一种来源于海绵的甾醇及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：一种来源于海绵的甾醇及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及海洋生物有效成分的提取领域，具体涉及一种来源于海绵的甾醇及其制备方法和应用。
背景技术：
：海绵是一种相当原始的多细胞动物，早在68亿年前就已经出现并一直生存繁衍到现在，几亿年海绵进化的结果是能产生多种活性物质。二十世纪五十年代就有报道从海绵中分离出活性物质，最近io年报道的海洋活性物质中来源于海绵的占相当大的比重。现已从不同的海绵体内分离鉴定了许多结构新颖的高活性抗肿瘤物质，显示出诱人的研究开发前景。Xestospongia属海绵为寻常海绵纲Haplosclerida目Petrosiidae科，是一种常见的大型海绵，直径可达3045cm，高度5070cm。外观好象大型桶状，故又称桶状海绵。太平洋印度洋皆有分布，分布在各处珊瑚礁海域。国外学者对加勒比海、红海，澳大利亚海域，新几内亚岛，日本冲绳岛以及菲律宾群岛海域的桶状海绵有较为深入的次生代谢产物研究，并发现不少具有开发前景的药物先导物或活性成分。对于我国南海海域的桶状海绵，国内外并无相关活性成分报道。甾醇广泛分布于植物界，但是含有过氧羟基的甾醇在自然界比较少见。在我们的发现之前，24-过氧羟基-24-乙烯基-胆甾醇仅在海藻Turbinariaornata和两种海鞘Cionaintestinalis、Phallusiamamillata中发现，其同分异构体29-过氧羟基豆甾_5，24(28)-二烯-313-醇只有在海藻Turbinariaornata中分离得到。我们从海绵中提取上述两种化合物，在国内外均属首次。而且，海藻Turbinariaornata的鉴定较为困难，易与其他褐藻混淆，海鞘Cionaintestinalis禾PPhallusiamamillata资源较少，在中国海域并无发现。因此上述的海藻和海鞘在资源利用上有较大的局限性。桶状海绵，作为一种大型海绵，在采集和鉴定上较为容易，Xestospongiamuta在我国南海海域资源比较丰富，可以解决上述两种化合物的来源问题。
发明内容本发明目的在于根据现有技术的不足，提供一种从来源丰富的的桶状海绵中提取的甾醇。本发明另一目的在于提供上述甾醇的提取方法。本发明还有一个目的在于提供上述甾醇在制备治疗抗癌药物中的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现—种来源于海绵的甾醇，该甾醇为24-过氧羟基-24-乙烯基_胆甾醇及其同分异构体29-过氧羟基豆甾_5，24(28)-二烯-3P-醇，这两种甾醇均含有一个过氧羟基_00H。所述24-过氧羟基-24-乙烯基-胆甾醇的结构式如下所示所述29-过氧羟基豆甾_5，24(28)-二烯-3|3-醇的结构式如下所示本发明来源于海绵的甾醇中，所述海绵是我国南海海域的桶状海绵Xestospongiamuta。本发明来源于海绵的甾醇的提取方法包括如下步骤(1)以桶状海绵Xestospongiamuta为原料，经醇提、浓縮后混悬于水；(2)用有机溶剂萃取后洗脱；(3)用硅胶薄层层析追踪检测馏分，对硅胶薄层层析板上比移值分别为0.45和0.40(展开剂为石油醚和丙酮，二者的体积比为5:1)的化合物进行富集和纯化。上述方法优选为如下步骤(1)以桶状海绵Xestospongiamuta为原料，醇提34次，将提取物浓縮后混悬于水；(2)用有机溶剂从低到高萃取用石油醚萃取后，萃取部位用石油醚和乙酸乙酯经过硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱部分再次进行硅胶柱层析，用石油醚和丙酮洗脱；(3)用硅胶薄层层析追踪检测馏分，对硅胶薄层层析板上比移值分别为0.45和0.40(展开剂为石油醚和丙酮，二者的体积比为5:1)的化合物进行富集和纯化。其中，步骤(1)中所述醇提，优选用甲醇或浓度大于75%的乙醇进行醇提；对提取物浓縮和混悬于水的方法均为本领域内常见的化合物提取过程中的操作方法。步骤(2)中，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选l:50，石油醚和丙酮的体积比优选12:1。所述石油醚优选6090沸程的石油醚。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)本发明是从桶状海绵中提取得到甾醇的，桶状海绵是大型海绵，其直径可达3045cm，高度为5070cm，有的甚至超过lm，因此桶状海绵便于发现、采集和鉴定，且桶状海绵的资源比较丰富。