诊断败血症或败血症风险的方法
诊断败血症或败血症风险的方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求2013年8月7日提交的美国临时专利申请序列No.61/863,266的权益， 所述申请的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0002] 本发明根据化087088、化018208和化094797(每个由美国国立卫生研究院授予)在 政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
[0003] 公开了诊断败血症或败血症风险的方法，W及治疗患者的败血症的方法。还公开 了辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法，W及治疗患者的SIRS的方法。
[0004] 背景
[000引严重败血症，一种对与急性器官功能障碍相关的感染的全身炎性反应，是儿童和 成人中发病率和死亡率的日益增加的原因，并且已成为影响750,000个个体/年的重症护理 中最重大挑战之一，其中死亡率为大约30%(Rittirsch等，"Harmful Molecular Mechanisms in Sepsis/'Nat.Rev.Immunol.8:776-787(2008);Angus等，"Epidemiology of Severe Sepsis in the United States：Analysis of Incidence,Outcome,and Associated Costs of Care/'Crit.Care Med.29:1303-1310(2001))。促炎性信号在败血 症的早期阶段出现，并且允许循环中性粒细胞进入炎症部位并吞隧外来病原体和坏死/调 亡细胞。蛋白水解酶，诸如弹性蛋白酶和和髓超氧化物酶(MP0)存储在中性粒细胞内的嗜苯 胺蓝顆粒中，并响应于被感染部位的多种机械、热和化学刺激而释放。中性粒细胞还产生活 性氧物质诸如过氧化氨、超氧化物和一氧化氮(化than,C.，"Neu化ophiIs and Immunity: Qiallenges and 0卵ortunities /'Nat .Rev. Immunol .6:173-182(2006))。虽然运些炎性介 质对于宿主防御是重要的，但它们也参与内皮和血管外宿主组织损伤（Nathan，C.， "Neutrophils and Immunity ：Challenges and Opportunities，''Nat.Rev. Immunol.6: 173-182(2006))。因此，在不受控制的炎性病症诸如败血症中，在此期间，许多中性粒细胞 在内皮界面和在下面的组织中变得具有活性，过盛的炎性活性导致进一步的微血管功能障 碍和组织损伤（Brown等，"Neutrophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepsis/'Lancet 368:157-169(2006))。许多报道已记录极度活跃的中性粒细胞在内脏器 官的微脉管系统中隔离是多器官衰竭的主要促成因素，此为败血症的重要特点（Brown等， "Neutrophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepsis/'Lancet 368： 157-169(2006);Suda等，"Neutrophil Elastase Inhibitor Improves SurviVal of Rats With Clinically Relevant Sepsis/'Shock 33:526-531(2010);Kovach等，"The F^mction of Neuhophils in Sepsis,"Curr.Opin.Infect.Dis.25(3):321-7(2012))0因 此，中性粒细胞募集可作为败血症中的双刃剑。
[0006]治疗介入要求全身炎性病症过程中白细胞转运步骤的机械知识。还需要用于诊断 败血症，辨别败血症和全身炎性反应综合症和治疗败血症的精确方法。本申请针对克服本 领域的运些和其它不足。
[0007] 概要
[0008] -方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。该方法包括检测受试者 中具有升高的整合素 VLA-3(CD49c/CD29)表达水平的中性粒细胞亚群的存在，借此中性粒 细胞亚群的存在表明受试者患有败血症或具有败血症风险。
[0009] 第二方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。该方法包括使来自受 试者的生物样本与特异性结合至生物样本中的整合素 VLA-3(CD49c/CD29)的试剂接触;检 巧肉生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂；W及测定生物样本中整合素 VLA-3的表达水 平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，生物样本中升高水平的整合素 VLA-3表明受试者 患有败血症或处于发展败血症的风险。
[0010] 第Ξ方面设及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法。该方法包括检测 患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素 VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群的存在或不 存在，借此中性粒细胞亚群的存在表明受试者患有败血症，而中性粒细胞亚群的不存在表 明受试者患有SIRS。
[0011] 第四方面设及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法。该方法包括使来 自受试者的生物样本与特异性结合至生物样本中的整合素化A-3(CD49c/CD29)的试剂接 触;检测与生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂；W及测定生物样本中整合素化A-3的表 达水平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，升高水平的整合素 VLA-3表明受试者患有败 血症，而相对于整合素化A-3的对照水平，没有升高水平的整合素化A-3表明受试者患有 SIRS。
[0012] 中性粒细胞向感染部位的迁移对于病原体清除W及因此宿主存活至关重要。细胞 表面整合素与其对应物配体的相互作用导致循环中性粒细胞粘附并定向迁移至感染部位。 因此，整合素的重要作用是使活性中性粒细胞在感染位点聚集，从而确保它们的免疫产物 和活性在该部位保持。然而，败血症期间过度的整合素活性导致大量中性粒细胞浸润到非 感染组织和伴随相关组织损伤的扩大的炎性反应。
[0013] 随附的实施例显示，不同于其它细胞外基质结合整合素，整合素化A-3(CD49c^ CD29)在从人败血症患者和小鼠败血症模型分离的中性粒细胞亚群上显著上调。与Grl胃 CDUb%LA-#粒细胞群相比，来自败血症动物的Grl胃CDUb%LA-3胃细胞显示高炎性表型。 施用VLA-3括抗剂肤和粒细胞中VLA-3表达的条件性消耗显著减少外渗中性粒细胞的数目 并改善败血症小鼠的存活。因此，在随附实施例中提供的结果显示VLA-3是败血症中组织归 巢和高反应性中性粒细胞亚型的独特标志^并且阻断VLA-3代表通过选择性祀向高炎性、快 速组织浸润性中性粒细胞亚型(Grl胃CDUb%LA-3胃)而用于治疗败血症的新治疗方法。通过 使用多光子活体显微镜检查(MP-IVM)，显示通过施用VLA-3括抗剂肤显著减少中性粒细胞 的外渗。因此，经由VLA-3选择性祀向活性、高炎性、快速组织浸润性中性粒细胞亚型(Gr 1胃 CDUb%LA-3胃)会在败血症期间将器官衰竭减至最低。未接触初始细胞，从而避开医源性免 疫抑制，运是在其它抗炎疗法中遇到的主要问题。
[0014] 附图简述
[001引图1A-1C证明整合素 VLA-3在败血症中人中性粒细胞上上调。在图1A中，分离来自 严重非感染性SIRS患者(n = 8,年龄63.5±8.9,病症:C0PD、肺纤维化、呼吸窘迫、鱗状细胞 癌、APCAHE II评分:21±6)、严重败血症患者(n = 6,年龄53.5±15,感染源:肾脏、肺、腹部、 泌尿生殖系统，阳性血液培养:83%，APCAHE II评分:33± 12)和健康供体(η = 5，年龄41 ± 14)的中性粒细胞，并且通过流式细胞术测量整合素的表面表达。结果表示为整合素表达平 均巧光强度(MFI)与相同供体的同种型对照MFI的比率。*p<0.05。图1B显示描绘诊断后在 不同时间点VLA-3表达的强度的直方图。该图代表六名败血症患者中的一名。图1C显示分离 自健康供体的中性粒细胞用PMA( 20ng/ml)、TNF-a (20ng/ml)、LPS(100μg/ml)或fMLP(ΙμΜ) 刺激1小时或3小时。通过RT-PCR测定与未刺激细胞相比VLA-3的基因表达的倍数变化（上 图），并且通过流式细胞术测量其表面表达(下图）。结果表示3个单独供体的平均值±SEM。* p<0.050
[0016] 图2显示整合素 VLA-3在鼠败血症中上调。通过流式细胞术测量败血症小鼠中性粒 细胞上的整合素表达。在所指示的时间点，细胞分离自初始和败血症小鼠的骨髓(BM)、腹腔 灌洗液(PL)和外周血。对于MFI分析，在Grl胃粒细胞上对细胞进行设口。结果表示为相对于 初始对照的MFI的倍数增加(初始血液MFI用于计算PL表达的％变化）。结果代表四只单独动 物/时间点的平均值±561^ ^ ^
[00Π ] 图3A-3C显示Grl胃CD1化胃VLA-3胃中性粒细胞的表型。在图3A中，伪彩色图显示在分 离自健康供体、SIRS和败血症患者的中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-#群体的存在。在图3B中， 细胞分离自化化PS施用后12小时)并用CD1化和Grl抗体染色。将细胞分选为Grl胃和Grl吗立 细胞并在细胞离屯、涂片（cytospin)后用H&E染色。Grl?细胞显示具有环状或多叶核的中性 粒细胞形态，而Grl?细胞具有单核细胞样外观。伪彩色图显示在败血症小鼠的骨髓中Grl胃 CDUb胃成熟中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-#群体的存在。在图3C中，在败血症后12小时和24 小时分离来自初始和化P诱导的败血症小鼠的BM细胞，并在Grl胃CD1化胃粒细胞上设口后分 选为VLA-3胃和VLA-3%田胞(上图）。下图显示确认BM中中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-3%田胞的 存在。将细胞针对日3&(PE)和Ly6G(APC)或Grl(FITC)进行染色。流式细胞术图显示〇3&胃和口3 姑5粒细胞群体的存在。^ ^ ^
[001引图4A-4B显示Grl胃CDUb%LA-3胃中性粒细胞具有促炎性表型。在图4A中，如图3C所 描述对细胞进行分选，并且通过RT-PCR定量IL-6、TNF-a和IL-Ιβ基因表达的差异。柱状图显 示与初始细胞相比的?音数变化。在图4B中，使用生物发光测定来测量分离自化P和内毒素血 症小鼠的ΒΜ的VLA-3胃和VLA-#细胞的髓过氧化物酶(ΜΡ0)活性。将分选的细胞(5χ104个细 胞/孔）用ΡΜΑ(ΙμΜ)在鲁米诺（luminolKlmg/孔）的存在下进行刺激，并且对发光强度进行 成像。线形图化侧)显示VLA-3胃和VLA-3%田胞中MP0活性的动力学，并且示出各自的发光图 像。
[0019]图5A-5的兑明阻断VLA-3改善存活。在图5A和5B中，细胞分离自用对照肤(8祉g/剂， 静脉内）或LXY2(8祉g/剂，静脉内）注射的败血症小鼠（CLP后8小时）的化和肺。LXY2是环状 肤CysD-AspD-Gl}f-Ty;r(3-N〇2)-Gly-4Hyp-Asn-切SD(Yao等，"Discovery of Targeting Ligands for Breast Cancer Cells Using the One-Bead One-Compound Combinatorial Method/'J. Med.化em. 52(1) :126-133(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。抗 Ly6G(或抗Gr-1)和抗CDUb抗体用于对中性粒细胞进行染色。柱状图显示化和肺中中性粒 细胞的总数目（n = 5)。在图5C中，柱状图显示在8小时时内毒素血症动物的化中中性粒细胞 的总数目。在图5D中，为测定Ξ组小鼠的化中的细菌负载，将稀释的样本在TSA血琼脂上划 线，并在37°C下解育24小时后对菌落进行计数(n = 5)。进行化P手术和内毒素血症，并且使 用Kaplan-Meyer log-rank检验分析存活W比较对照（n = 9)与LXY2(n = 9)处理的小鼠。在 图祀中，通过夹屯、ELISA测量化-6的血清水平。该图显示比-6的浓度。*p<0.05。在图5F和5G 中，在静脉内注射对照肤或LXY2(8祉g)后，通过多光子活体显微镜检查(MP-IVM)评估LysM- GFP小鼠的f MLP诱注的睾提肌血管中LXY2对中性粒细胞体内迁移的作用。在图5H中，施用 LXY2的小鼠的fMLP诱注的睾提肌微脉管系统的透射电子显微镜成像。缩写:P = PMN，L =管 腔，Peri =周皮细胞，Endo=内皮细胞。图5A、5B和5E中的结果表示为平均值±561。*口< 0.05。
[0020]图6A-6I显示条件性消耗VLA-3改善存活。在图6A中，通过使表达弹性蛋白酶化la) 启动子中的Cre的小鼠与具有floxed整合素基因的小鼠杂交来实现VLA-3(a3-cK0)和αν(αν- cKO)的条件性消耗(参见方法）。对得自使Ela-Cre和as/avflox小鼠繁殖的幼盧针对杂合基 因表达进行基因分型研究，并且显示flox和突变ere二者均存在的小鼠用于进一步繁殖。通 过突变条带(吐6;18569，日3;42769具有？1/?3，日,;15069)的存在证实整合素基因的缺失。在 图6B中，在分离自LPS注射的WT或cKO小鼠的BM和化的细胞中测量Gr 1胃CDUb胃中性粒细胞中 口3和αν的表面表达。在图6C中，细胞分离自败血症cKO小鼠（CLP后6小时）的化和肺，并且抗 LyGG/Grl和抗CDUb抗体用于对中性粒细胞进行染色。柱状图显示化和肺中中性粒细胞的 总数目（η = 6)。在图6D中，细胞分离自败血症cKO动物（6小时）的I市，并且用Ly6G/Gr 1和 CD1化抗体进行染色W用于流式细胞术。该图显示肺中Ly6G胃CDUb胃细胞的频率。在图6E中， 示出化P后6小时cKO小鼠 （n = 6/组）的化中的细菌负载。在图6F中，使用Kaplan-M巧er log- rank检验分析存活W比较cKO和Ela-化e对照小鼠 η = 12/组。在图6G中，示出如通过化ISA测 量的IL-6的血清水平。该图显示IL-6的浓度（η = 6/组）。在图6H和61中，通过MP-1VM评估 fMLP诱注的睾提肌血管中VLA-3对中性粒细胞体内迁移的影响。Ela-Cre小鼠用作a3-cK0的 对照。对于图抓、6E和6F，结果表示为平均值± SEM。*p < 0.05。
[0021 ] 详述
[0022] 本文描述的第一方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。对于运方 面和其它方面的目的，目标"受试者"涵盖动物，包括任何哺乳动物，尤其是人。在诊断受试 者中的败血症或败血症感染风险的情形中，目标受试者涵盖处于接触败血症感染的风险的 任何受试者。尤其易受影响的受试者包括婴儿和少年，W及免疫功能不全的少年和成人W 及老年人。然而，处于败血症感染的风险的任何婴儿、少年、成人或老年人或免疫功能不全 的个体可根据本文所述的方法进行诊断。
[0023] 根据一种方法，所述方法包括检测受试者中具有升高的整合素化A-3(CD49c/ CD29)表达水平的中性粒细胞亚群的存在，借此中性粒细胞亚群的存在表明受试者患有败 血症或具有败血症风险。
[0024] 根据另一种方法，所述方法包括使来自受试者的生物样本与特异性结合生物样本 中的整合素 VLA-3的试剂接触;检测与生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂，并测定生物 样本中整合素 VLA-3的表达水平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，生物样本中升高水 平的整合素 VLA-3表明受试者患有败血症或处于发展败血症的风险。
[0025] 如本文所用，术语"样本"是获自受试者的生物样本。该生物样本可为含有中性粒 细胞的任何样本。本领域技术人员将认识到可使用血浆、全血或全血的亚级分。生物样本还 可为血清或骨髓。可使用标准程序获得运些各种生物样本W用于回收特定样本。
[0026] 例如，可通过使用标准抽血获得血液或血清样本，如WhUe的美国专利No. 4，263， 922所公开，所述专利的公开内容整体W引用方式并入本文。通常，在标准抽血中，通过针组 件和把手系统将血液抽取到收集管中。抽血之后，将针组件和把手从管末端移除，并且单独 的盖合适地盖在管的每个末端W将血液样本保持在管中W供分析。在人的情况中，用采血 针(lancet)刺破指尖取血或通过标准静脉穿刺进行抽血也是获得体液样本的便利方法。可 使抽取的血液立即暴露于抗凝剂W阻止其凝固。已知的抗凝剂包括但不限于肝素、邸TA、D- Phe-Pro-A巧氯甲基酬二盐酸盐ΓΡΡΑΟΤ'）和巧樣酸钢。
[0027] 可根据本领域已知的程序获得骨髓样本。例如，可使用针吸或其它已知技术获得 骨髓样本。在某些实例中，可使用Ficoll-Hypaq密度梯度从骨髓样本中分离细胞。用于获得 骨髓样本的其它程序包括骨活检装置，诸如中空套管或针。不管用于获取样本的工具是什 么，然后可制备骨髓样本W供随后分析(例如，固定和标记）。可根据Silva等的美国专利公 开No.2014/0038177中所描述的方法获得样本，所述专利公开的公开内容整体W引用方式 并入本文。
[0028] 根据另一个实施方案，样本可通过腹腔灌洗获得。简言之，诊断性腹腔灌洗(D化） 是将有孔的透析导管引入腹腔中W获得流体用于实验室分析。D化通过至少Ξ种不同的技 术来实施，所述技术采用略微不同的设备和方法。在所有技术中，通过放置膀脫导管和胃管 用于对膀脫和胃降压来准备患者。在一种技术（即，不公开的技术）中，通过使用尖锐的套管 针制作小皮肤切口来放置透析导管。运项技术已得到改进W降低对腹部内脏的风险。该改 进的技术使用Seldinger导丝，其被称为"导丝穿针(wire through needle)"方法。通过18 号短斜面引导针将J形尖端的弹黃导丝传入骨盆。取出针并且多孔腹腔灌洗导管沿着导丝 前行至骨盆。移除J导丝，然后使用确定的技术对腹腔液进行取样。
[0029] 炎症可分类为急性或慢性。急性炎症是身体对有害刺激的最初反应，并且通过激 活免疫细胞随后释放各种介质和增加白细胞从血液向受损组织移动来达到。持续炎症，称 为慢性炎症，导致存在于炎症部位的细胞的类型的渐进转变，并且特征在于组织从炎性过 程同时破坏和痊愈。败血症是严重的医学病症，其特征在于全身炎性状态(称为全身炎性反 应综合症或SIRS)并且存在已知或疑似感染。身体可针对血液、尿、肺、皮肤或其它组织中的 微生物发展运种炎性反应。细菌入侵其它无菌部位像腹腔导致立即开始炎性反应。对运种 反应必须的是氧自由基，其主要被产生来杀灭微生物，但也可通过膜憐脂的过氧化反应损 害宿主结构（Hampton 等，"Inside the Neutrophil Pha邑ο s ome : Ox i dan t s， Meyloperoxidase'and Bacterial Killing/'Blood 92:3007-3017(1998) ;Meie;r的WO 2013/104798,所述文献的公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0030] 败血症或败血症风险的诊断可用于由感染生物体的类型表征的Ξ种主要类型的 败血症。革兰氏阴性败血症是最常见的并且病死率为约35%。运些感染的大多数由大肠杆 菌化scherichia coli)、克雷伯氏肺炎菌化lebsiella pneumonie)和铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)引起。革兰氏阳 性病原体诸如葡萄球菌（Staphylococci)和链 球菌（S化eptococci)是败血症的第二主要原因。第Ξ主要组包括真菌，其中真菌感染引起 相对小的败血症病例百分比，但是具有高死亡率。参见Kink的W0 1999/064070,其公开内容 整体W引用方式并入本文。 ^ ^
[0031 ] 在一个实施方案中，小鼠中的中性粒细胞亚群是Gr 1胃、CD 1化胃。Grl是鼠蛋白也称 为Ly-6G(蛋白质数据库登记号P35461;还参见Fleming等，。畑aracterization of Two Novel Ly-6genes.Protein Sequence and Potential Structural Similarity to Alpha-Bungarotoxin and Other 化urotoxins/'J.Immunol.150(12)5379-5390(1993)，其 公开内容整体W引用方式并入本文）。作为糖基憐脂酷肌醇(GPI)连接蛋白，Grl在骨髓中W 发育调控方式由髓系细胞表达。虽然单核细胞在其骨髓发育过程中仅短暂表达Grl，但Grl 在骨髓粒细胞W及在外周中性粒细胞上的表达是运些群体的良好标志。
[0032] 可使用常规的分子技术鉴定非鼠细胞中Grl的同源物或等同物。例如，人中的中性 粒细胞亚群可选择性地为中性粒细胞特异性标志物CD16+CD6化+。本领域技术人员可产生 或获得由来自目标有机体的髓系细胞制备的cDNA或基因组DNA文库，并且使用用氨基酸基 序或来自Grl的序列设计的简并寡核巧酸引物例如来获得核酸探针分子W筛选基因组或 cDNA文库;还可基于蛋白质-蛋白质相互作用使用遗传方法(例如酵母双杂交系统）。可使用 多种公开可获得的生物信息学资源来筛选序列数据库中鼠 Grl的同源物。参见Cambier等的 美国专利公开No. 2004/0229354，其公开内容整体W引用方式并入本文。
[0033] 中性粒细胞亚群可选择性地由中性粒细胞特异性标志物CD14+CD16-来定义 (Soehnlein等，"Phagocyte Partnership During the Onset and Resolution of Inf lammation，"化t.Rev. Immunol. 10:427-439(2010)，其公开内容整体W 引用方式并入本 文）。在另一个实施方案中，中性粒细胞特异性标志物CD14+CD16+可定义中性粒细胞亚群 (Saha等，"Multifunctional Monocytes：Toward A Functional Characterization of Blood Mono巧tes" Immunol .Cell .Biol .89:2-4(2011)，其公开内容整体W引用方式并入本 文)。
[0034] 如在几个实施方案中叙述的检测步骤可在一定时间段内W隔开的间隔重复。确定 受试者是否患有败血症或处于败血症的风险可在暴露于感染有机体后或在此后的任何时 间立即完成。通过在治疗败血症期间或之后的各个时间点测试所选受试者的整合素 VLA-3 表达水平或具有升高的整合素 VLA-3水平的中性粒细胞亚群的存在，该确定可用作确定跟 踪治疗的方法。理想地，确定败血症或败血症风险通过暴露于感染有机体后立刻(例如在暴 露后头24小时内）获得体液样本来完成。可在暴露后多于24小时或较少时间内（例如，暴露 发生后约六小时内）从受试者获得体液样本。另外的体液样本可进一步在暴露于感染有机 体几小时、几天或几周内获得。
[0035] 根据一个实施方案，用于确定受试者是否患有败血症或处于败血症风险的生物标 志物是整合素 VLA-3。中性粒细胞上整合素 VLA-3表达与败血症的严重性强烈相关并且可区 别败血症与SIRS。当前，2-3天内诊断是不可能的，因为运种决定是基于检测到败血症病原 体作出，而败血症病原体的检测在实验室中花费多于24小时进行细菌培养。本文所述的方 法使用生物标志物整合素 VLA-3在辨别败血症和SIRS的能力方面提供显著改善。运可改善 败血症和SIRS病例的结果，因为败血症和SIRS的治疗方法显著不同，并且当使用本文公开 的诊断方法时，合适的治疗介入可在非常早的时间点开始。
[0036] 通过使来自受试者的生物样本与特异性结合所获生物样本中的整合素 VLA-3的试 剂接触进行检测整合素 VLA-3的存在。在一个实施方案中，所述方法进一步包括使生物样本 与特异性结合中性粒细胞特异性标志物的试剂接触。
[0037] 在患有败血症或处于败血症风险的个体中发现具有升高的整合素 VLA-3表达水平 的中性粒细胞亚群的存在。如本文所用，术语"升高的"意图指所获生物样本中测量的整合 素 VLA-3水平高于同时或先前测量的非败血症受试者的预测正常范围、阔值VLA-3水平或对 照样本(例如，一个或多个校准标准值）。对照样本可来自暴露于败血症感染有机体之前特 定时间的相同受试者，来自未暴露于败血症感染有机体的不同的受试者或一组受试者，或 一个或多个各含有已知量的整合素 VLA-3的校准样本。与对照或正常范围合素 VLA-3水平相 比增加的合素 VLA-3水平的存在被认定为检测败血症或败血症风险的方法。
[0038] 可使用标准免疫诊断技术包括免疫测定，诸如竞争、直接反应或夹屯、式测定来测 量化A-3生物标志物的浓度。此类测定包括但不限于蛋白质印迹、凝集测试、酶标记和介导 的免疫测定如化ISA、生物素/抗生物素蛋白型测定、放射免疫测定、免疫电泳、免疫沉淀、气 相色谱法、高效液相色谱法化PLC )、尺寸排阻色谱法、固相亲和、流式细胞术等。在一个特定 实施方案中，使用流式细胞术进行检测。也可通过在诊断学领域应用的任何类型的方法来 测量VLA-3生物标志物的浓度，运些方法包括但不限于基于酶促反应、发光(特别是巧光)或 放射性化学品的测定方法。检测方法包括快速测试形式，包括免疫色谱法（例如，条状形 式）、放射免疫测定、化学发光和巧光免疫测定、免疫印迹测定、酶联免疫测定巧LISA)、基于 luminex的珠粒测定和蛋白质微阵列测定。参见Bergmann等的美国专利公开2011/0086831， 其公开内容整体W引用方式并入本文。测定类型还可进一步为基于微量滴定板、基于忍片、 基于珠粒，其中生物标志物蛋白可附着于表面或处于溶液中。测定可为同质或异质测定、夹 屯、测定、竞争性和非竞争性测定（T皿IMMUNOASSAY HANDBOOK,David Wild编，Elsevier LTD,Oxford;第Ξ版（2005年5月）；Hultschig等，"Recent Advances of Protein Microarrays /'Qirr.Opin.化em.Biol. 10( 1) :4-10(2006)，所述文献的公开内容整体W 引 用方式并入本文）。
[0039] 如本文所用基于巧光的测定包括使用标记试剂的染料。示例性染料可例如选自包 括W下的组:FAM(5-或6-簇基巧光素）、VIC、肥D、巧光素、巧光素-异硫氯酸醋(FITCKIRD- 700/800、花青染料(诸如〔￥3、〔￥5、〔￥3.5、〔￥5.5、切7、咕吨村311地611)、6-簇基-2'，4'，7'，4， 7-六氯巧光素化EX)、TET、6-簇基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基-巧光素 α〇Ε)、Ν，Ν，Ν'，N'- 四甲基-6-簇基若丹明（TAMRA)、6-簇基-X-若丹明（ROX)、5-簇基若丹明-6G(R6G5)、6-簇基 若丹明-6G(RG6)、若丹明、若丹明绿、若丹明红、若丹明110、B0DIPY染料(诸如B0DIPY TMR)、 Oregon Green、香豆素（Coumarine)(诸如伞形酬）、苯甲亚胺（诸如Hoechst 33258);菲晚类 (诸如Texas Red、化kima Yellow、Alexa Fluor、阳T、漠乙菲晚）、日丫晚鐵染料、R卡挫染料、吩 嗯嗦染料、化嘟染料、聚甲烘染料（Polymethin dye)等。基于化学发光的测定包括基于 KI服-〇THMER，ENCY化0P邸IA oF C肥MICAL TECHNOLOGY,第4版，exec.编，J.I.Kroschwitz; 编辑Μ.Howe-Grant，John Wil巧&Sons,15:518-562( 1993)中针对化学发光材料所述的物理 原理使用染料，所述文献的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0040] 在运方面也可使用基于色谱免疫测定的原理的测流测试。测流测试使用涂敷有抗 体和/或其它反应物的试纸条，所述抗体和/或其它反应物当与存在于接触血液样本或其它 样本中的VLA-3反应后，导致出现有色线（即，指示物），表明患者中存在高于特定阔值的整 合素 VLA-3,运触发形成化A-3/抗体复合物。试纸条的一般形式表现单一测试线，即所谓的 "T线"，和单一对照线，即所谓的乂线"。对照线用作功能有效性的指示物。提供较新近的测 试试纸条，其将多个测试线分组用于检测所接触样本中多于一种物质。参见Zhou等的美国 专利公开No. US2004/0191760，其公开内容整体W引用方式并入本文。
[0041] 与整合素 VLA-3结合的试剂包括但不限于任何已知的蛋白质或肤，诸如抗体、抗体 结合片段、或抗体模拟物、核酸适体和小分子整合素 VLA-3试剂。
