猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备方法

专利名称：：猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及兽用生物制品领域，特别涉及一种猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗。
背景技术：
：猪链球菌病和巴氏杆菌病是目前我国猪的最主要的两种细菌传染病。猪链球菌病是由多种链球菌感染引的的一种多症状的猪病，主要引起猪的败血症、脑膜炎、胸膜炎、组织脓肿、关节炎等症状，死亡率较高，流行时严重危害养猪业。国内猪链球菌病自上世纪60年代以来，在广西、广东、福建、湖南、江西、安徽、江苏、四川等地陆续发生，该病流行范围广，发病率和死亡率高，造成严重的经济损失。据资料统计，主要血清型为兰氏C群，其次为兰氏D群、E群。近年来广东、江苏、上海和四川等地发现有R群的病例出现，1991年广东省最早报导R群(猪链球菌2型)的出现，1998年长江大洪水后，江苏部分地区猪链球菌病爆发，并造成25人感染，14人死亡，经鉴定为R群，C群也同时大量存在，使用C群疫苗后，疫情得到控制，2005年四川部分地区爆发R群疫情。巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染引起的细菌性疾病，可引起败血症、肺炎。另外，可引起猪体的混合感染，其常常导致猪群出现高发病率和高死亡率，由于混合感染和滥用抗生素，导致一病多型、一病多症、一症多病的现象非常普遍，造成猪病日趋复杂，诊断难度越来越大，漏诊和误诊时有发生。巴氏杆菌按荚膜分可分为A、B、D、E四种荚膜血清型。巴氏杆菌病世界各地都有发生，热带地区较为严重。目前已流行的巴氏杆菌病以A、B群为主，还有少量的D群。目前，市面上使用的控制猪链球菌病的疫苗只有单独预防C群链球菌、巴氏杆菌荚膜A群、B群菌感染的活疫苗，而针对猪链球菌其他血清型的疫苗还没有。针对猪链球菌病的灭活疫苗和同时针对猪链球菌病与巴氏杆菌病的灭活疫苗，国内也还是空白。现有巴氏杆菌疫苗是活的细菌疫苗，用活的细菌作为免疫原，存在一定的散毒情况。另外，由于滥用抗生素，导致耐药菌株的产生，使药物治疗趋向无效、浪费；抗生素药物的残留，使肉用动物在出口时面临不能通过的难题。于是，用疫苗来预防疾病的方法就显得更加受欢迎。因此，需要发明一种新的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗以解决上述问题。
发明内容本发明的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种可以同时预防由兰氏C群马链球菌、兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949强毒株、猪链球菌2型、巴氏杆菌荚膜A群和B群菌所引起的细菌感染、免疫安全的猪链球菌、巴氏杆菌多价灭活疫苗。本发明的另一个目的在于提供一种操作简便的制备猪链球菌、巴氏杆菌多价灭活疫苗的方法。本发明提供一种猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗，所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗包括抗原和佐剂所述的抗原由已灭活的兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株培养浓縮液、兰氏D群链球菌C55914株培养浓縮液、兰氏E群链球菌C55949强毒株培养浓縮液、猪链球菌2型HA9801株培养浓縮液、巴氏杆菌荚膜A群菌培养浓縮液、巴氏杆菌荚膜B群菌培养浓縮液等菌量混合而成，所述的抗原为7585体积份数；所述的佐剂为氢氧化铝凝胶，所述的佐剂为1525体积份数。本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗，由于采用兰氏C群马链球菌、兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949强毒株、猪链球菌2型、荚膜血清A、B型的多杀性巴氏杆菌菌种制备多价灭活疫苗，可以预防由多种不同血清群链球菌引起的猪链球菌感染以及由多种不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌引起的感染，临床上达到一针多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。作为本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的优选实施方式，所述的巴氏杆菌荚膜A群菌的菌株为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株。作为本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的优选实施方式，所述的巴氏杆菌荚膜B群菌的菌株为荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-l。上述两个菌株的免疫原性强，适合作为生产菌株。作为本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的优选实施方式，所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗中还含有0.01%体积比的硫柳汞。硫柳汞是一种可以抑制霉菌的化学物质，防止疫苗生产和使用过程中受到霉菌污染。本发明还提供一种猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤(1)分别将兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株、兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949强毒株、猪链球菌2型HA9801株、巴氏杆菌荚膜A群菌和巴氏杆菌荚膜B群菌增殖，得到培养液；(2)将步骤(1)增殖得到的培养液灭活；(3)向灭活后的培养液分别加入氢氧化铝凝胶进行浓縮，在分别得到的浓縮液中，所述的氢氧化铝凝胶的体积份数为1525，上述培养液各自的体积份数分别为7585;(4)将步骤(3)得到的培养液浓縮液按等量菌数进行混合，得到猪链球菌、巴氏杆菌多价灭活疫苗。本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，操作简便，制备得到的产品能够预防由多种不同血清群链球菌引起的猪链球菌感染以及由多种不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌引起的感染，临床上达到一针多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。