(2)本发明从海绵中提取的甾醇有较强的细胞毒性，对癌细胞，尤其是Hela宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞和H印G2肝癌细胞均有显著的抑制作用，可用于制备治疗宫颈癌、胃癌、肝癌的药物。具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1本发明来源于海绵的甾醇的制备取采自我国南海海域的桶状海绵Xestospongiamuta湿重10公斤，适当剪碎，用20升95%的工业酒精室温下提取3次，减压回收提取液得到105克提取物。取100克提取物混悬于10升水中，加入10升石油醚(60-90)萃取3次，减压回收萃取液得到34克石油醚部位浸膏。30克石油醚部位浸膏经过硅胶中压柱层析(柱高46cm，柱径6cm，流速40mL/min)，依次用体积比为1/100、1/50、1/20、1/10、1/4、1/1的石油醚/乙酸乙酯各4升洗脱，其中体积比为1/50的石油醚/乙酸乙酯洗脱部分回收溶剂得到2.3克淡黄色固体，再用硅胶中压柱层析(柱高20cm，柱径2cm，流速5mL/min)，用l升石油醚/丙酮(体积比为12/1)洗脱，并用薄层层析追踪检测馏分，在不同馏分中析出两种白色固体，化合物1为21毫克，化合物2为8毫克，它们在薄层层析板上经茴香醛一硫酸显色均显示为单斑点(展开剂是体积比为5/1的石油醚/丙酮，比移值分别为0.45和0.40)。表1实施例1得到的两种化合物的^和13C核磁共振数据No.化合物1化合物2力S[mult乂(Hz)]13CSiH5[mult,J(Hz)]137.337.3232.031.9371.93.53(m)71.93.52(m)442.442.3140.8140.86121.75.35(d，5.0)121.75.35(d,5.0)731.831.7836.236.4950.250.21036.636.61121.121.11239.839.81342.442.41456.856.871524.324,31628.328.31756.055.71811.90.68(s)11.90.68Cs)1919.41.01(s)19.41.01(s)2036.034.72118.90.96(d,6.5)18.80.98(d，6.5)2231.729.72328.526.62489.2155.32532.031.92616.70.86(d,6.5)21.11.03(d，6.5)2717.70.88(d,6.5)22.01.03(d,6.5)28137.35.74(dd，18,11.5)115.05.31(t,7.0)29116.35.15(d,18)5.27(d,11.5)73.54.54(2H,d，7.0)OOH7.07(brs)8.02(brs)由^和"CNMR谱可以看出化合物1和化合物2均有29个C信号，其中高场有5个甲基，该两化合物很可能为甾醇类化合物。在SH3.53附近的多重峰指示甾核上的3I3-0H的存在。化合物1除了甾核上的C5，6双键外，还显示在侧链上有AXX'自旋系统的双键，即24位的乙烯基，该乙烯基的^和13CNMR数据显示其烯丙位C-24还连有一个过氧羟基，化合物l由此鉴定为24-过氧羟基-24-乙烯基-胆甾醇/H和"CNMR数据(表1)与文献报道的一致(TetrahedronLett.，1982,23，1905-1906)。化合物2除了甾核上的有同样的C5，6双键外，在侧链上C-24，25还具有一个环外双键，一个烯质子和烯丙位的亚甲基质子组成AX2自旋系统，烯丙位C-29的化学位移显示同样还连有一个过氧羟基，化合物2由此鉴定为29-过氧羟基豆甾-5，24(28)-二烯-3!3-醇？H和13CNMR数据(表1)与文献报道的一致(PlantaMed，1997，63，571-572)。实施例2来源于海绵的甾醇的体外抗肿瘤实验研究采用HeLa宫颈癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、H印G2肝癌细胞三种肿瘤细胞系；一种正常细胞，即L02人胚胎肝细胞，进行MTT实验。(1)取对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，调节细胞浓度为1X105个/mL，每孔100yL细胞悬液的量加入至96孔细胞培养板，在饱和湿度、371:、5%C02培养箱中培养；(2)24h后，吸弃旧培养基，空白组加入100iiL5X的RPMI1640培养基，给药组加入不同浓度梯度，即100、10、l、0iig/mL的供试样品，各组均为3个复孔，继续培养48h;(3)在实验结束前4h，每孔加入20iiLMTT(四甲基偶氮唑盐，5mg/mL，用PBS缓冲液配置)，继续在5%C02培养箱中培养4h;(4)小心吸弃上清，每孔各加入100iiL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡600s，酶标仪570nm处测定0D(吸光值)值。