合成羟基四氢嘧啶的重组大肠杆菌及其应用
本发明涉及合成羟基四氢嘧啶的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程及生物工程。
背景技术：
1、羟基四氢嘧啶(5-hydroxyectoine)是四氢嘧啶的衍生物，除了具有四氢嘧啶相似的作用之外，5-羟基四氢嘧啶的羟基基团具有更强的分子间氢键，表现出更大的极性和更好的溶解性；它还对细胞内的大分子物质具有更强的保护作用，能够补偿蛋白质表面失水，并具有显著的应力保护和功能保持特性，尤其在干燥保护和耐热特性方面；此外，羟基四氢嘧啶还可防止蛋白质和其他不稳定的大分子结构因环境胁迫而发生错误折叠或变性等功能。作为一种高附加值的保护剂，羟基四氢嘧啶在生物保护、化妆品、临床医学等多个领域展现出了巨大的应用潜力，商业需求持续增长。
2、羟基四氢嘧啶以l-天冬氨酸为前体，经过天冬氨酸激酶的磷酸化形成l-天冬氨酸-4-磷酸，然后由天冬氨酸半醛脱氢酶催化l-天冬氨酸-4-磷酸生成l-天冬氨酸-β-半醛；l-天冬氨酸-β-半醛由二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶ectb催化形成l-2,4-二氨基丁酸，再由l-2,4-二氨基丁酸乙酰基转移酶ecta催化进一步形成n(γ)-乙酰基二氨基丁酸；四氢嘧啶合酶ectc催化n(γ)-乙酰基二氨基丁酸形成四氢嘧啶，最后由四氢嘧啶羟化酶ectd将四氢嘧啶羟基化成5-羟基四氢嘧啶，该酶需要fe2+/α-酮戊二酸作为辅因子催化，而α-酮戊二酸用于发酵存在成本高，不利于工业化的缺陷。5-羟基四氢嘧啶的工业生产法——“细菌泌乳法”主要由嗜盐微生物如halomonas elongata通过响应渗透胁迫而产生。这是一个繁琐的过程，尽管高浓度nacl的培养条件可有助于防止非极端微生物污染，但同时也存在局限性，例如培养条件极端、过程控制复杂、低产率等。因此，需要通过代谢改造构建新的大肠杆菌，以高效合成5-羟基四氢嘧啶。
技术实现思路
1、本发明提供了能够合成羟基四氢嘧啶的重组细胞，在出发菌株的基因组上整合了来源于伸长盐单胞菌(halomonas elongata)的天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd和天冬氨酸激酶基因lysct311i，并使用游离质粒表达羟基四氢嘧啶合成关键基因，并将suca基因的天然启动子替换为生长期依赖性启动子。
2、在一种实施方式中，以大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株。
3、在一种实施方式中，所述羟基四氢嘧啶合成关键基因包括来源于维氏盐单胞菌(halomonas venusta)来源的四氢嘧啶合成基因簇ectabc和来源于伸长盐单胞菌(halomonas elongata)来源的四氢嘧啶羟化酶基因ectd。
4、在一种实施方式中，所述维氏盐单胞菌(halomonas venusta)来源的四氢嘧啶合成基因簇中，基因ecta具有如gene id:77015291所示的核苷酸序列，基因ectb具有如geneid：77015290所示的核苷酸序列，基因ectc具有如gene id：77015289所示的核苷酸序列。
5、在一种实施方式中，所述四氢嘧啶合成基因簇中的ectb基因编码的酶的第407位由谷氨酸突变成天冬氨酸。
6、在一种实施方式中，所述重组细胞还敲除了iclr基因，强化了乙醛酸循环，增加乙酰辅酶a的供应和前体物质草酰乙酸的积累以提高工程菌株的四氢嘧啶合成能力。
7、在一种实施方式中，所述来源于伸长盐单胞菌(halomonas elongata)的asd基因整合在基因组mota位点上。
8、在一种实施方式中，所述天冬氨酸激酶基因lysct311i基因整合在基因组chew位点上。
9、在一种实施方式中，以prsfduet-1为载体，表达四氢嘧啶合成基因簇ectabc或ectectabe407dc_hv。
10、在一种实施方式中，以pcdfduet-1为载体，表达四氢嘧啶羟化酶基因ectd。
11、在一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株，在基因组上mota位点整合了天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd_he，并在chew位点上整合天冬氨酸激酶基因lysct311i_cg，敲除了iclr基因，并用游离质粒prsfduet-1表达羟基四氢嘧啶合成关键基因ectabe407dc，并用pcdfduet-1质粒表达四氢嘧啶羟化酶基因ectd_he，并将suca基因的天然启动子替换为启动子prpstp1。