作为本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，灭活方式为在步骤(1)增殖得到的培养液中，按总体积分别加入0.2%的甲醛溶液，放置于37"灭活24小时，其间搅拌35次。作为本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，所述的巴氏杆菌荚膜A群菌的菌株为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株。作为本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，所述的巴氏杆菌荚膜B群菌的菌株为荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-l。上述两个菌株的免疫原性强，适合作为生产菌株。作为本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，该制备方法还包括步骤(5)向所述的猪链球菌、巴氏杆菌多价灭活疫苗加入0.01%体积比的硫柳汞。加入硫柳汞的作用在于抑制霉菌。作为本发明猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法的优选实施方式，步骤(2)在灭活后还可以分别对培养液进行灭活检验和毒素检验。进行灭活检验和毒素检验的作用在于对制造过程疫苗质量的控制。具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。本发明的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典(二〇〇五年版)》及附录。其他未特别注明的试剂或原料均可由本领域技术人员根据现有技术获得。实施例1本品是选用致病性的兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株、兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949强毒株、猪链球菌2型HA9801株，巴氏杆菌荚膜A群、荚膜B群菌接种于适宜培养基培养，将培养物经甲醛溶液灭活，去除残留毒素，加氢氧化铝胶浓縮配制而成，用于预防由链球菌兰氏C群、猪链球菌2型菌，巴氏杆菌荚膜A群、荚膜B群菌所引起的各种细菌菌感染。这包括了目前流行的几种最主要的细菌性疾病。制造及检验本品用的菌种为兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株、兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949强毒株、荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株及荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-l(效检可用C44-8)株等强毒株，均为中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应，猪链球菌2型HA9801株由广东永顺生物制药有限公司保管和使用。1菌种制造及检验本品用的菌种为致病性的兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株、兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949强毒株、猪链球菌2型HA9801株，巴氏杆菌荚膜A群、荚膜B群菌，为获得免疫原性强的菌种，各菌种经敏感猪体复壮后冻干保存。2疫苗制造及半成品检验2.1生产用种子的制备2.1.1—级种子的繁殖冻干菌种，用马丁肉汤稀释，划线接种于鲜血平皿上，置37t:培养1824小时，选取生长良好的菌落，接种于含有羊鲜血琼脂斜面上，37t:培养1824小时，作为一级种子。2.1.2二级种子的繁殖用少量缓冲肉汤洗一级种子的血琼脂斜面培养物，接种于缓冲肉汤大管中，置37t:培养1824小时取出，经检验纯粹后作为二级种子。2.2制苗用培养基采用商售的链球菌培养基、巴氏杆菌培养基。2.3制苗用菌液的制备2.3.1制苗用菌液的培养在培养基中加入血清2%，2株制苗用菌种液分别按5%的量加进培养基中分别培养，混匀后置37t:中培养；当菌液pH降低到6以下时停止培养。2.3.2纯粹检验培养结束后，分别从制苗菌液取样，根据《中华人民共和国兽药典(二OO五年版》中细菌类活疫苗纯粹检验方法进行纯粹检验，菌液应纯粹。2.3.3活菌计数分别从制苗菌液取样，用血琼脂平皿进行活菌计数，以确定培养菌数。2.3.4灭活在培养好的强毒菌液中，按总量加入0.2X的甲醛溶液，放置于37t:灭活24小时，其间搅拌35次。2.3.5灭活检验灭活后，取灭活菌液5ml接种于100ml含2%血清的培养基中37。C培养24小时，再移植于上述培养基100ml中37t:培养24小时；取灭活菌液0.5ml接种于血琼脂平皿，37°C培养24小时。上述两种方法培养均应无菌生长。2.3.6毒素检验取灭活菌液静脉注射1822g的SPF小鼠5只，每只0.2ml，3天内应5/5健活。2.3.7沉淀浓縮经灭活及毒素检验合格后，按灭活菌液加入适量的氢氧化铝胶摇匀进行沉淀浓縮，混匀，置常温沉淀4872小时。2.3.8去毒素向灭活好的菌液按比例加入15-25%的铝胶，混匀，将细菌的毒素最大限度地去掉。细菌在培养增殖过程中，会产生大量的有害物质，如增殖过程的分泌在培养基中外毒素(以蛋白质为主)和在增殖过程中细菌凋亡破裂后释放出来的内毒素(以脂多糖为主)，以及一些有机酸和酶。这些物质均对动物机体有毒害作用(以过敏反应等为最常见)。氢氧化铝胶是一种弱的具有吸附作用的胶体，它能吸附细菌菌体，与之结合后，形成颗粒，并在重力作用下，沉降于液体下面，但不能吸附或极重量吸附细菌毒素等小物质。同时，氢氧化铝胶是一种免疫剌激剂，可以增强抗原的非特异性免疫应答。当抗原(细菌)在液体培养基中增殖及灭活完成，根椐活菌计数的结果，往抗原液中添加适量灭菌氢氧化铝胶，搅拌均匀后，静置。氢氧化铝胶和抗原(细菌)结合物则沉降于下部，细菌毒素等有害物质在残留在上清液中。将上清去除后，以无菌生理盐水将沉淀物重悬，配制成的疫苗成品，将大大提高产品的安全性。3配苗与分装3.1混合根椐2.3.3的活菌计数结果，将2.3.8的剩余物按菌数等比例混合，各个菌株按每2毫升含适宜菌数配苗，按总量加入0.01%硫柳汞。3.2半成品检验取分装前苗样，按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验，应无细菌生长。