抑制率(CI)=(对照组0D570-样品组0D570)X100%+对照组0D570，用SPSS软件，计算药物的半数抑制率IC50值。结果见表2。表2两种海绵甾醇对L02，HeLa，SGC-7901和H印G2细胞系的半数抑制率。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>体外实验表明，该两个过氧羟基甾醇对L02的IC5。值为3985iig/mL，具有中等或较弱抑制作用，对肿瘤细胞HeLa，SGC-7901和H印G2的IC5。值为0.83.g/mL，具有较强的抑制活性，表明该两化合物对肿瘤细胞的抑制活性具有一定的选择性，可经过进一步研究在治疗癌症尤其是宫颈癌、胃癌、肝癌中应用。权利要求一种甾醇，包括24-过氧羟基-24-乙烯基-胆甾醇及其同分异构体29-过氧羟基豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇，其特征在于该甾醇来源于海绵。。2.根据权利要求1所述的甾醇，其特征在于所述24-过氧羟基-24-乙烯基-胆甾醇的结构式如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.根据权利要求l所述的甾醇，其特征在于所述29-过氧羟基豆甾-5，24(28)-二烯-3P-醇的结构式如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>4.根据权利要求1或2或3所述的甾醇，其特征在于所述海绵是桶状海绵Xestospongiamuta。5.权利要求1所述甾醇的提取方法，其特征在于所述方法包括如下步骤(1)以桶状海绵Xestospongiamuta为原料，经醇提、浓縮后混悬于水；(2)用有机溶剂萃取后洗脱；(3)用硅胶薄层层析追踪检测馏分，以体积比为5:1的石油醚和丙酮作为展开剂，对硅胶薄层层析板上比移值分别为0.45和0.40的化合物进行富集和纯化。6.根据权利要求5所述甾醇的提取方法，其特征在于所述方法包括如下步骤(1)以桶状海绵Xestospongiamuta为原料，醇提34次，将提取物浓縮后混悬于水；(2)用有机溶剂从低到高萃取用石油醚萃取后，萃取部位用石油醚和乙酸乙酯经过硅胶柱层析梯度洗脱，洗脱部分再次进行硅胶柱层析，用石油醚和丙酮洗脱；(3)用硅胶薄层层析追踪检测馏分，以体积比为5:1的石油醚和丙酮作为展开剂，对硅胶薄层层析板上比移值分别为0.45和0.40的化合物进行富集和纯化。7.根据权利要求5或6所述甾醇的提取方法，其特征在于步骤(1)中所述醇为甲醇或浓度大于75%的乙醇。8.根据权利要求6所述甾醇的提取方法，其特征在于所述步骤(2)中，石油醚和乙酸乙酯的体积比为l:50，石油醚和丙酮的体积比为12:1，石油醚为6090沸程的石油醚。9.权利要求1所述甾醇的应用，其特征在于该甾醇用于制备预防或治疗癌症的药物，对癌细胞有显著的生长抑制作用。10.根据权利要求9所述甾醇的应用，其特征在于该甾醇用于制备预防或治疗宫颈癌、胃癌、肝癌的药物。全文摘要本发明公开了一种来源于海绵的甾醇，该甾醇为24-过氧羟基-24-乙烯基-胆甾醇或其同分异构体29-过氧羟基豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇，24-过氧羟基-24-乙烯基-胆甾醇的结构式如式(1)所示；29-过氧羟基豆甾-5，24(28)-二烯-3β-醇的结构式如式(2)所示。式(1)式(2)本发明还公开了上述来源于海绵的甾醇的提取方法及其在制备治疗癌症的药物中的应用。本发明从海绵中提取甾醇，海绵来源丰富，采集方便，提取的甾醇有较强的细胞毒性，对宫颈癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞等肿瘤细胞均有较强的生长抑制作用；本发明来源于海绵的甾醇可用于制备治疗癌症的药物，尤其是用于制备治疗宫颈癌、胃癌、肝癌的药物。文档编号A61P35/00GK101712711SQ200910193049公开日2010年5月26日申请日期2009年10月13日优先权日2009年10月13日发明者刘永宏,周雪峰,徐暾海,杨献文,王隶书,黄日明申请人:中国科学院南海海洋研究所