对EGFRvIII有特异性的抗体结合位点的制作方法
对EGFRvIII有特异性的抗体结合位点的制作方法
【专利说明】对EGFRvI I I有特异性的抗体结合位点
[0001 ]本发明设及特异性结合EGFRvII I的结合蛋白和特异性结合EGFRvH I和CD3的多特 异性结合蛋白。本发明进一步延伸到结合EGFRWII和CD3的多特异性串联双抗体（tandem diabody)。特别是，本发明设及用于募集T细胞W专口有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高 细胞毒性EGFRvII I/CD3双特异性串联双抗体(TandA b?)。
[0002] EGFR失调与许多癌症相关联，小分子和EGFR祀向抗体均已成功用于临床。然而，由 于EGFR的广泛的正常组织表达，被批准用于临床应用的抗体W及那些处于开发中的抗体均 具有严重的副作用。具有截短的胞外结构域并确保配体非依赖性固有活性的EGFR的缺失突 变体(deletion variantHiKEGFRWII)，是与致癌性转化相关的最常见的突变体形式。 EGFRvIII专口在癌组织中表达，并与各种实体瘤类型相关。癌细胞上受限制的EGFRvIII表 达提供了开发专口祀向癌症同时保护正常组织并充分降低与EGFR治疗相关的副作用的细 胞毒性抗体的机会。
[0003] 在本发明的第一个方面中，本文描述了全人的、高特异性的、高亲和力EGFRvin结 合蛋白。所描述的EGFRvIII结合蛋白具有如下优势：
[0004] 它们不促进或促进来自祀向阳性分子的细胞表面的非常低的EGFRvIII内化，运有 利于募集细胞毒性T-细胞或NK-细胞。图9中的结果显示，根据本发明，细胞在所有测试条件 下暴露于EGFRWII结合蛋白之后，相对于未处理的细胞，EGFRWII受体分子仍保留在细胞 表面上。运些结果表明，本发明的EGFRVIII/CD3结合蛋白令人惊讶地不显示任何内化趋势 (图9)。本发明的EGFRvIII特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可 能促进EGFRvII I表达的增加，从而导致其细胞表面密度增加。
[000引可使用亲和力成熟技术(affinity maUiration technique)使运些高亲和力结合 蛋白的亲和力得到进一步大幅提高W获得对EGFRWII有特异性、Kd在l(K)pM范围或更低的 结合蛋白。令人惊讶的事实是，运些结合蛋白展示了结合EGFRvIII的异常特异性，且对天然 EGFR(野生型EGFR或EGFRwt)没有交叉反应性。由于来自EGFR细胞外结构域(外显子2-7)的 269个氨基酸的框内（in-打ame)缺失，因此相对于EGFRwt，在EGFRWII中形成新表位(neo- epitope)，且预计该新表位相当小：其由新的氨基酸并列(novel化xtaposition of amino acidsK氨基酸5融合于氨基酸274)和缺失位点处的一个新的GLY氨基酸组成。
[0006] 亲和力成熟筛选方法的目的在于通过促进解离速率化OFF)降低的结合蛋白的选择 来提高结合亲和力。然而，令人惊讶的是，所显示的亲和力成熟的结合蛋白大大增加了结合 速率化ON)，而koFF的降低对结合蛋白的提高达100倍的结合仅有小的贡献，其中一些可变抗 体结构域显示Kd小于lOOpM。
[0007] 运些独特的性质使运些本文所描述的对EGFRvIII有特异性的可变抗体结构域特 别适用于开发多特异性的，例如双特异性的、多价的、免疫效应细胞参与（immune effector cell engaging)、肿瘤祀向抗体治疗，诸如，例如EGFRvII I/CD3双特异性串联双抗体 (TandAb").