[0042] 在本方法的一个实施方案中，试剂是单克隆抗体、或其结合片段、适体或抗体模拟 物。如本文所用，术语"抗体"可W多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、细胞 内抗体Γ胞内抗体"）、抗体片段(例如Fv、Fab和F(ab) 2似及单链抗体(scFv)、嵌合抗体和 人源化抗体化arlow和David Lane编，USING ANTIB0DIES:A LABORATORY MANUAUCold Spring Harbor Laboratory Press，1999);Houston等，"Protein Engineering of Antibody Binding Sites：Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli，'' Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883(1988);Bird等，"Single-Chain Antigen- Binding Proteins/'Science 242:423-426(1988)，所述文献的公开内容整体 W 引用方式 并入本文）。
[0043] 天然存在的抗体通常具有两条相同的重链和两条相同的轻链，其中每条轻链通过 链间二硫键与重链共价连接，并且多个二硫键进一步将两条重链彼此连接。单条链可折叠 成具有类似大小（110-125个氨基酸)和结构但具有不同功能的结构域。轻链可包含一个可 变结构域(VL)和/或一个恒定结构域(CL)。重链也可包含一个可变结构域(VH)和/或根据抗 体的类型和同种型，Ξ个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。在人中，同种型为IgA、 I曲、I巧、IgG和IgM，其中IgA和IgG进一步被细分为亚类或亚型（IgAl-2和IgGl-4)。
[0044] 通常可变结构域从一种抗体到另一种显示相当的氨基酸序列可变性，特别是在抗 原结合位点的位置。在VL和VH的每个中发现称为高变区或互补决定区（CDR)的Ξ个区，其由 称为骨架可变区的较少可变区支撑。本发明抗体包括IgG单克隆抗体W及抗体片段或工程 改造形式。运些例如是Fv片段或其中所例示抗体的CDR和/或可变结构域被工程改造为单链 抗原结合蛋白的蛋白质。
[0045] 由化和VH结构域构成的抗体的部分被指定为Fv(可变片段)并且构成抗原结合位 点。单链Fv(scFv或SCA)是在一条多肤链上含有化结构域和VH结构域的抗体片段，其中一个 结构域的N端和其它结构域的C端通过柔性接头接合。用于产生单链抗体的肤接头通常是柔 性肤，选择其W确保发生化和VH结构域适当的Ξ维折叠。接头一般为3至50个氨基酸残基， 并且在一些情况下较短，例如约3至30个氨基酸残基，或3至25个氨基酸残基，或甚至3至15 个氨基酸残基。此类接头肤的实例包括四个甘氨酸残基重复随后是丝氨酸残基。
[0046] 单链抗体缺乏其所来源的完整抗体的一些或所有恒定结构域。因此，它们可克服 与使用完整抗体相关的一些问题。例如，单链抗体倾向于没有重链恒定区和其它生物分子 之间的某些不希望的相互作用。另外，单链抗体显著小于完整抗体并且可具有大于完整抗 体的渗透性，从而允许单链抗体更有效地定位于并结合祀抗原结合位点。此外，单链抗体相 对小的尺寸使其相较于完整抗体较不可能在接受者中激发不需要的免疫反应。
[0047] 用于单克隆抗体产生的方法在本领域中是熟知的（MONOCLONAL ANTIB0DIES- PRODUCTION'ENGI肥ERING AND CLINICAL APPLICATI0NS(Mary A.Ritter和Heather M丄adyman编，1995)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。单克隆抗体可使用杂交瘤方 法审U备，诸女日由Kohler and Milstein, '^Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity,"化 1:ure 256:495-497(1975)所描述 的那些方法，所述文献的公开内容整体w引用方式并入本文。使用杂交瘤方法，使宿主动物 免疫W引发由淋己细胞产生将特异性结合免疫抗原的抗体。一般，该过程设及从已用先前 目标抗原免疫的哺乳动物的脾获得免疫细胞(淋己细胞）。在一个实施方案中，产生针对 VLA-3肤的单克隆抗体。然后使分泌抗体的淋己细胞与骨髓瘤细胞或转化细胞融合，从而产 生永生的分泌免疫球蛋白的细胞系（Mi 1 stein和Kohler，"Derivation of Specif ic Antibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion，'' Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。培养所得的融合细 胞或杂交瘤，并筛选希望的单克隆抗体的产生。克隆产生此类抗体的群落，并使其在体内或 体外生长W产生大量抗体。或者，可在体外免疫淋己细胞。免疫后，分离淋己细胞并使用例 如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融合W形成然后可从未融合的淋己细胞和骨髓瘤细胞 挑选出的杂交瘤细胞。然后可使用标准方法在体外培养物中（JAMES W. G0DING，MONO化0NAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press 1986)，其公开内容整体W 引用 方式并入本文)或动物中体内作为腹水肿瘤使产生单克隆抗体的杂交瘤繁殖，所述单克隆 抗体特异性针对整合素 VLA-3,如通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合测定如放射免疫 测定(RIA)或酶联免疫吸附测定化LISA)所测定。如W上对于多克隆抗体所述，然后可从培 养基或腹水纯化单克隆抗体。
[004引 在另一实施方案中，可从使用McCafferty等，"Phage Antibodies:Filamentous Phage Displaying Antibody 化riable Domains,"化1:ure 348:552-554(1990)中所述的 技术产生的抗体隧菌体文库分离抗体或抗体片段，所述文献的公开内容整体W引用方式并 入本文。Li 等，"Platelet Fragmentation Requires a Specif ic Structural Conformation of Human Monoclonal Antibody Against盼Integrin/'J.Biol.Chem.283 (6) :3224-3230(2008其公开内容整体W引用方式并入本文，描述了使用隧菌体表面展示技 术分离能够结合来自人scFv抗体文库的VLA-3的九种单克隆人抗体。因此，运种技术是用于 分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的非常可行的替代方案。
[0049] 或者，还可使用如化billy等的美国专利4,816,567中所述的重组DNA方法制备单 克隆抗体，所述专利的公开内容整体W引用方式并入本文。通过使用寡核巧酸引物的RT- PCR从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离编码单克隆抗体的多核巧酸，所述寡核巧酸引物特异性 扩增编码抗体的重链和轻链的基因。然后将分离的编码重链和轻链的多核巧酸克隆至合适 的表达载体中，将表达载体转染进宿主细胞，由所述宿主细胞产生单克隆抗体。而且，如所 述可从隧菌体展示文库分离希望物种的重组单克隆抗体或其片段(McCaffedy等，"Phage Antibodies：Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains/'Nature 348:552-554(1990);Clackson等，"Making Antibody Fragments Using Phage Display Libraries/'Nature 352:624-628(1991);和Marks等，"By-passing Immunization:Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage，"J.Mol.Biol.222:581-597 (1991)，所述文献的公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0050] 单克隆抗体可为人源化抗体。此类抗体可在治疗上使用W在向人受试者施用时降 低抗原性和人抗小鼠抗体反应。人抗体是由人产生的抗体或具有与由人产生的抗体对应的 氨基酸序列的抗体。可通过用具有希望的特异性、亲和力和能力的非人抗体(例如，小鼠、大 鼠、兔、仓鼠等）的互补决定区取代人抗体的互补决定区（CDR)来使抗体人源化(Jones等， ('Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse/'Nature 321: 522-525( 1986);民iechmann等，（'民eshaping Human Antibodies for Therapy/'Na化re 332:323-327(1988);Verhoeyen等，"Reshaping Human Antibodies:Grafting an Antilysozyme Activity/'Science 239:1534-1536(1988)，戶片 述文献的公开内容整体^引用方式并入本文）。可使用本领域已知的各种技术产生人源化 抗体。可产生体外免疫或分离自产生针对靴抗原的抗体的免疫个体的永生化人B淋己细胞 (参见例如，Reisfeld等，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER T皿RAPy 77(Alan R丄iss 编，1985)和Garrard的美国专利No.5,750,373，所述文献的公开内容整体?引用方式并入 本文）。而且，人源化抗体可选自瞻菌体文库，其中所述瞻菌体文库表达人抗体化i等， ('Platelet Fragmentation 民equires a Specific Structural Conformation of Human Monoclonal Antibody Against03In tegrin，，'J.Biol.Chem.283(6):3224-3230(2008)， Vaughan等，('Human Antibodies with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage Display Library/'Nature Biotechnology 14:309-314 (1996) ;Sheets等，（'Efficient Construction of a Large Nonimmune Phage Antibody Library：The Production of High-Affinity Human Single-Chain Antibodies to F*rotein Antigens，，'F*roc.Nat' 1 .Acad.Sci .U.S.A.95:6157-6162(1998) ;Hoogenboom等， ('By-passing Immunisation. Human Antibodies From Synthetic Repertoires of Germline VH Gene Segments Rearranged In VitroJ.Mol.Biol.227：381-8(1992)； Marks等，（'By-passing Immunization.Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage，，'J.Mol. Biol. 222:581-97( 1991)，所述文献的公开内容整体W 引用 方式并入本文）。人源化抗体也可在含有人免疫球蛋白基因座，能够在免疫后在不产生内源 性免疫球蛋白的情况下产生全部人抗体的转基因小赢中制备。这种方法描述于Surani等的 美国专利No.5,545,807;Lonberg等的美国专利No.5,545,806;Lonbe巧等的美国专利No.5， 569,825;Lonberg等的美国专利No.5,625，126;Lonberg等的美国专利No.5,633,425;和 Lonberg等的美国专利No. 5,661，016,所述专利的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0051] 除了利用完整抗体外，本文的方法涵盖使用此类抗体的结合部分。此类结合部分 包括Fab片段、F(ab)2片段、Fal/片段、F(al/)2片段、Fd片段、Fd^片段、Fv片段和微抗体，例 如，抗体重链可变结构域的61个残基的子结构域(Pessi等，"A Designed Metal-binding Protein with a Novel Fold/'NaUire 362:367-369(1993)，其公开内容整体^引用方式 并入本文）D 结构域抗体（dAb)(参见例如，Ho It等，"Domain Antibodies : Proteins for Therapy/'Trends Bio technol · 21:484-90(2003)，其公开内容整体^引用方式并入本文） 也适于本文公开的方法。这些抗体片段可通过常规程序制备，诸如如J.Goding，M0N0化0NAL ANTIB0DIES:PRINCIPLES AND PRACTICE 98-118(1984)中所述的蛋白水解断裂程序，所述 文献的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0052] 另外，单链抗体也是适合的（例如，Huston的美国专利No.5,476,786和加 ston和 Oppermann白勺美国专禾l」No . 5，132,405 ;Huston等，（'Protein Engineering of Antibody Binding Sites:民ecovery of Specific Activity in an Anti-digoxin Single-chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli，，'Proc .Nat^ 1 Acad. Sci .USA 85:5879-83 (1988) ;Ladner等的美国专利No .4,946,778;Bird等，"Single-chain Antigen-binding Proteins/'Science 242:423-6(1988);Ward等，"Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli，'' Nature 341:544-6(1989)，所述文献的每一个的公开内容整体W引用方式并入本文）。单链 抗体通过经由氨基酸桥连接Fv区的重免疫球蛋白链片段和轻免疫球蛋白链片段而形成，从 而产生单链多肤。本文还涵盖使用单价抗体。sdAb可天然产生，即通过免疫单峰骆驼、骆驼、 美洲驼、羊驼或整鱼来产生(Ghahroudi等，"Selection and Identification of Single Domain Antibody Fragments from Camel Heavy-Chain Antibodies/'FEBS Letters 414 (3) :521-526(1997)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。或者，抗体可在微生物中产生 或源自常规完整抗体化armsen等，"Properties production，and Appl ications of Camelid Single-Domain Antibody Fragments/?ρρ?.Microbiol.Biotechnology 77:13- 22(2007)，Holt等，"Domain Antibodies：Proteins for Therapy，"Trends Biotech.21 (11) :484-490(2003),其公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0053] Ξ链抗体是将两个scFv片段与化b片段组合的多功能重组抗体衍生物。Fab片段用 作特定的异二聚化信号，并且两个scFv片段各自与不同的化b链融合（Schoonjans等， "Efficient Heterodimerization of Recombinant Bi-and Trispecific Antibodies，" Bios巧aration 9(3): 179-183(2000)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0054] 双链抗体是小的二价和双特异性抗体片段，其包含在同一多肤链(VH-化)上与轻 链(VL)可变结构域连接的重链(VH)可变结构域，所述多肤链由肤接头连接，所述肤接头太 短而不足^允许同一链上两个结构域之间配对化〇11;[]1旨日1'等，"'01日13〇(11日3'：51]1日11 Bivalent and Bispecific Antibody Fragments/'Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14)： 6444-6448( 1993)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。
[005引针对VLA-3的示例性抗体包括而不限于如下可商购获得的那些：LS-A81 36 (Lifespan Biosciences)、LS-A8140(Lifespan Biosciences)、LS-C123048化ifespan Biosciences)、LS-C44108(Lifespan Biosciences)、PA1621(Booster Immunoleader)、 MCA1948PE(AbD Serotec)、MCA1813(AbD Serotec)、MCA1948FT(AbD Serotec)、MCA1948 (AbD Serotec)、HPA008572(Atlas Antibodies)、17-0494-41(eBioscience)、17-0494-42 (eBioscience)、:343805 (BioLegend)、:343804(BioLegend)、:343802(BioLegend)、:343801 (BioLegend)、ABIN968338(antibodies-online)、ABINI 12369(antibodies-online)、 ABIN112368(antibodies-0nline)、ABINl12371(antibodies-0nline)、MAB1952Z(Merck Millipore)、CPlll^-100UG(Merck Millipore)、AB1920(Merck Millipore)、MAP1952(Merck Millipore)XWB-252CD8(Genway)^GWB-33C613(Genway)^GWB-390721 (Genway) XWB- 4A5FF0(Genway)、PA1-28601(Thermo Fisher Scientific，Inc .)、MAl-27165(Thermo Fisher Scientific，Inc.)、MAl-34075(Thermo Fisher Scientific，Inc .)、MAl-70075 (Thermo Fisher Scientific,Inc .)、251177(At)biotec)、251428(Abbiotec)、orb 14075 (Biorbyt)、orbl3512(Biorbyt)、AP20567PU-N(Acris Antibodies)、BM6022P(Acris Antibodies)、SMI 544A(Ac;r is Antibodies)、BM6023P( Acr is Antibodies)、69475 (NovaTeinBio)、119-17485(Raybiotech)、119-17484(Raybiotech)、0ASA02153(Aviva Systems Biology)、0ASA02147(Aviva Systems Biology)、0ASA02150(Aviva Systems Biology)、0ASA02155(Aviva Systems Biology)、CABT-20410MH(Creative Biomart)、 CABT-29879MH(Creative Biomart)XABT-29877MH(Creative Biomart)XABT-29881MH (Creative Miomad)、XW-7793(ProSci)、NBPl-40612(Novus Biologicals)、NBPl-61615 (Novus Biologicals)、NB100-2675(Novus Biologicals)、NB100-64901(Novus Biologicals)、]；7661-33D(加 ited States Biological)、I7661-33C(United States Biological)、I7661-33C(United States Biological)、I761133Dl(United States Biological)、I7661-33M化nited States Biological)、AF2787(R&D Systems)、MAB1345 (R&D Systems)、FAB1345A(R&D Systems)、FAB1345A(R&D Systems)、FAB1345F(R&D Systems )、sc-59967( Santa Cruz Biotechno1ogy)、sc-32237 ( Santa Cruz Biotechnology)、sc-6587(Santa Cruz Biotechno logy)、sc-6592(Santa Cruz Biotechnology)、bs-1057R(Bioss)、bs-2093R(Bioss)、ab131055(abeam)、ab133198 (abeam)、abl1767(abeam)、abl25120(abeam)、abl40919(abeam)、ab20141(abeam)、ab91043 (abeam)、ab20140(abcam)、abll5912(abcam)、ab91050(abcam)、ab30488(abcam)、ab30489 (abeam)、abl81432(abcam)和abl90731(abeam)。
[0056] 适体是在分子识别方面代表抗体的替代物的一类分子。适体是具有W高亲和力和 特异性识别几乎任何类型的祀分子的能力的肤或寡核巧酸序列。此类配体可通过随机序列 文库的指数富集配体的系统进化(沈LEX)来分离，如Tuerk和Gold, "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment:RNA Ligands to Bacteriophage T4DNA 化lymerase/'Science 249(4968): 505-510( 1990)所述，其公开内容整体W引用方式并入 本文。随机序列文库可通过DNA的组合化学合成而获得。在该文库中，每个成员是独特序列 的最终经化学修饰的线性低聚物。该类分子的可能修饰、用途和优点已在Jayasena， "Aptamers:An Emerging Class of Molecules that Rival Antibodies in Diagnostics /'Clin.Qiem.45(9): 1628-1650(1999)中进行综述，所述文献的公开内容整体 W引用方式并入本文。
[0057] 抗体模拟物也适用于本文。示例性抗体模拟物包括而不限于称为单抗体 (monobody)的那些，所述单抗体源自第十人III型纤连蛋白结构域(1中n3KKoide等，叮he Fibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins，" J.Mol.Biol.284:1141-1151(1998);Koide等，"Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using Designer Binding Proteins：Application to the Estrogen Receptor/'Proc.化t'l Acad.Sci.USA 99:1253-1258(2002)，所述文献的每个 的公开内容整体W引用方式并入本文）；和称为亲和抗体(aff化ody)的那些，所述亲和抗体 源自葡萄球菌蛋白A的稳定的α-螺旋细菌受体结构域Z(Nord等，"Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial Receptor Domain/'化ture Biotechnol. 15(8) :772-777(1997)，其公开内容整体W引用方式并入本 文）。运些抗体模拟物中的变化可通过取代运些多肤的一个或多个结构域然后筛选经修饰 的单抗体或亲和抗体的整合素 VLA-3结合特异性来产生。
[0058] 用于产生多克隆抗体的程序也是熟知的。可根据已知方法通过W下方式产生多克 隆抗体和其片段：向尤其选自例如猪、牛、马、兔、山羊、绵羊和小鼠的宿主动物施用适当的 抗原或表位，然后回收来自所述宿主动物的血清(含有抗体）。本领域已知的各种佐剂可用 于增强抗体产生。用于产生多克隆抗体的程序公开在Ed化rlow和David Lane, USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring 化rbor Laborato巧 Press,1988)中，其 公开内容整体W引用方式并入本文。虽然抗体可为多克隆的，但可使用纯化技术使多克隆 抗血清成为单特异性的。
[0059] 在具体的实施方案中，运些检测方法设及使所获样本与能够选择性地与化A-3生 物标志物相互作用的结合配偶体接触。在一个实施方案中，结合配偶体是抗VLA-3抗体，其 是指识别整合素 VLA-3的抗体或其结合片段。抗VLA-3抗体可W是多克隆的或单克隆的，理 想地为单克隆的，W及特异性结合整合素 VLA-3的其任何片段。在另一个实施方案中，结合 配偶体是抗体模拟物，其可为核酸或肤适体，或含有一个或多个特异性结合整合素 VLA-3的 可变区的多肤支架。
[0060] 前述结合测定可设及使结合配偶体(即抗体、抗体模拟物或适体)与固体支撑物结 合。可使用的固体支撑物包括而不限于基质如硝化纤维素（例如，呈膜或微量滴定孔的形 式）；聚氯乙締(例如，片或微量滴定孔）；聚苯乙締乳胶(例如，珠粒或微量滴定板）；聚偏氣 乙締;重氮纸;尼龙膜;活化珠粒、磁性响应珠粒等。
[0061] 在运些测定中使用的结合配偶体可用可检测的分子或物质标记，所述可检测的分 子或物质诸如上述类型的巧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其它标记。标记为本 领域已知的，其一般提供(直接地或间接地)信号。如本文所用，关于结合配偶体的术语"标 记的"旨在涵盖通过将可检测的物质诸如放射性试剂或巧光团（例如，巧光素异硫氯酸醋 (FITC)或藻红蛋白（PE)或說青(切5))与结合配偶体偶联（即，物理连接)来直接标记结合配 偶体，W及通过与可检测物质的反应性来间接标记结合配偶体。结合配偶体可通过本领域 已知的任何方法用放射性分子标记。例如放射性分子包括而不限于 Reiss。取决于所用的测定和检测方法，抗体可任选地与其它蛋白质或化学标记物缀合W促 进与化A-3结合的抗体的检测。抗体可与酶组分诸如碱性憐酸酶或可容易检测的基团诸如 胶体金、生物素和链霉亲和素缀合。其它合适的缀合剂在本领域是熟知的。参见Kelley的美 国专利公开No. 2004/0115748，其公开内容整体W引用方式并入本文。
[0062] 可通过流式细胞术检测VLA-3和中性粒细胞标志物。流式细胞术已广泛用于鉴定 慢性脱髓銷疾病实验鼠模型W及脑缺血鼠模型中的中枢神经系统中的白细胞群体(参见 Tjoa等，"The Use of Flow Cytometry to Assess Neutrophil Infiltration in the Injured Murine Spinal Cord,"J.化urosci.Meth. 129:49-59(2003)，其公开内容整体W 引用方式并入本文）。流式细胞术可测量回收在特定样本中的中性粒细胞上的整合素表达。 可使用ACK裂解缓冲液（Invitrogen，San Diego，CA)进行RBC裂解。之前稀释或未稀释的样 本可用例如尤其是标记的抗Grl、标记的抗Ly6G和标记的抗CD1 lb(eBioscience，San Diego，CA，）进行染色。样本可用任何合适的固定剂，诸如超冷醇或3.7%甲醒进行固定。可 在FACS CalUber流式细胞仪(BD Biosciences，San Diego，CA)或等同的流式细胞仪上收 集细胞数据。在指出的时间点，移除样本，并且通过使用例如配备有CellQuest软件的 Becton Dickenson FACScan的流式细胞术测量细胞的前向和侧向散射参数W及细胞表面 标志巧光。
[0063] 在另一个实施方案中，ELISA方法用于测量整合素化A-3浓度，其中微量滴定板的 孔涂敷有特异性结合整合素 VLA-3或中性粒细胞特异性标志物诸如Gr-1、CD14、CD16或CD62 的一组抗体。然后将之前稀释或未稀释的体液样本添加到涂敷孔中。在解育一段时间足W 允许形成抗体-抗原复合物后，可洗涂板w除 去未结合的部分并添加可检测标记的第二结 合分子。使第二结合分子与任何捕获的整合素 VLA-3反应，洗涂板，并且使用本领域熟知的 方法检测第二结合分子的存在。