12、在一种实施方式中，所述基因ectabc_hv的核苷酸序列如seq id no.1所示。
13、在一种实施方式中，所述基因ectd_he的核苷酸序列如seq id no.2所示。
14、在一种实施方式中，所述基因asd_he的核苷酸序列如seq id no.3所示。
15、在一种实施方式中，所述基因lysct311i_cg的核苷酸序列如seq id no.4所示。
16、在一种实施方式中，所述基因ectbe407d_hv的核苷酸序列如seq id no.5所示。
17、在一种实施方式中，所述基因ectabe407dc_hv的核苷酸序列如seq id no.6所示。
18、在一种实施方式中，所述基因iclr的核苷酸序列如seq id no.7所示。
19、在一种实施方式中，所述生长期依赖性启动子包括prpsl启动子、prpstp1启动子或prrncp1启动子。
20、在一种实施方式中，所述prpsl启动子的核苷酸序列如seq id no.8所示。
21、在一种实施方式中，所述prpstp1启动子的核苷酸序列如seq id no.9所示。
22、在一种实施方式中，所述prrncp1启动子的核苷酸序列如seq id no.10所示。
23、本发明还提供了所述大肠杆菌工程菌在生产羟基四氢嘧啶中的应用。
24、在一种实施方式中，所述应用是将所述大肠杆菌工程菌在不添加α-酮戊二酸的培养基中发酵。
25、在一种实施方式中，所述方法发酵至少48h。
26、在一种实施方式中，所述发酵是在5-l以上规模的发酵罐上进行，发酵时间≥60h；可选地，发酵60-72h。
27、在一种实施方式中，将培养至对数生长期的菌液接种至发酵培养基中，接种后培养至对数中期(发酵罐条件下od600≥40)，加入iptg诱导剂，控制ph为7.0±0.1。
28、在一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，在35～37℃下培养至对数中期，加入终浓度为0.2mm的iptg，在28～30℃诱导，从接种至发酵培养基算起发酵至少60h。
29、在一种实施方式中，所述应用是将所述大肠杆菌工程菌在37℃、220r/min培养10h，获得种子液，再按照4％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，于37℃，220r/min培养3h(od600达0.7±0.1)，加入终浓度为0.2mm的iptg，在30℃，220r/min下诱导和进行羟基四氢嘧啶的合成。
30、在一种实施方式中，用于种子培养的培养基为lb培养基，含有：酵蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l。
31、在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：酵母粉7g/l、(nh4)2so4 7.5g/l、kh2po42g/l、k2hpo4.3h2o 3g/l、mgso4.7h2o 1g/l、柠檬酸1g/l、维生素b1 0.1g/l、甘油10g/l、麦芽糖糊精10g/l和葡萄糖10g/l。
32、在一种实施方式中，发酵过程还进行补料；所述补料是补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖浓度为0.1～1g/l。
33、本发明还提供所述大肠杆菌工程菌或所述方法在生产羟基四氢嘧啶的产品中的应用。
34、有益效果：
35、(1)本发明以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，通过过表达羟基四氢嘧啶合成关键基因包括维氏盐单胞菌来源的ectabc和伸长盐单胞菌来源的ectd，构建了具有高效的羟基四氢嘧啶合成能力的大肠杆菌。
36、(2)本发明通过引入ectbe407d和激活乙醛酸循环，增强前体碳通量和辅因子乙酰辅酶a的供应，并将suca天然启动子替换成生长期依赖性启动子，使构建的合成羟基四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌能够通过感知特殊的细胞生理条件来动态重定向α-酮戊二酸节点处的碳通量分布，实现菌体生长和5-羟基四氢嘧啶合成所需的α-酮戊二酸的平衡。所构建菌株可以在不添加α-酮戊二酸的发酵条件下，实现羟基四氢嘧啶的高效合成，在摇瓶产量可提升至3.4±0.2g/l，将得到的大肠杆菌工程菌株使用5-l发酵罐诱导发酵60h，od600达到82.7±1.3，产量达到58.0±1.4g/l，具有重要的工业应用价值。