[0008] 在本发明的进一步方面中，提供了多价EGFRWII结合抗体，其对EGFRWII具有两 个结合位点，或在多价双特异性抗体的情况下，除对EGFRvHI具有两个结合位点之外，还对 T-细胞抗原CD3或特异性表达于天然杀伤(NK)细胞上的CD16A具有结合位点。
[0009] 在一个实施例中，使用对EGFRWII具有两个结合位点并另外包含对CD3具有两个 结合位点的EGFRvII I/CD3串联双抗体，并测试了它们与重组EGFRvII I-或EGFR-Fc融合抗原 的结合。在非还原条件下（由于完整的二硫键，分子结构仍部分保留），或在还原条件下（蛋 白结构完全变性），EGFRvIII-或EGFR-Fc融合抗原通过SDS-PAGE分离，通过蛋白质印迹 (Western Blotting)转移至PVDF膜，并使用不同的EGFRVIII/CD3串联双抗体抗体(diabody ant化ody)或EGFR-结合IgG西妥昔单抗来评估结合W修饰(decorate)印迹（图4)。该实施例 显示，包含对EGFRvIII具有两个结合位点的亲代EGFRvIII结合结构域和亲和力成熟的 EGFRvH I结合结构域在多价抗体形式中也保持其对EGFRvH I的选择特异性。在还原和非还 原条件下，所有EGFRWII/CD3串联双抗体均能识别EGFRvIII，但在任意的运些条件下均不 能识别全长野生型EGFR。该实施例还证明，本文所描述的EGFRWII特异性结合结构域能识 别线性表位，且其反应性不需要完整的Ξ维结构。运与EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗(爱必 妥化rbitux))相反，EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗能识别野生型EGFR和成熟的EGFRvIII， 但其反应性显然需要完整二硫键与构象表位(图4)。
[0010] 在另一个实施例中，使用包含与不同CD3结合结构域组合的亲代的或亲和力成熟 的EGFRvIII特异性结构域和/或在串联双抗体分子中具有不同顺序单个结合结构域的 EGFRvII I/CD3串联双抗体。具有结构域顺序Vl?3-VhEwkviiI-VlEwkviiI-Vh?3的串联双抗体在串 联双抗体分子的中部含有二价EGFRvIII结合位点，而具有结构域顺序VhEwkviiI-化?3-Vh?3- 化EGWviii的串联双抗体在外面的位置具有两个EGFRvIII结合位点且在中部具有两个CD3结 合位点。在ELISA中，分析串联双抗体的不同EGFRvIII-结构域和结构域顺序突变体与 EGFRvIII抗原、野生型EGFR抗原的浓度依赖性结合W及与CD3抗原的浓度依赖性结合（图 6)。所有含有亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体均显示了与EGFRvIII结合的 大幅提高，清楚地表现为相应的结合曲线向较低浓度移位大于两个数量级（图6)。没有观察 到任何串联双抗体与野生型EGFR抗原的结合。
[0011 ] 可通过隧菌体展示文库（phase display libraries)选择和鉴定抗EGFRWiUjt 体，例如选择性地结合成熟的而非天然形式(native form)的EGFR的抗原-结合蛋白。Τ细胞 是不能由天然抗体募集的有效的肿瘤杀伤效应细胞。因此，在本发明的进一步方面中，本发 明提供了一组多特异性EGFRVIII/CD3抗原-结合蛋白，特别是串联双抗体，其能募集Τ细胞、 具有宽范围的结合特性和细胞毒性特性。在一组体外试验中表征了本发明的抗原-结合蛋 白的结合特性、Τ细胞介导的细胞毒性活性和祀标介导的Τ细胞活化的特征。在FACS中，本发 明的抗原-结合蛋白对Biacore、ELISA和EGFRvIII-阳性细胞中的EGFRvIII抗原显示异常的 特异性。在测试的全浓度范围内，没有观察到任何结合蛋白与EGFR抗原或与EGFRwt表达细 胞的可检测的结合。最有效的高亲和力串联双抗体对表达EGFRvII I的F98神经胶质瘤细胞 和C册细胞显示EC50为IpM-lOpM的细胞毒性;剩余的串联双抗体显示EC50高达约lOOOOpM的 细胞毒性。也试验了运些串联双抗体对作为结合至天然形式的残基的更敏感探针的EGFRwt +细胞的细胞毒性。直至最大评估的串联双抗体浓度为0 .化Μ时，才在EGFRwt+细胞或其他 EGFRvIII-阴性细胞上观察到细胞毒性。与CD3的高亲和力结合对有效的T细胞募集是至关 重要的，然而，在体外不存在EGFRvIIr祀细胞时，如由增殖缺乏测量，本发明的串联双抗体 没有引起τ细胞活化，运有助于良好的临床前安全性（图10)。总之，抗肿瘤细胞毒性的严格 特异性和高效性由EGFRvII I/CD3串联双抗体介导。