[0064]在另一个实施方案中，可使用阵列忍片进行体液样本的整合素 VLA-3浓度测量。运 种阵列技术允许在单一基质上同时进行大量实验，当用于生物分析物时所述基质通常称为 生物忍片。例如，之前稀释或未稀释的整合素 VLA-3或中性粒细胞特异性标志物诸如Gr-1、 CD14XD16或CD62的结合配偶体可固定在阵列忍片的表面。将获自受试者的体液样本任选 地稀释并然后存放在阵列忍片上。在解育一段时间足W允许形成结合配偶体-VLA-3复合物 后，洗涂阵列忍片W除去未结合的部分，因此大体分离化A-3阳性中性粒细胞或中性粒细 胞。在第二步中，可用用于无标记检测的合适的检测方案或使用用于标记检测对整合素 VLA-3特异的第二结合配偶体的合适的检测方案进行整合素 VLA-3浓度的测量。在一个实施 方案中，对第二结合配偶体进行标记，因此允许形成对整合素化A-3特异的一组"斑点"（有 色沉积）。例如，可通过用特定检测器分析阵列忍片上的斑点来进行检测和定量。
[006引上述鉴定的捕获测定还可在通过FACS分选大体上分离中性粒细胞群体或化A-3+ 中性粒细胞群体，然后破坏细胞W释放用于蛋白质定量的自由的表面标志物后进行。
[0066] 确定败血症或败血症的风险可基于化A-3生物标志物的存在或水平来进行，或其 可基于另外的诊断标志物或生物标志物进行。存在可用于帮助检测或诊断败血症或败血症 的风险的许多另外的生物标志物。运些生物标志物包括但不限于活化部分凝血酶原时间 (曰口1'1')^01化^025八064、补体肤似八4^5曰）、弹性蛋白酶曰1蛋白酶抑制剂复合物、内皮 白细胞粘附分子UELAm-l)、endocan、E-选择素、纤维蛋白降解产物、生长停滞特异性蛋白6 (gas-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝溶胶蛋白、比-1受体括抗剂、化-8、化-10、比-12、 IL-18、干扰素诱导蛋白lO(IP-lO)、层粘连蛋白、脂多糖结合蛋白化BP)、一氧化氮(NO)、硝 酸盐、亚硝酸盐、骨桥蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂l(PAI-l)、穿透素3、肤聚糖、血浆纤连蛋 白（pFN)、11型憐脂酶A2(PLA2-II)、血清溶菌酶、可溶性ST2蛋白、表面活性剂蛋白（A、B、C、 D)、髓系细胞表达触发受体1蛋白（TREM-1)和肌巧蛋白。败血症的生物标志物进一步在 Pierrakos 等，"Sepsis Biomarkers:A Review/'Critical &re 14:R15(2010)中讨论，其 公开内容整体W引用方式并入本文。
[0067] 受试者可为之前患有败血症的个体，并且所述检测用于确定所述受试者中败血症 复发的风险。在一个特定的实施方案中，受试者是具有败血症倾向的个体，并且所述方法用 于败血症的早期检测。
[0068] 在用所公开的方法评价受试者W评估败血症或败血症风险的存在后，诊断的结果 将决定所测试受试者的治疗过程(如果有的话）。
[0069] 因此，另一方面设及治疗患者的败血症的方法。所述方法包括进行本文所公开的 方法之一W诊断患有败血症的患者和施用疗法W治疗所述患者的败血症。
[0070] 在一个实施方案中，当基于所述诊断患者患有败血症和/或具有增加的败血症风 险时，用于受试者的疗法包括施用VLA-3括抗剂肤或抗VLA-3抗体。示例性的VLA-3括抗剂肤 包括而不限于环肤1^乂￥1和1^(￥2(分别是切3〇-43口〇-61厂1^611-61厂4而口-43]1-〔73〇和切3〇- AspD-Gly-Tyr(3-N〇2)-Gly-4Hyp-Asn-CysD) (Yao等，''Discovery of Targeting Ligands for Breast Cancer Cells Using the One-Bead One-Compound Combinatorial Method/'J.Med.畑em. 52(1) :126-133(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）、 Accutin(Yeh等，"Accutin，A New Disintegrin，Inhibits Angiogenesis In Vitro and In Vivo by Acting as Integrin AlphavbetaSAntagonist and Inducing Apoptosis，'' Blood 1998 92(9):3268-76(1998),其公开内容整体W引用方式并入本文）、和G1厂Arg- Gly-Asp(GRGD)(Chen等，"Signaling and Regulatory Mechanisms of IntegrinalphaSbetalon the Apoptosis of Cultured Rat Podocytes，''J. Lab Cl in. Med. 147 (6): 274-80 (2006)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。示例性的抗VLA- 3抗体包括上述那些或其人源化变体。
[0071] 在另一个实施方案中，当基于所述诊断患者患有败血症和/或具有增加的败血症 风险时，用于患者的疗法包括消耗整合素 VLA-3表达。在另一个实施方案中，当基于所述诊 断患者患有败血症和/或具有增加的败血症风险时，用于患者的疗法包括药物、疗法、外科 手术或其任何组合。
[0072] 治疗方法还可包括为用于管理败血症抗性的药剂的药物、VLA-3的阻断剂、抗生 素、血管加压药或其组合。运些药剂可W单一形式或多种不同组合物的形式施用。
[0073] VLA-3阻断剂包括而不限于反义分子、siRNA分子、shRNA分子和miRNA分子。
[0074] 能够与编码整合素 VLA-3的RNA转录物杂交的反义核酸分子从转基因表达，所述转 基因通过将编码整合素化A-3的DNA分子或其片段或变体W相对于表达载体的启动子和y 调控序列的相反定向连接至表达载体而制备。转录DM分子后，所得RNA分子将与编码实际 蛋白质或多肤产物的mRNA转录物互补。W相反定向连接DNA分子可根据本领域标准的已知 技术来进行。可将重组分子，包括反义序列或其寡核巧酸片段在体内使用递送媒介物直接 引入组织的细胞，所述递送媒介物诸如逆转录病毒载体、腺病毒载体和DNA病毒载体。也可 使用物理技术(诸如显微注射和电穿孔)或化学方法(诸如DNA共沉淀和并入脂质体内）将它 们在体内引入细胞。
[00巧]作为全长反义VLA-3mRNA的替代选择，SiRNA可用于结合化A-3DsiRNA是长度大约 20-25个核巧酸两端均具有短的2-3个核巧酸的y突出的双链合成RNA分子。双链SiRNA分子 代表一部分勒ImRNA分子(在运种情况下一部分VLA-3核巧酸序列）的有义和反义链。S iRNA分 子通常被设计成祀向mRNA祀标的从起始密码子下游起大约50-100个核巧酸的区域。当引入 细胞后，SiRNA复合物触发内源性RNA干扰(RNAi)途径，从而导致祀mRNA分子的裂解和降解。 [0076]已描述了SiRNA组合物的各种改进，诸如将经修饰的核巧酸或基序并入SiRNA分子 的一条链或两条链W增强稳定性、特异性和功效，并且根据运个方面适于使用（参见例如， Giese等的W0 2004/015107;McSwiggen等的W0 2003/070918; Imanishi等的W0 1998/ 39352; Jesper等的美国专利申请公开No . 2002/0068708 ;Kaneko等的美国专利申请公开 No. 2002/0147332 ;Miat等的美国专利申请公开No. 2008/0119427，其公开内容整体W引用 方式并入本文）。
[OOW]短或小发夹RNA分子在功能上与SiRNA分子类似，但包含构成紧密发夹环（tight hai巧in turn)的较长RNA序列。通过细胞机构将shRNA裂解成SiRNA,并且经由细胞RNA干扰 途径使基因表达沉默。已经开发了有效干扰人整合素 VLA-3表达的ShRNA分子，并且其适用 于本文所述的方法。
[0078]用于本文所述的任何方面的另外疗法包括而不限于施用氧、施用流体、透析、去除 败血症感染源(包括脈汁和脈肿）的外科手术或任何前述药物组合物。针对VLA-3的示例性 RNAi包括而不限于H00003675-R01 (Novus BiologicalS)和H00003675-R02(Novus Biologicals)。用于选择用于序列已知的基因的合适的RNA或RNA编码载体的方法在本领域 熟知（例如参见^Tuschl等，"Targeted mRNA Degradation by Double-Shanded RNA In Vitro/'Genes Dev. 13:3191-7( 1999) ;Hannon，G J.，"RNA Inte;rference，''化 ture 418: 244-251(2002);McManus等，"Gene Silencing Using Micro-RNA Designed Hairpins，" RNA 8:842-850(2002);Graham的美国专利No.6,573,099、Fire等的美国专利No.6,506， 559、Zernicka-Goetz等的WO 01/36646、Fire等的WO 99/32619和Beach等的WO 01/68836， 其公开内容整体W引用方式并入本文。
[0079] 用于治疗患有败血症的患者的药物组合物还含有药学上或生理上可接受的载体、 赋形剂或稳定剂。药物组合物可W呈固体或液体形式，诸如片剂、胶囊、粉剂、溶液、悬浮液 或乳液，并且可口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内施用、通过鼻内滴注、通过腔内 或膀脫内滴注施用、眼内、动脉内、病变内施用、通过施加至粘膜，诸如鼻、咽喉和支气管的 粘膜施用，或通过引入至一个或多个淋己结施用。对于大多数治疗目的，可静脉内或肠胃外 施用肤或核酸。
[0080] 对于可注射剂量，一种或多种治疗剂的溶液或悬浮液可在具有药物载体的生理上 可接受的稀释剂中制备。此类载体包括无菌液体，诸如水和油，添加或不添加表面活性剂和 其它药学上或生理上可接受的载体，包括佐剂、赋形剂或稳定剂。例证性的油为石油、动物 油、植物油或合成来源的油，例如，花生油、大豆油或矿物油。通常，水、生理盐水、葡萄糖水 溶液和相关糖溶液，和二醇，诸如丙二醇或聚乙二醇，是尤其用于可注射溶液的液体载体。
[0081] 对于用作气溶胶，溶液或悬浮液中的一种或多种治疗剂可连同合适的推进剂一起 包装在加压气溶胶容器中，所述推进剂例如控推进剂，如具有常规佐剂的丙烷、下烧或异下 烧。所述材料还可W非加压的形式施用，如喷雾剂或雾化剂。
[0082] 可对其它本领域已知的递送系统进行改进W用于递送W上所述的治疗性蛋白质、 肤或核酸分子。
[0083] 另一方面设及监测任何败血症疗法的功效。在一个实施方案中，运通过确定基线 整合素 VLA-3水平是否大于治疗后整合素 VLA-3水平来进行。如果如此，那么疗法是有效的。 或者，如果基线整合素 VLA-3水平小于治疗后整合素 VLA-3水平，那么疗法无效并且应选择 新的治疗介入。
[0084] 合适的整合素 VLA-3表达的参照水平度量获自非患病组织但不必源自正诊断的相 同受试者的样本中的败血症或败血症风险。在一个实施方案中，整合素 VLA-3表达的参照水 平获自代表与正用于诊断的样本相同的组织或细胞类型的样本。参照水平可W是来自受试 者的正常非患病样本中的整合素 VLA-3表达。或者，参照水平可获自来自个体群的非患病组 织。
[0085] 本文描述的当前方面的方法可进一步包括在一定时间段W隔开的间隔重复所述 施用。在一个实施方案中，在一定时间段W隔开的间隔进行所述疗法，其中基线整合素 VLA- 3水平在所述时间段内的中间点获得，并且治疗后整合素 VLA-3水平在所述中间点后获得。
[0086] 第四方面设及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法。所述方法包括检 测在患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素 VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群的存在 或不存在，借此所述中性粒细胞亚群的存在表明所述受试者患有败血症，而所述中性粒细 胞亚群的不存在表明所述受试者患有SIRS。该方法根据W上所述的方面进行。
[0087] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括在所述检测之前选择表现败血症和/或 SIRS的一种或多种临床症状的患者。在辨别两种病症后，可施用合适的疗法。败血症治疗如 上所述。
[0088] 本文所述的该方面的疗法可包括但不限于选自由W下组成的组的药剂:TNF-a和 IL-1受体括抗剂、抗缓激肤、血小板激活因子受体括抗剂、抗凝剂(抗凝血酶III)、缓激肤括 抗剂、泊拉得可(deltibant)(CP-0127)、肾上腺素、类固醇和苯海拉明。或者，疗法可包括选 自由W下组成的组的抗氧化剂:砸、谷氨酷胺、二十碳五締酸、稱黑激素、维生素 C和维生素 E。
[0089] 对于SIRS治疗的进一步讨论，参见Fein等，"Treatment of Severe Systemic Inflammatory Response Syndrome and Sepsis With a Novel Bradykinin Antagonist， Deltibant(CP-〇127).Results of Randomized,Double-Blind,Placebo-Controlled Trial.CP-0127SIRS and Sepsis SUidy Group/'JAMA 277(6) :482-87(1997) ;Berger等， "Antioxidant Supplementation in Sepsis and Systemic Inflammatory Response Syndrome，" Crit. Care Med . 3 5(增刊 9) : S584-90 (2007); Rina Ido 等，''Anti oxidant Therapy in Critically Septic 化tients/'Curr.Drug Targets 10(9):872-80(2009); Bulger等，"An Argument for Vitamin E Supplementation in the Management of Systemic Inflammatory Response Syn化ome，"化ock 19(2) :99-103(2003),其公开内容 整体W引用方式并入本文。
[0090] 另一方面设及治疗受试者的SIRS的方法，其包括进行根据本文所述的先前方面的 方法W诊断患有SIRS的患者；和向所述患者施用疗法W治疗SIRS。该方法根据W上所述的 方面进行。因此，诊断患有SIRS的患者可设及关于败血症的阴性结果。治疗SIRS可使用W上 所述的程序进行。
[0091] 应理解某些方面、方式、实施方案、变型和特征W不同层次的细节进行描述W提供 对当前技术的基本了解。也提供了如在本说明书中使用的某些术语的定义。除非另外定义， 否则本文使用的所有技术和科学术语一般具有如此所属领域普通技术人员通常所理解的 相同含义。 实施例
[0092] 提供W下实施例W说明所要求保护的发明的实施方案但绝不旨在限制其范围。
[0093] 实施例1-4的材料和方法
[0094] 败血症小鼠模型-根据罗彻斯特大学委员会批准的动物资源协议（Animal Resource Protocol)进行内毒素血症和化P。对于内毒素血症测定，对8-12周龄巧7BL/6 化arlan)雄性小鼠称重并通过腹膜内（IP)注射施用LPS(大肠杆菌055:B，Sigma-Al化ich) W达到LD90死亡率。在异氣烧吸入麻醉下进行化P存活手术。结扎盲肠并用21号针彻底刺 穿。通过皮下注射1ml乳酸林格氏溶液使所有小鼠恢复知觉。对于VLA-3阻断实验，在化P或 内毒素血症后2小时通过静脉内（IV)施用并且8小时、32小时通腹膜内施用LXY2(8如g) (切SD-AspD-Gl}f-Ty;r ( 3-N02 )-Gly-4Hyp-Asn-切SD)(其中氨基酸可为D氨基酸）或对照（8祉 g)(Peptide International)肤。监测存活持续 120小时。
[0095] 条件性敲除动物的产生-为产生粒细胞特异性整合素敲除小鼠，从欧洲小鼠变异 库化uropean Mouse Mutant Archive化MMA))购买粒细胞弹性蛋白酶2(Ela)-Cre敲入小 鼠，在所述小鼠中化e-重组酶代替Ela基因在髓系细胞中表达，从而允许标记有loxP位点的 革己基因的髓样前体细胞条件性诱变（Tkalcevic等，"Impaired Immunity and Enhanced Resistance to Endotoxin in the Absence of Neutrophil Elastase and Cathepsin G/'Immunity 12:201-210(2000)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。使Ela-Cre小鼠 与a3-Flox和Qv-Flox小鼠杂交四至五代W实现日3和αν基因在转基因小鼠中的缺失。由自尾 组织分离DNA通过PCR对小鼠进行基因型分析。对于Ela-Cre，引物F(CAT GAC ACC CCC ACT GTCGTGTCC)(WQIDN0:l)、R(TGGCACCACAGAAATGACCTCCAC)(SEQIDN0:2WPLx (ΤΤΤ GGT GCA CGG TCA GCA GAT TGGKSEQ ID顯：3)用于产生对于*巧日突变型分别为 615bp和 18加 p的条带。对于整合素03引物P1(GAA CAA CAT CTG CCT GGA GTKSEQ ID NO: 4)和P2(GTA TGA CTT CTG CCATGTAGCKSEQ ID 側:5)用于产生对于*巧的1〇义分别为4426口 和494bp的条带。使用引物PI和P3(CAA CAG CAC TGC TGT AGC A)(沈Q ID N0:6)产生427bp 的条带来证实通过Cre介导的重组去除基因（Margadant等，"Integrin AlphaSbetalInhibits Directional Migration and Wound Re-Epithelialization in the Skin/'J.Cell Sci. 122:278-288(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。对于 整合素 αν引物F(GGT GAC TCA GAC CTT CAG C)(SEQ ID N0:7)和Rev(CAC AAA TCA AGG ATG ACC AAA CTG AG)(沈Q ID N0:8)用于产生550bp的条带，对于野生型和floxed小鼠是 700bp，并且Cre介导的缺失后是 150bp化acy-Hulbe;rt等，"Ulcerative Colitis and Autoimmunity Induced by Loss of Myeloid Alphav Integrins，'' Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 104:15823-15828(2007)，其公开内容整体W引用方式并入本 文）。对于所有实验和进一步繁殖，选择具有栋色毛色化la-化e亲本的毛色）的转基因小鼠。
[0096] 中性粒细胞的分离和体外刺 激-经由肘前静脉穿刺从健康志愿者收集血液至含有 肝素的采血管（va州tainer)中。经由1步多晶型（Fresenius Kabi Norge AS)密度梯度通过 离屯、从全血分离粒细胞和红细胞。通过低渗裂解去除剩余的红细胞，得到中性粒细胞纯度 >98%。罗彻斯特大学的人类研究审查委员会(Human Research Sadies Review Board) 批准该研究，并且根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)获得知情同意。为测量整 合素表达，在37°C溫度下在具有葡萄糖的L15(Le化ovitz)培养基中用PMA(20ng/ml)、TNF-a (20ng/ml)、LPS(100μg/ml)或fMLP(lyM)刺激中性粒细胞1小时或3小时。
[0097] 败血症患者样本收集-将根据4种SIRS标准中的至少巧巾(体溫>38°C或<36°C，屯、 率>90/111，呼吸率>20次呼吸/111或口0)2<32111111化，白细胞计数>12,000、<4,000或>10% 外周血涂片上的不成熟形式)和至少一种急性器官功能障碍而许可进入特需病房的患者纳 入研究，其中要求根据两种情况确认致命异常。在诊断的36小时内和3-5天后收集血液和尿 样本。通过临床微生物培养证实严重败血症。患有严重非感染性SIRS的患者符合上述SIRS 和急性器官功能障碍标准但不具有记录的感染。4°C下针对中性粒细胞分离和流式细胞术 立即对血液样本进行处理。对于测量整合素的表面表达，使用纯化的小鼠抗人整合素日3、口5 和€^(]\11111口〇'6)、小鼠1邑61(681〇3(^611。6,5曰11〇16邑〇，〔4，1]54)同种型对照和藻红蛋白 (P E)标记的大鼠抗小鼠二抗。
[0098] 流式细胞术-对于流式细胞术测量中性粒细胞上的整合素表达，在所指示的时间 点从初始小鼠和败血症小鼠分离骨髓(BM)、腹腔灌洗液(PL)、外周血和肺，并随后制备单细 胞悬浮液。使用ACK裂解缓冲液（Invitrogen，San Diego，CA)进行RBC裂解。用未缀合的抗 CD16/32(eBioscience，San Diego，CA)使Fc受体封闭30分钟。用Alexafluor 488标记的抗 Grl (Invitrogen)使样本染色。使用别藻蓝蛋白（APC)标记的Ly6G(BD Biosciences)、 ?6托9-切5.5标记的抗〔01化（68;[03。16]1。6,5日]1〇16旨〇，〔4，）、巧光素异硫氯酸醋巧11'〇抗 F4/80(eBioscience，San Diego，CA，USA)、纯化的山羊抗小鼠整合素 a3/CD49c R&D Systerns)、阳抗小鼠整合素 a2/CD49b、α日/CD49e、av/CD51、APC抗小鼠整合素 a6/CD49f和阳缀 合的驴抗山羊IgG(SantaC;ruz)抗体。所有样本用3.7%甲醒固定并在FACSCalliber流式 细胞仪(BD Biosciences，San Diego，CA)上收集。使用Flow Jo软件分析数据。
[0099] 实时PCR-由人中性粒细胞制备总RNA，或使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN， Valencia，CA)分选小鼠骨髓粒细胞。类似地，通过使用鼠白血病病毒逆转录酶化if e Technologies，Bethesda，MD)，用寡聚物（dT)作为引物（Invitrogen,San Diego，CA)，使RNA 逆转录。将所有cDNA分成等份试样，并在-20°C下储存直到进一步使用。使用TaqMan?基 因表达测定（Applied Biosystems)进行人中性粒细胞上整合素日3和日2^及化-6、化-10和 TNFamRNA的定量。根据制造商方案，使用SYBR green PCR主混合液(A卵lied Biosystems) 进行PCR。对每个样本进行管家基因、鼠/人次黄嚷岭憐酸核糖转移酶基因（GAPDH)的PCR扩 增作为样本上样的对照并使样本之间标准化。使用软件分析RQ值。
[0100] 多光子活体显微镜检查(MP-IVM)-对于溶菌酶M(LysM)-GFP小鼠的MP-IVM(Faust 等，（'Insertion of Enhanced Green Fluorescent Protein Into the Lysozyme Gene Creates Mice With Green Fluorescent Granulocytes and Macrophages/'Blood 96: 719-726(2000)，其公开内容整体W引用方式并入本文），使用溶菌酶M(LysM)-GFP小鼠，其 中粒细胞和单核细胞表达GFP。为了准确示踪单个外渗白细胞的形态变化和迁移速度，使用 80 %WT和20 %LysM-GFP骨髓引入经福照的WT受体小鼠来产生混合骨髓嵌合体小鼠 W降低 成像期间巧光细胞的密度。将骨髓转移至经福照受体小鼠后8周，然后使用小鼠用于体内成 像。如先前所述制备睾提肌用于成像（Sumagin等，"Leukoc}fte-Endothelial Cell Interactions are Linked to Vascular Permeability Via I CAM-1-Mediated Signaling/'Am.J.Physiol.Head Circ.I^ysiol.295:H969-册77(2008)，其公开内容整体 W引用方式并入本文）。简言之，用戊己比妥钢(65mg/kg腹膜内）麻醉小鼠并保持于异氣烧 吸入麻醉。通过将动物置于溫垫装置上保持体溫。从腹内取出右睾提肌并轻轻夹在专口设 计的台上W供通过显微镜检查观察睾提肌小静脉。通过向从腹内取出的睾提肌组织诱注 fMLP(lyM)诱导白细胞外渗，并且使用配备有25x NA1.05水浸物镜的Olympus FV1000-A0M 多光子系统进行延时成像60分钟（Auffray等，"Monitoring of Blood Vessels and Tissues by a Population of Monocytes With Patrolling Behavior，''Science 317： 666-670(2007)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。在制备和观察期间，用溫热的碳酸 氨盐缓冲盐水持续诱注组织。为标记血管，向尾静脉静脉内注射Texas Red dex化an 70， 000MW(20mg/kg)(Invi化ogen)。当观察到外渗细胞时，静脉内注射化A-3阻断肤LXY2(8祉 g)。完成所述方案后，通过麻醉过量使动物安乐死W标记VLA-3条件性敲除(cKO)和Ela-Cre 动物中的中性粒细胞，在尾静脉中静脉内施用Alexafluor 488缀合的Grl抗体。用velocity 软件(Perki址Imer)分析成像数据。
[0101] 电子显微镜检查-通过MP-IVM首先在LysM-GFP小鼠的fMLP刺激的睾提肌小静脉上 观察到白细胞外渗。当观察到外渗细胞时，静脉内注射LXY2(8祉g)肤。然后立即将睾提肌从 安乐死后的身体切离并用2.5%戊二醒固定。对组织进一步处理W供在罗彻斯特大学的电 子显微镜研究中屯、化lectron Microscope Research Core)进行透射电子显微镜检查。
[0102] 通过生物发光测定测量MP0活性-对于体外MP0测量，使分选的中性粒细胞(5xl04个细胞/孔)重悬浮于含有肥PES和1 %FBS的缓冲液中，然后用ΙμΜ PMA刺激。PMA刺激后将化 g鲁米诺盐(5-氨基-2-，3-二氨-1,4-献嗦二酬）（Sigma，St Louis，Μ0)添加至每个孔。为测 量巧光强度，使用XenogenIVIS成像系统((?ιliperLifesciences，Ho地into，MA)对小鼠或 96孔板成像。使用Living Image 3.2软件分析图像。在ΡΜΑ不存在下添加鲁米诺产生零巧 光。
[0103] 细菌清除测定-向腹膜注射10ml PBS后收集腹腔灌洗液。进行1:100 1:1000和1: 10000稀释，并且将每种稀释液的10化1散布在膜酶大豆琼脂（化yptic Soy Agar(TSA))血 液琼脂板(3日111日1，1^日11日皿，1(日邮日3)上。使所有板在37°0溫度下解育24小时。每组的菌落计数 表示为CFU/ml。
[0104] Grr小鼠中性粒细胞的表型-从败血症小鼠的腹腔灌洗液分离细胞，并用FITC标 记的抗Grl抗体染色，并用FACS A;ria(BD Biosciences，San Diego，CA)分选为Grl?和Grl低 粒细胞。用化andon cytospin-2使细胞沉淀在载玻片上，然后用苏木精和伊红染色。在20倍 放大倍数下分析细胞的形态。
[0105] IL-6细胞因子化ISA-在指定时间点收集来自单个小鼠的血清，并通过标准夹屯、 ELISA方案测定化-6的水平。抗IL-6、捕获和检测Ab购自抓曲armingen，并且标准重组鼠 IL-6和链霉亲和素-HRP分别购自化proTecKRocky Hill,NJ)和thermo scientific。使用 TMB(The;rmo Scientific,Rockford，IL)使显色反应显色，并且用EILISA酶标仪化inetic酶 标仪;Molecular Devices)在450nm下测量。
[0106] 数据分析-所有值表示为平均值±SEM。通过单因素 AN0VA分析来自人样本的数据。 通过配对非参数t检验(Wi 1 coxon检验）分析来自鼠实验的数据。通过KaplanHVteyer log- rank检验分析存活曲线。使用Gra地Pad Prism 4.0软件进行所有统计分析。P值<0.05被认 为显著。
[0107] 实施例1-VLA-3表达在败血症中性粒细胞中增加
[0108] 中性粒细胞首先通过内皮随后通过细胞外基质的动态迁移牵设于败血症相关组 织损伤和器官功能障碍的病理生理学中（Brown等，"Neutrophils in Development of Multiple 0;rgan Failure in S邱sis/'Lancet 368:157-169(2006)，其公开内容整体W引 用方式并入本文）。虽然化（CD18)整合素，包括LFA-1(Ql化；CDlla/CD18)和Mac-l(aM化； CDUb/CD18)已显示在败血症中性粒细胞上上调并且介导全身和局部炎症期间的跨内皮迁 移（TEM)(Lin等，"Altered Leukocyte Immunophenotypes in Septic Shock.Studies of HLA-DR，CDUb，CD14，andiL^2民 e 邱 ression/'Chest 104:847-853( 1993)，其公开内容整 体W引用方式并入本文），但是存在相对较少可用的关于中性粒细胞控制间隙组织中的迁 移的能力的信息。
