使用微滴式PCR系统的多重荧光测量的制作方法

背景技术：

1、微滴式数字pcr(ddpcr)是用于检测和定量核酸靶标的有用方法。使用标记的寡核苷酸探针能够对乳液(即微滴)中存在的靶标进行特异性检测。然而，ddpcr在单个反应中可以测量的靶标数目有限。目前的多重ddpcr技术仅限于在单个反应中使用两个不同的颜色通道测量两个靶标。

技术实现思路

1、本文公开了通过使用单个光通道实现多个靶标的检测，用于增加可在单个数字测定(例如，数字pcr、ddpcr等)中测量的靶标数目的方法和组合物。在一些情况下，使用单个光通道检测三个、四个或更多个靶标。这是对现有数字多重化技术的关键改进。

2、在一些方面，本文提供了用于进行数字测定的方法，其包括：(a)将以下划分到多个分区中：(i)三个或更多个核酸靶标，和(ii)包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针的核酸探针集；(b)扩增所述分区中的所述三个或更多个核酸靶标；(c)由所述核酸探针集生成n个信号，所述n个信号中的每一个对应于在所述多个分区的分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在；以及(d)在单个光通道中检测所述n个信号；其中在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约x，所述第二核酸探针的浓度为至少约2x，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4x。在一些实施方案中，n为3或更大。在一些实施方案中，n为4或更大。在一些实施方案中，所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针。在一些实施方案中，在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8x。在一些实施方案中，所述n个信号中的每一个对应于荧光强度水平。在一些实施方案中，所述n个信号由所述核酸探针集生成。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。在一些实施方案中，所述扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述扩增包括线性扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括核酸延伸反应。

3、在一些方面，本文提供了用于进行数字测定的方法，其包括：(a)将以下划分到多个分区中：(i)三个或更多个核酸靶标，和(ii)包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针的核酸探针集；(b)扩增所述分区中的所述三个或更多个核酸靶标；(c)由所述核酸探针集生成n个信号，所述n个信号中的每一个对应于在所述多个分区的分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在；以及(d)在单个光通道中检测所述n个信号；其中在(a)中，所述第一核酸探针具有约y的强度水平，所述第二核酸探针具有至少约2y的强度水平，并且所述第三核酸探针具有至少约4y的强度水平。在一些实施方案中，所述第一核酸探针包含具有约y的强度水平的一个荧光团，所述第二核酸探针包含各自具有约y的强度水平的至少两个荧光团，并且所述第三核酸探针包含各自具有约y的强度水平的至少四个荧光团。在一些实施方案中，所述第一核酸探针包含具有约y的强度水平的荧光团，所述第二核酸探针包含具有至少约2y的强度水平的荧光团，并且所述第三核酸探针包含具有至少约4y的强度水平的荧光团。在一些实施方案中，n为3或更大。在一些实施方案中，n为4或更大。在一些实施方案中，所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针。在一些实施方案中，所述第四核酸探针具有8x的强度水平。在一些实施方案中，所述第四核酸探针包含具有至少约8x的强度水平的荧光团。在一些实施方案中，所述n个信号中的每一个对应于荧光强度水平。在一些实施方案中，所述n个信号由所述核酸探针集生成。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。在一些实施方案中，所述扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述扩增包括线性扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括核酸延伸反应。

