二(5-丁基-2-吡啶甲酸-n1,o2)合铜(ⅱ)在制备抗结核病药物中的应用的制作方法

专利名称：：二(5-丁基-2-吡啶甲酸-n1,o2)合铜(ⅱ)在制备抗结核病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及金属络合物在抗结核菌领域的应用，尤其涉及二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)在制备抗结核病药物中的应用。
背景技术：
：由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)引起的结核病是严重危害人类健康的传染病，而且随着耐药菌株增加和在艾滋病人群中并发结核病等诸多原因，近年来全球结核病的发病呈增高趋势。据世界卫生组织(WHO)估计，目前全球受Mtb感染的人口占世界人口的三分之一，其中5%10%的感染者成为结核病患者。我国每年出现活动性肺结核病人130万例，其中传染性肺结核约60万例，是全球结核病高负担国家之一。自20世纪50年代初，抗结核药物相继问世，使结核病的治疗起到划时代的变化。传统的第一线抗结核药物有异烟肼、链霉素、对氨水杨酸钠，其他则为第二线药物如利福平等老药及利福霉素、喹诺酮类等新药。然而由于结核病患者的治疗管理尚不十分规范，不规则化疗，滥用抗结核药物，不执行归口管理等问题仍然严重，使结核病耐药情况日益严重，且耐药性的变化更趋向于多种药物同时耐药，尤其是对异烟肼和利福平同时耐药的多重耐药性结核(MDR-TB)发生率高，这给结核病的防治工作造成极大困难。海洋微生物由于其所处的特殊环境，发展出了各种独特的代谢方式，这不仅确保其在极端环境中生存，也为人类提供了在陆地微生物中难以发现的大量新颖代谢产物，其中不少具有潜在的实际应用价值，已被认为是寻找药理活性物质的新源泉。此外，海洋微生物易于采集和培养，人工发酵产生的代谢产物比高等生物所含的物质更易提纯，成本更低，符合可持续发展的资源开发原则，所以从中筛选到的活性化合物更利于工业化生产。来源于红树林内源真菌F^flWwmsp.ZZF51的铜离子络合物——二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(11)，其结构式如式(I)所示，为蓝色晶体，化学式组成为C2oH24CuN204，分子质量为419.1019。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(I)谭倪等人谭倪、邵长伦、何丽仙等，Cu(II)促进海洋真菌Fusariumsp.ZZF51产生代谢产物二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)的研究，中山大学学报(自然科学版)，2008年第47巻第4期已经给出式(I)所示铜离子络合物的提取方法以及结构分析，但未研究该铜离子络合物的医药学性质。目前尚未见有二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)具有抗结核活性的相关报道。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供来源于海洋红树林内源真菌的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)在制备抗结核病药物中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的发明人从红树林内源真菌F^"n'wmsp.ZZF51的培养液的乙酸乙酯萃取部位，经硅胶柱层析，在乙酸乙酯/石油醚(体积比为90/10)的洗脱液中得到二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(n)，其结构式如式(I)所示，外观为蓝色晶体，化学式组成为(32(^240^204，分子质量为419.1019，红外光谱羰基吸收峰为1653cm—1，饱和脂肪烃基吸收峰为2929，1342,701(^1-1，核磁共振氢谱在化学位移S0.8961.668和10.01311.326出现两组包状吸收信号，显微电镜(能谱)给出化合物中含有铜元素，如下结构被X射线单晶结物证实。本发明人先用卡介苗做应试菌株，采用纸片扩散法对二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)的抗结核菌活性进行初步试验，根据初步试验的结果，本发明再用固体培养基稀释法测定了该化合物对卡介苗、结核分枝杆菌标准株H37RV株、临床分离耐ISREMTB株、临床分离耐ISEMTB株四种结核菌的最小抑菌浓度，实验结果证实二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)具有很强的抗结核菌活性，可作为治疗结核菌感染疾病的先导化合物，也可用于制备治疗结核病药物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明提供了一种新的可用于抗结核病治疗的化合物——二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(11)，从而扩大了抗结核菌药物的种类；2.针对目前结核病发病率高、结核杆菌多重耐药菌株及人体免疫缺陷病毒双重感染的出现，使结核病发病率和死亡率呈上升趋势的现状，本发明发现二(5-丁基-2-妣啶甲酸-Nl，02)合铜(II)具有抗结核菌和耐药性结核菌活性的特点，可用于抗结核药物的制备，具有非常广阔的应用前景；3.二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)来源于海洋红树林内生真菌，从真菌中提取化合物的方法简单，而优化培养方法将使大量发酵生产本化合物的成本低廉。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例l二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)的制备配制培养基，其配方为含葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、酵母膏lg/L、粗海盐2g/L，pH为7.0。采用上述培养基对红树林内源真菌i^^n'wwsp.ZZF51进行悬浮态发酵培养，在25"静置培养22天，过滤，收集发酵液。将上述发酵液采用乙酸乙酯萃取，萃取物拌硅胶装柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，从体积比为9:l的乙酸乙酯和石油醚的洗脱液中得到络合物粗品，经一次制备薄层层析，一次重结晶纯化后可制得纯品二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)。实施例2固体培养基稀释法测定二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(n)抗卡介苗绝对浓度从斜面上刮取卡介苗培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.1)比浊，即配成lmg/ml的卡介苗菌悬液。将二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)用DMSO配成高浓度的原液，用含5%的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基(该培养基已经12rC高压蒸气灭菌15分钟、冷却至5055。C)，混匀，制成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)浓度分别为60ug/ml、40yg/ml、30ug/ml、20ug/ml、15ug/ml禾口10ug/ml的斜面培养基。