[0109] 中性粒细胞表达可结合至ECM蛋白的几种细胞表面整合素化indbom等， ('Integrin-Dependent Neutrophil Migration in Extravascular Tissue，，， Semin. Immunol. 14:115-121 (2002)，其公开内容整体^引用方式并入本文）D为了确定哪种 ECM结合整合素对于败血症期间中性粒细胞转运是重要的，从患有严重败血症的患者、患有 非感染性严重SIRS(全身炎性反应综合症)和健康志愿者收集循环中性粒细胞。不同于其它 整合素，与健康对照受试者相比，来自患有严重败血症的患者的中性粒细胞上VLA-3的表面 表达水平显著升高。有趣的是，在患有严重非感染性SIRS的受试者中未观察到VLA-3水平的 上调（图1A)，证明VLA-3是可辨别败血症和5135的新型细胞表面标志物。如图18所示， VLA-3表达在诊断的24-36小时内升高(n = 6)，而在恢复后水平回到正常(n = 4)。在从健康 受试者的外周血分离并与各种刺激物解育的中性粒细胞中进一步研究VLA-3的mRNA和细胞 表面水平的增加。由PMA和LPS诱导的中性粒细胞激活在刺激的1小时和3小时内诱导VLA-3 的mRNA和蛋白质水平的显著增加（图1C)。
[0110] 为在败血症期间进行VLA-3和其它ECM蛋白结合整合素的表达动力学的详细测量， 使用W下两种小鼠模型:LPS诱导的内毒素血症和盲肠结扎和穿刺(CLP)。在两种模型中，由 CD18(中性粒细胞激活的熟知标志物)升高的表面表达来证实中性粒细胞刺激（图2)。从内 毒素症和化P小鼠的骨髓、外周血和腹腔灌洗液分离的中性粒细胞的流式细胞术分析掲示 在所分析的ECM蛋白结合整合素中，仅VLA-3表达显著增强（图2)。在化P和内毒素症诱导的 腹膜炎中，在败血症发作后循环中VLA-3表达中性粒细胞的比例也增加。本文提供的结果证 明VLA-3在中性粒细胞上的表达在全身炎症期间增强，并且运一发现可能对败血症期间中 性粒细胞向外周组织募集有用。^
[0111] 实施例2-Grl胃CDUb%LA-3胃败血症中性粒细胞亚群表现促炎性表型
[0112] 有趣的是，在分离自败血症患者的活性中性粒细胞亚群中，VLA-3表达的显著增加 更明显（图3A)。运种VLA-3胃中性粒细胞群体未见于SI粉患者或健康受试者。与人患者类似， 在来自败血症小鼠的所有活性中性粒细胞(Grl胃CDUb胃)中，仅一细胞亚群表达较高水平的 化A-3 (图3B和C)。运使用针对中性粒细胞特异性标志物的Gr 1和Ly6G抗体得到证实（图3C， 下图）。
[0113] 先前已提议高炎性中性粒细胞亚型在败血症期间产生，此可引起组织损伤并导致 败血症中的M0F(E5;rown等，"Neuhophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepis/'Lancet 368:157-169(2006)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。促炎性细 胞因子(诸如IL-6、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和IL-Ιβ)的增加的全身释放和升高的MP0活性 是高反应性中性粒细胞的生物标志物（Nathan，C .，"Neutrophi Is and Immuni ty : Qiallenges and Opportunities,"化t.Rev. Immunol .6:173-182(2006)，其公开内容整体 W引用方式并入本文）。为确定Grl胃CDl lb胃VLA-3胃细胞是否与高炎性表型相关，测量促炎性 细胞因子的mRNA水平。在CLP小鼠中，Gr 1胃CD 1 A%LA-3胃中性粒细胞中IL-6、TNF-a和IL-1 β mRNAS勺表达水平显著增加，但Grl胃CDUb%LA-#群体中促炎性细胞因子的水平类似于初女台 Gr 1胃CD 1 lb%LA-3?中性粒细胞中的水平（图4A)。接下来，测量两个中性粒细胞群体(Gr 1胃 CD η b%LA-3%目对于Gr 1胃CD η b%LA-3?)中MP0的酶活性。如图4B所示，来自化P和内毒素血 症小鼠的Gr 1胃CD η b%LA-3胃中性粒细胞的MP0活性表现出相比于Gr 1胃CD η b%LA-3%田胞对 PMA刺激更高的敏感性。总之，本文提供的数据证明VLA-3是具有高炎性表型的败血症中性 粒细胞亚组的新型标志物。
[0114] 实施例3-化A3的阻断和条件性消耗通过干扰中性粒细胞外渗和迁移来改善败血 症期间的存活
[0115] 已提议阻断炎性中性粒细胞从脉管系统向组织的募集作为严重的全身炎症的治 疗（Grommes等，"Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury，"Mol.Med.17: 293-307(2011);Souto等，"Essential Role of CCR2in Neutrophil Tissue Infiltration and Multiple Organ Dysfunction in Sepsis/'Am.J.Respir.Crit.Care Med. 183:234-242(2011)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。然而，在极端情况中，运 种方法可模拟白细胞粘附缺陷，其为损害宿主针对感染的防御的通常致命的症状组。因此， 中性粒细胞外渗的一般抑制或TEM可通过在循环中留下所有活化的中性粒细胞来证明是致 命的。有趣的是，证明CD18的部分消耗可改善炎症(Wilson等/'Gene化rgeting Yields a CD18-Mu1:ant Mouse for Sl:udy of Inflammation, "J. Immunol. 151:1571-1578(1993),其 公开内容整体W引用方式并入本文）。^
[0116] 接下来评估选择性祀向VLA-3胃高炎性中性粒细胞亚组并阻断其在败血症期间的 浸润是否有益于降低多系统器官功能障碍和衰竭的严重性和败血症的死亡率。施用VLA-3 小分子括抗剂肤LXY2(Yao等，"Discovery of Targeting Ligands for Breast Cancer Cells Using the One-Bead One-Compound Combinatorial Method，"J.Med.Chem.52: 126-133(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）显著减少了患有化P(图5A)和内毒 素血症（图5B)诱导的败血症的小鼠中组织浸润性中性粒细胞的数目，而不改变局部细菌清 除率（图5C)。类似地，LXY2保护小鼠免遭败血症致命性（图加)并且降低血清中IL-6细胞因 子的水平（图5E)。
[0117] 为进入发炎组织，中性粒细胞必需穿过基底膜，其为脉管系统下面的ECM结构。 VLA-3已沿着ECM蛋白牵设于中性粒细胞趋化性，所述ECM蛋白包括纤连蛋白和层粘连蛋白， 其为基底膜的主要组分化lices等，"Receptor Functions for the Integrin VLA-3: Fibronectin,Collagen,and Laminin Binding are Difierentially Infuenced by Arg- Gly-Asp Peptide and by Divalent &tions，''J.Cell Biol. 112:169-181(1991) ;Ha;rler 等，"Promotion of Neutrophil Chemotaxis Through Difierential Regulation of Beta land Beta 2Integrins/'J.Immunol.162:6792-6799(1999)，其公开内容整体W引用 方式并入本文）。血管的MP-IVM掲示用LXY2处理小鼠显著减少响应于fMLP的中性粒细胞外 渗（图5F和5G)。另外，超微结构分析显示大部分中性粒细胞积累在内皮和基底膜之间的空 间内（图5H)，表明VLA-3和其配体之间的相互作用参与炎性情况下高反应性中性粒细胞的 外渗。
[0118] 由于死于肾脏和肺的发育缺陷的小鼠中VLA-3敲除的致命性，确定VLA-3对体内免 疫功能的精确作用具有挑战化reidberg等，"Alpha 3Beta lintegrin化S a Crucial Role in Kidney and Lung Organogenesis/'Development 122:3537-3547(1996)，，其公 开内容整体W引用方式并入本文）。 为避免运个问题并进一步评估化A-3在败血症中的功 能，通过使a3-f lox小鼠与在粒细胞弹性蛋白酶启动子下表达化e的小鼠化la-Cre)杂交产 生VLA-3的条件性敲除(〇3-沈0)。在败血症中性粒细胞上未检测到αν整合素的细胞表面表达 的增加（图2D)。因此，还产生αν整合素的条件性敲除(av-cKO)作为对照。运些cKO小鼠 W预期 的频率出生并且发育正常而没有缺陷的迹象。Ela-Cre转基因小鼠在粒细胞中表达Cre，导 致特别是在中性粒细胞中的基因缺失。证实了floxeda亚基等位基因的缺失和蛋白质不存 在（图6A和6B)。与E1 a-Cre和Qv-cKO小鼠相比，VLA-3的消耗在CLP的化内显著减少了浸润腹 膜和肺的中性粒细胞的数目和频率（图6C和6D)。败血症期间的存活被显著改善，但细菌清 除不受影响（图6E和6F)。另外，与αtv-cKO小鼠相比，a3-cK0小鼠中IL-6的水平显著降低，表 明败血症严重性降低（图6G)。为测量VLA-3移除对中性粒细胞外渗的影响，在发炎睾提肌脉 管系统中进行MP-IVM。支持本文所述的结果，与对照动物相比，a3-cK0小鼠中外渗中性粒细 胞的数目显著减少（图細和61)。总之，本文提供的数据证明整合素 VLA-3从粒细胞中选择性 消耗成功地减少了中性粒细胞的大量组织浸润并改善败血症期间的存活。
[0119] 实施例1-3的讨论
[0120] 中性粒细胞首先通过内皮随后通过ECM的动态迁移牵设于败血症相关组织损伤和 器官功能障碍的病理生理学中（Brown等，''Neuhophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepsis/'Lancet 368:157-169(2006);Kovach等，"The Function of Neutrophils in Sepsis /'Curr.Opin. Infect .Dis . 25(3): 321-7(2012)，其公开内容整体 W引用方式并入本文）。在白血球渗出穿过毛细血管内皮后，中性粒细胞必须穿过内皮下的 基底膜W迁移通过ECM并接近组织空间（Nourshar曲等，"Breaching Multiple Barriers: Leukocyte Motility Through Venular Walls and the Interstitium，" Nat.Rev.Mol. Cell Biol. 11:366-378(2010)，其公开内容整体W引用方式并入本文）dVLA- 3介导中性粒细胞通过基底膜的趋化性化yun等，"化opod Elongation is a Common Final Step in Leukocyte Extravasation Through Inflamed Vessels，"J.Exp.Med.209(7): 1349-62(2012)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。在之前的实施例中，显示整合素 VLA-3与败血症期间的大量中性粒细胞浸润相关，并且中性粒细胞上VLA-3的选择性阻断抑 制其通过基底膜的迁移。
[0121] 作为免疫防御的第一线，通常认为中性粒细胞是终末分化且同质的细胞群体。然 而，在炎症期间，中性粒细胞活跃地迁移进受感染的或发炎的组织并使其自身暴露于在疾 病进展过程中延长其存活和滞留的局部炎性介质（Colotta等，"Modulat ion of Granulocyte Survival and Programmed Cell Death by Cytokines and Bacterial Products/'Blood 80:2012-2020(1992)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。如本文所 述，提供几条独立的证据支持败血症期间存在先前未识别的VLA-3胃/高炎性中性粒细胞亚 群。首先，来自败血症人患者和鼠败血症模型的循环和组织浸润性中性粒细胞的流式细胞 术分析掲示活化的中性粒细胞亚群表达高水平的细胞表面VLA-3。其次，当人患者从败血症 恢复后，VLA-3胃中性粒细胞亚群消失。第Ξ，败血症期间显著的VLA-3表达上调与增加的促 炎性细胞因子表达、升高的MP0活性和由中性粒细胞引起的快速组织浸润相关。最后，施用 VLA-3的特异性肤抑制剂和中性粒细胞中VLA-3的选择性遗传消耗均改善了败血症小鼠的 存活。与本文所述的发现一致，新出现的证据已证明存在功能上异质的中性粒细胞亚组，包 括表现fMLP(al-Essa等，''Heterogeneity of Circulating and Exudated Polymorphonuclear Leukocytes in Superoxide-Generating Response to Cyclic AMP and Cyclic AMP-Elevating Agents. Investigation of the Underlying Mechanism，'' Biochem. Pharmacol. 49:315-322( 1995)，其公开内容整体W引用方式并入本文)和T细胞受 体（Puellmann等，"A Variable Immunoreceptor in a Subpopulation of Human 化utro地ils/'Proc.Natl .Acad.Sci .U S A103:14441-14446(2006)，其公开内容整体W引 用方式并入本文）的差异表达的那些。此外，已在小鼠（Tsuda等，"Three Dif ierent Neutrophil Subsets Exhibited in Mice with Dif ierent Susceptibilities to Infection by Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus，"Immunity21:215-226 (2004)，其公开内容整体W引用方式并入本文）和人（化akravadi等，"Reprogramming of a Subpopulation of Human Blood Neutrophils by Prolonged Exposure to 切tokines/'Lab Invest.89:1084-1099(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）中 鉴定了具有不同的细胞因子和趋化因子产生特征的两个中性粒细胞亚组，对巨隧细胞活化 的不同作用W及独特的表面抗原表达。因此本文所述的发现对哺乳动物免疫系统中中性粒 细胞功能的当前理解增加了新的方面。
[0122] 虽然活化的中性粒细胞可损伤组织，但它们也可杀灭细菌。因此，刺激的中性粒细 胞的非选择性抑制可能对患有严重败血症的患者无益并且可不利地影响宿主防御。已显示 针对对于白细胞外渗重要的粘附分子诸如&(CD18)整合素化FA-1和Mac-1)和ICAM-1 (其内 皮膜对应物配体)的抗体在某些情形下有益但与破坏性感染相关。因为危及生命的感染通 常出现在中性白细胞减少症情况中比出现在淋己细胞减少症患者中更早，所W相较于使用 干扰淋己细胞募集的药剂后所看到的结果，施用阻断中性粒细胞向受感染组织位点募集的 药剂具有更大的感染和免疫反应受损的风险。因此，治疗败血症的主要挑战是缺乏仅在异 常活化的白细胞中操纵免疫功能的治疗策略。在败血症期间，在循环和组织中观察到VLA-3 的表达增加，并且VLA-3的运种上调与扩大的中性粒细胞炎症、器官损伤和致命性相关。运 些结果证明VLA-3是高反应性和促炎性中性粒细胞的新型标志物，并且是在败血症期间针 对异常活化的中性粒细胞的抗炎性疗法的合适祀标。一致地，施用VLA-3括抗剂W及条件性 消耗中性粒细胞中的VLA-3减少了败血症小鼠的肺中浸润性中性粒细胞的数目并改善存 活。
[0123] 先前，Werr等进行的研究（Werr等/'Betal Integrins are Critically Involved in Neutrophil Locomotion in Extravascular Tissue In Vivo/'J.Exp.Med.187:2091- 2096(1998)，其公开内容整体W引用方式并入本文）已显示炎症期间外渗PMN上&整合素的 细胞表面表达高度上调，并且m整合素子族的成员除了VLA-4(a4&)和化Α-5(α5βι)外都对 血管外ΡΜΝ运动性是重要的。如本文所证明，在SIRS和严重败血症患者中，VLA-3表达水平明 显不同。SIRS在大手术或创伤后常见并且设及严重的炎症。如果SIRS伴随有确认的感染源， 则将其诊断为败血症。因此，运些结果表明除了促炎性环境外，微生物组分的较强的化R配 体介导的作用可牵设于败血症期间中性粒细胞上的VLA-3上调。因为败血症的迅速诊断保 证快速治疗，包括早期施用抗生素和控制败血症源，所W准确区分败血症与SIRS是引起有 效疗法的重要的第一步。运些数据证明VLA-3在危重患者中区分败血症和SIRS方面具有价 值，并且也代表用于控制由活化中性粒细胞的化A-3胃亚组诱导的宿主组织损伤的治疗祀 标。
[0124] 应理解W上公开的和其它特征和功能的变型或其替代物可组合到许多其它系统 或应用中。其中多种当前未预见的或意料之外的替代物、修改、变型或改进可随后由本领域 技术人员作出，运些也旨在由W下权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法，所述方法包括： 检测所述受试者中具有升高的整合素 VLA-3(CD49c/CD29)表达水平的中性粒细胞亚群 的存在，从而所述中性粒细胞亚群的存在表明所述受试者患有败血症或具有败血症的风 险。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述中性粒细胞亚群是Grl气⑶lib?。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测对获自所述受试者的生物样本进行。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样本选自血液、血浆、血清或骨髓。5. 根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样本是血液样本。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述血液样本是血清样本、全血样本、全血的亚级 分或血浆样本。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测使用流式细胞术进行。8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测在一定时间段以隔开的间隔重复。9. 根据权利要求3所述的方法，其还包括： 使来自所述受试者的所述生物样本与特异性结合至所得生物样本中的整合素 VLA-3的 试剂接触。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述试剂是单克隆抗体或其结合片段、适体或抗 体模拟物。11. 根据权利要求3所述的方法，其还包括： 使所述生物样本与特异性结合至中性粒细胞特异性标志物的试剂接触。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述中性粒细胞特异性标志物是CD16+CD62L+。13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是之前患有败血症的个体，并且所述 检测用于确定所述受试者中败血症复发的风险。14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是具有败血症倾向的个体，并且所述 方法用于败血症的早期检测。15. 根据权利要求1所述的方法，其还包括： 使用除整合素 VLA-3外的生物标志物鉴定败血症，所述生物标志物选自由以下组成的 组：活化部分凝血酶原时间（aPTT)、CD 11 b、CD25、CD64、补体肽(C3、C4、C5a)、弹性蛋白酶α 1 蛋白酶抑制剂复合物、内皮白细胞粘附分子1 (ELAm-1)、endocan、E-选择素、纤维蛋白降解 产物、生长停滞特异性蛋白6(gas-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝溶胶蛋白、IL-1受体 拮抗剂、1卜8、1卜10、几-12、几-18、干扰素诱导蛋白10(1卩-10)、层粘连蛋白、脂多糖结合蛋 白（LBP)、一氧化氮(NO)、硝酸盐、亚硝酸盐、骨桥蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂l(PAI-l)、穿 透素3、肽聚糖、血浆纤连蛋白（pFN)、II型磷脂酶A2(PLA2-II)、血清溶菌酶、可溶性ST2蛋 白、表面活性剂蛋白（A、B、C、D)、髓系细胞表达触发受体1蛋白（TREM-1)和肌钙蛋白。16. -种诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法，所述方法包括： 使来自受试者的生物样本与特异性结合至所述生物样本中的整合素 VLA-3(CD49c/ CD29)的试剂接触； 检测与所述生物样本中的整合素 VLA-3结合的所述试剂，以及 测定所述生物样本中的整合素 VLA-3的表达水平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水 平，所述生物样本中升高水平的整合素 VLA-3表明所述受试者患有败血症或处于发展败血 症的风险。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述检测使用流式细胞术进行。18. 根据权利要求16所述的方法，其中所述生物样本选自血液、血浆、血清或骨髓。19. 根据权利与要求16所述的方法，其中所述生物样本是血液样本。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述血液样本是血清样本、全血样本、全血的亚 级分或血浆样本。21. 根据权利要求16所述的方法，其中所述接触和检测在一定时间段以隔开的间隔重 复。22. 根据权利要求16所述的方法，其中所述试剂是单克隆抗体或其结合片段、适体或抗 体模拟物。23. 根据权利要求16所述的方法，其中所述整合素 VLA-3存在于中性粒细胞上。24. 根据权利要求16所述的方法，其还包括： 使所述生物样本与特异性结合至中性粒细胞特异性标志物的试剂接触。25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述中性粒细胞特异性标志物是CD16+CD62L+。26. 根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者是之前患有败血症的个体，并且所述 检测用于确定所述受试者中败血症复发的风险。27. 根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者是具有败血症倾向的个体，并且所述 方法用于败血症的早期检测。28. 根据权利要求16所述的方法，其还包括： 使用除整合素 VLA-3外的生物标志物鉴定败血症，所述生物标志物选自由以下组成的 组：活化部分凝血酶原时间（aPTT)、CD 11 b、CD25、CD64、补体肽(C3、C4、C5a)、弹性蛋白酶α 1 蛋白酶抑制剂复合物、内皮白细胞粘附分子1 (ELAm-1)、endocan、E-选择素、纤维蛋白降解 产物、生长停滞特异性蛋白6(gas-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝溶胶蛋白、IL-1受体 拮抗剂、1卜8、1卜10、几-12、几-18、干扰素诱导蛋白10(1卩-10)、层粘连蛋白、脂多糖结合蛋 白（LBP)、一氧化氮(NO)、硝酸盐、亚硝酸盐、骨桥蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂l(PAI-l)、穿 透素3、肽聚糖、血浆纤连蛋白（pFN)、II型磷脂酶A2(PLA2-II)、血清溶菌酶、可溶性ST2蛋 白、表面活性剂蛋白（A、B、C、D)、髓系细胞表达触发受体1蛋白（TREM-1)和肌钙蛋白。29. -种治疗患者的败血症的方法，所述方法包括： 进行根据权利要求1的一项所述的方法以诊断患有败血症的患者;和 施用疗法以治疗患者的败血症。30. 根据权利要求29所述的方法，其中当基于所述诊断所述患者患有败血症和/或处于 增加的败血症风险时，用于所述受试者的疗法包括施用整合素 VLA-3拮抗剂肽或抗VLA-3抗 体。31. 根据权利要求29所述的方法，其中当基于所述诊断所述患者患有败血症和/或处于 增加的败血症风险时，用于所述患者的疗法包括消耗整合素 VLA-3表达。32. 根据权利要求29所述的方法，其中当基于所述诊断所述患者患有败血症和/或处于 增加的败血症风险时，用于所述患者的疗法包括药物、疗法、外科手术或其任何组合。33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述药物是用于管理败血症抗性的药剂、整合素 VLA-3的阻断剂、抗生素或血管加压药。34. 根据权利要求32所述的方法，其中所述疗法选自由以下组成的组:施用氧、施用流 体和透析。35. 根据权利要求32所述的方法，其中所述外科手术去除败血症感染源，包括脓汁和脓 肿。36. 根据权利要求29所述的方法，其中所述施用通过口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉 内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过植入、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病变内、经皮、 通过施加至粘膜或通过引入至一个或多个淋巴结来进行。37. 根据权利要求29所述的方法，其中当所述测定表明基线整合素 VLA-3水平大于治疗 后整合素 VLA-3水平时，所述疗法是有效的。38. 根据权利要求29所述的方法，其中当所述测定表明所述基线整合素 VLA-3水平小于 所述治疗后整合素 VLA-3水平时，所述疗法无效。39. 根据权利要求29所述的方法，其还包括： 在一定时间段以隔开的间隔重复所述施用。40. 根据权利要求29所述的方法，其中所述疗法在一定时间段以隔开的间隔进行，其中 所述基线整合素 VLA-3水平在所述时间段内的中间点获得，并且所述治疗后整合素 VLA-3水 平在所述中间点后获得。41. 根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者是婴儿、少年或成人。42. -种辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法，其包括： 检测在患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素 VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群 的存在或不存在，借此所述中性粒细胞亚群的存在表明所述受试者患有败血症，而所述中 性粒细胞亚群的不存在表明所述受试者患有SIRS。43. 根据权利要求42所述的方法，其还包括： 在所述检测前选择表现败血症和/或SIRS的一种或多种临床症状的患者。44. 一种治疗患者的SIRS的方法，其包括： 进行根据权利要求42所述的方法以诊断患有SIRS的所述患者;和 向所述患者施用疗法以治疗所述SIRS。45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述疗法包括选自由以下组成的组的药剂:TNF-a和IL-1受体拮抗剂、抗缓激肽、血小板激活因子受体拮抗剂、抗凝剂(抗凝血酶III)、缓激 肽拮抗剂、泊拉得可(CP-0127 )、肾上腺素、类固醇和苯海拉明。46. 根据权利要求44所述的方法，其中所述疗法包括选自由以下组成的组的抗氧化剂： 硒、谷氨酰胺、二十碳五烯酸、褪黑激素、维生素 C和维生素 E。47. 根据权利要求44所述的方法，其中所述疗法包括施用氧、施用流体和透析。48. 根据权利要求44所述的方法，其中所述疗法包括手术去除感染源，包括脓汁和脓 肿。49. 根据权利要求44所述的方法，其中所述施用通过口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉 内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过植入、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病变内、经皮、 通过施加至粘膜或通过引入至一个或多个淋巴结来进行。50. 根据权利要求44所述的方法，其还包括： 在一定时间段以隔开的间隔重复所述施用。
【专利摘要】本发明涉及诊断受试者的败血症或败血症风险的方法以及治疗患者的败血症的方法。所述方法包括检测所述受试者中具有升高的整合素VLA-3(CD49c/CD29)表达水平的中性粒细胞亚群的存在。所述方法还包括使来自受试者的生物样本与特异性结合至所述生物样本中的整合素VLA-3(CD49c/CD29)的试剂接触，检测与整合素VLA-3结合的试剂和测定所述样本中整合素VLA-3的表达水平。本发明还涉及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法和治疗患者的SIRS的方法，其包括检测在患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群的存在或不存在。
【IPC分类】C07K14/705
【公开号】CN105555800