技术特征：
1.合成羟基四氢嘧啶的基因工程菌，其特征在于，在出发菌株的基因组上整合了来源于伸长盐单胞菌(halomonas elongata)的天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd和天冬氨酸激酶基因lysct311i，并使用游离质粒表达羟基四氢嘧啶合成关键基因，并将suca基因的天然启动子替换为生长期依赖性启动子；所述生长期依赖性启动子包括prpsl启动子、prpstp1启动子或prrncp1启动子。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述羟基四氢嘧啶合成关键基因包括来源于维氏盐单胞菌(halomonas venusta)来源的四氢嘧啶合成基因簇ectabc和来源于伸长盐单胞菌(halomonas elongata)来源的四氢嘧啶羟化酶基因ectd。
3.根据权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述四氢嘧啶合成基因簇中的ectb基因编码的酶的第407位由谷氨酸突变成天冬氨酸。
4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，还降低了iclr基因的表达。
5.根据权利要求1～4任一所述的基因工程菌，其特征在于，所述asd基因整合在基因组mota位点上和/或所述天冬氨酸激酶基因lysct311i基因整合在基因组chew位点上。
6.根据权利要求1～5任一所述的基因工程菌，其特征在于，以prsfduet-1为载体，表达四氢嘧啶合成基因簇ectabc或ectectabe407dc_hv。
7.根据权利要求1～6任一所述的基因工程菌，其特征在于，以pcdfduet-1为载体，表达四氢嘧啶羟化酶基因ectd。
8.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，在基因组上mota位点整合了天冬氨酸半醛脱氢酶基因asd_he，并在chew位点上整合天冬氨酸激酶基因lysct311i_cg，敲除了iclr基因，并用游离质粒prsfduet-1表达羟基四氢嘧啶合成关键基因ectabe407dc，并用pcdfduet-1质粒表达四氢嘧啶羟化酶基因ectd_he，并将suca基因的天然启动子替换为启动子prpstp1。
9.根据权利要求1～8任一所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌bl21(de3)为出发菌株。
10.权利要求1～9任一所述的基因工程菌在生产羟基四氢嘧啶中的应用。
11.一种发酵生产羟基四氢嘧啶的方法，其特征在于，将权利要求1～9任一所述的基因工程菌在发酵培养基中培养一段时间，用iptg诱导。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，将培养至对数生长期的菌液接种至发酵培养基中，接种后培养至对数中期，用iptg诱导，发酵至少48h。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，发酵过程还进行补料；所述补料是补加葡萄糖，使发酵体系中的葡萄糖浓度为0.1～1g/l。
14.权利要求1～9任一所述的基因工程菌或权利要求11～13任一所述方法在生产羟基四氢嘧啶的产品中的应用。
技术总结
本发明公开了合成羟基四氢嘧啶的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中过表达羟基四氢嘧啶合成相关基因，构建5‑羟基四氢嘧啶生物合成途径，并过表达途径中的强化基因以调节胞内代谢通路，并将sucA天然启动子替换成生长期依赖性启动子，以重新动态分布α‑酮戊二酸节点的代谢通量，平衡细胞生长和羟基四氢嘧啶生产之间的需求，并优化5‑羟基四氢嘧啶生物合成的碳源使用。使构建的重组大肠杆菌摇瓶发酵产量达到3.4±0.2g/L，5‑L发酵罐上发酵产量达到58.0±1.4g/L，在大肠杆菌中实现了异源的、无需高盐诱导的羟基四氢嘧啶的高效合成。
技术研发人员：徐沙,周景文,曾伟主,李莉红
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23