3.3分装6以100ml/瓶，或20ml/瓶分装，盖上瓶塞，并压铝盖。在其他实施例中，还可以采用其他的制致病性的巴氏杆菌荚膜A群、B群强毒菌株，并不仅局限于实施例1中所采用的菌株。灭活的方式也可以采用P-丙内酯(BPL)、Y-射线照射和加热等其他灭活方法。作为防腐剂的硫柳汞可以采用其他含汞物质代替，例如二甲基汞，或者基于安全的原因，硫柳汞也可以不添加。实施例2效力研究用健康易感猪30头，各肌肉注射实施例1制得的疫苗2ml，含1个使用剂量；21天后，用各个强毒菌株进行强毒攻击。链球菌C群C55138株选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪3头，注射C55138株致死量的强毒菌液，观察IO天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上死亡为合格。猪链球菌2型HA9801株选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，用HA9801强毒株致死剂量攻击，观察10天，对照组4/5以上死亡，免疫组4/5以上保护，判为合格。D群C55914株取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，注射D群C55914株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上发病为合格。E群C55949株取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，注射E群C55949株强毒菌液，观察10天，免疫猪4/5以上保护，对照猪4/5以上发病为合格。巴氏杆菌P71株选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，注射P71株强毒菌液，观察10天，对照猪4/5死亡，免疫猪4/5以上保护。巴氏杆菌C44-1株选取免疫猪5头，连同条件相同的对照猪5头，各静脉注射C44-l株强毒菌液，观察10天，对照猪4/5以上死亡，免疫猪4/5以上保护。结果对照组实验组C55138株4/5死亡4/5保护C55914株4/5发病5/5保护C55949株4/5发病5/5保护HA9801株4/5死亡5/5保护P71株4/5死亡4/5保护7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。权利要求一种猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗包括抗原和佐剂所述的抗原由已灭活的兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株培养浓缩液、兰氏D群链球菌C55914株培养浓缩液、兰氏E群链球菌C55949强毒株培养浓缩液、猪链球菌2型HA9801株培养浓缩液、巴氏杆菌荚膜A群菌培养浓缩液、巴氏杆菌荚膜B群菌培养浓缩液等菌量混合而成，所述的抗原为75～85体积份数；所述的佐剂为氢氧化铝凝胶，所述的佐剂为15～25体积份数。2.如权利要求1所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述的巴氏杆菌荚膜A群菌的菌株为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株。3.如权利要求1所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述的巴氏杆菌荚膜B群菌的菌株为荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-l。4.如权利要求l所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗，其特征在于，所述的猪链球菌、巴氏杆菌多价灭活疫苗中还含有0.01%体积比的硫柳汞。5.—种猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤(1)分别将兰氏C群马链球菌兽疫亚种C55138株、兰氏D群链球菌C55914株、兰氏E群链球菌C55949强毒株、猪链球菌2型HA9801株、巴氏杆菌荚膜A群菌和巴氏杆菌荚膜B群菌增殖，得到培养液；(2)将步骤(1)增殖得到的培养液灭活；(3)向灭活后的培养液分别加入氢氧化铝凝胶进行浓縮，在分别得到的浓縮液中，所述的氢氧化铝凝胶的体积份数为1525，上述培养液各自的体积份数分别为7585;(4)将步骤(3)得到的培养液浓縮液按等量菌数进行混合，得到猪链球菌、巴氏杆菌多价灭活疫苗。6.如权利要求5所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，灭活方式为在步骤(1)增殖得到的培养液中，按总体积分别加入0.2%的甲醛溶液，放置于37t:灭活24小时，其间搅拌35次。7.如权利要求5所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的巴氏杆菌荚膜A群菌的菌株为荚膜A群多杀性巴氏杆菌P71株。8.如权利要求5所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的巴氏杆菌荚膜B群菌的菌株为荚膜B群多杀性巴氏杆菌C44-l。9.如权利要求5所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，还包括步骤(5)向所述的猪链球菌、巴氏杆菌多价灭活疫苗加入0.01%体积比的硫柳汞。10.如权利要求5所述的猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)在灭活后分别对培养液进行灭活检验和毒素检验。全文摘要本发明提供一种猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗，可以预防由多种不同血清群链球菌引起的猪链球菌感染以及由多种不同荚膜血清型的多杀性巴氏杆菌引起的感染，临床上达到一针多防的效果，降低成本，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。本发明还提供一种猪链球菌病、多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗的制备方法。文档编号A61K39/09GK101780274SQ20091019389公开日2010年7月21日申请日期2009年11月13日优先权日2009年11月13日发明者以体强,张毓金,杨球,林旭埜,游启有,郭沈涛申请人:广东永顺生物制药有限公司