【申请号】CN201480049084
【发明人】M·金姆
【申请人】罗切斯特大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年8月6日
【公告号】EP3030576A1, US20160195544, WO2015021165A1
【专利说明】
[0001] 本申请要求2013年8月7日提交的美国临时专利申请序列No.61/863,266的权益， 所述申请的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0002] 本发明根据化087088、化018208和化094797(每个由美国国立卫生研究院授予)在 政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
技术领域
[0003] 公开了诊断败血症或败血症风险的方法，W及治疗患者的败血症的方法。还公开 了辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法，W及治疗患者的SIRS的方法。
[0004] 背景
[000引严重败血症，一种对与急性器官功能障碍相关的感染的全身炎性反应，是儿童和 成人中发病率和死亡率的日益增加的原因，并且已成为影响750,000个个体/年的重症护理 中最重大挑战之一，其中死亡率为大约30%(Rittirsch等，"Harmful Molecular Mechanisms in Sepsis/'Nat.Rev.Immunol.8:776-787(2008);Angus等，"Epidemiology of Severe Sepsis in the United States：Analysis of Incidence,Outcome,and Associated Costs of Care/'Crit.Care Med.29:1303-1310(2001))。促炎性信号在败血 症的早期阶段出现，并且允许循环中性粒细胞进入炎症部位并吞隧外来病原体和坏死/调 亡细胞。蛋白水解酶，诸如弹性蛋白酶和和髓超氧化物酶(MP0)存储在中性粒细胞内的嗜苯 胺蓝顆粒中，并响应于被感染部位的多种机械、热和化学刺激而释放。中性粒细胞还产生活 性氧物质诸如过氧化氨、超氧化物和一氧化氮(化than,C.，"Neu化ophiIs and Immunity: Qiallenges and 0卵ortunities /'Nat .Rev. Immunol .6:173-182(2006))。虽然运些炎性介 质对于宿主防御是重要的，但它们也参与内皮和血管外宿主组织损伤（Nathan，C.， "Neutrophils and Immunity ：Challenges and Opportunities，''Nat.Rev. Immunol.6: 173-182(2006))。因此，在不受控制的炎性病症诸如败血症中，在此期间，许多中性粒细胞 在内皮界面和在下面的组织中变得具有活性，过盛的炎性活性导致进一步的微血管功能障 碍和组织损伤（Brown等，"Neutrophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepsis/'Lancet 368:157-169(2006))。许多报道已记录极度活跃的中性粒细胞在内脏器 官的微脉管系统中隔离是多器官衰竭的主要促成因素，此为败血症的重要特点（Brown等， "Neutrophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepsis/'Lancet 368： 157-169(2006);Suda等，"Neutrophil Elastase Inhibitor Improves SurviVal of Rats With Clinically Relevant Sepsis/'Shock 33:526-531(2010);Kovach等，"The F^mction of Neuhophils in Sepsis,"Curr.Opin.Infect.Dis.25(3):321-7(2012))0因 此，中性粒细胞募集可作为败血症中的双刃剑。
[0006]治疗介入要求全身炎性病症过程中白细胞转运步骤的机械知识。还需要用于诊断 败血症，辨别败血症和全身炎性反应综合症和治疗败血症的精确方法。本申请针对克服本 领域的运些和其它不足。
[0007] 概要
[0008] -方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。该方法包括检测受试者 中具有升高的整合素 VLA-3(CD49c/CD29)表达水平的中性粒细胞亚群的存在，借此中性粒 细胞亚群的存在表明受试者患有败血症或具有败血症风险。
[0009] 第二方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。该方法包括使来自受 试者的生物样本与特异性结合至生物样本中的整合素 VLA-3(CD49c/CD29)的试剂接触;检 巧肉生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂；W及测定生物样本中整合素 VLA-3的表达水 平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，生物样本中升高水平的整合素 VLA-3表明受试者 患有败血症或处于发展败血症的风险。
[0010] 第Ξ方面设及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法。该方法包括检测 患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素 VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群的存在或不 存在，借此中性粒细胞亚群的存在表明受试者患有败血症，而中性粒细胞亚群的不存在表 明受试者患有SIRS。
[0011] 第四方面设及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法。该方法包括使来 自受试者的生物样本与特异性结合至生物样本中的整合素化A-3(CD49c/CD29)的试剂接 触;检测与生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂；W及测定生物样本中整合素化A-3的表 达水平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，升高水平的整合素 VLA-3表明受试者患有败 血症，而相对于整合素化A-3的对照水平，没有升高水平的整合素化A-3表明受试者患有 SIRS。
[0012] 中性粒细胞向感染部位的迁移对于病原体清除W及因此宿主存活至关重要。细胞 表面整合素与其对应物配体的相互作用导致循环中性粒细胞粘附并定向迁移至感染部位。 因此，整合素的重要作用是使活性中性粒细胞在感染位点聚集，从而确保它们的免疫产物 和活性在该部位保持。然而，败血症期间过度的整合素活性导致大量中性粒细胞浸润到非 感染组织和伴随相关组织损伤的扩大的炎性反应。
[0013] 随附的实施例显示，不同于其它细胞外基质结合整合素，整合素化A-3(CD49c^ CD29)在从人败血症患者和小鼠败血症模型分离的中性粒细胞亚群上显著上调。与Grl胃 CDUb%LA-#粒细胞群相比，来自败血症动物的Grl胃CDUb%LA-3胃细胞显示高炎性表型。 施用VLA-3括抗剂肤和粒细胞中VLA-3表达的条件性消耗显著减少外渗中性粒细胞的数目 并改善败血症小鼠的存活。因此，在随附实施例中提供的结果显示VLA-3是败血症中组织归 巢和高反应性中性粒细胞亚型的独特标志^并且阻断VLA-3代表通过选择性祀向高炎性、快 速组织浸润性中性粒细胞亚型(Grl胃CDUb%LA-3胃)而用于治疗败血症的新治疗方法。通过 使用多光子活体显微镜检查(MP-IVM)，显示通过施用VLA-3括抗剂肤显著减少中性粒细胞 的外渗。因此，经由VLA-3选择性祀向活性、高炎性、快速组织浸润性中性粒细胞亚型(Gr 1胃 CDUb%LA-3胃)会在败血症期间将器官衰竭减至最低。未接触初始细胞，从而避开医源性免 疫抑制，运是在其它抗炎疗法中遇到的主要问题。
[0014] 附图简述
[001引图1A-1C证明整合素 VLA-3在败血症中人中性粒细胞上上调。在图1A中，分离来自 严重非感染性SIRS患者(n = 8,年龄63.5±8.9,病症:C0PD、肺纤维化、呼吸窘迫、鱗状细胞 癌、APCAHE II评分:21±6)、严重败血症患者(n = 6,年龄53.5±15,感染源:肾脏、肺、腹部、 泌尿生殖系统，阳性血液培养:83%，APCAHE II评分:33± 12)和健康供体(η = 5，年龄41 ± 14)的中性粒细胞，并且通过流式细胞术测量整合素的表面表达。结果表示为整合素表达平 均巧光强度(MFI)与相同供体的同种型对照MFI的比率。*p<0.05。图1B显示描绘诊断后在 不同时间点VLA-3表达的强度的直方图。该图代表六名败血症患者中的一名。图1C显示分离 自健康供体的中性粒细胞用PMA( 20ng/ml)、TNF-a (20ng/ml)、LPS(100μg/ml)或fMLP(ΙμΜ) 刺激1小时或3小时。通过RT-PCR测定与未刺激细胞相比VLA-3的基因表达的倍数变化（上 图），并且通过流式细胞术测量其表面表达(下图）。结果表示3个单独供体的平均值±SEM。* p<0.050
[0016] 图2显示整合素 VLA-3在鼠败血症中上调。通过流式细胞术测量败血症小鼠中性粒 细胞上的整合素表达。在所指示的时间点，细胞分离自初始和败血症小鼠的骨髓(BM)、腹腔 灌洗液(PL)和外周血。对于MFI分析，在Grl胃粒细胞上对细胞进行设口。结果表示为相对于 初始对照的MFI的倍数增加(初始血液MFI用于计算PL表达的％变化）。结果代表四只单独动 物/时间点的平均值±561^ ^ ^
[00Π ] 图3A-3C显示Grl胃CD1化胃VLA-3胃中性粒细胞的表型。在图3A中，伪彩色图显示在分 离自健康供体、SIRS和败血症患者的中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-#群体的存在。在图3B中， 细胞分离自化化PS施用后12小时)并用CD1化和Grl抗体染色。将细胞分选为Grl胃和Grl吗立 细胞并在细胞离屯、涂片（cytospin)后用H&E染色。Grl?细胞显示具有环状或多叶核的中性 粒细胞形态，而Grl?细胞具有单核细胞样外观。伪彩色图显示在败血症小鼠的骨髓中Grl胃 CDUb胃成熟中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-#群体的存在。在图3C中，在败血症后12小时和24 小时分离来自初始和化P诱导的败血症小鼠的BM细胞，并在Grl胃CD1化胃粒细胞上设口后分 选为VLA-3胃和VLA-3%田胞(上图）。下图显示确认BM中中性粒细胞中VLA-3胃和VLA-3%田胞的 存在。将细胞针对日3&(PE)和Ly6G(APC)或Grl(FITC)进行染色。流式细胞术图显示〇3&胃和口3 姑5粒细胞群体的存在。^ ^ ^
[001引图4A-4B显示Grl胃CDUb%LA-3胃中性粒细胞具有促炎性表型。在图4A中，如图3C所 描述对细胞进行分选，并且通过RT-PCR定量IL-6、TNF-a和IL-Ιβ基因表达的差异。柱状图显 示与初始细胞相比的?音数变化。在图4B中，使用生物发光测定来测量分离自化P和内毒素血 症小鼠的ΒΜ的VLA-3胃和VLA-#细胞的髓过氧化物酶(ΜΡ0)活性。将分选的细胞(5χ104个细 胞/孔）用ΡΜΑ(ΙμΜ)在鲁米诺（luminolKlmg/孔）的存在下进行刺激，并且对发光强度进行 成像。线形图化侧)显示VLA-3胃和VLA-3%田胞中MP0活性的动力学，并且示出各自的发光图 像。
[0019]图5A-5的兑明阻断VLA-3改善存活。在图5A和5B中，细胞分离自用对照肤(8祉g/剂， 静脉内）或LXY2(8祉g/剂，静脉内）注射的败血症小鼠（CLP后8小时）的化和肺。LXY2是环状 肤CysD-AspD-Gl}f-Ty;r(3-N〇2)-Gly-4Hyp-Asn-切SD(Yao等，"Discovery of Targeting Ligands for Breast Cancer Cells Using the One-Bead One-Compound Combinatorial Method/'J. Med.化em. 52(1) :126-133(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。抗 Ly6G(或抗Gr-1)和抗CDUb抗体用于对中性粒细胞进行染色。柱状图显示化和肺中中性粒 细胞的总数目（n = 5)。在图5C中，柱状图显示在8小时时内毒素血症动物的化中中性粒细胞 的总数目。在图5D中，为测定Ξ组小鼠的化中的细菌负载，将稀释的样本在TSA血琼脂上划 线，并在37°C下解育24小时后对菌落进行计数(n = 5)。进行化P手术和内毒素血症，并且使 用Kaplan-Meyer log-rank检验分析存活W比较对照（n = 9)与LXY2(n = 9)处理的小鼠。在 图祀中，通过夹屯、ELISA测量化-6的血清水平。该图显示比-6的浓度。*p<0.05。在图5F和5G 中，在静脉内注射对照肤或LXY2(8祉g)后，通过多光子活体显微镜检查(MP-IVM)评估LysM- GFP小鼠的f MLP诱注的睾提肌血管中LXY2对中性粒细胞体内迁移的作用。在图5H中，施用 LXY2的小鼠的fMLP诱注的睾提肌微脉管系统的透射电子显微镜成像。缩写:P = PMN，L =管 腔，Peri =周皮细胞，Endo=内皮细胞。图5A、5B和5E中的结果表示为平均值±561。*口< 0.05。
[0020]图6A-6I显示条件性消耗VLA-3改善存活。在图6A中，通过使表达弹性蛋白酶化la) 启动子中的Cre的小鼠与具有floxed整合素基因的小鼠杂交来实现VLA-3(a3-cK0)和αν(αν- cKO)的条件性消耗(参见方法）。对得自使Ela-Cre和as/avflox小鼠繁殖的幼盧针对杂合基 因表达进行基因分型研究，并且显示flox和突变ere二者均存在的小鼠用于进一步繁殖。通 过突变条带(吐6;18569，日3;42769具有？1/?3，日,;15069)的存在证实整合素基因的缺失。在 图6B中，在分离自LPS注射的WT或cKO小鼠的BM和化的细胞中测量Gr 1胃CDUb胃中性粒细胞中 口3和αν的表面表达。在图6C中，细胞分离自败血症cKO小鼠（CLP后6小时）的化和肺，并且抗 LyGG/Grl和抗CDUb抗体用于对中性粒细胞进行染色。柱状图显示化和肺中中性粒细胞的 总数目（η = 6)。在图6D中，细胞分离自败血症cKO动物（6小时）的I市，并且用Ly6G/Gr 1和 CD1化抗体进行染色W用于流式细胞术。该图显示肺中Ly6G胃CDUb胃细胞的频率。在图6E中， 示出化P后6小时cKO小鼠 （n = 6/组）的化中的细菌负载。在图6F中，使用Kaplan-M巧er log- rank检验分析存活W比较cKO和Ela-化e对照小鼠 η = 12/组。在图6G中，示出如通过化ISA测 量的IL-6的血清水平。该图显示IL-6的浓度（η = 6/组）。在图6H和61中，通过MP-1VM评估 fMLP诱注的睾提肌血管中VLA-3对中性粒细胞体内迁移的影响。Ela-Cre小鼠用作a3-cK0的 对照。对于图抓、6E和6F，结果表示为平均值± SEM。*p < 0.05。
[0021 ] 详述
[0022] 本文描述的第一方面设及诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法。对于运方 面和其它方面的目的，目标"受试者"涵盖动物，包括任何哺乳动物，尤其是人。在诊断受试 者中的败血症或败血症感染风险的情形中，目标受试者涵盖处于接触败血症感染的风险的 任何受试者。尤其易受影响的受试者包括婴儿和少年，W及免疫功能不全的少年和成人W 及老年人。然而，处于败血症感染的风险的任何婴儿、少年、成人或老年人或免疫功能不全 的个体可根据本文所述的方法进行诊断。
[0023] 根据一种方法，所述方法包括检测受试者中具有升高的整合素化A-3(CD49c/ CD29)表达水平的中性粒细胞亚群的存在，借此中性粒细胞亚群的存在表明受试者患有败 血症或具有败血症风险。
[0024] 根据另一种方法，所述方法包括使来自受试者的生物样本与特异性结合生物样本 中的整合素 VLA-3的试剂接触;检测与生物样本中的整合素 VLA-3结合的试剂，并测定生物 样本中整合素 VLA-3的表达水平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水平，生物样本中升高水 平的整合素 VLA-3表明受试者患有败血症或处于发展败血症的风险。
[0025] 如本文所用，术语"样本"是获自受试者的生物样本。该生物样本可为含有中性粒 细胞的任何样本。本领域技术人员将认识到可使用血浆、全血或全血的亚级分。生物样本还 可为血清或骨髓。可使用标准程序获得运些各种生物样本W用于回收特定样本。
[0026] 例如，可通过使用标准抽血获得血液或血清样本，如WhUe的美国专利No. 4，263， 922所公开，所述专利的公开内容整体W引用方式并入本文。通常，在标准抽血中，通过针组 件和把手系统将血液抽取到收集管中。抽血之后，将针组件和把手从管末端移除，并且单独 的盖合适地盖在管的每个末端W将血液样本保持在管中W供分析。在人的情况中，用采血 针(lancet)刺破指尖取血或通过标准静脉穿刺进行抽血也是获得体液样本的便利方法。可 使抽取的血液立即暴露于抗凝剂W阻止其凝固。已知的抗凝剂包括但不限于肝素、邸TA、D- Phe-Pro-A巧氯甲基酬二盐酸盐ΓΡΡΑΟΤ'）和巧樣酸钢。
[0027] 可根据本领域已知的程序获得骨髓样本。例如，可使用针吸或其它已知技术获得 骨髓样本。在某些实例中，可使用Ficoll-Hypaq密度梯度从骨髓样本中分离细胞。用于获得 骨髓样本的其它程序包括骨活检装置，诸如中空套管或针。不管用于获取样本的工具是什 么，然后可制备骨髓样本W供随后分析(例如，固定和标记）。可根据Silva等的美国专利公 开No.2014/0038177中所描述的方法获得样本，所述专利公开的公开内容整体W引用方式 并入本文。
[0028] 根据另一个实施方案，样本可通过腹腔灌洗获得。简言之，诊断性腹腔灌洗(D化） 是将有孔的透析导管引入腹腔中W获得流体用于实验室分析。D化通过至少Ξ种不同的技 术来实施，所述技术采用略微不同的设备和方法。在所有技术中，通过放置膀脫导管和胃管 用于对膀脫和胃降压来准备患者。在一种技术（即，不公开的技术）中，通过使用尖锐的套管 针制作小皮肤切口来放置透析导管。运项技术已得到改进W降低对腹部内脏的风险。该改 进的技术使用Seldinger导丝，其被称为"导丝穿针(wire through needle)"方法。通过18 号短斜面引导针将J形尖端的弹黃导丝传入骨盆。取出针并且多孔腹腔灌洗导管沿着导丝 前行至骨盆。移除J导丝，然后使用确定的技术对腹腔液进行取样。
[0029] 炎症可分类为急性或慢性。急性炎症是身体对有害刺激的最初反应，并且通过激 活免疫细胞随后释放各种介质和增加白细胞从血液向受损组织移动来达到。持续炎症，称 为慢性炎症，导致存在于炎症部位的细胞的类型的渐进转变，并且特征在于组织从炎性过 程同时破坏和痊愈。败血症是严重的医学病症，其特征在于全身炎性状态(称为全身炎性反 应综合症或SIRS)并且存在已知或疑似感染。身体可针对血液、尿、肺、皮肤或其它组织中的 微生物发展运种炎性反应。细菌入侵其它无菌部位像腹腔导致立即开始炎性反应。对运种 反应必须的是氧自由基，其主要被产生来杀灭微生物，但也可通过膜憐脂的过氧化反应损 害宿主结构（Hampton 等，"Inside the Neutrophil Pha邑ο s ome : Ox i dan t s， Meyloperoxidase'and Bacterial Killing/'Blood 92:3007-3017(1998) ;Meie;r的WO 2013/104798,所述文献的公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0030] 败血症或败血症风险的诊断可用于由感染生物体的类型表征的Ξ种主要类型的 败血症。革兰氏阴性败血症是最常见的并且病死率为约35%。运些感染的大多数由大肠杆 菌化scherichia coli)、克雷伯氏肺炎菌化lebsiella pneumonie)和铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)引起。革兰氏阳 性病原体诸如葡萄球菌（Staphylococci)和链 球菌（S化eptococci)是败血症的第二主要原因。第Ξ主要组包括真菌，其中真菌感染引起 相对小的败血症病例百分比，但是具有高死亡率。参见Kink的W0 1999/064070,其公开内容 整体W引用方式并入本文。 ^ ^
[0031 ] 在一个实施方案中，小鼠中的中性粒细胞亚群是Gr 1胃、CD 1化胃。Grl是鼠蛋白也称 为Ly-6G(蛋白质数据库登记号P35461;还参见Fleming等，。畑aracterization of Two Novel Ly-6genes.Protein Sequence and Potential Structural Similarity to Alpha-Bungarotoxin and Other 化urotoxins/'J.Immunol.150(12)5379-5390(1993)，其 公开内容整体W引用方式并入本文）。作为糖基憐脂酷肌醇(GPI)连接蛋白，Grl在骨髓中W 发育调控方式由髓系细胞表达。虽然单核细胞在其骨髓发育过程中仅短暂表达Grl，但Grl 在骨髓粒细胞W及在外周中性粒细胞上的表达是运些群体的良好标志。
[0032] 可使用常规的分子技术鉴定非鼠细胞中Grl的同源物或等同物。例如，人中的中性 粒细胞亚群可选择性地为中性粒细胞特异性标志物CD16+CD6化+。本领域技术人员可产生 或获得由来自目标有机体的髓系细胞制备的cDNA或基因组DNA文库，并且使用用氨基酸基 序或来自Grl的序列设计的简并寡核巧酸引物例如来获得核酸探针分子W筛选基因组或 cDNA文库;还可基于蛋白质-蛋白质相互作用使用遗传方法(例如酵母双杂交系统）。可使用 多种公开可获得的生物信息学资源来筛选序列数据库中鼠 Grl的同源物。参见Cambier等的 美国专利公开No. 2004/0229354，其公开内容整体W引用方式并入本文。
[0033] 中性粒细胞亚群可选择性地由中性粒细胞特异性标志物CD14+CD16-来定义 (Soehnlein等，"Phagocyte Partnership During the Onset and Resolution of Inf lammation，"化t.Rev. Immunol. 10:427-439(2010)，其公开内容整体W 引用方式并入本 文）。在另一个实施方案中，中性粒细胞特异性标志物CD14+CD16+可定义中性粒细胞亚群 (Saha等，"Multifunctional Monocytes：Toward A Functional Characterization of Blood Mono巧tes" Immunol .Cell .Biol .89:2-4(2011)，其公开内容整体W引用方式并入本 文)。
[0034] 如在几个实施方案中叙述的检测步骤可在一定时间段内W隔开的间隔重复。确定 受试者是否患有败血症或处于败血症的风险可在暴露于感染有机体后或在此后的任何时 间立即完成。通过在治疗败血症期间或之后的各个时间点测试所选受试者的整合素 VLA-3 表达水平或具有升高的整合素 VLA-3水平的中性粒细胞亚群的存在，该确定可用作确定跟 踪治疗的方法。理想地，确定败血症或败血症风险通过暴露于感染有机体后立刻(例如在暴 露后头24小时内）获得体液样本来完成。可在暴露后多于24小时或较少时间内（例如，暴露 发生后约六小时内）从受试者获得体液样本。另外的体液样本可进一步在暴露于感染有机 体几小时、几天或几周内获得。
[0035] 根据一个实施方案，用于确定受试者是否患有败血症或处于败血症风险的生物标 志物是整合素 VLA-3。中性粒细胞上整合素 VLA-3表达与败血症的严重性强烈相关并且可区 别败血症与SIRS。当前，2-3天内诊断是不可能的，因为运种决定是基于检测到败血症病原 体作出，而败血症病原体的检测在实验室中花费多于24小时进行细菌培养。本文所述的方 法使用生物标志物整合素 VLA-3在辨别败血症和SIRS的能力方面提供显著改善。运可改善 败血症和SIRS病例的结果，因为败血症和SIRS的治疗方法显著不同，并且当使用本文公开 的诊断方法时，合适的治疗介入可在非常早的时间点开始。
[0036] 通过使来自受试者的生物样本与特异性结合所获生物样本中的整合素 VLA-3的试 剂接触进行检测整合素 VLA-3的存在。在一个实施方案中，所述方法进一步包括使生物样本 与特异性结合中性粒细胞特异性标志物的试剂接触。
[0037] 在患有败血症或处于败血症风险的个体中发现具有升高的整合素 VLA-3表达水平 的中性粒细胞亚群的存在。如本文所用，术语"升高的"意图指所获生物样本中测量的整合 素 VLA-3水平高于同时或先前测量的非败血症受试者的预测正常范围、阔值VLA-3水平或对 照样本(例如，一个或多个校准标准值）。对照样本可来自暴露于败血症感染有机体之前特 定时间的相同受试者，来自未暴露于败血症感染有机体的不同的受试者或一组受试者，或 一个或多个各含有已知量的整合素 VLA-3的校准样本。与对照或正常范围合素 VLA-3水平相 比增加的合素 VLA-3水平的存在被认定为检测败血症或败血症风险的方法。
[0038] 可使用标准免疫诊断技术包括免疫测定，诸如竞争、直接反应或夹屯、式测定来测 量化A-3生物标志物的浓度。此类测定包括但不限于蛋白质印迹、凝集测试、酶标记和介导 的免疫测定如化ISA、生物素/抗生物素蛋白型测定、放射免疫测定、免疫电泳、免疫沉淀、气 相色谱法、高效液相色谱法化PLC )、尺寸排阻色谱法、固相亲和、流式细胞术等。在一个特定 实施方案中，使用流式细胞术进行检测。也可通过在诊断学领域应用的任何类型的方法来 测量VLA-3生物标志物的浓度，运些方法包括但不限于基于酶促反应、发光(特别是巧光)或 放射性化学品的测定方法。检测方法包括快速测试形式，包括免疫色谱法（例如，条状形 式）、放射免疫测定、化学发光和巧光免疫测定、免疫印迹测定、酶联免疫测定巧LISA)、基于 luminex的珠粒测定和蛋白质微阵列测定。参见Bergmann等的美国专利公开2011/0086831， 其公开内容整体W引用方式并入本文。测定类型还可进一步为基于微量滴定板、基于忍片、 基于珠粒，其中生物标志物蛋白可附着于表面或处于溶液中。测定可为同质或异质测定、夹 屯、测定、竞争性和非竞争性测定（T皿IMMUNOASSAY HANDBOOK,David Wild编，Elsevier LTD,Oxford;第Ξ版（2005年5月）；Hultschig等，"Recent Advances of Protein Microarrays /'Qirr.Opin.化em.Biol. 10( 1) :4-10(2006)，所述文献的公开内容整体W 引 用方式并入本文）。
[0039] 如本文所用基于巧光的测定包括使用标记试剂的染料。示例性染料可例如选自包 括W下的组:FAM(5-或6-簇基巧光素）、VIC、肥D、巧光素、巧光素-异硫氯酸醋(FITCKIRD- 700/800、花青染料(诸如〔￥3、〔￥5、〔￥3.5、〔￥5.5、切7、咕吨村311地611)、6-簇基-2'，4'，7'，4， 7-六氯巧光素化EX)、TET、6-簇基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基-巧光素 α〇Ε)、Ν，Ν，Ν'，N'- 四甲基-6-簇基若丹明（TAMRA)、6-簇基-X-若丹明（ROX)、5-簇基若丹明-6G(R6G5)、6-簇基 若丹明-6G(RG6)、若丹明、若丹明绿、若丹明红、若丹明110、B0DIPY染料(诸如B0DIPY TMR)、 Oregon Green、香豆素（Coumarine)(诸如伞形酬）、苯甲亚胺（诸如Hoechst 33258);菲晚类 (诸如Texas Red、化kima Yellow、Alexa Fluor、阳T、漠乙菲晚）、日丫晚鐵染料、R卡挫染料、吩 嗯嗦染料、化嘟染料、聚甲烘染料（Polymethin dye)等。基于化学发光的测定包括基于 KI服-〇THMER，ENCY化0P邸IA oF C肥MICAL TECHNOLOGY,第4版，exec.编，J.I.Kroschwitz; 编辑Μ.Howe-Grant，John Wil巧&Sons,15:518-562( 1993)中针对化学发光材料所述的物理 原理使用染料，所述文献的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0040] 在运方面也可使用基于色谱免疫测定的原理的测流测试。测流测试使用涂敷有抗 体和/或其它反应物的试纸条，所述抗体和/或其它反应物当与存在于接触血液样本或其它 样本中的VLA-3反应后，导致出现有色线（即，指示物），表明患者中存在高于特定阔值的整 合素 VLA-3,运触发形成化A-3/抗体复合物。试纸条的一般形式表现单一测试线，即所谓的 "T线"，和单一对照线，即所谓的乂线"。对照线用作功能有效性的指示物。提供较新近的测 试试纸条，其将多个测试线分组用于检测所接触样本中多于一种物质。参见Zhou等的美国 专利公开No. US2004/0191760，其公开内容整体W引用方式并入本文。
[0041] 与整合素 VLA-3结合的试剂包括但不限于任何已知的蛋白质或肤，诸如抗体、抗体 结合片段、或抗体模拟物、核酸适体和小分子整合素 VLA-3试剂。