[001引产生了具有CD3结合Kd范围为1. InM至约500nM但相对恒定的EGFRvin结合Kd(范围 为2. OnM-6.7nM)的串联双抗体，其显示了对表达EGFRvH I的细胞的CD3结合强度和细胞毒 性效力的良好相关性，其ECso值范围为25pM至约lOOOOpM(图11)。
[0013] 虽然本发明的抗原-结合蛋白对EGFRWII的亲和力已得到显著提高，但特异性没 有损失。
[0014] TandAb'^是用于表示串联双抗体的Affimed Therapeutics的商标化ipriyanov et al.,1999,J.Mol.Biol,293:41-56；Cochlovius et al.,2000,Cancer Res.,60:4336- 4341;Reusch et al.,2004,Int.J.化ncer,112:509-518,Kipriyanov,2009,Methods Mol Biol,562:177_93;McAleese and Eser,2012,Future Oncol.8:687-95)。在本发明的上下 文中，TandAb和串联双抗体作为同义词使用。
[0015] 野生型EGFR基因和蛋白的序列是已知的。EGFRvIII是野生型EGFR基因的外显子2- 7(8(Ubp)的框内缺失的结果，导致受体外部结构域的267个氨基酸缺失，并在外显子1和8的 接点处产生新的甘氨酸残基。EGFR胞外结构域内的该新的氨基酸并列产生肿瘤特异性和免 疫原性表位。
[0016] 根据本发明的第一个方面，描述了对至少EGFRWII具有特异性的结合蛋白，其不 与野生型EGFR交叉反应。该结合蛋白优选包括选自下表1A中所描述的CDR的抗体可变重链 的CDR1、CDR2、CDR3和抗体可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3。
[0017] 表1A:来自特异性结合EGFRWII的结合蛋白的人类轻链和重链CDR的氨基酸序列 的序列标识号 [001 引
[0019]
[0020] 因此，本发明的实施方案是具有至少一个EGFRWII结合位点的EGFRvIII结合蛋 白，包含抗体可变重链结构域和/或抗体可变轻链结构域;其中，所述抗体可变重链结构域 包含选自沈Q ID 側：27、33、42、46、49、53的〔〇1?1，选自沈01〇側：28、38、43、50、54、61、63 的〔032和沈9 10顯:29的〔01?;所述抗体可变轻链结构域包含选自569 10^:30、34、36、 39、44、47、51、56、59、64的〔01?1，选自沈9 10側：31、40、57的〔01?2和选自沈9 10側：32、35、 37、41、45、48、52、55、58、60、62和65的〔0尺3。
[0021] 根据进一步的实施方案，所述结合蛋白包含具有选自如表1B所示的SEQ ID N0:1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和25的抗体可变重链结构域和/或选自如表18所示的569 10 N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和26的抗体可变轻链结构域的至少一个EGFRvIII结合 位点。Ξ个可变轻链CDR和Ξ个可变重链CDR的氨基酸序列在表1中W粗体显示且加有下划 线。运些结构位点显示对EGFRvIII的亲和力提高，而特异性没有损失。运些抗原-结合蛋白 不与野生型EGFR抗原交叉反应。
[0022] 进一步地，本发明的运些抗原-结合蛋白在结合EGFRWII时没有显示或仅显示最 小化的EGFRvIII内化。根据本发明，在根据实施例9的测试条件下，在细胞暴露于EGFRvIII- 结合抗体之后，大于80%，优选大于90%，最优选大于95%的EGFRvin受体分子仍保留在细 胞表面。本发明的EGFRvin特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可 能促进EGFRvII I的表达增加，从而导致其细胞表面密度增加。
[0023] 术语"结合蛋白"是指具有抗原结合性质的免疫球蛋白衍生物，即含有抗原结合位 点的免疫球蛋白多肤或其片段。该结合蛋白包含抗体的可变结构域或其片段。每个抗原-结 合结构域都由结合相同表位的抗体即免疫球蛋白、可变重链结构域(VH)和抗体可变轻链结 构域(VL)形成。本发明的可变轻链结构域或可变重链结构域是包含CDRUCDR2和CDR3的多 肤。优选地，本发明的结合蛋白缺乏免疫球蛋白恒定结构域。术语"结合蛋白"也指抗体片段 或衍生物，包括化b Jab '、F(ab '）2、Fv片段、单链Fv、双抗体、串联双抗体(TandAbK ；)、弹性 抗体 ^1姑16〇(17，胖003/025018)、串联单链尸￥((3。尸￥)2)。
