一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法

ccd和u-hglgps光源的荧光显微镜，分别在红色、绿色、蓝色和青色的通道下，曝光时间为100ms，测量分生孢子的自发光荧光强度，以灰度值表示，筛选出具有自发荧光强度特性的菌种；
10.s3、分生孢子的荧光光谱测定：以步骤2筛选出的菌种为对象，取0.1～0.3g 其固体分生孢子，分别在激发光em＝455nm的波长为300-430nm，发射光ex＝ 375nm的波长为400-700nm的范围内进行荧光光谱扫描，根据自发荧光峰值的荧光强度判断橡胶树白粉菌。
11.进一步说明，步骤s1中，所述分生孢子的收集包括采集和/或培养方法。
12.进一步说明，步骤s2中，所述孢子悬浮液的浓度为105cfu/ml。
13.进一步说明，步骤s2中，自发荧光的强度是采用imagej软件以灰度值表示，筛选具有自发荧光强度特性的菌种的灰度值大于10。
14.进一步说明，步骤s3中，所述荧光光谱扫描的速度为1200nm/min，狭缝宽度为10nm，光电倍增管电压为400v pmt。
15.进一步说明，步骤s3中，橡胶树白粉菌在波长为300-430nm的激发光谱中的自发荧光强度的峰位与峰值为373nm，1813.2a.u,与其他种类白粉菌激发光谱相比具有强度上的特异性。
16.进一步说明，步骤s3中，橡胶树白粉菌在波长为400-700nm的发射光谱中的自发荧光强度的峰位与峰值为373nm，1927.2a.u,与其他种类白粉菌发射光谱相比具有强度上的特异性。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
18.本发明首次利用自发荧光强度联合荧光光谱特性，利用显微观察与光谱测定，从微观的分生孢子荧光强度观察到定量的固体孢子光谱扫描，对橡胶树白粉菌进行区分与鉴别，有效提高鉴别的准确性和效率。
19.经本发明实验结果发现，橡胶树白粉菌分生孢子自发荧光，在强度上具有一定的特异性，在不同的荧光通道下产生了明显强于其他白粉菌分生孢子的自发荧光现象，同时，通过光谱发射峰强度，利用其光谱特异性，实现了橡胶树白粉菌准确快速的鉴别。
20.本发明在实际应用中，采集方式可多样化，采集到的样品可无需分离与纯培养，无需预富集，样品来源方式不限定于在实验室条件下，可直接从野外发病叶片表面或空气中采集，无需依靠诱导产生特定的真菌结构，有效解决了传统形态学于基因层面鉴别手段所面临的分生孢子形态相似，因专性寄生而导致的难以离体纯培养、样本不易收集等难题，弥补传统形态学鉴定的不足。
21.本发明的鉴别方法直观、高效且准确度高，样品需求量小，尤其对于橡胶树白粉菌以及其他种类白粉菌的难以培养的专性寄生菌来说，少量的分生孢子即可满足鉴别需要。
22.本发明通过构建橡胶树白粉菌分生孢子鉴别技术，并选取最佳的参数设置，达到了预期的效果，为橡胶树白粉病预测预报与病害防控提供有力支撑。
附图说明
23.图1为本发明实施例的不同植物病原真菌的分生孢子在不同荧光通道下的自发荧光显微观察图；
24.图2为本发明实施例的不同植物病原真菌的分生孢子自发荧光强度比较分析图；a
为3种白粉菌分生孢子的自发荧光强度比较；b为3种橡胶树病原真菌分生孢子的自发荧光强度比较；
25.图3为本发明实施例的具有自发荧光特性的菌种的荧光光谱图，a为激发 光谱，b为发射光谱；图4为本发明实施例的橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别流程图。
具体实施方式
26.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
27.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
28.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.在实际应用中，本发明所使用的白粉菌分生孢子的培养方法、收集方式、该过程使用的材料等不局限于特定的方式和品牌，例如，孢子可以从空气中捕捉，接种于培养基中产孢，从发病部位采集等，且无需过滤、洗涤与调整浓度。
30.实施例1-收集橡胶树的致病真菌和/或白粉菌的分生孢子：
31.将橡胶树白粉菌(erysihequercicola)接种于古铜期橡胶叶片培养并收集，将其他致病真菌分别接种于pad4突变型拟南芥叶片和豇豆叶片表面并培养并收集；或接种于pda培养基于28℃下培养三天后刮去菌丝，放置于光照条件下诱导产孢。
32.将所有分生孢子用无菌水悬浮后，过滤，以去除菌丝等杂质；然后，离心3 分钟，去除上清液，洗涤三次，使用无菌水将孢子悬浮液的浓度稀释至1
×
10
5 cfu/ml，备用。
33.实施例2-分生孢子的荧光强度测量
34.将实施例1所配置成浓度为105cfu/ml的分生孢子悬浮液，滴加于玻璃载玻片上，使用配备dp80 ccd和u-hglgps光源的olympus bx53荧光显微镜，分别在红色(rfp)、绿色(gfp)、蓝色(dapi)和青色(cfp)四个通道下，曝光时间为100ms，测量分生孢子的自发光荧光强度，采用imagej计算荧光强度，以灰度值表示，筛选出具有自发荧光强度特性的菌种(灰度值大于10)。