将浓度为lmg/ml的卡介苗菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37。C培养48周，观察实验结果，结果如表l所示。本实施例中所用Middlebrook7H9肉汤培养基和Middlebrook7H11琼脂培养基为本领域技术人员进行结核菌培养时的常用培养基，其配方采用常规配方即可。实施例3固体培养基稀释法测定二(5-丁基2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)抗结核分枝杆菌标准株H37RV株绝对浓度从斜面上刮取结核分枝杆菌标准株H37RV株培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.1)比浊，即配成lmg/ml的H37RV株菌悬液。将二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)用DMSO配成高浓度的原液，用含5%的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)按所需剂量加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基中(该培养基已经12rC高压蒸气灭菌15分钟，并冷却至5055°C)，混匀，制成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)浓度分别为60iig/ml、40iig/ml、30yg/ml、20ug/ml、15yg/ml禾n10ug/ml的斜面培养基。将浓度为lmg/ml的H37RV株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37。C培养48周，观察实验结果，结果如表l所示。实施例4固体培养基稀释法测定二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)抗结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株绝对浓度从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株(耐异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇结核杆菌临床分离株)培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.l)比浊，即配成lmg/ml的菌悬液。将二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)用DMSO配成高浓度的原液，用含5%的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)按所需剂量加入到4mlMiddlebrook7H11琼脂培养基中(该培养基已经12rC高压蒸气灭菌15分钟，并冷却至5055。C)，混匀，制成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)浓度分别为60ug/ml、40yg/ml、30ug/ml、20ug/ml、15ug/ml和10ug/ml的斜面培养基。将浓度为lmg/ml的结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37C培养48周，观察实验结果，结果如表l所示。实施例5固体培养基稀释法测定二(5-丁基-2-吡旋甲酸-Nl，02)合铜(II)抗结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株绝对浓度从斜面上刮取结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株(耐异烟肼、链霉素、乙胺丁醇结核杆菌临床分离株)培养物，加入到3mlMiddlebrook7H9肉汤培养基中，加入少量玻璃珠，旋紧试管盖，于涡旋振荡器上剧烈振动研磨，与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.l)比浊，配成lmg/ml的结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株菌悬液。将二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)用DMSO配成高浓度的原液，用含5%的吐温-80无菌超纯水稀释原液至所需浓度，将稀释好的二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)按所需剂量加入到4mlMiddlebrook7Hl1琼脂培养基中(该培养基已经12rC高压蒸气灭菌15分钟，并冷却至5055°C)，混匀，制成含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)浓度分别为60ug/ml、40ug/ml、30ug/ml、20yg/ml、15ug/ml和10ug/ml的斜面培养基。将浓度为lmg/ml的结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株菌悬液用接种环蘸取数环，分别接种于含二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)系列浓度的培养基和空白对照培养基斜面上，置于37。C培养48周，观察实验结果，结果如表1所示。表l二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)抗卡介苗、结核分枝杆菌标准株H37RV株、结核分枝杆菌临床分离株耐ISREMTB株、结核分枝杆菌临床分离株耐ISEMTB株的MIC(yg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1、二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合铜(II)在制备抗结核病药物中的应用。2、根据权利要求1所述应用，其特征在于所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)对卡介苗的最小抑菌浓度为15ug/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)对结核分枝杆菌标准株H37RV株的最小抑菌浓度为15yg/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)对结核分枝杆菌临床分离耐ISREMTB株的最小抑菌浓度为40iig/ml，所述二(5-丁基-2-吡啶甲酸-Nl，02)合铜(II)对结核分枝杆菌临床分离耐ISEMTB株的最小抑菌浓度为10iig/ml。全文摘要本发明公开一种二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合铜(II)在制备抗结核菌药物中的应用。二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合铜(II)具有抗结核菌和耐药性结核菌活性的特点，可用于抗结核菌药物的制备，而且二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合铜(II)来源于海洋红树林内生真菌，从真菌中提取化合物的方法简单，而优化培养方法将使大量发酵生产本化合物的成本低廉，因此将二(5-丁基-2-吡啶甲酸-N1，O2)合铜(II)用于制备抗结核药物具有非常广阔的前景。文档编号A61K31/44GK101669947SQ200910192549公开日2010年3月17日申请日期2009年9月22日优先权日2009年9月22日发明者佘志刚,林永成,潘嘉慧,军王,赖小敏申请人:中山大学