[0024] 表1B:所有抗-EGFRvin可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)的氨基酸序 列（CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列W粗体显示且加有下划线）
[0025]
[0026]
[0027]
[0028] 在优选的实施方案中，赋予对EGFRWII具有特异性的结合蛋白包含来自表1所示 的可变重链结构域和可变轻链结构域的W下组合之一的抗原结合位点：
[0029] (i)沈Q ID N0:1 和沈Q ID N0:2，
[0030] 。1)沈9 10^):3和沈9 10^):4，
[0031 ] (iii)沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6，
[0032] (iv)沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8，
[0033] (V)沈Q ID N0:9和沈Q ID N0:10，
[0034] (vi)沈Q ID NO: 11和沈Q ID NO: 12，
[0035] (乂^)569 10^):13和沈9 10^):14，
[0036] (乂^1)沈9 10^):15和沈9 10^):16，
[0037] (ix)沈Q ID NO:17和沈Q ID NO: 18，
[003引（x)WQIDN0:l^PWQIDN0:20，
[0039] (xi)沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:22,或
[0040] (又11)56910^):25和沈910^):26。
[0041] 本发明还提供不仅对EGFRvIII具有特异性，而且还具有至少一个其他功能结构域 的结合蛋白。在进一步的实施方案中，所述至少一个其他功能结构域是效应子结构域 (effector domain)。"效应子结构域"是对效应细胞有特异性的结合位点，其可刺激或触发 细胞毒性、吞隧、抗原呈递、细胞因子释放。运样的效应细胞是，例如但不限于，T-细胞或NK- 细胞。特别是，所述其他效应子结构域包含形成CD3优选人类CD3的抗原结合位点的至少一 个抗体可变重链结构域和至少一个可变轻链结构域。
[0042] 因此，本发明的EGFRvIII结合蛋白可W是多特异性的。本文所用的术语"多特异性 的"意思是指本发明的结合蛋白对不同的表位具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个 用于EGFRvIII。例如，结合蛋白可W是Ξ特异性的，并且对肿瘤细胞上的两个不同的表位 和/或抗原具有结合位点且对效应细胞诸如例如CD3上的表位或抗原具有至少一个结合位 点。结合蛋白对相同抗原的不同表位和/或不同抗原的表位可具有结合位点。运样的多特异 性结合蛋白包括单链双抗体、（scFv)2、串联双抗体pTandAb?；)和弹性抗体（参见Le Gall et al.，1999F邸S Letts 453:164-168和WO 03/025018)。在本发明的具体实施方案中，结 合蛋白是对EGFRv III和CD3双特异性的。
[0043] 本发明的多特异性结合蛋白的CD3结合位点可由如下组成:如表2所示的可变重链 结构域(SEQ ID NO:23)和可变轻链结构域(SEQID NO:24)，或与CDR序列仅两个氨基酸不同 的该序列的密切同源物山1〇36 homolog)，或对CD3(称为CD3)有特异性的任何其他全人的、 人源化的或非人可变抗体结构域，诸如，例如，对CD3，特别是CD3e有特异性的可变抗体结构 域或任何其他全人的、人源化的或非人可变抗体结构域，诸如，例如UCHT1或0KT3的可变抗 体结构域。
[0044] 表2:全人抗-CD3可变重链结构域（VH)和可变轻链结构域（VL)的氨基酸序列 (CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列W粗体显示且加有下划线）
[0045]
[0046] 此外，本发明的EGFRWII结合蛋白可W是多价的。本文所用的术语"多价的"意思 是指，本发明的结合蛋白包含至少两个抗原结合位点。抗原结合位点可具有相同或不同的 特异性。在本发明的实施方案中，结合蛋白W至少两个结合位点即二价方式结合相同表位。 二价的结合蛋白的实例是双抗体，至少四价的结合蛋白的实例是串联双抗体。
