恩镰孢菌素类化合物在制备抗耐药结核菌药物中的应用的制作方法

专利名称：：恩镰孢菌素类化合物在制备抗耐药结核菌药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及结核菌的医药学研究，尤其涉及恩镰孢菌素类化合物在制备抗耐药结核菌药物中的应用。
背景技术：
：海洋微生物由于其所处的特殊环境，发展出了各种独特的代谢方式，这不仅确保其在极端环境中生存，也为人类提供了在陆地微生物中难以发现的大量新颖代谢产物，其中不少具有潜在的实际应用价值，已被认为是寻找药理活性物质的新源泉。此外，海洋微生物易于采集和培养，人工发酵产生的代谢产物比高等生物所含的物质更易提纯，成本更低，符合可持续发展的资源开发原则，所以从中筛选到的活性化合物更利于工业化生产。耐多药结核菌是至少对两种主要一线抗结核药物-异烟肼和利福平具耐药性的结核杆菌菌株。广泛耐药结核菌(也称为极端耐药结核菌)是对6类二线药物中的至少3类以上具耐药性的耐多药结核菌。世界卫生组织估计，目前全球约有17亿结核病患者，每年约有600—800万新病例，每年死于结核病的人多达300万。对耐药性肺结核的调査表明，在每年记录的600—800万新病例中，有10%的患者至少耐一种抗结核药，有2%的患者耐两种以上的抗结核药。我国目前耐多药性肺结核病形势不容乐观。第四次全国结核病流行病学抽样调查报告表明，在我国耐药性肺结核病患者中有60%耐两种以上抗结核药物，10.2%耐4种以上抗结核药物。每年约有42万患者感染耐多药性结核，其中有6.6万患者因此而.死亡，而极端耐药性结核患者数量约为2.7万例，且因此而死亡的患者数已逾1.6万例，甚至在某种程度上高过了艾滋病感染的致死率。耐药结核既是严重的公共卫生问题，又是沉重的经济负担，在治疗花费上，一般结核病人的治疗费用，每人仅需要150200元；而耐多药结核病人的治疗费用，每人需要1.5万元至两万元。结核病人因不能支付医药费而中断治疗者，在临床上并不少见。耐药结核的不断扩散，有可能使耐药结核升级为新的不治之症。鸟-胞内分枝杆菌属于非结核分枝杆菌，危害程度属第三类，危险程度为n级，可引起结核样病变，多见于肺和肾。目前，免疫功能低下人群(包括艾滋病人)常发生非结核分枝杆菌(如鸟-胞内分枝杆菌复合菌组)的条件感染，出现典型结核病相似的症状，是艾滋病患者主要死亡的原因之一；更为严重的是，这些非结核分枝杆菌对现有的抗结核药物常天然耐药，表现为天然的多重耐药性。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一类来源于海洋红树林内生真菌的，具有好的抗鸟-胞内分枝杆菌活性、抗耐药性结核菌活性的恩镰孢菌素类化合物在制备抗耐药结核菌药物中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的本发明的恩镰孢菌素类化合物是来源于海洋红树林内生真菌的，具有式(I)所示通式的一类化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(1)当R'=R2=<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>时，式(I)化合物为恩镰孢菌素G(enniatinG)，其外观为白色固体，理化性质为m.p.l25127。C，[a]2D5-52.7°(c,0.29,CHCl3)，分子式为(335116^309分子质量667，红外光谱在2965，2930，2875，1752，1658，1470，1416，1373，1270，1191，1128，1015，861cm"有吸收，核磁共振氢谱化学位移为S5.23(dd，J4,10Hz),1.75(m),1.55(m),0.92(d,J6.5Hz),0.94(d,J6.5Hz)，5.00(d,J9Hz),2.25(m),1.00(d，J7Hz),0.92(d,J7Hz),4.70(dd,J5,10Hz),1.72(m)，1.46(m),0.92(d,J6.5Hz),0.92(d,J6.5Hz),4.99(d,J9Hz),2.26(m)，0.99(d,J7Hz),0.916(d,J7Hz),4.90(d,J10Hz),2.23,1.03(d,J6.5Hz),0.89(d,J6.5Hz),5.11(d,J9Hz),2.32(m),0.91(d,J7Hz)，1.00(d,J7.0Hz),3.134(s),3.13(s),3.12(s);(2)当R尸R产Rf日寸，式(I)化合物为恩镰孢菌素B(enniatinB)，其外观为白色固体，理化性质为m.p.150-153。