[0042] 在本方法的一个实施方案中，试剂是单克隆抗体、或其结合片段、适体或抗体模拟 物。如本文所用，术语"抗体"可W多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、细胞 内抗体Γ胞内抗体"）、抗体片段(例如Fv、Fab和F(ab) 2似及单链抗体(scFv)、嵌合抗体和 人源化抗体化arlow和David Lane编，USING ANTIB0DIES:A LABORATORY MANUAUCold Spring Harbor Laboratory Press，1999);Houston等，"Protein Engineering of Antibody Binding Sites：Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli，'' Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883(1988);Bird等，"Single-Chain Antigen- Binding Proteins/'Science 242:423-426(1988)，所述文献的公开内容整体 W 引用方式 并入本文）。
[0043] 天然存在的抗体通常具有两条相同的重链和两条相同的轻链，其中每条轻链通过 链间二硫键与重链共价连接，并且多个二硫键进一步将两条重链彼此连接。单条链可折叠 成具有类似大小（110-125个氨基酸)和结构但具有不同功能的结构域。轻链可包含一个可 变结构域(VL)和/或一个恒定结构域(CL)。重链也可包含一个可变结构域(VH)和/或根据抗 体的类型和同种型，Ξ个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。在人中，同种型为IgA、 I曲、I巧、IgG和IgM，其中IgA和IgG进一步被细分为亚类或亚型（IgAl-2和IgGl-4)。
[0044] 通常可变结构域从一种抗体到另一种显示相当的氨基酸序列可变性，特别是在抗 原结合位点的位置。在VL和VH的每个中发现称为高变区或互补决定区（CDR)的Ξ个区，其由 称为骨架可变区的较少可变区支撑。本发明抗体包括IgG单克隆抗体W及抗体片段或工程 改造形式。运些例如是Fv片段或其中所例示抗体的CDR和/或可变结构域被工程改造为单链 抗原结合蛋白的蛋白质。
[0045] 由化和VH结构域构成的抗体的部分被指定为Fv(可变片段)并且构成抗原结合位 点。单链Fv(scFv或SCA)是在一条多肤链上含有化结构域和VH结构域的抗体片段，其中一个 结构域的N端和其它结构域的C端通过柔性接头接合。用于产生单链抗体的肤接头通常是柔 性肤，选择其W确保发生化和VH结构域适当的Ξ维折叠。接头一般为3至50个氨基酸残基， 并且在一些情况下较短，例如约3至30个氨基酸残基，或3至25个氨基酸残基，或甚至3至15 个氨基酸残基。此类接头肤的实例包括四个甘氨酸残基重复随后是丝氨酸残基。
[0046] 单链抗体缺乏其所来源的完整抗体的一些或所有恒定结构域。因此，它们可克服 与使用完整抗体相关的一些问题。例如，单链抗体倾向于没有重链恒定区和其它生物分子 之间的某些不希望的相互作用。另外，单链抗体显著小于完整抗体并且可具有大于完整抗 体的渗透性，从而允许单链抗体更有效地定位于并结合祀抗原结合位点。此外，单链抗体相 对小的尺寸使其相较于完整抗体较不可能在接受者中激发不需要的免疫反应。
[0047] 用于单克隆抗体产生的方法在本领域中是熟知的（MONOCLONAL ANTIB0DIES- PRODUCTION'ENGI肥ERING AND CLINICAL APPLICATI0NS(Mary A.Ritter和Heather M丄adyman编，1995)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。单克隆抗体可使用杂交瘤方 法审U备，诸女日由Kohler and Milstein, '^Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity,"化 1:ure 256:495-497(1975)所描述 的那些方法，所述文献的公开内容整体w引用方式并入本文。使用杂交瘤方法，使宿主动物 免疫W引发由淋己细胞产生将特异性结合免疫抗原的抗体。一般，该过程设及从已用先前 目标抗原免疫的哺乳动物的脾获得免疫细胞(淋己细胞）。在一个实施方案中，产生针对 VLA-3肤的单克隆抗体。然后使分泌抗体的淋己细胞与骨髓瘤细胞或转化细胞融合，从而产 生永生的分泌免疫球蛋白的细胞系（Mi 1 stein和Kohler，"Derivation of Specif ic Antibody-Producing Tissue Culture and Tumor Lines by Cell Fusion，'' Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。培养所得的融合细 胞或杂交瘤，并筛选希望的单克隆抗体的产生。克隆产生此类抗体的群落，并使其在体内或 体外生长W产生大量抗体。或者，可在体外免疫淋己细胞。免疫后，分离淋己细胞并使用例 如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融合W形成然后可从未融合的淋己细胞和骨髓瘤细胞 挑选出的杂交瘤细胞。然后可使用标准方法在体外培养物中（JAMES W. G0DING，MONO化0NAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press 1986)，其公开内容整体W 引用 方式并入本文)或动物中体内作为腹水肿瘤使产生单克隆抗体的杂交瘤繁殖，所述单克隆 抗体特异性针对整合素 VLA-3,如通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合测定如放射免疫 测定(RIA)或酶联免疫吸附测定化LISA)所测定。如W上对于多克隆抗体所述，然后可从培 养基或腹水纯化单克隆抗体。
[004引 在另一实施方案中，可从使用McCafferty等，"Phage Antibodies:Filamentous Phage Displaying Antibody 化riable Domains,"化1:ure 348:552-554(1990)中所述的 技术产生的抗体隧菌体文库分离抗体或抗体片段，所述文献的公开内容整体W引用方式并 入本文。Li 等，"Platelet Fragmentation Requires a Specif ic Structural Conformation of Human Monoclonal Antibody Against盼Integrin/'J.Biol.Chem.283 (6) :3224-3230(2008其公开内容整体W引用方式并入本文，描述了使用隧菌体表面展示技 术分离能够结合来自人scFv抗体文库的VLA-3的九种单克隆人抗体。因此，运种技术是用于 分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的非常可行的替代方案。
[0049] 或者，还可使用如化billy等的美国专利4,816,567中所述的重组DNA方法制备单 克隆抗体，所述专利的公开内容整体W引用方式并入本文。通过使用寡核巧酸引物的RT- PCR从成熟B细胞或杂交瘤细胞分离编码单克隆抗体的多核巧酸，所述寡核巧酸引物特异性 扩增编码抗体的重链和轻链的基因。然后将分离的编码重链和轻链的多核巧酸克隆至合适 的表达载体中，将表达载体转染进宿主细胞，由所述宿主细胞产生单克隆抗体。而且，如所 述可从隧菌体展示文库分离希望物种的重组单克隆抗体或其片段(McCaffedy等，"Phage Antibodies：Filamentous Phage Displaying Antibody Variable Domains/'Nature 348:552-554(1990);Clackson等，"Making Antibody Fragments Using Phage Display Libraries/'Nature 352:624-628(1991);和Marks等，"By-passing Immunization:Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage，"J.Mol.Biol.222:581-597 (1991)，所述文献的公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0050] 单克隆抗体可为人源化抗体。此类抗体可在治疗上使用W在向人受试者施用时降 低抗原性和人抗小鼠抗体反应。人抗体是由人产生的抗体或具有与由人产生的抗体对应的 氨基酸序列的抗体。可通过用具有希望的特异性、亲和力和能力的非人抗体(例如，小鼠、大 鼠、兔、仓鼠等）的互补决定区取代人抗体的互补决定区（CDR)来使抗体人源化(Jones等， ('Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse/'Nature 321: 522-525( 1986);民iechmann等，（'民eshaping Human Antibodies for Therapy/'Na化re 332:323-327(1988);Verhoeyen等，"Reshaping Human Antibodies:Grafting an Antilysozyme Activity/'Science 239:1534-1536(1988)，戶片 述文献的公开内容整体^引用方式并入本文）。可使用本领域已知的各种技术产生人源化 抗体。可产生体外免疫或分离自产生针对靴抗原的抗体的免疫个体的永生化人B淋己细胞 (参见例如，Reisfeld等，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER T皿RAPy 77(Alan R丄iss 编，1985)和Garrard的美国专利No.5,750,373，所述文献的公开内容整体?引用方式并入 本文）。而且，人源化抗体可选自瞻菌体文库，其中所述瞻菌体文库表达人抗体化i等， ('Platelet Fragmentation 民equires a Specific Structural Conformation of Human Monoclonal Antibody Against03In tegrin，，'J.Biol.Chem.283(6):3224-3230(2008)， Vaughan等，('Human Antibodies with Sub-Nanomolar Affinities Isolated from a Large Non-immunized Phage Display Library/'Nature Biotechnology 14:309-314 (1996) ;Sheets等，（'Efficient Construction of a Large Nonimmune Phage Antibody Library：The Production of High-Affinity Human Single-Chain Antibodies to F*rotein Antigens，，'F*roc.Nat' 1 .Acad.Sci .U.S.A.95:6157-6162(1998) ;Hoogenboom等， ('By-passing Immunisation. Human Antibodies From Synthetic Repertoires of Germline VH Gene Segments Rearranged In VitroJ.Mol.Biol.227：381-8(1992)； Marks等，（'By-passing Immunization.Human Antibodies from V-gene Libraries Displayed on Phage，，'J.Mol. Biol. 222:581-97( 1991)，所述文献的公开内容整体W 引用 方式并入本文）。人源化抗体也可在含有人免疫球蛋白基因座，能够在免疫后在不产生内源 性免疫球蛋白的情况下产生全部人抗体的转基因小赢中制备。这种方法描述于Surani等的 美国专利No.5,545,807;Lonberg等的美国专利No.5,545,806;Lonbe巧等的美国专利No.5， 569,825;Lonberg等的美国专利No.5,625，126;Lonberg等的美国专利No.5,633,425;和 Lonberg等的美国专利No. 5,661，016,所述专利的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0051] 除了利用完整抗体外，本文的方法涵盖使用此类抗体的结合部分。此类结合部分 包括Fab片段、F(ab)2片段、Fal/片段、F(al/)2片段、Fd片段、Fd^片段、Fv片段和微抗体，例 如，抗体重链可变结构域的61个残基的子结构域(Pessi等，"A Designed Metal-binding Protein with a Novel Fold/'NaUire 362:367-369(1993)，其公开内容整体^引用方式 并入本文）D 结构域抗体（dAb)(参见例如，Ho It等，"Domain Antibodies : Proteins for Therapy/'Trends Bio technol · 21:484-90(2003)，其公开内容整体^引用方式并入本文） 也适于本文公开的方法。这些抗体片段可通过常规程序制备，诸如如J.Goding，M0N0化0NAL ANTIB0DIES:PRINCIPLES AND PRACTICE 98-118(1984)中所述的蛋白水解断裂程序，所述 文献的公开内容整体W引用方式并入本文。
[0052] 另外，单链抗体也是适合的（例如，Huston的美国专利No.5,476,786和加 ston和 Oppermann白勺美国专禾l」No . 5，132,405 ;Huston等，（'Protein Engineering of Antibody Binding Sites:民ecovery of Specific Activity in an Anti-digoxin Single-chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli，，'Proc .Nat^ 1 Acad. Sci .USA 85:5879-83 (1988) ;Ladner等的美国专利No .4,946,778;Bird等，"Single-chain Antigen-binding Proteins/'Science 242:423-6(1988);Ward等，"Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli，'' Nature 341:544-6(1989)，所述文献的每一个的公开内容整体W引用方式并入本文）。单链 抗体通过经由氨基酸桥连接Fv区的重免疫球蛋白链片段和轻免疫球蛋白链片段而形成，从 而产生单链多肤。本文还涵盖使用单价抗体。sdAb可天然产生，即通过免疫单峰骆驼、骆驼、 美洲驼、羊驼或整鱼来产生(Ghahroudi等，"Selection and Identification of Single Domain Antibody Fragments from Camel Heavy-Chain Antibodies/'FEBS Letters 414 (3) :521-526(1997)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。或者，抗体可在微生物中产生 或源自常规完整抗体化armsen等，"Properties production，and Appl ications of Camelid Single-Domain Antibody Fragments/?ρρ?.Microbiol.Biotechnology 77:13- 22(2007)，Holt等，"Domain Antibodies：Proteins for Therapy，"Trends Biotech.21 (11) :484-490(2003),其公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0053] Ξ链抗体是将两个scFv片段与化b片段组合的多功能重组抗体衍生物。Fab片段用 作特定的异二聚化信号，并且两个scFv片段各自与不同的化b链融合（Schoonjans等， "Efficient Heterodimerization of Recombinant Bi-and Trispecific Antibodies，" Bios巧aration 9(3): 179-183(2000)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。
[0054] 双链抗体是小的二价和双特异性抗体片段，其包含在同一多肤链(VH-化)上与轻 链(VL)可变结构域连接的重链(VH)可变结构域，所述多肤链由肤接头连接，所述肤接头太 短而不足^允许同一链上两个结构域之间配对化〇11;[]1旨日1'等，"'01日13〇(11日3'：51]1日11 Bivalent and Bispecific Antibody Fragments/'Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14)： 6444-6448( 1993)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。
[005引针对VLA-3的示例性抗体包括而不限于如下可商购获得的那些：LS-A81 36 (Lifespan Biosciences)、LS-A8140(Lifespan Biosciences)、LS-C123048化ifespan Biosciences)、LS-C44108(Lifespan Biosciences)、PA1621(Booster Immunoleader)、 MCA1948PE(AbD Serotec)、MCA1813(AbD Serotec)、MCA1948FT(AbD Serotec)、MCA1948 (AbD Serotec)、HPA008572(Atlas Antibodies)、17-0494-41(eBioscience)、17-0494-42 (eBioscience)、:343805 (BioLegend)、:343804(BioLegend)、:343802(BioLegend)、:343801 (BioLegend)、ABIN968338(antibodies-online)、ABINI 12369(antibodies-online)、 ABIN112368(antibodies-0nline)、ABINl12371(antibodies-0nline)、MAB1952Z(Merck Millipore)、CPlll^-100UG(Merck Millipore)、AB1920(Merck Millipore)、MAP1952(Merck Millipore)XWB-252CD8(Genway)^GWB-33C613(Genway)^GWB-390721 (Genway) XWB- 4A5FF0(Genway)、PA1-28601(Thermo Fisher Scientific，Inc .)、MAl-27165(Thermo Fisher Scientific，Inc.)、MAl-34075(Thermo Fisher Scientific，Inc .)、MAl-70075 (Thermo Fisher Scientific,Inc .)、251177(At)biotec)、251428(Abbiotec)、orb 14075 (Biorbyt)、orbl3512(Biorbyt)、AP20567PU-N(Acris Antibodies)、BM6022P(Acris Antibodies)、SMI 544A(Ac;r is Antibodies)、BM6023P( Acr is Antibodies)、69475 (NovaTeinBio)、119-17485(Raybiotech)、119-17484(Raybiotech)、0ASA02153(Aviva Systems Biology)、0ASA02147(Aviva Systems Biology)、0ASA02150(Aviva Systems Biology)、0ASA02155(Aviva Systems Biology)、CABT-20410MH(Creative Biomart)、 CABT-29879MH(Creative Biomart)XABT-29877MH(Creative Biomart)XABT-29881MH (Creative Miomad)、XW-7793(ProSci)、NBPl-40612(Novus Biologicals)、NBPl-61615 (Novus Biologicals)、NB100-2675(Novus Biologicals)、NB100-64901(Novus Biologicals)、]；7661-33D(加 ited States Biological)、I7661-33C(United States Biological)、I7661-33C(United States Biological)、I761133Dl(United States Biological)、I7661-33M化nited States Biological)、AF2787(R&D Systems)、MAB1345 (R&D Systems)、FAB1345A(R&D Systems)、FAB1345A(R&D Systems)、FAB1345F(R&D Systems )、sc-59967( Santa Cruz Biotechno1ogy)、sc-32237 ( Santa Cruz Biotechnology)、sc-6587(Santa Cruz Biotechno logy)、sc-6592(Santa Cruz Biotechnology)、bs-1057R(Bioss)、bs-2093R(Bioss)、ab131055(abeam)、ab133198 (abeam)、abl1767(abeam)、abl25120(abeam)、abl40919(abeam)、ab20141(abeam)、ab91043 (abeam)、ab20140(abcam)、abll5912(abcam)、ab91050(abcam)、ab30488(abcam)、ab30489 (abeam)、abl81432(abcam)和abl90731(abeam)。
[0056] 适体是在分子识别方面代表抗体的替代物的一类分子。适体是具有W高亲和力和 特异性识别几乎任何类型的祀分子的能力的肤或寡核巧酸序列。此类配体可通过随机序列 文库的指数富集配体的系统进化(沈LEX)来分离，如Tuerk和Gold, "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment:RNA Ligands to Bacteriophage T4DNA 化lymerase/'Science 249(4968): 505-510( 1990)所述，其公开内容整体W引用方式并入 本文。随机序列文库可通过DNA的组合化学合成而获得。在该文库中，每个成员是独特序列 的最终经化学修饰的线性低聚物。该类分子的可能修饰、用途和优点已在Jayasena， "Aptamers:An Emerging Class of Molecules that Rival Antibodies in Diagnostics /'Clin.Qiem.45(9): 1628-1650(1999)中进行综述，所述文献的公开内容整体 W引用方式并入本文。
[0057] 抗体模拟物也适用于本文。示例性抗体模拟物包括而不限于称为单抗体 (monobody)的那些，所述单抗体源自第十人III型纤连蛋白结构域(1中n3KKoide等，叮he Fibronectin Type III Domain as a Scaffold for Novel Binding Proteins，" J.Mol.Biol.284:1141-1151(1998);Koide等，"Probing Protein Conformational Changes in Living Cells by Using Designer Binding Proteins：Application to the Estrogen Receptor/'Proc.化t'l Acad.Sci.USA 99:1253-1258(2002)，所述文献的每个 的公开内容整体W引用方式并入本文）；和称为亲和抗体(aff化ody)的那些，所述亲和抗体 源自葡萄球菌蛋白A的稳定的α-螺旋细菌受体结构域Z(Nord等，"Binding Proteins Selected from Combinatorial Libraries of an alpha-helical Bacterial Receptor Domain/'化ture Biotechnol. 15(8) :772-777(1997)，其公开内容整体W引用方式并入本 文）。运些抗体模拟物中的变化可通过取代运些多肤的一个或多个结构域然后筛选经修饰 的单抗体或亲和抗体的整合素 VLA-3结合特异性来产生。
[0058] 用于产生多克隆抗体的程序也是熟知的。可根据已知方法通过W下方式产生多克 隆抗体和其片段：向尤其选自例如猪、牛、马、兔、山羊、绵羊和小鼠的宿主动物施用适当的 抗原或表位，然后回收来自所述宿主动物的血清(含有抗体）。本领域已知的各种佐剂可用 于增强抗体产生。用于产生多克隆抗体的程序公开在Ed化rlow和David Lane, USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Cold Spring 化rbor Laborato巧 Press,1988)中，其 公开内容整体W引用方式并入本文。虽然抗体可为多克隆的，但可使用纯化技术使多克隆 抗血清成为单特异性的。
[0059] 在具体的实施方案中，运些检测方法设及使所获样本与能够选择性地与化A-3生 物标志物相互作用的结合配偶体接触。在一个实施方案中，结合配偶体是抗VLA-3抗体，其 是指识别整合素 VLA-3的抗体或其结合片段。抗VLA-3抗体可W是多克隆的或单克隆的，理 想地为单克隆的，W及特异性结合整合素 VLA-3的其任何片段。在另一个实施方案中，结合 配偶体是抗体模拟物，其可为核酸或肤适体，或含有一个或多个特异性结合整合素 VLA-3的 可变区的多肤支架。
[0060] 前述结合测定可设及使结合配偶体(即抗体、抗体模拟物或适体)与固体支撑物结 合。可使用的固体支撑物包括而不限于基质如硝化纤维素（例如，呈膜或微量滴定孔的形 式）；聚氯乙締(例如，片或微量滴定孔）；聚苯乙締乳胶(例如，珠粒或微量滴定板）；聚偏氣 乙締;重氮纸;尼龙膜;活化珠粒、磁性响应珠粒等。
[0061] 在运些测定中使用的结合配偶体可用可检测的分子或物质标记，所述可检测的分 子或物质诸如上述类型的巧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其它标记。标记为本 领域已知的，其一般提供(直接地或间接地)信号。如本文所用，关于结合配偶体的术语"标 记的"旨在涵盖通过将可检测的物质诸如放射性试剂或巧光团（例如，巧光素异硫氯酸醋 (FITC)或藻红蛋白（PE)或說青(切5))与结合配偶体偶联（即，物理连接)来直接标记结合配 偶体，W及通过与可检测物质的反应性来间接标记结合配偶体。结合配偶体可通过本领域 已知的任何方法用放射性分子标记。例如放射性分子包括而不限于 Reiss。取决于所用的测定和检测方法，抗体可任选地与其它蛋白质或化学标记物缀合W促 进与化A-3结合的抗体的检测。抗体可与酶组分诸如碱性憐酸酶或可容易检测的基团诸如 胶体金、生物素和链霉亲和素缀合。其它合适的缀合剂在本领域是熟知的。参见Kelley的美 国专利公开No. 2004/0115748，其公开内容整体W引用方式并入本文。
[0062] 可通过流式细胞术检测VLA-3和中性粒细胞标志物。流式细胞术已广泛用于鉴定 慢性脱髓銷疾病实验鼠模型W及脑缺血鼠模型中的中枢神经系统中的白细胞群体(参见 Tjoa等，"The Use of Flow Cytometry to Assess Neutrophil Infiltration in the Injured Murine Spinal Cord,"J.化urosci.Meth. 129:49-59(2003)，其公开内容整体W 引用方式并入本文）。流式细胞术可测量回收在特定样本中的中性粒细胞上的整合素表达。 可使用ACK裂解缓冲液（Invitrogen，San Diego，CA)进行RBC裂解。之前稀释或未稀释的样 本可用例如尤其是标记的抗Grl、标记的抗Ly6G和标记的抗CD1 lb(eBioscience，San Diego，CA，）进行染色。样本可用任何合适的固定剂，诸如超冷醇或3.7%甲醒进行固定。可 在FACS CalUber流式细胞仪(BD Biosciences，San Diego，CA)或等同的流式细胞仪上收 集细胞数据。在指出的时间点，移除样本，并且通过使用例如配备有CellQuest软件的 Becton Dickenson FACScan的流式细胞术测量细胞的前向和侧向散射参数W及细胞表面 标志巧光。
[0063] 在另一个实施方案中，ELISA方法用于测量整合素化A-3浓度，其中微量滴定板的 孔涂敷有特异性结合整合素 VLA-3或中性粒细胞特异性标志物诸如Gr-1、CD14、CD16或CD62 的一组抗体。然后将之前稀释或未稀释的体液样本添加到涂敷孔中。在解育一段时间足W 允许形成抗体-抗原复合物后，可洗涂板w除 去未结合的部分并添加可检测标记的第二结 合分子。使第二结合分子与任何捕获的整合素 VLA-3反应，洗涂板，并且使用本领域熟知的 方法检测第二结合分子的存在。