[0047] 在本发明进一步的方面中，所述的EGFRWII结合蛋白W及双特异性EGFRWIKP CD3结合位点是人源化的或全人的，即人源的。在本发明进一步的方面中，EGFRvIII结合蛋 白或多特异性EGFRvIII和CD3结合蛋白是二聚体，即包含两个具有EGFRvIII和CD3抗原结合 位点的多肤。
[004引根据本发明，W串联双抗体(TandAb'K)的形式提供二聚双特异性EGFRWII和CD3 结合蛋白。运样的串联双抗体通过连接能够同源二聚的四个抗体可变结合结构域(单基因 构建体中的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)(参见McAleese and Eser ,2012， 化ture化col. 8:687-95))来构建。在运样的串联双抗体中，接头（1 inker)长度是其防止可 变结构域的分子间配对W致分子不能折叠回其本身上来形成单链双抗体，而是被迫与另一 条链的互补结构域(complementary domain)配对。对运些结构域还可W运样排列，即使得 相应的VH和化结构域在二聚期间配对。由单个基因构建表达后，两条同样的多肤链头尾折 叠形成约llOkDa的功能性非共价同源二聚体(McAleese and Eser,2012,Ρ\ι1:ι?Γθ Oncol.8: 687-95)。尽管不存在分子内共价键，同源二聚体一旦形成即是高度稳定的，保持完整并且 不恢复为单体形式。
[0049] 在多特异性串联双抗体的一个实施方案中，提供了人源化的双特异性四价抗体 (TandAb?)，其对CD巧蛇GFRvII I各具有两个结合位点巧GFRvII I/CD3 REC民Urr-TandAb、3 )，W利用T细胞的细胞毒性能力治疗成胶质细胞瘤(GB)、前列腺癌、头颈癌W及其他表皮生 长因子受体突变体VIII阳性化GFRVIII+)癌。
[0050 ] 相对于传统单克隆抗体，串联双抗体具有提供优势的大量性质，还具有较小的多 特异性分子。串联双抗体在不存在糖基化时是全功能性的。串联双抗体可仅含有抗体可变 结构域，并因此可没有可与化部分相关的任何副作用。因为双特异性串联双抗体允许二价 结合至EGFRWII和CD3中的每一个，因此，其亲合力（avidity)与IgG的亲合力相同。串联双 抗体的大小约为ll〇W)a，小于IgG，运可增强肿瘤渗透。然而，与基于抗体-结合结构域或非 抗体支架的较小的双特异性形式相比，该大小远高于首过清除（first-pass clearance)的 肾阔，运提供了药代动力学优势。例如1(19'17日11〇￥5]\1:]\161}1〇(13]\1〇1.81〇1.2009;562:177- 93、Kip;riyanov SM:Methods Mol.Biol.2003;207:323-33或McAleese and Eser,2012, 化化re化col.8:687-95中描述了运样的串联双抗体的产生和制备。
[0051] 串联双抗体在C册细胞中良好表达。可W使有效的上游和下游制造工艺落实到位。
[0052] 将本发明的EGFRWII和CD3双特异性串联双抗体设计为通过募集细胞毒性T细胞 特异性祀向EGFRWir肿瘤细胞。抗体不能直接募集细胞毒性T细胞。相反，通过雇用 (engage)在运些细胞上特异性表达的CD3分子，串联双抗体可使细胞毒性T细胞与EGFRvII I +肿瘤细胞W高度特异性的方式交联，从而显著增加运些分子的细胞毒作用。串联双抗体显 示强的、特异性的和有效的细胞毒性。显著的证据是T细胞能在控制肿瘤生长中起作用。例 如，大肠肿瘤W及来自饥正患者的淋己结中细胞毒性T细胞的存在显示与更好的临床结果相 互关联。此外，对于黑色素瘤疫苗，W及针对CTLA-4即T-细胞活化的负调节剂的抗体，已证 明了经设计诱导T-细胞应答的疗法的潜力。本发明的串联双抗体通过结合表面表达的CD3、 优选CD3e雇用细胞毒性T细胞，CD3e形成T-细胞受体的一部分。该串联双抗体与在特定肿瘤 细胞表面上表达的CD3和EGFRWII的同时结合引起T-细胞活化并调节随后的肿瘤细胞裂 解。
[0053] "二聚体"是指两个多肤的复合体。优选地，所述两个多肤彼此非共价相关，特别是 在两个多肤之间没有共价键的条件下。优选地，双特异性二聚体是同源二聚体，即包含两个 相同多肤。然而，Ξ特异性或其他多特异性二聚体可W是异源二聚体并包含两个不同的多 肤，例如可变轻链结构域的至少一个结合位点位于一个多肤上且可变重链结构域位于其他 结构域上。术语"多肤"是指由酷胺键连接的氨基酸残基的聚合物。优选地，多肤是未分枝的 单链融合蛋白。在该多肤中，可变抗体结构域相继连接。除可变结构域N-端和/或C-端之外， 该多肤还可具有连续的（contiguous)氨基酸残基。例如，运样连续的氨基酸残基可包括可 有益于多肤纯化的化g序列，优选在C-端。