35.实施例3-分生孢子的荧光光谱表征
36.根据实施例2的分生孢子荧光特异性检测结果，以实施例2筛选出的菌种为对象，取其培养了14-21天的3种新鲜固体菌种各0.1g，并使用f-7000荧光光谱仪配套的固体粉末夹固定采集到的孢子。
37.进行荧光光谱扫描，孢子的激发光谱(em＝455nm)和发射光谱(ex＝375 nm)分别在300-430nm和400-700nm范围内扫描，扫描速度为1200nm/min，狭缝宽度为10nm，光电倍增管电压为400v pmt。每个样品测量5次后取平均值，根据自发荧光峰值的荧光强度判断橡胶树白粉菌，橡胶树白粉菌在波长为 300-430nm的激发光谱中的自发荧光强度的峰值为373nm，1813.2a.u；橡胶树白粉菌在波长为400-700nm的发射光谱中的自发荧光强度的峰位与峰值为 373nm，1927.2a.u。
38.实施例4-橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法
39.(1)植物病原真菌分生孢子的收集：
40.以橡胶树白粉菌(erysihequercicola)、二孢白粉菌(erysihecichoracearum)、叉丝单囊(podosphaerahibiscicola)壳白粉菌、暹罗炭疽菌(colletotrichumtropicale)和
可可毛色二孢菌(lasiodiplodia theobromae)作为实验对象。
41.将橡胶树白粉菌(erysihequercicola)接种于古铜期橡胶叶片培养并收集，作为白粉菌类对照的二孢白粉菌(erysihecichoracearum)与叉丝单囊 (podosphaerahibiscicola)壳白粉菌分别接种于pad4突变型拟南芥叶片和豇豆叶片表面并培养并收集。
42.同为橡胶树叶部病害的暹罗炭疽菌(colletotrichum tropicale)和可可毛色二孢菌(lasiodiplodia theobromae)接种于pda培养基于28℃下培养三天后刮去菌丝，放置于光照条件下诱导产孢。
43.将上述收集到的所有分生孢子用无菌水悬浮后通过miracloth滤布(merckkgaa，孔径22-25μm，germany)过滤以去除菌丝等杂质；然后以10,000rpm 速度离心3分钟去除上清液，洗涤三次后，使用无菌水将孢子悬浮液的浓度稀释至1
×
105cfu/ml，备用。
44.(2)植物病原真菌分生孢子荧光特异性观察
45.利用橡胶树白粉菌自发荧光特异性可实现鉴别。取步骤(2)采集并配置的孢子悬浮液，在玻璃载玻片上滴加10-20μl分生孢子悬浮液，使用配备dp80 ccd和u-hglgps光源的olympus bx53荧光显微镜，分别在红色(rfp)、绿色(gfp)、蓝色(dapi)和青色(cfp)四个通道下，观察并拍摄用于荧光强度计算的分生孢子自发荧光图片，实现对橡胶树白粉菌(e.quercicola)、二孢白粉菌(e.cichoracearum)、叉丝单囊壳白粉菌(p.hibiscicola)、暹罗炭疽菌(c.tropicale)以及可可毛色二孢菌(l.theobromae)的分生孢子在4个通道下的自发荧光显微观察，曝光时间为100ms，并采用imagej以灰度值表示荧光强弱，计算统计荧光强度，如图1所示。
46.每种真菌的分生孢子自发荧光强度测量包含三个生物学重复，每个生物学重复包含10个单孢子的荧光强度并平均化，筛选出具有自发荧光特性的菌种。
47.结果如图1，橡胶树白粉菌(e.quercicola)，暹罗炭疽菌(c.siamense) 以及可可毛色二孢菌(l.theobromae)均为侵染橡胶树的致病真菌，具有相同寄主与生理环境。但暹罗炭疽菌(c.siamense)与可可毛色二孢菌(l.theobromae) 的孢子并没有显示出可视化的自发荧光现象，而橡胶树白粉菌(e.quercicola) 分生孢子显示出了明显较强的自发荧光。
48.橡胶树白粉菌(erysihequercicola)、二孢白粉菌(e.cichoracearum)、叉丝单囊壳白粉菌(p.hibiscicola)的3种白粉菌均显示除了一定的自发荧光现象，表明自发荧光可能是白粉菌所共有的特性。此外，虽然3种白粉菌的形态极为相似，但橡胶树白粉菌(e.quercicola)具有明显的较强的自发荧光，是与其他两种白粉菌相互区分的明显标志。
49.如图2所示，为了更好地反应其强度情况，本发明对自发荧光的强度在 imagej软件中进行了统计，并以灰度值表示。其中，肉眼无法观察到灰度值低于10的孢子自发荧光，因此，筛选具有自发荧光特性的灰度值大于10的菌种进行下一步的荧光光谱表征(橡胶树白粉菌(erysihequercicola)、二孢白粉菌 (e.cichoracearum)、叉丝单囊壳白粉菌(p.hibiscicola))。
50.其中，图中小写字母代表95％差异水平，大写字母代表99％差异水平，具有相同字母的数据不具有显著性差异。