[0064]在另一个实施方案中，可使用阵列忍片进行体液样本的整合素 VLA-3浓度测量。运 种阵列技术允许在单一基质上同时进行大量实验，当用于生物分析物时所述基质通常称为 生物忍片。例如，之前稀释或未稀释的整合素 VLA-3或中性粒细胞特异性标志物诸如Gr-1、 CD14XD16或CD62的结合配偶体可固定在阵列忍片的表面。将获自受试者的体液样本任选 地稀释并然后存放在阵列忍片上。在解育一段时间足W允许形成结合配偶体-VLA-3复合物 后，洗涂阵列忍片W除去未结合的部分，因此大体分离化A-3阳性中性粒细胞或中性粒细 胞。在第二步中，可用用于无标记检测的合适的检测方案或使用用于标记检测对整合素 VLA-3特异的第二结合配偶体的合适的检测方案进行整合素 VLA-3浓度的测量。在一个实施 方案中，对第二结合配偶体进行标记，因此允许形成对整合素化A-3特异的一组"斑点"（有 色沉积）。例如，可通过用特定检测器分析阵列忍片上的斑点来进行检测和定量。
[006引上述鉴定的捕获测定还可在通过FACS分选大体上分离中性粒细胞群体或化A-3+ 中性粒细胞群体，然后破坏细胞W释放用于蛋白质定量的自由的表面标志物后进行。
[0066] 确定败血症或败血症的风险可基于化A-3生物标志物的存在或水平来进行，或其 可基于另外的诊断标志物或生物标志物进行。存在可用于帮助检测或诊断败血症或败血症 的风险的许多另外的生物标志物。运些生物标志物包括但不限于活化部分凝血酶原时间 (曰口1'1')^01化^025八064、补体肤似八4^5曰）、弹性蛋白酶曰1蛋白酶抑制剂复合物、内皮 白细胞粘附分子UELAm-l)、endocan、E-选择素、纤维蛋白降解产物、生长停滞特异性蛋白6 (gas-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝溶胶蛋白、比-1受体括抗剂、化-8、化-10、比-12、 IL-18、干扰素诱导蛋白lO(IP-lO)、层粘连蛋白、脂多糖结合蛋白化BP)、一氧化氮(NO)、硝 酸盐、亚硝酸盐、骨桥蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂l(PAI-l)、穿透素3、肤聚糖、血浆纤连蛋 白（pFN)、11型憐脂酶A2(PLA2-II)、血清溶菌酶、可溶性ST2蛋白、表面活性剂蛋白（A、B、C、 D)、髓系细胞表达触发受体1蛋白（TREM-1)和肌巧蛋白。败血症的生物标志物进一步在 Pierrakos 等，"Sepsis Biomarkers:A Review/'Critical &re 14:R15(2010)中讨论，其 公开内容整体W引用方式并入本文。
[0067] 受试者可为之前患有败血症的个体，并且所述检测用于确定所述受试者中败血症 复发的风险。在一个特定的实施方案中，受试者是具有败血症倾向的个体，并且所述方法用 于败血症的早期检测。
[0068] 在用所公开的方法评价受试者W评估败血症或败血症风险的存在后，诊断的结果 将决定所测试受试者的治疗过程(如果有的话）。
[0069] 因此，另一方面设及治疗患者的败血症的方法。所述方法包括进行本文所公开的 方法之一W诊断患有败血症的患者和施用疗法W治疗所述患者的败血症。
[0070] 在一个实施方案中，当基于所述诊断患者患有败血症和/或具有增加的败血症风 险时，用于受试者的疗法包括施用VLA-3括抗剂肤或抗VLA-3抗体。示例性的VLA-3括抗剂肤 包括而不限于环肤1^乂￥1和1^(￥2(分别是切3〇-43口〇-61厂1^611-61厂4而口-43]1-〔73〇和切3〇- AspD-Gly-Tyr(3-N〇2)-Gly-4Hyp-Asn-CysD) (Yao等，''Discovery of Targeting Ligands for Breast Cancer Cells Using the One-Bead One-Compound Combinatorial Method/'J.Med.畑em. 52(1) :126-133(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）、 Accutin(Yeh等，"Accutin，A New Disintegrin，Inhibits Angiogenesis In Vitro and In Vivo by Acting as Integrin AlphavbetaSAntagonist and Inducing Apoptosis，'' Blood 1998 92(9):3268-76(1998),其公开内容整体W引用方式并入本文）、和G1厂Arg- Gly-Asp(GRGD)(Chen等，"Signaling and Regulatory Mechanisms of IntegrinalphaSbetalon the Apoptosis of Cultured Rat Podocytes，''J. Lab Cl in. Med. 147 (6): 274-80 (2006)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。示例性的抗VLA- 3抗体包括上述那些或其人源化变体。
[0071] 在另一个实施方案中，当基于所述诊断患者患有败血症和/或具有增加的败血症 风险时，用于患者的疗法包括消耗整合素 VLA-3表达。在另一个实施方案中，当基于所述诊 断患者患有败血症和/或具有增加的败血症风险时，用于患者的疗法包括药物、疗法、外科 手术或其任何组合。
[0072] 治疗方法还可包括为用于管理败血症抗性的药剂的药物、VLA-3的阻断剂、抗生 素、血管加压药或其组合。运些药剂可W单一形式或多种不同组合物的形式施用。
[0073] VLA-3阻断剂包括而不限于反义分子、siRNA分子、shRNA分子和miRNA分子。
[0074] 能够与编码整合素 VLA-3的RNA转录物杂交的反义核酸分子从转基因表达，所述转 基因通过将编码整合素化A-3的DNA分子或其片段或变体W相对于表达载体的启动子和y 调控序列的相反定向连接至表达载体而制备。转录DM分子后，所得RNA分子将与编码实际 蛋白质或多肤产物的mRNA转录物互补。W相反定向连接DNA分子可根据本领域标准的已知 技术来进行。可将重组分子，包括反义序列或其寡核巧酸片段在体内使用递送媒介物直接 引入组织的细胞，所述递送媒介物诸如逆转录病毒载体、腺病毒载体和DNA病毒载体。也可 使用物理技术(诸如显微注射和电穿孔)或化学方法(诸如DNA共沉淀和并入脂质体内）将它 们在体内引入细胞。
[00巧]作为全长反义VLA-3mRNA的替代选择，SiRNA可用于结合化A-3DsiRNA是长度大约 20-25个核巧酸两端均具有短的2-3个核巧酸的y突出的双链合成RNA分子。双链SiRNA分子 代表一部分勒ImRNA分子(在运种情况下一部分VLA-3核巧酸序列）的有义和反义链。S iRNA分 子通常被设计成祀向mRNA祀标的从起始密码子下游起大约50-100个核巧酸的区域。当引入 细胞后，SiRNA复合物触发内源性RNA干扰(RNAi)途径，从而导致祀mRNA分子的裂解和降解。 [0076]已描述了SiRNA组合物的各种改进，诸如将经修饰的核巧酸或基序并入SiRNA分子 的一条链或两条链W增强稳定性、特异性和功效，并且根据运个方面适于使用（参见例如， Giese等的W0 2004/015107;McSwiggen等的W0 2003/070918; Imanishi等的W0 1998/ 39352; Jesper等的美国专利申请公开No . 2002/0068708 ;Kaneko等的美国专利申请公开 No. 2002/0147332 ;Miat等的美国专利申请公开No. 2008/0119427，其公开内容整体W引用 方式并入本文）。
[OOW]短或小发夹RNA分子在功能上与SiRNA分子类似，但包含构成紧密发夹环（tight hai巧in turn)的较长RNA序列。通过细胞机构将shRNA裂解成SiRNA,并且经由细胞RNA干扰 途径使基因表达沉默。已经开发了有效干扰人整合素 VLA-3表达的ShRNA分子，并且其适用 于本文所述的方法。
[0078]用于本文所述的任何方面的另外疗法包括而不限于施用氧、施用流体、透析、去除 败血症感染源(包括脈汁和脈肿）的外科手术或任何前述药物组合物。针对VLA-3的示例性 RNAi包括而不限于H00003675-R01 (Novus BiologicalS)和H00003675-R02(Novus Biologicals)。用于选择用于序列已知的基因的合适的RNA或RNA编码载体的方法在本领域 熟知（例如参见^Tuschl等，"Targeted mRNA Degradation by Double-Shanded RNA In Vitro/'Genes Dev. 13:3191-7( 1999) ;Hannon，G J.，"RNA Inte;rference，''化 ture 418: 244-251(2002);McManus等，"Gene Silencing Using Micro-RNA Designed Hairpins，" RNA 8:842-850(2002);Graham的美国专利No.6,573,099、Fire等的美国专利No.6,506， 559、Zernicka-Goetz等的WO 01/36646、Fire等的WO 99/32619和Beach等的WO 01/68836， 其公开内容整体W引用方式并入本文。
[0079] 用于治疗患有败血症的患者的药物组合物还含有药学上或生理上可接受的载体、 赋形剂或稳定剂。药物组合物可W呈固体或液体形式，诸如片剂、胶囊、粉剂、溶液、悬浮液 或乳液，并且可口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内施用、通过鼻内滴注、通过腔内 或膀脫内滴注施用、眼内、动脉内、病变内施用、通过施加至粘膜，诸如鼻、咽喉和支气管的 粘膜施用，或通过引入至一个或多个淋己结施用。对于大多数治疗目的，可静脉内或肠胃外 施用肤或核酸。
[0080] 对于可注射剂量，一种或多种治疗剂的溶液或悬浮液可在具有药物载体的生理上 可接受的稀释剂中制备。此类载体包括无菌液体，诸如水和油，添加或不添加表面活性剂和 其它药学上或生理上可接受的载体，包括佐剂、赋形剂或稳定剂。例证性的油为石油、动物 油、植物油或合成来源的油，例如，花生油、大豆油或矿物油。通常，水、生理盐水、葡萄糖水 溶液和相关糖溶液，和二醇，诸如丙二醇或聚乙二醇，是尤其用于可注射溶液的液体载体。
[0081] 对于用作气溶胶，溶液或悬浮液中的一种或多种治疗剂可连同合适的推进剂一起 包装在加压气溶胶容器中，所述推进剂例如控推进剂，如具有常规佐剂的丙烷、下烧或异下 烧。所述材料还可W非加压的形式施用，如喷雾剂或雾化剂。
[0082] 可对其它本领域已知的递送系统进行改进W用于递送W上所述的治疗性蛋白质、 肤或核酸分子。
[0083] 另一方面设及监测任何败血症疗法的功效。在一个实施方案中，运通过确定基线 整合素 VLA-3水平是否大于治疗后整合素 VLA-3水平来进行。如果如此，那么疗法是有效的。 或者，如果基线整合素 VLA-3水平小于治疗后整合素 VLA-3水平，那么疗法无效并且应选择 新的治疗介入。
[0084] 合适的整合素 VLA-3表达的参照水平度量获自非患病组织但不必源自正诊断的相 同受试者的样本中的败血症或败血症风险。在一个实施方案中，整合素 VLA-3表达的参照水 平获自代表与正用于诊断的样本相同的组织或细胞类型的样本。参照水平可W是来自受试 者的正常非患病样本中的整合素 VLA-3表达。或者，参照水平可获自来自个体群的非患病组 织。
[0085] 本文描述的当前方面的方法可进一步包括在一定时间段W隔开的间隔重复所述 施用。在一个实施方案中，在一定时间段W隔开的间隔进行所述疗法，其中基线整合素 VLA- 3水平在所述时间段内的中间点获得，并且治疗后整合素 VLA-3水平在所述中间点后获得。
[0086] 第四方面设及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法。所述方法包括检 测在患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素 VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群的存在 或不存在，借此所述中性粒细胞亚群的存在表明所述受试者患有败血症，而所述中性粒细 胞亚群的不存在表明所述受试者患有SIRS。该方法根据W上所述的方面进行。
[0087] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括在所述检测之前选择表现败血症和/或 SIRS的一种或多种临床症状的患者。在辨别两种病症后，可施用合适的疗法。败血症治疗如 上所述。
[0088] 本文所述的该方面的疗法可包括但不限于选自由W下组成的组的药剂:TNF-a和 IL-1受体括抗剂、抗缓激肤、血小板激活因子受体括抗剂、抗凝剂(抗凝血酶III)、缓激肤括 抗剂、泊拉得可(deltibant)(CP-0127)、肾上腺素、类固醇和苯海拉明。或者，疗法可包括选 自由W下组成的组的抗氧化剂:砸、谷氨酷胺、二十碳五締酸、稱黑激素、维生素 C和维生素 E。
[0089] 对于SIRS治疗的进一步讨论，参见Fein等，"Treatment of Severe Systemic Inflammatory Response Syndrome and Sepsis With a Novel Bradykinin Antagonist， Deltibant(CP-〇127).Results of Randomized,Double-Blind,Placebo-Controlled Trial.CP-0127SIRS and Sepsis SUidy Group/'JAMA 277(6) :482-87(1997) ;Berger等， "Antioxidant Supplementation in Sepsis and Systemic Inflammatory Response Syndrome，" Crit. Care Med . 3 5(增刊 9) : S584-90 (2007); Rina Ido 等，''Anti oxidant Therapy in Critically Septic 化tients/'Curr.Drug Targets 10(9):872-80(2009); Bulger等，"An Argument for Vitamin E Supplementation in the Management of Systemic Inflammatory Response Syn化ome，"化ock 19(2) :99-103(2003),其公开内容 整体W引用方式并入本文。
[0090] 另一方面设及治疗受试者的SIRS的方法，其包括进行根据本文所述的先前方面的 方法W诊断患有SIRS的患者；和向所述患者施用疗法W治疗SIRS。该方法根据W上所述的 方面进行。因此，诊断患有SIRS的患者可设及关于败血症的阴性结果。治疗SIRS可使用W上 所述的程序进行。
[0091] 应理解某些方面、方式、实施方案、变型和特征W不同层次的细节进行描述W提供 对当前技术的基本了解。也提供了如在本说明书中使用的某些术语的定义。除非另外定义， 否则本文使用的所有技术和科学术语一般具有如此所属领域普通技术人员通常所理解的 相同含义。 实施例
[0092] 提供W下实施例W说明所要求保护的发明的实施方案但绝不旨在限制其范围。
[0093] 实施例1-4的材料和方法
[0094] 败血症小鼠模型-根据罗彻斯特大学委员会批准的动物资源协议（Animal Resource Protocol)进行内毒素血症和化P。对于内毒素血症测定，对8-12周龄巧7BL/6 化arlan)雄性小鼠称重并通过腹膜内（IP)注射施用LPS(大肠杆菌055:B，Sigma-Al化ich) W达到LD90死亡率。在异氣烧吸入麻醉下进行化P存活手术。结扎盲肠并用21号针彻底刺 穿。通过皮下注射1ml乳酸林格氏溶液使所有小鼠恢复知觉。对于VLA-3阻断实验，在化P或 内毒素血症后2小时通过静脉内（IV)施用并且8小时、32小时通腹膜内施用LXY2(8如g) (切SD-AspD-Gl}f-Ty;r ( 3-N02 )-Gly-4Hyp-Asn-切SD)(其中氨基酸可为D氨基酸）或对照（8祉 g)(Peptide International)肤。监测存活持续 120小时。
[0095] 条件性敲除动物的产生-为产生粒细胞特异性整合素敲除小鼠，从欧洲小鼠变异 库化uropean Mouse Mutant Archive化MMA))购买粒细胞弹性蛋白酶2(Ela)-Cre敲入小 鼠，在所述小鼠中化e-重组酶代替Ela基因在髓系细胞中表达，从而允许标记有loxP位点的 革己基因的髓样前体细胞条件性诱变（Tkalcevic等，"Impaired Immunity and Enhanced Resistance to Endotoxin in the Absence of Neutrophil Elastase and Cathepsin G/'Immunity 12:201-210(2000)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。使Ela-Cre小鼠 与a3-Flox和Qv-Flox小鼠杂交四至五代W实现日3和αν基因在转基因小鼠中的缺失。由自尾 组织分离DNA通过PCR对小鼠进行基因型分析。对于Ela-Cre，引物F(CAT GAC ACC CCC ACT GTCGTGTCC)(WQIDN0:l)、R(TGGCACCACAGAAATGACCTCCAC)(SEQIDN0:2WPLx (ΤΤΤ GGT GCA CGG TCA GCA GAT TGGKSEQ ID顯：3)用于产生对于*巧日突变型分别为 615bp和 18加 p的条带。对于整合素03引物P1(GAA CAA CAT CTG CCT GGA GTKSEQ ID NO: 4)和P2(GTA TGA CTT CTG CCATGTAGCKSEQ ID 側:5)用于产生对于*巧的1〇义分别为4426口 和494bp的条带。使用引物PI和P3(CAA CAG CAC TGC TGT AGC A)(沈Q ID N0:6)产生427bp 的条带来证实通过Cre介导的重组去除基因（Margadant等，"Integrin AlphaSbetalInhibits Directional Migration and Wound Re-Epithelialization in the Skin/'J.Cell Sci. 122:278-288(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。对于 整合素 αν引物F(GGT GAC TCA GAC CTT CAG C)(SEQ ID N0:7)和Rev(CAC AAA TCA AGG ATG ACC AAA CTG AG)(沈Q ID N0:8)用于产生550bp的条带，对于野生型和floxed小鼠是 700bp，并且Cre介导的缺失后是 150bp化acy-Hulbe;rt等，"Ulcerative Colitis and Autoimmunity Induced by Loss of Myeloid Alphav Integrins，'' Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 104:15823-15828(2007)，其公开内容整体W引用方式并入本 文）。对于所有实验和进一步繁殖，选择具有栋色毛色化la-化e亲本的毛色）的转基因小鼠。
[0096] 中性粒细胞的分离和体外刺 激-经由肘前静脉穿刺从健康志愿者收集血液至含有 肝素的采血管（va州tainer)中。经由1步多晶型（Fresenius Kabi Norge AS)密度梯度通过 离屯、从全血分离粒细胞和红细胞。通过低渗裂解去除剩余的红细胞，得到中性粒细胞纯度 >98%。罗彻斯特大学的人类研究审查委员会(Human Research Sadies Review Board) 批准该研究，并且根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)获得知情同意。为测量整 合素表达，在37°C溫度下在具有葡萄糖的L15(Le化ovitz)培养基中用PMA(20ng/ml)、TNF-a (20ng/ml)、LPS(100μg/ml)或fMLP(lyM)刺激中性粒细胞1小时或3小时。
[0097] 败血症患者样本收集-将根据4种SIRS标准中的至少巧巾(体溫>38°C或<36°C，屯、 率>90/111，呼吸率>20次呼吸/111或口0)2<32111111化，白细胞计数>12,000、<4,000或>10% 外周血涂片上的不成熟形式)和至少一种急性器官功能障碍而许可进入特需病房的患者纳 入研究，其中要求根据两种情况确认致命异常。在诊断的36小时内和3-5天后收集血液和尿 样本。通过临床微生物培养证实严重败血症。患有严重非感染性SIRS的患者符合上述SIRS 和急性器官功能障碍标准但不具有记录的感染。4°C下针对中性粒细胞分离和流式细胞术 立即对血液样本进行处理。对于测量整合素的表面表达，使用纯化的小鼠抗人整合素日3、口5 和€^(]\11111口〇'6)、小鼠1邑61(681〇3(^611。6,5曰11〇16邑〇，〔4，1]54)同种型对照和藻红蛋白 (P E)标记的大鼠抗小鼠二抗。
[0098] 流式细胞术-对于流式细胞术测量中性粒细胞上的整合素表达，在所指示的时间 点从初始小鼠和败血症小鼠分离骨髓(BM)、腹腔灌洗液(PL)、外周血和肺，并随后制备单细 胞悬浮液。使用ACK裂解缓冲液（Invitrogen，San Diego，CA)进行RBC裂解。用未缀合的抗 CD16/32(eBioscience，San Diego，CA)使Fc受体封闭30分钟。用Alexafluor 488标记的抗 Grl (Invitrogen)使样本染色。使用别藻蓝蛋白（APC)标记的Ly6G(BD Biosciences)、 ?6托9-切5.5标记的抗〔01化（68;[03。16]1。6,5日]1〇16旨〇，〔4，）、巧光素异硫氯酸醋巧11'〇抗 F4/80(eBioscience，San Diego，CA，USA)、纯化的山羊抗小鼠整合素 a3/CD49c R&D Systerns)、阳抗小鼠整合素 a2/CD49b、α日/CD49e、av/CD51、APC抗小鼠整合素 a6/CD49f和阳缀 合的驴抗山羊IgG(SantaC;ruz)抗体。所有样本用3.7%甲醒固定并在FACSCalliber流式 细胞仪(BD Biosciences，San Diego，CA)上收集。使用Flow Jo软件分析数据。
[0099] 实时PCR-由人中性粒细胞制备总RNA，或使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN， Valencia，CA)分选小鼠骨髓粒细胞。类似地，通过使用鼠白血病病毒逆转录酶化if e Technologies，Bethesda，MD)，用寡聚物（dT)作为引物（Invitrogen,San Diego，CA)，使RNA 逆转录。将所有cDNA分成等份试样，并在-20°C下储存直到进一步使用。使用TaqMan?基 因表达测定（Applied Biosystems)进行人中性粒细胞上整合素日3和日2^及化-6、化-10和 TNFamRNA的定量。根据制造商方案，使用SYBR green PCR主混合液(A卵lied Biosystems) 进行PCR。对每个样本进行管家基因、鼠/人次黄嚷岭憐酸核糖转移酶基因（GAPDH)的PCR扩 增作为样本上样的对照并使样本之间标准化。使用软件分析RQ值。
[0100] 多光子活体显微镜检查(MP-IVM)-对于溶菌酶M(LysM)-GFP小鼠的MP-IVM(Faust 等，（'Insertion of Enhanced Green Fluorescent Protein Into the Lysozyme Gene Creates Mice With Green Fluorescent Granulocytes and Macrophages/'Blood 96: 719-726(2000)，其公开内容整体W引用方式并入本文），使用溶菌酶M(LysM)-GFP小鼠，其 中粒细胞和单核细胞表达GFP。为了准确示踪单个外渗白细胞的形态变化和迁移速度，使用 80 %WT和20 %LysM-GFP骨髓引入经福照的WT受体小鼠来产生混合骨髓嵌合体小鼠 W降低 成像期间巧光细胞的密度。将骨髓转移至经福照受体小鼠后8周，然后使用小鼠用于体内成 像。如先前所述制备睾提肌用于成像（Sumagin等，"Leukoc}fte-Endothelial Cell Interactions are Linked to Vascular Permeability Via I CAM-1-Mediated Signaling/'Am.J.Physiol.Head Circ.I^ysiol.295:H969-册77(2008)，其公开内容整体 W引用方式并入本文）。简言之，用戊己比妥钢(65mg/kg腹膜内）麻醉小鼠并保持于异氣烧 吸入麻醉。通过将动物置于溫垫装置上保持体溫。从腹内取出右睾提肌并轻轻夹在专口设 计的台上W供通过显微镜检查观察睾提肌小静脉。通过向从腹内取出的睾提肌组织诱注 fMLP(lyM)诱导白细胞外渗，并且使用配备有25x NA1.05水浸物镜的Olympus FV1000-A0M 多光子系统进行延时成像60分钟（Auffray等，"Monitoring of Blood Vessels and Tissues by a Population of Monocytes With Patrolling Behavior，''Science 317： 666-670(2007)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。在制备和观察期间，用溫热的碳酸 氨盐缓冲盐水持续诱注组织。为标记血管，向尾静脉静脉内注射Texas Red dex化an 70， 000MW(20mg/kg)(Invi化ogen)。当观察到外渗细胞时，静脉内注射化A-3阻断肤LXY2(8祉 g)。完成所述方案后，通过麻醉过量使动物安乐死W标记VLA-3条件性敲除(cKO)和Ela-Cre 动物中的中性粒细胞，在尾静脉中静脉内施用Alexafluor 488缀合的Grl抗体。用velocity 软件(Perki址Imer)分析成像数据。
[0101] 电子显微镜检查-通过MP-IVM首先在LysM-GFP小鼠的fMLP刺激的睾提肌小静脉上 观察到白细胞外渗。当观察到外渗细胞时，静脉内注射LXY2(8祉g)肤。然后立即将睾提肌从 安乐死后的身体切离并用2.5%戊二醒固定。对组织进一步处理W供在罗彻斯特大学的电 子显微镜研究中屯、化lectron Microscope Research Core)进行透射电子显微镜检查。
[0102] 通过生物发光测定测量MP0活性-对于体外MP0测量，使分选的中性粒细胞(5xl04个细胞/孔)重悬浮于含有肥PES和1 %FBS的缓冲液中，然后用ΙμΜ PMA刺激。PMA刺激后将化 g鲁米诺盐(5-氨基-2-，3-二氨-1,4-献嗦二酬）（Sigma，St Louis，Μ0)添加至每个孔。为测 量巧光强度，使用XenogenIVIS成像系统((?ιliperLifesciences，Ho地into，MA)对小鼠或 96孔板成像。使用Living Image 3.2软件分析图像。在ΡΜΑ不存在下添加鲁米诺产生零巧 光。
[0103] 细菌清除测定-向腹膜注射10ml PBS后收集腹腔灌洗液。进行1:100 1:1000和1: 10000稀释，并且将每种稀释液的10化1散布在膜酶大豆琼脂（化yptic Soy Agar(TSA))血 液琼脂板(3日111日1，1^日11日皿，1(日邮日3)上。使所有板在37°0溫度下解育24小时。每组的菌落计数 表示为CFU/ml。
[0104] Grr小鼠中性粒细胞的表型-从败血症小鼠的腹腔灌洗液分离细胞，并用FITC标 记的抗Grl抗体染色，并用FACS A;ria(BD Biosciences，San Diego，CA)分选为Grl?和Grl低 粒细胞。用化andon cytospin-2使细胞沉淀在载玻片上，然后用苏木精和伊红染色。在20倍 放大倍数下分析细胞的形态。
[0105] IL-6细胞因子化ISA-在指定时间点收集来自单个小鼠的血清，并通过标准夹屯、 ELISA方案测定化-6的水平。抗IL-6、捕获和检测Ab购自抓曲armingen，并且标准重组鼠 IL-6和链霉亲和素-HRP分别购自化proTecKRocky Hill,NJ)和thermo scientific。使用 TMB(The;rmo Scientific,Rockford，IL)使显色反应显色，并且用EILISA酶标仪化inetic酶 标仪;Molecular Devices)在450nm下测量。
[0106] 数据分析-所有值表示为平均值±SEM。通过单因素 AN0VA分析来自人样本的数据。 通过配对非参数t检验(Wi 1 coxon检验）分析来自鼠实验的数据。通过KaplanHVteyer log- rank检验分析存活曲线。使用Gra地Pad Prism 4.0软件进行所有统计分析。P值<0.05被认 为显著。
[0107] 实施例1-VLA-3表达在败血症中性粒细胞中增加
[0108] 中性粒细胞首先通过内皮随后通过细胞外基质的动态迁移牵设于败血症相关组 织损伤和器官功能障碍的病理生理学中（Brown等，"Neutrophils in Development of Multiple 0;rgan Failure in S邱sis/'Lancet 368:157-169(2006)，其公开内容整体W引 用方式并入本文）。虽然化（CD18)整合素，包括LFA-1(Ql化；CDlla/CD18)和Mac-l(aM化； CDUb/CD18)已显示在败血症中性粒细胞上上调并且介导全身和局部炎症期间的跨内皮迁 移（TEM)(Lin等，"Altered Leukocyte Immunophenotypes in Septic Shock.Studies of HLA-DR，CDUb，CD14，andiL^2民 e 邱 ression/'Chest 104:847-853( 1993)，其公开内容整 体W引用方式并入本文），但是存在相对较少可用的关于中性粒细胞控制间隙组织中的迁 移的能力的信息。