[0054] 双特异性串联双抗体的每个多肤都包含至少四个可变结构域，即CD3结合蛋白的 可变轻链(VL)和可变重链(VH)W及EGFRvin结合蛋白的可变轻链(VL)和可变重链(VH)。四 个结合结构域由肤接头L1、L2和L3连接，并可从N-端至C-端进行如下排列：
[005引（i)VL(CD3)-L1-VH化GFRvIII)-L2-化化GFRvIII)-L3-VH(CD3);或
[0056] (i i)VH(CD3)-L1-VL(EGFRvIII)-L2-VH(EGFRvIII)-L3-VL(CD3);或
[0057] (i i i)VL(EGFRvIII)-LI-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(EGFRvIII);或
[0058] av)VH(EGFRvIII)-Ll-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(EGFRvIII)。
[0059] 在本发明的实施方案中，四个可变结构域按化(CD3)-Ll-VmEGFRWII)-L2-VL 化GFRパII)-L3-VH(CD3)排列。具有结构域顺序VLGD3-VHEGFRv…-化EGFRvΠI-VHCD 3并含有不同 EGFRWII结合序列的串联双抗体，尽管对EGFRvII I具有不同亲和力，所有都显示出对第二 特异性CD3非常相似的结合，如CD3 丫 ε抗原上通过化ISA所示（图5A)。在含有外面位置的 EGFRvIII结合结构域和中部的两个CD3结合位点的其他串联双抗体结构域顺序(VhEwkviiI- VlGdS-VhGdS-VlEgwviii)中，EGFRvin与亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的结合的显著提高 同样是明显的，而串联双抗体中部结构域与CD3的结合稍弱，且在单个串联双抗体之间比第 一结构域顺序变化更多（图5B)。当用不同CD3结构域（SEQ ID N0:23和24)构建含有不同 EGFRvIII-结合结构域的串联双抗体时，进行了相似的观察(图5C)。
[0060] 接头的长度影响抗原-结合串联双抗体的柔初性（flexibility)。例如， Todorovska et al.，2001Journal of Immunological Methods 248:47-66;Perisic et al.，1994Structure 2:11217-1226;Le Gall et al.,2004,Protein Engineering 17: 357-366和W094/13804中描述了接头长度对形成二聚抗原-结合蛋白的影响。
[0061] 根据本发明，优选肤接头L1、L2和L3的长度是可使一个多肤的结构域与另一个多 肤的结构域分子间结合W形成二聚抗原-结合串联双抗体。运样的接头是"短的"，即由〇、1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基组成。因此，所述接头由约12个或更少的氨基酸 残基组成。在0个氨基酸残基的情况中，所述接头是肤键。运样的短接头通过在不同多肤的 抗体可变轻链结构域和抗体可变重链结构域之间结合和形成正确的抗原-结合位点有利于 两个多肤的分子间二聚。约12个或更少氨基酸残基的短接头通常防止同一多肤链的相邻结 构域彼此分子间相互作用。在本发明的一个实施方案中，运些接头由约3个至约10个，例如4 个、5个或6个连续氨基酸残基组成。
[0062] 关于运些接头的氨基酸组成，选择不干扰两个多肤二聚化的肤。例如，包含甘氨酸 和丝氨酸残基的接头通常提供蛋白酶抗性。接头的氨基酸序列，例如，可通过隧菌体展示法 (地age-display method)来优化，W提高抗原结合和抗原-结合多肤二聚体的产率。适于本 发明的串联双抗体的肤接头的实例是GGSGGS(SEQ ID N0:66)、GGSG(SEQ ID N0:67)或 GGSGG(SEQ ID N0:68)。
[0063] 本文所述的EGFRvIII结合蛋白和多特异性串联双抗体可通过表达编码串联双抗 体多肤的多核巧酸产生，所述串联双抗体的多肤与另一个相同多肤结合W形成抗原-结合 串联双抗体。因此，本发明进一步的实施方案是编码本文所述的抗原-结合串联双抗体多肤 的多核巧酸，例如DNA或RNA。
[0064] 多核巧酸可通过本领域技术人员已知的方法构建，例如，通过将编码由编码肤接 头的序列隔开的或由肤键直接连接的至少四个抗体可变结构域的基因组合到单基因构建 体中，并在细菌或其他适当的表达系统诸如例如CK)细胞中表达，所述单基因构建体与合适 的启动子、可选地用于检测和纯化的蛋白标签，W及合适的转录终止子可操作地连接。根据 所使用的载体系统和宿主，可使用任何数量的包括构成和诱导启动子的合适的转录和翻译 元件。选择启动子W使其驱动多核巧酸在各自宿主细胞中的表达。
