洗脱液上完后，用纯净水洗至流出液无色，再用10％～70％的乙醇溶液洗；(f)乙醇洗涤后，用纯净水洗至流出液无乙醇味，再用0.1～0.5mol/L的氨水或含氨0.1～0.5mol/L的5％～50％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，用80D纳滤膜浓缩并滤除氨等小分子杂质，浓缩液喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)；(g)在步骤(e)中断开的大孔树脂柱用3％～10％的乙醇洗涤以除去胶性杂质，再用50％～70％乙醇洗脱黄酮，收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇，浓缩液喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
2. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于加入的絮凝剂为ZTC l+l天然澄清剂、甲壳素、101果汁澄清剂、明胶-丹宁或蛋清。
3. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(d)使滤液流经阳离子树脂柱，流出液再进入与阳离子树脂柱串连在一起 的大孔树脂柱；阳离子树脂柱交换的是1-脱氧野尻霉素(DNJ);大孔树脂柱吸附的是黄酮。
4. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(d)所述的阳离子树脂是指强酸型阳离子交换树脂为国产阳离子732树脂、美国Amberlite IR-120 、 Dowex-50或德国Lewat i t-100;所述的大孔吸附树脂是指HPD-700、 HPD-600、 HPD-400、 D101或AB-8大孔吸附树脂。
5. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(c)和(e)所述的酸为盐酸、硫酸、嫌酸或醋酸。
6. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(e)所述的将从阳离子交换树脂柱流出的含有l-脱氧野尻霉素(DNJ)的 洗脱液，调节PH后，再过一次阳离子交换树脂柱，并用乙醇溶液洗涤柱子以除去杂质，提 高产品质量。
7. 根据权利要求1所述的从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其 特征在于步骤(e)所述的乙醇洗涤是用10%~70%乙醇浓度中的一种浓度洗涤或几种浓度 间隔洗涤。
全文摘要
一种从桑叶中连续提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮的方法，其方法要点为将桑叶和乙醇混合后提取，离心过滤，浓缩后加入絮凝剂絮凝沉淀；除去沉淀后将滤液加入连通的多个阳离子交换树脂柱，并流经与该树脂柱串连在一起的大孔吸附树脂柱；滤液加入结束后用纯净水洗至大孔树脂柱流出液无色时将其断开，再用氨水或含氨的乙醇溶液从阳离子树脂柱上洗脱1-脱氧野尻霉素(DNJ)；洗脱液再上阳离子树脂柱，重复操作后收集洗脱液，用80D纳滤膜浓缩过滤后喷雾干燥，得棕黄色粉末状1-脱氧野尻霉素(DNJ)。用3％～10％的乙醇洗涤大孔树脂柱以除去胶性杂质，再用50％～70％乙醇洗脱黄酮，收集棕红色洗脱液，减压浓缩回收乙醇后喷雾干燥，得黄棕色粉末状桑叶总黄酮。
文档编号A61P3/00GK101671294SQ20091019254
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者钢 刘, 张全才, 杭伟锋, 邓国江, 玲 鲍 申请人:广东太阳神集团有限公司
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