[0109] 中性粒细胞表达可结合至ECM蛋白的几种细胞表面整合素化indbom等， ('Integrin-Dependent Neutrophil Migration in Extravascular Tissue，，， Semin. Immunol. 14:115-121 (2002)，其公开内容整体^引用方式并入本文）D为了确定哪种 ECM结合整合素对于败血症期间中性粒细胞转运是重要的，从患有严重败血症的患者、患有 非感染性严重SIRS(全身炎性反应综合症)和健康志愿者收集循环中性粒细胞。不同于其它 整合素，与健康对照受试者相比，来自患有严重败血症的患者的中性粒细胞上VLA-3的表面 表达水平显著升高。有趣的是，在患有严重非感染性SIRS的受试者中未观察到VLA-3水平的 上调（图1A)，证明VLA-3是可辨别败血症和5135的新型细胞表面标志物。如图18所示， VLA-3表达在诊断的24-36小时内升高(n = 6)，而在恢复后水平回到正常(n = 4)。在从健康 受试者的外周血分离并与各种刺激物解育的中性粒细胞中进一步研究VLA-3的mRNA和细胞 表面水平的增加。由PMA和LPS诱导的中性粒细胞激活在刺激的1小时和3小时内诱导VLA-3 的mRNA和蛋白质水平的显著增加（图1C)。
[0110] 为在败血症期间进行VLA-3和其它ECM蛋白结合整合素的表达动力学的详细测量， 使用W下两种小鼠模型:LPS诱导的内毒素血症和盲肠结扎和穿刺(CLP)。在两种模型中，由 CD18(中性粒细胞激活的熟知标志物)升高的表面表达来证实中性粒细胞刺激（图2)。从内 毒素症和化P小鼠的骨髓、外周血和腹腔灌洗液分离的中性粒细胞的流式细胞术分析掲示 在所分析的ECM蛋白结合整合素中，仅VLA-3表达显著增强（图2)。在化P和内毒素症诱导的 腹膜炎中，在败血症发作后循环中VLA-3表达中性粒细胞的比例也增加。本文提供的结果证 明VLA-3在中性粒细胞上的表达在全身炎症期间增强，并且运一发现可能对败血症期间中 性粒细胞向外周组织募集有用。^
[0111] 实施例2-Grl胃CDUb%LA-3胃败血症中性粒细胞亚群表现促炎性表型
[0112] 有趣的是，在分离自败血症患者的活性中性粒细胞亚群中，VLA-3表达的显著增加 更明显（图3A)。运种VLA-3胃中性粒细胞群体未见于SI粉患者或健康受试者。与人患者类似， 在来自败血症小鼠的所有活性中性粒细胞(Grl胃CDUb胃)中，仅一细胞亚群表达较高水平的 化A-3 (图3B和C)。运使用针对中性粒细胞特异性标志物的Gr 1和Ly6G抗体得到证实（图3C， 下图）。
[0113] 先前已提议高炎性中性粒细胞亚型在败血症期间产生，此可引起组织损伤并导致 败血症中的M0F(E5;rown等，"Neuhophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepis/'Lancet 368:157-169(2006)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。促炎性细 胞因子(诸如IL-6、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和IL-Ιβ)的增加的全身释放和升高的MP0活性 是高反应性中性粒细胞的生物标志物（Nathan，C .，"Neutrophi Is and Immuni ty : Qiallenges and Opportunities,"化t.Rev. Immunol .6:173-182(2006)，其公开内容整体 W引用方式并入本文）。为确定Grl胃CDl lb胃VLA-3胃细胞是否与高炎性表型相关，测量促炎性 细胞因子的mRNA水平。在CLP小鼠中，Gr 1胃CD 1 A%LA-3胃中性粒细胞中IL-6、TNF-a和IL-1 β mRNAS勺表达水平显著增加，但Grl胃CDUb%LA-#群体中促炎性细胞因子的水平类似于初女台 Gr 1胃CD 1 lb%LA-3?中性粒细胞中的水平（图4A)。接下来，测量两个中性粒细胞群体(Gr 1胃 CD η b%LA-3%目对于Gr 1胃CD η b%LA-3?)中MP0的酶活性。如图4B所示，来自化P和内毒素血 症小鼠的Gr 1胃CD η b%LA-3胃中性粒细胞的MP0活性表现出相比于Gr 1胃CD η b%LA-3%田胞对 PMA刺激更高的敏感性。总之，本文提供的数据证明VLA-3是具有高炎性表型的败血症中性 粒细胞亚组的新型标志物。
[0114] 实施例3-化A3的阻断和条件性消耗通过干扰中性粒细胞外渗和迁移来改善败血 症期间的存活
[0115] 已提议阻断炎性中性粒细胞从脉管系统向组织的募集作为严重的全身炎症的治 疗（Grommes等，"Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury，"Mol.Med.17: 293-307(2011);Souto等，"Essential Role of CCR2in Neutrophil Tissue Infiltration and Multiple Organ Dysfunction in Sepsis/'Am.J.Respir.Crit.Care Med. 183:234-242(2011)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。然而，在极端情况中，运 种方法可模拟白细胞粘附缺陷，其为损害宿主针对感染的防御的通常致命的症状组。因此， 中性粒细胞外渗的一般抑制或TEM可通过在循环中留下所有活化的中性粒细胞来证明是致 命的。有趣的是，证明CD18的部分消耗可改善炎症(Wilson等/'Gene化rgeting Yields a CD18-Mu1:ant Mouse for Sl:udy of Inflammation, "J. Immunol. 151:1571-1578(1993),其 公开内容整体W引用方式并入本文）。^
[0116] 接下来评估选择性祀向VLA-3胃高炎性中性粒细胞亚组并阻断其在败血症期间的 浸润是否有益于降低多系统器官功能障碍和衰竭的严重性和败血症的死亡率。施用VLA-3 小分子括抗剂肤LXY2(Yao等，"Discovery of Targeting Ligands for Breast Cancer Cells Using the One-Bead One-Compound Combinatorial Method，"J.Med.Chem.52: 126-133(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）显著减少了患有化P(图5A)和内毒 素血症（图5B)诱导的败血症的小鼠中组织浸润性中性粒细胞的数目，而不改变局部细菌清 除率（图5C)。类似地，LXY2保护小鼠免遭败血症致命性（图加)并且降低血清中IL-6细胞因 子的水平（图5E)。
[0117] 为进入发炎组织，中性粒细胞必需穿过基底膜，其为脉管系统下面的ECM结构。 VLA-3已沿着ECM蛋白牵设于中性粒细胞趋化性，所述ECM蛋白包括纤连蛋白和层粘连蛋白， 其为基底膜的主要组分化lices等，"Receptor Functions for the Integrin VLA-3: Fibronectin,Collagen,and Laminin Binding are Difierentially Infuenced by Arg- Gly-Asp Peptide and by Divalent &tions，''J.Cell Biol. 112:169-181(1991) ;Ha;rler 等，"Promotion of Neutrophil Chemotaxis Through Difierential Regulation of Beta land Beta 2Integrins/'J.Immunol.162:6792-6799(1999)，其公开内容整体W引用 方式并入本文）。血管的MP-IVM掲示用LXY2处理小鼠显著减少响应于fMLP的中性粒细胞外 渗（图5F和5G)。另外，超微结构分析显示大部分中性粒细胞积累在内皮和基底膜之间的空 间内（图5H)，表明VLA-3和其配体之间的相互作用参与炎性情况下高反应性中性粒细胞的 外渗。
[0118] 由于死于肾脏和肺的发育缺陷的小鼠中VLA-3敲除的致命性，确定VLA-3对体内免 疫功能的精确作用具有挑战化reidberg等，"Alpha 3Beta lintegrin化S a Crucial Role in Kidney and Lung Organogenesis/'Development 122:3537-3547(1996)，，其公 开内容整体W引用方式并入本文）。 为避免运个问题并进一步评估化A-3在败血症中的功 能，通过使a3-f lox小鼠与在粒细胞弹性蛋白酶启动子下表达化e的小鼠化la-Cre)杂交产 生VLA-3的条件性敲除(〇3-沈0)。在败血症中性粒细胞上未检测到αν整合素的细胞表面表达 的增加（图2D)。因此，还产生αν整合素的条件性敲除(av-cKO)作为对照。运些cKO小鼠 W预期 的频率出生并且发育正常而没有缺陷的迹象。Ela-Cre转基因小鼠在粒细胞中表达Cre，导 致特别是在中性粒细胞中的基因缺失。证实了floxeda亚基等位基因的缺失和蛋白质不存 在（图6A和6B)。与E1 a-Cre和Qv-cKO小鼠相比，VLA-3的消耗在CLP的化内显著减少了浸润腹 膜和肺的中性粒细胞的数目和频率（图6C和6D)。败血症期间的存活被显著改善，但细菌清 除不受影响（图6E和6F)。另外，与αtv-cKO小鼠相比，a3-cK0小鼠中IL-6的水平显著降低，表 明败血症严重性降低（图6G)。为测量VLA-3移除对中性粒细胞外渗的影响，在发炎睾提肌脉 管系统中进行MP-IVM。支持本文所述的结果，与对照动物相比，a3-cK0小鼠中外渗中性粒细 胞的数目显著减少（图細和61)。总之，本文提供的数据证明整合素 VLA-3从粒细胞中选择性 消耗成功地减少了中性粒细胞的大量组织浸润并改善败血症期间的存活。
[0119] 实施例1-3的讨论
[0120] 中性粒细胞首先通过内皮随后通过ECM的动态迁移牵设于败血症相关组织损伤和 器官功能障碍的病理生理学中（Brown等，''Neuhophils in Development of Multiple Organ Failure in Sepsis/'Lancet 368:157-169(2006);Kovach等，"The Function of Neutrophils in Sepsis /'Curr.Opin. Infect .Dis . 25(3): 321-7(2012)，其公开内容整体 W引用方式并入本文）。在白血球渗出穿过毛细血管内皮后，中性粒细胞必须穿过内皮下的 基底膜W迁移通过ECM并接近组织空间（Nourshar曲等，"Breaching Multiple Barriers: Leukocyte Motility Through Venular Walls and the Interstitium，" Nat.Rev.Mol. Cell Biol. 11:366-378(2010)，其公开内容整体W引用方式并入本文）dVLA- 3介导中性粒细胞通过基底膜的趋化性化yun等，"化opod Elongation is a Common Final Step in Leukocyte Extravasation Through Inflamed Vessels，"J.Exp.Med.209(7): 1349-62(2012)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。在之前的实施例中，显示整合素 VLA-3与败血症期间的大量中性粒细胞浸润相关，并且中性粒细胞上VLA-3的选择性阻断抑 制其通过基底膜的迁移。
[0121] 作为免疫防御的第一线，通常认为中性粒细胞是终末分化且同质的细胞群体。然 而，在炎症期间，中性粒细胞活跃地迁移进受感染的或发炎的组织并使其自身暴露于在疾 病进展过程中延长其存活和滞留的局部炎性介质（Colotta等，"Modulat ion of Granulocyte Survival and Programmed Cell Death by Cytokines and Bacterial Products/'Blood 80:2012-2020(1992)，其公开内容整体W引用方式并入本文）。如本文所 述，提供几条独立的证据支持败血症期间存在先前未识别的VLA-3胃/高炎性中性粒细胞亚 群。首先，来自败血症人患者和鼠败血症模型的循环和组织浸润性中性粒细胞的流式细胞 术分析掲示活化的中性粒细胞亚群表达高水平的细胞表面VLA-3。其次，当人患者从败血症 恢复后，VLA-3胃中性粒细胞亚群消失。第Ξ，败血症期间显著的VLA-3表达上调与增加的促 炎性细胞因子表达、升高的MP0活性和由中性粒细胞引起的快速组织浸润相关。最后，施用 VLA-3的特异性肤抑制剂和中性粒细胞中VLA-3的选择性遗传消耗均改善了败血症小鼠的 存活。与本文所述的发现一致，新出现的证据已证明存在功能上异质的中性粒细胞亚组，包 括表现fMLP(al-Essa等，''Heterogeneity of Circulating and Exudated Polymorphonuclear Leukocytes in Superoxide-Generating Response to Cyclic AMP and Cyclic AMP-Elevating Agents. Investigation of the Underlying Mechanism，'' Biochem. Pharmacol. 49:315-322( 1995)，其公开内容整体W引用方式并入本文)和T细胞受 体（Puellmann等，"A Variable Immunoreceptor in a Subpopulation of Human 化utro地ils/'Proc.Natl .Acad.Sci .U S A103:14441-14446(2006)，其公开内容整体W引 用方式并入本文）的差异表达的那些。此外，已在小鼠（Tsuda等，"Three Dif ierent Neutrophil Subsets Exhibited in Mice with Dif ierent Susceptibilities to Infection by Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus，"Immunity21:215-226 (2004)，其公开内容整体W引用方式并入本文）和人（化akravadi等，"Reprogramming of a Subpopulation of Human Blood Neutrophils by Prolonged Exposure to 切tokines/'Lab Invest.89:1084-1099(2009)，其公开内容整体W引用方式并入本文）中 鉴定了具有不同的细胞因子和趋化因子产生特征的两个中性粒细胞亚组，对巨隧细胞活化 的不同作用W及独特的表面抗原表达。因此本文所述的发现对哺乳动物免疫系统中中性粒 细胞功能的当前理解增加了新的方面。
[0122] 虽然活化的中性粒细胞可损伤组织，但它们也可杀灭细菌。因此，刺激的中性粒细 胞的非选择性抑制可能对患有严重败血症的患者无益并且可不利地影响宿主防御。已显示 针对对于白细胞外渗重要的粘附分子诸如&(CD18)整合素化FA-1和Mac-1)和ICAM-1 (其内 皮膜对应物配体)的抗体在某些情形下有益但与破坏性感染相关。因为危及生命的感染通 常出现在中性白细胞减少症情况中比出现在淋己细胞减少症患者中更早，所W相较于使用 干扰淋己细胞募集的药剂后所看到的结果，施用阻断中性粒细胞向受感染组织位点募集的 药剂具有更大的感染和免疫反应受损的风险。因此，治疗败血症的主要挑战是缺乏仅在异 常活化的白细胞中操纵免疫功能的治疗策略。在败血症期间，在循环和组织中观察到VLA-3 的表达增加，并且VLA-3的运种上调与扩大的中性粒细胞炎症、器官损伤和致命性相关。运 些结果证明VLA-3是高反应性和促炎性中性粒细胞的新型标志物，并且是在败血症期间针 对异常活化的中性粒细胞的抗炎性疗法的合适祀标。一致地，施用VLA-3括抗剂W及条件性 消耗中性粒细胞中的VLA-3减少了败血症小鼠的肺中浸润性中性粒细胞的数目并改善存 活。
[0123] 先前，Werr等进行的研究（Werr等/'Betal Integrins are Critically Involved in Neutrophil Locomotion in Extravascular Tissue In Vivo/'J.Exp.Med.187:2091- 2096(1998)，其公开内容整体W引用方式并入本文）已显示炎症期间外渗PMN上&整合素的 细胞表面表达高度上调，并且m整合素子族的成员除了VLA-4(a4&)和化Α-5(α5βι)外都对 血管外ΡΜΝ运动性是重要的。如本文所证明，在SIRS和严重败血症患者中，VLA-3表达水平明 显不同。SIRS在大手术或创伤后常见并且设及严重的炎症。如果SIRS伴随有确认的感染源， 则将其诊断为败血症。因此，运些结果表明除了促炎性环境外，微生物组分的较强的化R配 体介导的作用可牵设于败血症期间中性粒细胞上的VLA-3上调。因为败血症的迅速诊断保 证快速治疗，包括早期施用抗生素和控制败血症源，所W准确区分败血症与SIRS是引起有 效疗法的重要的第一步。运些数据证明VLA-3在危重患者中区分败血症和SIRS方面具有价 值，并且也代表用于控制由活化中性粒细胞的化A-3胃亚组诱导的宿主组织损伤的治疗祀 标。
[0124] 应理解W上公开的和其它特征和功能的变型或其替代物可组合到许多其它系统 或应用中。其中多种当前未预见的或意料之外的替代物、修改、变型或改进可随后由本领域 技术人员作出，运些也旨在由W下权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法，所述方法包括： 检测所述受试者中具有升高的整合素 VLA-3(CD49c/CD29)表达水平的中性粒细胞亚群 的存在，从而所述中性粒细胞亚群的存在表明所述受试者患有败血症或具有败血症的风 险。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述中性粒细胞亚群是Grl气⑶lib?。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测对获自所述受试者的生物样本进行。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样本选自血液、血浆、血清或骨髓。5. 根据权利要求3所述的方法，其中所述生物样本是血液样本。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述血液样本是血清样本、全血样本、全血的亚级 分或血浆样本。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测使用流式细胞术进行。8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述检测在一定时间段以隔开的间隔重复。9. 根据权利要求3所述的方法，其还包括： 使来自所述受试者的所述生物样本与特异性结合至所得生物样本中的整合素 VLA-3的 试剂接触。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述试剂是单克隆抗体或其结合片段、适体或抗 体模拟物。11. 根据权利要求3所述的方法，其还包括： 使所述生物样本与特异性结合至中性粒细胞特异性标志物的试剂接触。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述中性粒细胞特异性标志物是CD16+CD62L+。13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是之前患有败血症的个体，并且所述 检测用于确定所述受试者中败血症复发的风险。14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是具有败血症倾向的个体，并且所述 方法用于败血症的早期检测。15. 根据权利要求1所述的方法，其还包括： 使用除整合素 VLA-3外的生物标志物鉴定败血症，所述生物标志物选自由以下组成的 组：活化部分凝血酶原时间（aPTT)、CD 11 b、CD25、CD64、补体肽(C3、C4、C5a)、弹性蛋白酶α 1 蛋白酶抑制剂复合物、内皮白细胞粘附分子1 (ELAm-1)、endocan、E-选择素、纤维蛋白降解 产物、生长停滞特异性蛋白6(gas-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝溶胶蛋白、IL-1受体 拮抗剂、1卜8、1卜10、几-12、几-18、干扰素诱导蛋白10(1卩-10)、层粘连蛋白、脂多糖结合蛋 白（LBP)、一氧化氮(NO)、硝酸盐、亚硝酸盐、骨桥蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂l(PAI-l)、穿 透素3、肽聚糖、血浆纤连蛋白（pFN)、II型磷脂酶A2(PLA2-II)、血清溶菌酶、可溶性ST2蛋 白、表面活性剂蛋白（A、B、C、D)、髓系细胞表达触发受体1蛋白（TREM-1)和肌钙蛋白。16. -种诊断受试者中的败血症或败血症风险的方法，所述方法包括： 使来自受试者的生物样本与特异性结合至所述生物样本中的整合素 VLA-3(CD49c/ CD29)的试剂接触； 检测与所述生物样本中的整合素 VLA-3结合的所述试剂，以及 测定所述生物样本中的整合素 VLA-3的表达水平，其中相对于整合素 VLA-3的对照水 平，所述生物样本中升高水平的整合素 VLA-3表明所述受试者患有败血症或处于发展败血 症的风险。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述检测使用流式细胞术进行。18. 根据权利要求16所述的方法，其中所述生物样本选自血液、血浆、血清或骨髓。19. 根据权利与要求16所述的方法，其中所述生物样本是血液样本。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述血液样本是血清样本、全血样本、全血的亚 级分或血浆样本。21. 根据权利要求16所述的方法，其中所述接触和检测在一定时间段以隔开的间隔重 复。22. 根据权利要求16所述的方法，其中所述试剂是单克隆抗体或其结合片段、适体或抗 体模拟物。23. 根据权利要求16所述的方法，其中所述整合素 VLA-3存在于中性粒细胞上。24. 根据权利要求16所述的方法，其还包括： 使所述生物样本与特异性结合至中性粒细胞特异性标志物的试剂接触。25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述中性粒细胞特异性标志物是CD16+CD62L+。26. 根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者是之前患有败血症的个体，并且所述 检测用于确定所述受试者中败血症复发的风险。27. 根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者是具有败血症倾向的个体，并且所述 方法用于败血症的早期检测。28. 根据权利要求16所述的方法，其还包括： 使用除整合素 VLA-3外的生物标志物鉴定败血症，所述生物标志物选自由以下组成的 组：活化部分凝血酶原时间（aPTT)、CD 11 b、CD25、CD64、补体肽(C3、C4、C5a)、弹性蛋白酶α 1 蛋白酶抑制剂复合物、内皮白细胞粘附分子1 (ELAm-1)、endocan、E-选择素、纤维蛋白降解 产物、生长停滞特异性蛋白6(gas-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、凝溶胶蛋白、IL-1受体 拮抗剂、1卜8、1卜10、几-12、几-18、干扰素诱导蛋白10(1卩-10)、层粘连蛋白、脂多糖结合蛋 白（LBP)、一氧化氮(NO)、硝酸盐、亚硝酸盐、骨桥蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂l(PAI-l)、穿 透素3、肽聚糖、血浆纤连蛋白（pFN)、II型磷脂酶A2(PLA2-II)、血清溶菌酶、可溶性ST2蛋 白、表面活性剂蛋白（A、B、C、D)、髓系细胞表达触发受体1蛋白（TREM-1)和肌钙蛋白。29. -种治疗患者的败血症的方法，所述方法包括： 进行根据权利要求1的一项所述的方法以诊断患有败血症的患者;和 施用疗法以治疗患者的败血症。30. 根据权利要求29所述的方法，其中当基于所述诊断所述患者患有败血症和/或处于 增加的败血症风险时，用于所述受试者的疗法包括施用整合素 VLA-3拮抗剂肽或抗VLA-3抗 体。31. 根据权利要求29所述的方法，其中当基于所述诊断所述患者患有败血症和/或处于 增加的败血症风险时，用于所述患者的疗法包括消耗整合素 VLA-3表达。32. 根据权利要求29所述的方法，其中当基于所述诊断所述患者患有败血症和/或处于 增加的败血症风险时，用于所述患者的疗法包括药物、疗法、外科手术或其任何组合。33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述药物是用于管理败血症抗性的药剂、整合素 VLA-3的阻断剂、抗生素或血管加压药。34. 根据权利要求32所述的方法，其中所述疗法选自由以下组成的组:施用氧、施用流 体和透析。35. 根据权利要求32所述的方法，其中所述外科手术去除败血症感染源，包括脓汁和脓 肿。36. 根据权利要求29所述的方法，其中所述施用通过口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉 内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过植入、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病变内、经皮、 通过施加至粘膜或通过引入至一个或多个淋巴结来进行。37. 根据权利要求29所述的方法，其中当所述测定表明基线整合素 VLA-3水平大于治疗 后整合素 VLA-3水平时，所述疗法是有效的。38. 根据权利要求29所述的方法，其中当所述测定表明所述基线整合素 VLA-3水平小于 所述治疗后整合素 VLA-3水平时，所述疗法无效。39. 根据权利要求29所述的方法，其还包括： 在一定时间段以隔开的间隔重复所述施用。40. 根据权利要求29所述的方法，其中所述疗法在一定时间段以隔开的间隔进行，其中 所述基线整合素 VLA-3水平在所述时间段内的中间点获得，并且所述治疗后整合素 VLA-3水 平在所述中间点后获得。41. 根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者是婴儿、少年或成人。42. -种辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法，其包括： 检测在患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素 VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群 的存在或不存在，借此所述中性粒细胞亚群的存在表明所述受试者患有败血症，而所述中 性粒细胞亚群的不存在表明所述受试者患有SIRS。43. 根据权利要求42所述的方法，其还包括： 在所述检测前选择表现败血症和/或SIRS的一种或多种临床症状的患者。44. 一种治疗患者的SIRS的方法，其包括： 进行根据权利要求42所述的方法以诊断患有SIRS的所述患者;和 向所述患者施用疗法以治疗所述SIRS。45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述疗法包括选自由以下组成的组的药剂:TNF-a和IL-1受体拮抗剂、抗缓激肽、血小板激活因子受体拮抗剂、抗凝剂(抗凝血酶III)、缓激 肽拮抗剂、泊拉得可(CP-0127 )、肾上腺素、类固醇和苯海拉明。46. 根据权利要求44所述的方法，其中所述疗法包括选自由以下组成的组的抗氧化剂： 硒、谷氨酰胺、二十碳五烯酸、褪黑激素、维生素 C和维生素 E。47. 根据权利要求44所述的方法，其中所述疗法包括施用氧、施用流体和透析。48. 根据权利要求44所述的方法，其中所述疗法包括手术去除感染源，包括脓汁和脓 肿。49. 根据权利要求44所述的方法，其中所述施用通过口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉 内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过植入、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病变内、经皮、 通过施加至粘膜或通过引入至一个或多个淋巴结来进行。50. 根据权利要求44所述的方法，其还包括： 在一定时间段以隔开的间隔重复所述施用。
【专利摘要】本发明涉及诊断受试者的败血症或败血症风险的方法以及治疗患者的败血症的方法。所述方法包括检测所述受试者中具有升高的整合素VLA-3(CD49c/CD29)表达水平的中性粒细胞亚群的存在。所述方法还包括使来自受试者的生物样本与特异性结合至所述生物样本中的整合素VLA-3(CD49c/CD29)的试剂接触，检测与整合素VLA-3结合的试剂和测定所述样本中整合素VLA-3的表达水平。本发明还涉及辨别败血症和全身炎性反应综合症(SIRS)的方法和治疗患者的SIRS的方法，其包括检测在患有全身炎症的受试者中具有升高的整合素VLA-3表达水平的中性粒细胞亚群的存在或不存在。
【IPC分类】C07K14/705
【公开号】CN105555800
【申请号】CN201480049084
【发明人】M·金姆
【申请人】罗切斯特大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年8月6日
【公告号】EP3030576A1, US20160195544, WO2015021165A1
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