[0065] 作为本发明进一步的实施方案，可将多核巧酸插入到载体中，优选表达载体中。该 重组载体可根据本领域技术人员已知的方法构建。
[0066] 各种表达载体/宿主系统可用于包含或表达编码本发明多肤的多核巧酸。用于在 大肠杆菌化.coli)中表达的表达载体的实例是pSKK化e Gall et al.，J I讓unol Methods. (2004)285(1) :111-27)或用于在哺乳动物细胞中表达的pcDNA5(Invitrogen(英 杰公司））。
[0067] 因此，本文所述的抗原-结合串联双抗体可通过将编码上文所述多肤的载体引入 到宿主细胞并在所述多肤链表达、可从所述培养基分离W及任选地此后纯化的条件下培养 所述细胞。
[0068] 在进一步的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含EGFRvIII结合蛋白， 抗原-结合串联双抗体，包含编码抗原结合串联双抗体的多肤的多核巧酸的载体或由该载 体转化的宿主细胞，W及至少一种药学上可接受的载体。术语"药学上可接受的载体"的意 思是指包括不干扰成分生物活性的效力并且对所施用的患者没有毒性的任何载体。合适的 药学上的载体实例是本领域已知的，包括生理盐水、憐酸盐缓冲生理盐水、水、乳化液例如 油/水乳化液、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。运样的载体可通过传统方法配制，并W合适 的剂量施用于个体。优选地，该组合物是无菌的。运些组合物也可包含佐剂，例如防腐剂、乳 化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保预防微生物的作用。
[0069] 通过使用本领域已知的成熟技术和标准方法，技术人员会没有过度负担地容易构 建并获得抗原-结合蛋白如本文所述的串联双抗体，参见，例如Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory ManuaK分子克隆实验室手册），Cold Spring 化rbor Laboratoiy (1989)N.Y,;The Protein Protocols 化n化ook(蛋白质实验指南手册），John M.Wa化er编 车茸，Humana Press Inc. (2002);或Antibody engineering:methods and protocols(抗体 工程：方法和方案）/Benny K.C.Lo编辑；Benny K.C. II Se;ries:Methods in molecular biology(分子生物学方法）（Totowa，N.J.)。
【附图说明】
[0070] 图1说明亲和力成熟后衍生的EGFRvIII特异性高亲和力结合结构域中可变序列的 位置。不同于亲代序列的重链和轻链可变区的CDR位置用星号标出，各自的氨基酸用灰色高 亮显示。具有有益突变的位置用深灰色高亮显示。
[0071 ] 图2显示Biacore T200中，多循环动力学测量不同scFv抗体结合至重组EGFRvIII- Fc抗原或野生型EGFR-Fc抗原的结果。Sensogram显示在4个不同scFv抗体浓度水平（86nM， 17.2碰，3.4碰，0.69碰)下随时间测量的表面等离子体共振(5?1〇响应单元(抓)的动力学。 测量结合180秒，此后测量解离。使用1:1结合模型分析数据。
[0072] 图3显示流式细胞仪测量scFv抗体结合至(A)过表达EGFRvin的F98大鼠神经胶质 瘤细胞(F98Ewkviii)、（b)过表达天然EGFR的F98细胞(F98Ewk)、（c)未转染的F98细胞(F98)的 结果，W及相似的scFv抗体结合至(D)过表达EGFRvIII的C册细胞(C册ewkviii)、(e)过表达天 然EGFR的C册细胞(CH〇ewkviii )和(F)未转染的Oro细胞(CH0)的结果。
[0073] 图4说明含有不同EGFRvH I结合结构域的串联双抗体与由SDA-PAGE分离并通过蛋 白质印迹转移至PDVF膜的纯化的EGFRWII-或天然EGFR-Fc融合抗原（非还原蛋白或用DTT 还原的蛋白）的结合。Fc融合蛋白通过二硫键在Fc部分二聚，但用DTT还原后是单体。 EGFRvIII-特异性抗体W还原或非还原的构象结合至EGFRvIII-融合蛋白，但不与天然EGFR 结合。该抗-EGFR抗体西妥昔单抗用作对照，并识别非还原性EGFRvIII-Fc和非还原性EGFR- Fc抗原，但不识别DTT-处理的抗原。