4、在一些方面，本文提供了用于进行数字测定的方法，其包括：(a)将三个或更多个核酸靶标划分到多个分区中；(b)扩增分区中的所述三个或更多个核酸靶标；(c)生成n个信号，所述n个信号中的每一个对应于在所述多个分区的分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在；以及(d)在单个光通道中检测所述信号。在一些实施方案中，n为3或更大。在一些实施方案中，n为4或更大。在一些实施方案中，所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述n个信号中的每个信号对应于荧光强度水平。在一些实施方案中，(a)进一步包括将包含三个或更多个核酸探针的核酸探针集划分到多个分区中。在一些实施方案中，所述n个信号由所述核酸探针集生成。在一些实施方案中，所述核酸探针集各自包含一个或多个荧光团。在一些实施方案中，在(a)中提供的所述核酸探针集的浓度使得所述n个信号中的每一个对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每个核酸探针包含不同数目的荧光团，使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。在一些实施方案中，(a)中所述核酸探针集中的每个核酸探针以不同的浓度提供。在一些实施方案中，所述核酸探针集包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针。在一些实施方案中，在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约x，所述第二核酸探针的浓度为至少约2x，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4x。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8x。在一些实施方案中，在(a)中，所述第一核酸探针包含一个荧光团，所述第二核酸探针包含至少两个荧光团，并且所述第三核酸探针包含至少四个荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针包含至少六个荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含相同的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每一个包含不同的荧光团。在一些实施方案中，所述扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述扩增包括线性扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括核酸延伸反应。

5、在一些方面，本文提供了进行数字测定的方法，其包括：(a)在多个微滴中扩增来自样品的至少三个核酸靶标，所述多个微滴包含核酸探针集，所述核酸探针集包含用能够在单个光通道中检测的荧光团标记的三个或更多个核酸探针，其中每个核酸探针与所述至少三个核酸靶标中的靶标互补；(b)如果存在所述至少三个核酸靶标中的一个或多个，则从所述多个微滴检测n个信号，其中所述n个信号中的每一个对应于在所述微滴中存在的所述至少三个核酸靶标中的一个或多个的独特组合；以及(c)从所述n个信号确定所述样品中所述至少三个核酸靶标中的每一个的存在或不存在。在一些实施方案中，n为3或更大。在一些实施方案中，n为4或更大。在一些实施方案中，所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。在一些实施方案中，所述n个信号中的每一个对应于荧光强度水平。在一些实施方案中，所述n个信号由所述核酸探针集生成。在一些实施方案中，(a)中提供的所述核酸探针集的浓度使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。在一些实施方案中，所述核酸探针集中的每个核酸探针包含不同数目的荧光团，使得所述信号对应于所述分区中所述三个或更多个核酸靶标中的核酸靶标的独特组合的存在。在一些实施方案中，所述核酸探针集包含第一核酸探针、第二核酸探针和第三核酸探针。在一些实施方案中，在(a)中，所述第一核酸探针的浓度为约x，所述第二核酸探针的浓度为至少约2x，并且所述第三核酸探针的浓度为至少约4x。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8x。在一些实施方案中，所述第一核酸探针包含具有约x的强度水平的荧光团，所述第二核酸探针包含具有至少约2x的强度水平的荧光团，并且所述第三核酸探针包含具有至少约4x的强度水平的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针，并且其中在(a)中，所述第四核酸探针包含具有至少约8x的强度水平的荧光团。在一些实施方案中，所述核酸探针集各自包含一个或多个荧光团。在一些实施方案中，所述荧光团是相同的荧光团。在一些实施方案中，所述荧光团是不同的荧光团。在一些实施方案中，所述扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述扩增包括线性扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括核酸延伸反应。

技术特征：

1.一种用于进行数字测定的方法，其包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中n为3或更大。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中n为4或更大。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述三个或更多个核酸靶标是四个或更多个核酸靶标。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述核酸探针集进一步包含第四核酸探针。

6.根据权利要求5所述的方法，其中在(a)中，所述第四核酸探针的浓度为至少约8x。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述n个信号中的每一个对应于荧光强度水平。

8.一种用于进行数字测定的方法，其包括：

9.一种用于进行数字测定的方法，其包括：

10.一种进行数字测定的方法，其包括：

技术总结
本公开内容提供了用于在数字测定中检测单个光通道中的多个核酸靶标的方法和组合物。在一些情况下，可以在单个通道中检测三个或更多个核酸靶标。核酸靶标可以被分区、扩增、用于生成信号，其中每个信号对应于分区中核酸靶标的独特组合。

技术研发人员：阿迪蒂亚·拉贾戈帕
受保护的技术使用者：克罗玛科德公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23