C，[|2D5-103°(c,0.30,CHCl3)，分子式为C33Hs7N309分子质量639，核磁共振氢谱化学位移为S1.06(d,J6.5Hz,9H),0.99(d,J6.5Hz,9H),0.96(d,J7Hz,9H),0.90(d，J7Hz,9H)，2.28(m，6H),3.13(s，9H),4.52(d,J8Hz,3H),5.14(d,J9.5Hz,3H);乂(3)当R产，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>时，式(I)化合物为恩镰孢菌素B4(enniatinB4)，其外观为白色固体，理化性质为m.p.140-143°C，[^5-88.9°(c,0.32,CHCl3)，分子式为C34H59N309分子质量653，核磁共振氢谱化学位移为S0.88(d,J6.5Hz，3H),0.90(d,J6Hz,3H)，0.93(d,J6.5Hz,3H),0.94(d,J7Hz,12H),0.98(d,J6.5Hz,6H),1.0(d,J6.5Hz,3H),1.03(d,J7Hz,3H),1.04(d,J7Hz,3H)，1.53((m,lH)，1.75(ddd,J4，10，14Hz，1H),1.84(ddd,J4.5,9,14Hz,lH),2.20-2.35(m,5H),3.10(s,3H),3.14(s,3H),3.16(s,3H),4.46(d,J10Hz,lH),4.70(m,lH),4.94(d,J10Hz,lH),4.98(d,J9Hz,lH),5.08(d,J8.5Hz,lH),5.19(d,J8Hz，lH);(4)当R产RfR3=v时，式(I)化合物为白僵菌素(Beauvericin)，其外观为白色固体，理化性质为mp.80°C;分子式为C45H57N309，分子质量783.3;核磁共振氢谱化学位移为57.24(15H,br，Phe)，5.63(3H,浙J4.8，12.4Hz)，4.78(3H,d,Hz)，3.44(3H,浙J4.4,14.4Hz)，3.06(9H，&N-CH3)，2.93(3H,浙/12.4，14.4Hz)，1.卯(3H,m)，0.81(9H，d,J6.6Hz)，0.34(9H,d,/6.6Hz,)。发明人从红树林内源真菌F^"Wwmsp.732弁培养液的乙酸乙酯萃取部位、菌体的甲醇提取液浓縮物中，经硅胶柱层析，在乙酸乙酯/环己烷(体积比为l/1)的等度洗脱液中依次得到上述式(I)所示恩镰孢菌素类化合物。林永成，王军等在文献YongChengLin,WangJun,etal,ANovelCompoundEnniatinGfromtheMangroveFungusHalosarpheiasp.(strain#723)fromtheSouthChinaSea.AustralianJournalofChemistry,2002,Vol.55,225.中对红树林内源真菌Fw^n'wmsp.732弁的提取方法以及结构分析，已经有详细报道。本发明人通过固体培养基稀释法研究发现，上述四个恩镰孢菌素类化合物具有很强的抗鸟-胞内分枝杆菌(Mycobacteriumavium-intracelluare)活性，抗耐药性结核菌临床分离耐ISREMTB(耐异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇四种抗结核药物)株活性，及抗耐药性结核菌临床分离耐ISEMTB(耐异烟肼、链霉素、乙胺丁醇三种抗结核药物)株的活性，可作为治疗耐药性结核菌感染疾病的先导化合物，也可作为抗耐药结核菌药物，用于耐药性结核病的治疗，具有广泛的应用前景。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果针对当前结核病发病率高、结核杆菌多重耐药菌株及人体免疫缺陷病毒双重感染的出现，使结核病发病率和死亡率呈上升趋势的现状，本发明发现恩镰孢菌素类化合物具有很强的抗耐药结核病菌活性，提供恩镰孢菌素类化合物在抗耐药结核病菌方面的新应用，不但为耐药结核病菌的治疗提供了新的有利工具，而且扩大了恩镰孢菌素类化合物的应用范围；此外，本发明的恩镰孢菌素类化合物来源于海洋红树林内生真菌，原料充足，且原料采集和培养容易，易提纯，成本低，繁殖周期短，利于大规模的工业化生产。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1式(I)所示恩镰孢菌素类化合物的制备本实施例采用GTY培养基(含有2.5质量％葡萄糖、0.8质量％蛋白胨，20质量。/。人工海水起始值为pH6)对红树林内源真菌Fwan^wsp.732#进行悬浮态发酵培养，在25。C静置培养15天，过滤，分离菌体和发酵液。将上述发酵液采用乙酸乙酯萃取，萃取物拌硅胶装柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，从体积比为4:16:l的乙酸乙酯和石油醚的洗脱液中得到式(I)所示恩镰孢菌素类化合物混合物粗品，在用乙酸乙酯/环己烷(体积比为1/1)混合溶剂等度洗脱，依次得到恩镰孢菌素G、恩镰孢菌素B和恩镰孢菌素B4。