Cyclo（Pro-Val）的制备方法及用途与流程

本发明属于化学分析，具体涉及cyclo(pro-val)的制备方法及用途。

背景技术：

1、cyclo(pro-val)，中文名环(脯氨酸-缬氨酸)，cas:5654-87-5，是由脯氨酸和缬氨酸通过肽键环合而成的环二肽类化合物。结构式如下：

2、

3、环二肽是典型的二酮哌嗪(dkp)环结构，同时具有两个氢受体和两个氢供体，在药物化学中是一个重要的药效团。相比于直链肽，环二肽具有结构稳定的优点，更适用于药物开发。目前天然提取、酶解、微生物发酵、重组技术和化学合成是获得环二肽的主要方法，研究它们的功能活性以及开发相关药物的一个重要前提是制备得到高纯度的环二肽。环二肽主要来源于动植物的组织器官和微生物的次生代谢产物等，原料不易得，制备成本高。

4、黄水是白酒酿造过程中起糟滴窖产生的黄色或棕黄色粘稠、浑浊液体，是白酒酿造过程的特有副产物。白酒酿造是以大米、糯米、高粱、玉米、小麦等粮食为原料，以酒曲为发酵剂，长时间的自然发酵过程。酒曲中的蛋白酶、糖化酶和酯化酶等各种酶系以及霉菌、细菌等微生态体系，分解利用原料中的蛋白质、淀粉等大分子物质，生成分子量更小的多糖，寡糖、单糖、多肽、小分子肽、氨基酸、乙醇以及白酒风味组分所构成的复杂体系，伴随酒醅中的过饱和水分以及酵母有氧呼吸产生的水分，在起糟滴窖过程中一起下渗至窖池底部，形成黄水。因此，黄水相当于酶解法和微生物发酵法协同作用的蛋白水解产物，黄水风味成份通过蒸馏方式得到回收利用，而剩余的底锅黄水则作为废液处理后排放，其中植物蛋白、微生物蛋白等在白酒酿造发酵过程中水解产生的大量肽类化合物未得到回收利用。

5、高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合征，可能导致心肌梗死、心力衰竭、中风和肾衰竭等多种疾病。肾素-血管紧张素系统(ras)是哺乳动物最重要的心血管调节通路，血管紧张素转化酶(ace)是维持肾素-血管紧张素(ras)和激肽释放酶(kks)系统之间平衡的关键酶，可以通过裂解his-leu灭活血管舒张剂缓激肽(血管紧张素ⅰ)，生成强效血管收缩剂血管紧张素ⅱ，引起血压升高。ace抑制剂可以降低血管紧张素ⅱ水平，实现降血压的作用。目前发现的ace抑制剂较少，且使用后还存在一些不良反应，因此，开发新的高效且低副作用的ace抑制剂对于高血压的治疗和预防具有重要的临床意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供cyclo(pro-val)的制备方法及用途，更具体的是提供从黄水中分离制备cyclo(pro-val)的方法及在ace抑制剂方面的应用，以解决现有制备方法存在的原料不易得到、制备工艺复杂、小分子肽类ace抑制剂资源紧缺以及白酒酿造副产物资源化利用等一系列问题。