51.(3)橡胶树白粉菌荧光光谱表征
52.利用橡胶树白粉菌的荧光光谱特征实现种水平上的鉴别。根据步骤(2)的自发荧
光显微观察结果，以橡胶树白粉菌(erysihequercicola)、二孢白粉菌 (e.cichoracearum)、叉丝单囊壳白粉菌(p.hibiscicola)为实验对象，相应采集并培养了14-21天的该3种新鲜白粉菌各0.1g，并使用f-7000荧光光谱仪配套的固体粉末夹固定采集到的孢子。
53.对3种白粉菌的进行荧光光谱扫描。孢子的激发光谱(em＝455nm)和发射光谱(ex＝375nm)分别在300-430nm和400-700nm范围内扫描，扫描速度为1200nm/min，狭缝宽度为10nm，光电倍增管电压为400v pmt。每个样品测量5次后取平均值。
54.结果如图3所示，3种白粉菌分生孢子的荧光光谱均显示出了明显的峰值，在它们的激发光谱中，360-375nm范围内具有相近的最大激发波长；在它们的发射光谱中，458-463nm范围内具有极为相近的最大发射波长。值得注意的是，橡胶树白粉菌具有明显的高强度自发荧光峰值，这表明了与步骤2中的测定结果相符，橡胶树白粉菌的自发荧光具有特异性，且明显强于其他两种白粉菌。此外，叉丝单囊壳白粉菌在487nm显示出了明显的不同发射光谱趋势，而不仅仅是在强度上与其他两种白粉菌有区别。橡胶树白粉菌erysihequercicola在波长为300-430nm的激发光谱中的自发荧光强度的峰位与峰值为373nm，1813.2 a.u；橡胶树白粉菌在波长为400-700nm的发射光谱中的自发荧光强度的峰位与峰值为373nm，1927.2a.u。
55.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于：包括如下步骤：s1、收集橡胶树的致病真菌和/或白粉菌的分生孢子；s2、分生孢子的荧光强度测量：将收集的分生孢子制成孢子悬浮液，使用配备dp80 ccd和u-hglgps光源的荧光显微镜，分别在红色、绿色、蓝色和青色的通道下，测量分生孢子的自发光荧光强度，以灰度值表示，筛选出具有自发荧光强度特性的菌种；s3、分生孢子的荧光光谱测定：以步骤2筛选出的菌种为对象，取其0.1～0.3g固体分生孢子，分别在激发光em＝455nm的波长为300-430nm，发射光ex＝375nm的波长为400-700nm的范围内进行荧光光谱扫描，根据自发荧光峰值的荧光强度判断橡胶树白粉菌。2.如权利要1所述的一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于：步骤s1中，所述分生孢子的收集包括采集和/或培养方法。3.如权利要1所述的一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于：步骤s2中，所述孢子悬浮液的浓度为105cfu/ml。4.如权利要1所述的一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于：步骤s2中，自发荧光的强度是采用imagej软件以灰度值表示，曝光时间为100ms，筛选具有自发荧光强度特性的菌种的灰度值大于10。5.如权利要1所述的一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于：步骤s3中，所述荧光光谱扫描的速度为1200nm/min，狭缝宽度为10nm，光电倍增管电压为400v pmt。6.如权利要1所述的一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于：步骤s3中，橡胶树白粉菌在波长为300-430nm的激发光谱中的自发荧光强度的峰位与峰值为373nm，1813.2a.u。7.如权利要1所述的一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，其特征在于：步骤s3中，橡胶树白粉菌在波长为400-700nm的发射光谱中的的自发荧光强度的峰位与峰值为373nm，1927.2a.u。

技术总结
本发明提供一种橡胶树白粉菌分生孢子快速鉴别方法，包括：(1)收集分生孢子；(2)将分生孢子制成孢子悬浮液，分别在红色、绿色、蓝色和青色的通道下测量分生孢子的自发光荧光强度，以灰度值表示，筛选具有自发荧光强度特性的菌种；(3)以步骤2筛选出的菌种为对象，在激发光Em＝455nm的波长为300-430nm，发射光Ex＝375nm的波长为400-700nm内荧光光谱扫描，根据自发荧光峰值的荧光强度判断橡胶树白粉菌，本发明利用橡胶树白粉菌不同荧光通道的显微观察与荧光光谱结合，对橡胶树白粉菌实现快速准确的识别与鉴定，为橡胶树白粉病预测预报与病害防控提供有力支撑。害防控提供有力支撑。害防控提供有力支撑。


技术研发人员：缪卫国 徐鑫泽 刘文波 施泽坤
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2022.09.01
技术公布日：2023/1/6