将上述菌体用甲醇提取，萃取物拌硅胶装柱,以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱,再经石油醚-丙酮梯度洗脱，在石油醚-丙酮体积比为10:2极性段可得到白僵菌素。实施例2恩镰孢菌素类化合物抗鸟-胞内分枝杆菌活性试验本实施例采用固体培养基稀释法对恩镰孢菌素G、恩镰孢菌素B、恩镰孢菌素B4和白僵菌素四种物质的抗鸟-胞内分枝杆菌活性进行检测。取斜面培养的鸟-胞内分枝杆菌培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.l)比浊，即配成lmg/ml的鸟-胞内分枝杆菌菌悬液。将恩镰孢菌素G、恩镰孢菌素B、恩镰孢菌素B4和白僵菌素分别用DMSO(二甲基亚砜)配成高浓度的原液，用含5%的吐温-80无菌超纯水稀释原液至120iig/ml，将稀释好的各恩镰孢菌素类化合物按等比稀释法加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基中(该培养基已经12rC高压蒸气灭菌15分钟，并冷却至5055。C)，混匀，分别制成浓度为60ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ixg/ml、15ixg/ml和10ug/ml的含各恩镰孢菌素类化合物的斜面培养基。将浓度为lmg/ml的鸟-胞内分枝杆菌菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含系列浓度的各恩镰孢菌素类化合物的斜面培养基和空白对照培养基斜面上，置于37。C培养48周，观察实验结果，结果如表l所示。本实施例中所用Middlebrook7H9肉汤培养基和Middlebrook7H11琼脂培养基为本领域技术人员进行结核菌培养时的常用培养基，其配方采用常规配方即可。实施例3恩镰孢菌素类化合物抗结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株活性试验本实施例采用固体培养基稀释法对恩镰孢菌素G、恩镰孢菌素B、恩镰孢菌素B4和白僵菌素四种物质的抗结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株(耐异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇结核杆菌临床分离株)活性进行检测。从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.l)比浊，即配成lmg/ml的菌悬液。此操作在三级生物安全实验室中进行。将恩镰孢菌素G、恩镰孢菌素B、恩镰孢菌素B4和白僵菌素分别用DMSO(二甲基亚砜)配成高浓度的原液，用含5%的吐温-80无菌超纯水稀释原液至120ug/ml，将稀释好的四类恩镰孢菌素类化合物按等比稀释法分别加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基(该培养基已经121。C高压蒸气灭菌15分钟，并冷却至5055°C)中，混匀，分别制成浓度为60ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml、15ug/ml和10yg/ml的含各恩镰孢菌素类化合物斜面培养基。将浓度为lmg/ml的结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含系列浓度的各恩镰孢菌素类化合物的斜面培养基和空白对照培养基的斜面上，置于37'C培养48周，观察实验结果，结果如表1所示。本实施例中所用Middlebrook7H9肉汤培养基和Middlebrook7H11琼脂培养基为本领域技术人员进行结核菌培养时的常用培养基，其配方采用常规配方即可。实施例4恩镰孢菌素类化合物抗结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株活性试验本实施例采用固体培养基稀释法对恩镰孢菌素G、恩镰孢菌素B、恩镰孢菌素B4和白僵菌素，这四种物质的抗结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株(耐异烟肼、链霉素、乙胺丁醇结核杆菌临床分离株)活性进行检测。从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.l)比浊，即配成lmg/ml的结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株菌悬液。将恩镰孢菌素G、恩镰孢菌素B、恩镰孢菌素B4和白僵菌素分别用DMSO配成高浓度的原液，用含5%的吐温-80无菌超纯水稀释原液至120ug/ml，将稀释好四类恩镰孢菌素类化合物分别加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基(该培养基已经12rC高压蒸气灭菌15分钟，并冷却至5055。