2、第一方面，本发明提供了cyclo(pro-val)的制备方法：从黄水中分离得到。

3、其中，所述的制备方法，包括如下步骤：

4、a、取黄水，浓缩除去水分，得到黄水浓缩液；

5、b、将黄水浓缩液以丙酮沉淀，取上清液，浓缩回收丙酮，得到粗肽提取液；

6、c、将粗肽提取液进行大孔树脂柱层析，收集含有cyclo(pro-val)的洗脱液，浓缩，得到粗品；

7、d、将粗品进行凝胶柱层析，收集含有cyclo(pro-val)的洗脱液，浓缩，得到精品；

8、e、将精品通过制备色谱纯化，收集cyclo(pro-val)目标峰的洗脱液，浓缩，得到纯品。

9、进一步地，步骤a中，所述黄水浓缩温度为60～80℃。

10、进一步地，步骤b中：

11、丙酮与黄水浓缩液体积比为(1：1～2：1)。

12、黄酮沉淀温度为-10～10℃。

13、沉淀时间为16～24小时。

14、浓缩回收丙酮的温度为30～50℃。

15、进一步地，步骤c中：

16、大孔树脂为dm301大孔吸附树脂。

17、以乙醇-水为洗脱剂。

18、以乙醇/水，乙醇体积含量5％，15％，30％，65％，100％的比例进行梯度洗脱。

19、进一步地，步骤d中：

20、所述的凝胶为葡聚糖凝胶sephadex lh-20。

21、以甲醇-水为洗脱试剂。

22、以甲醇/水，甲醇体积含量15％的比例进行等度洗脱。

23、浓缩温度为60～80℃。

24、进一步地，步骤e中：

25、制备色谱为c18柱。

26、以乙腈/水为洗脱试剂。

27、以乙腈/水，乙腈体积含量10％的比例进行等度洗脱。

28、色谱流速为10ml/min，进样量为5ml。

29、进一步地，所述黄水为固态酿造白酒起糟滴窖过程产生黄色或棕黄色的粘稠液体。

30、进一步地，所述黄水为酿造五粮浓香型白酒产生的黄水。

31、第二方面，本发明提供上述制备方法制备的cyclo(pro-val)。

32、第三方面，本发明提供上述cyclo(pro-val)在制备血管紧张素转化酶(ace)抑制药物上的用途。

33、进一步地，所述用途是通过对ace抑制活性评价，采用酶联免疫试剂盒分析方法实现。

34、进一步地，将ace抑制剂标准品以稀释液配制成1.875、3.75、7.5、15、30ng/l5个浓度低度，以浓度为横坐标，od值为纵坐标建立标准曲线。

35、进一步地，将cyclo(pro-val)纯品以20％乙醇水配制成1mg/ml的母液，再分别配制成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/ml 7个浓度梯度，以标准曲线回归方程计算样品ace抑制浓度。

36、进一步地，采用ace天然晶体的3d结构(pdb id:1o8a)去水并加全氢后作为受体，cyclo(pro-val)分子的3d结构加全氢后作为配体，用autodock vina软件对接研究他们的结合模式。

37、进一步地，设置对接盒子，间距活性中心坐标(a:33.953；y:38.432；z:38.648)。挑选最低结合能的结合方式，并采用pymol2.6将对接结果可视化。

38、第四方面，本发明提供上述cyclo(pro-val)在制备降高血压药物上的用途。

39、有益效果：

40、1、本发明首次发现酿酒副产物黄水中存在环二肽，并将有机溶剂沉淀、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析和制备色谱等多种分离技术相结合，从五粮浓香型白酒副产物黄水中分离得到高纯的cyclo(pro-val)。本发明的分离纯化方法为从黄水中分离制备cyclo(pro-val)提供了可能，也为该类化合物的大量获得提供了新的方法。

41、2、黄水是白酒酿造的副产物，通常作为废液处理后排放，一方面为白酒企业的废液处理造成了负担，另一方面黄水中大量肽类健康功能活性成分未得到循环利用，造成了资源浪费。本发明从黄水中制备cyclo(pro-val)并探究其功能活性，既开发黄水的资源化利用途径，另一方面可以减轻白酒企业废液处理负担，减少碳排放。

42、3、本发明首次从黄水中分离纯化得到cyclo(pro-val)，原料易得，制备方法简便，产物纯度高，将有机溶剂沉淀、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析和制备色谱等多种分离技术相结合，从成分复杂的黄水中首次分离得到了纯度在95％以上的cyclo(pro-val)。

43、4、本发明开发了黄水cyclo(pro-val)的新用途。通过评价cyclo(pro-val)对血管紧张素转化酶(ace)的抑制作用，分子对接计算机模拟cyclo(pro-val)对ace的作用机制，提供了cyclo(pro-val)在辅助治疗高血压药物开发方面的新用途。

技术特征：

1.cyclo(pro-val)的制备方法：其特征在于：从黄水中分离得到，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的cyclo(pro-val)的制备方法：其特征在于：步骤a中，所述黄水浓缩温度为60～80℃。

3.根据权利要求1或2所述的cyclo(pro-val)的制备方法：其特征在于：步骤b中，满足以下至少一项：

4.根据权利要求1～3任一项所述的cyclo(pro-val)的制备方法：其特征在于：步骤c中，满足以下至少一项：

5.根据权利要求1～4任一项所述的cyclo(pro-val)的制备方法：其特征在于：步骤d中，满足以下至少一项：

6.根据权利要求1～5任一项所述的cyclo(pro-val)的制备方法：其特征在于：步骤e中，满足以下至少一项：

7.根据权利要求1～6任一项所述的cyclo(pro-val)的制备方法：其特征在于：所述黄水为固态酿造白酒起糟滴窖过程产生黄色或棕黄色的粘稠液体；优选地，所述黄水为酿造五粮浓香型白酒产生的黄水。

8.权利要求1～7任一项所述的制备方法制备的cyclo(pro-val)。

9.权利要求8所述的cyclo(pro-val)在制备ace抑制药物上的用途。

10.权利要求8所述的cyclo(pro-val)在制备降高血压药物上的用途。

技术总结
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及Cyclo(Pro‑Val)的制备方法及用途。为了解决现有Cyclo(Pro‑Val)制备方法原料不易得到、制备工艺复杂的问题，本发明将有机溶剂沉淀、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析和制备色谱等多种分离技术相结合，从成分复杂的黄水中首次分离得到了纯度在95％以上的Cyclo(Pro‑Val)。本发明制备方法简便，成本低、产品纯度高，开发了黄水的资源化利用途径。而且本发明通过评价Cyclo(Pro‑Val)对血管紧张素转化酶(ACE)的抑制活性，提供了Cyclo(Pro‑Val)在辅助降血压药物开发方面的新用途。

技术研发人员：廖勤俭,郭艳,胡娇,郑佳,苏建,王芳,周韩玲,罗珠,李松柏,杨紫丹
受保护的技术使用者：宜宾五粮液股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23