C)中，混匀，分别制成浓度为60iig/ml、40ug/ml、30ug/ml、20ug/ml、15yg/ml禾口10Ug/ml的含各恩镰孢菌素类化合物斜面培养基。将浓度为lmg/ml的结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含系列浓度的各恩镰孢菌素类化合物的培养基和空白对照培养基的斜面上，置于37°C培养48周，观察实验结果，结果如表l所示。本实施例中所用Middlebrook7H9肉汤培养基和Middlebrook7H11琼脂培养基为本领域技术人员进行结核菌培养时的常用培养基，其配方采用常规配方即可。表l恩镰孢菌素类化合物抗鸟-胞内分枝杆菌、结核分枝杆菌临床分离株耐ISREMTB株和临床分离株耐ISEMTB株的MIC(Pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、恩镰孢菌素类化合物在制备抗耐药结核菌药物中的应用。2、根据权利要求l所述应用，其特征在于所述恩镰孢菌素类化合物具有式(I)所示通式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中(1)当R产<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>时，式(I)化合物为恩镰孢菌素G;(2)当<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>时，式(I)化合物为恩镰孢菌素B;(3)当<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>时，式(I)化合物为恩镰孢菌素B4;(4)当R产R^R产^^时，式(I)化合物为白僵菌素。3、根据权利要求2所述应用，其特征在于所述权利要求1所述恩镰孢菌素G对鸟-胞内分枝杆菌的最小抑菌浓度为50yg/ml，所述恩镰孢菌素B对鸟-胞内分枝杆菌的最小抑菌浓度为60yg/ml，所述恩镰孢菌素B4对鸟-胞内分枝杆菌的最小抑菌浓度为60ug/ml，所述白僵菌素对鸟-胞内分枝杆菌的的最小抑菌浓度为60lig/ml。4、根据权利要求2所述应用，其特征在于所述权利要求1所述恩镰孢菌素G对结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株的最小抑菌浓度为15ug/ml，所述恩镰孢菌素B对结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株的最小抑菌浓度为15iig/ml，所述恩镰孢菌素B4对结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株的最小抑菌浓度为30ug/ml，所述白僵菌素对结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株的最小抑菌浓度为20ixg/ml。5、根据权利要求2所述应用，其特征在于所述权利要求1所述恩镰孢菌素G对结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株的最小抑菌浓度为15ixg/ml，所述恩镰孢菌素B对结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株的最小抑菌浓度为15"g/ml，所述恩镰孢菌素B4对结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株的最小抑菌浓度为15yg/ml，所述白僵菌素对结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株的最小抑菌浓度为20ug/ml。全文摘要本发明公开一种恩镰孢菌素类化合物在制备抗耐药结核菌药物中的应用，该恩镰孢菌素类化合物具有式(I)所示通式。针对当前结核病发病率高、结核杆菌多重耐药菌株及人体免疫缺陷病毒双重感染的出现，使结核病发病率和死亡率呈上升趋势的现状，本发明发现恩镰孢菌素类化合物具有很强的抗耐药结核病菌活性，提供恩镰孢菌素类化合物在抗耐药结核病菌方面的新应用，不但为耐药结核病菌的治疗提供了新的有利工具，而且扩大了恩镰孢菌素类化合物的应用范围。此外，本发明的恩镰孢菌素类化合物来源于海洋红树林内生真菌，原料充足，且原料采集和培养容易，易提纯，成本低，繁殖周期短，利于大规模的工业化生产。文档编号A61P31/00GK101669939SQ200910192548公开日2010年3月17日申请日期2009年9月22日优先权日2009年9月22日发明者佘志刚,林永成,军王,赖小敏,伊陈申请人:中山大学