[0074] 图5显示了化ISA中分析的不同EGFRVIII/CD3特异性串联双抗体与EGFRWII-Fc、 EGFR-化和CD3 丫 ε重组抗原的浓度依赖性结合。（A)显示了具有结构域顺序VlGDS-VhEGWvIII- 化ewkviiI-Vh?3的EGFRVIII/CD3特异性串联双抗体的结合信号，（B)显示了具有结构域顺序 VHEGFKvni-VLGD3-VHGD3-VLEGFRvIII的egfRvIII/CDS特异性串联双抗体的结合信号，W及(C)显示 了含有SEQ ID NO: 23、24的CD3结构域并具有结构域顺序化gdS-VhEgfkviiI-VlEgfkviiI-VhGd3的 EGFRWII /CD3特异性串联双抗体的结合信号。含有亲和力成熟的EGFRWII -结合结构域的 串联双抗体与EGFRvIII的结合的提高是明显可检测到的，在所有形式/结构域顺序中作为 各自结合曲线向较低浓度的移位。
[0075] 图6显示Biacore T200中，多循环动力学测量含有结构域顺序为化GDS-VHEGFKvm- 化egfkviiI-Vh?3的不同二价EGFRW II结合结构域的EGFRvII I/CD3特异性串联双抗体结合至 重组EGFRvII I-Fc抗原的结果。Sensogram显示在不同串联双抗体浓度水平下随时间测量的 表面等离子体共振(SPR)响应单元(RU)的动力学。测量结合180秒，此后测量解离。使用1:1 结合模型分析数据。
[0076] 图7显示来自（Α)Ξ个个体头颈化&N)癌患者、（Β)Ξ个个体成胶质细胞瘤患者的组 织切片的免疫组织化学（IHC)染色结果，W及(C)来自前列腺癌、乳腺癌化erfneg)和非小细 胞肺癌(NS化C)的代表性结果。切片用巧巾不同浓度的二价构象的含有EGFRWII -特异性结 合结构域Li3G30的EGFRvIII-特异性双抗体进行染色，所述二价构象类似于EGFRWn祀向 串联双抗体抗体(例如，（Vl?3-)VhEWKvIII-VlEWKvIii(-Vh?3))的排列但缺少CD3结合部分。作为 对照，切片用识别EGFR(存在于健康组织W及癌组织上）W及EGFRvin的EGFR-特异性IgG抗 体西妥昔单抗进行染色。染色的特异性由在不含EGFR-或EGFRvIII-特异性初级抗体的二级 试剂中解育的对照切片证实。
[OOW]图8说明在EGFRWII阳性细胞上，与含有亲和力成熟之前的亲代EGFRWII结合结 构域化i3G30)的EGFRvIII和CD3各自的串联双抗体相比，含有不同亲和力成熟的EGFRvIII- 特异性结合结构域的EGFRVIII/CD3串联双抗体的细胞毒性能力、有效性和祀标依赖性特异 性的提高：（A)含有EGFRvIII/CDS串联双抗体的ABC 470，（B)含有EGFRVIII/CD3串联双抗体 的ABC 471，（C)含有EGFRWII/CD3串联双抗体的ABC 472。在使用表达EGFRWII的C册细胞 (CH〇egfkviii)、表达EGFRvIII阴性EGFR的C册细胞(CH妒GFK)或未转染的C册细胞作为祀细胞并 且使用人类PBMC作为效应细胞，在基于流式细胞术的分析中，测量抗体浓度依赖性细胞毒 性。在各图版（A-C)中，含有单个EGFRvIII结合结构域和CD3结构域v64、顺序为VlEdS- VhEWKvIII-VlEWKvIII-VhED3的串联双抗体示于左侦L含有与不同CD3结构域组合的单个 EGFRvIII结合结构域、顺序为VhEwkviiI-Vl?3-Vh?3-VlEwkviii的串联双抗体示于右侧。
[0078] 图9显示结合EGFRvIII-特异性抗体时，评估EGFRvIII受体从细胞表面内化的结 果。在37°C下用不同浓度的立种不同的具有结构域顺序化wS-VhEWKvIII-VlEWKvIII-Vh?3。)或 VHEGFRvni-VLCD3-VHGD3-VLEGFRvniQv)，和/或含有不同 CD3-结合结构域的 EGFRvIII/CDS 串联双 抗体抗体将表达EGFRvHI的细胞解育24小时。调整之后，用10μg/ml饱和浓度的各自的串联 双抗体抗体染色细胞表面所有剩余的EGFRvII I受体分子。
[0079] 图10显示在EGFRvIII/CD3(或EGFRVIII/CD16A)串联双抗体抗体的存在下，评估人 类PBMC培养物中细胞增殖(Br加 incoporation)的结果。PBMC用作阳性对照，其在CD3结合 抗体0KT3或植物凝集素 (plant lectin phytohemagglutinin) (PHA)的存在下增殖。在不存 在EGFRvIII-阳性祀细胞的情况下，用不同的EGFRWII/CD3串联双抗体解育PBMC不诱导 PBMC的活化和增殖。
[0080] 图11说明EGFRVIII/CD3串联双抗体的CD3-结合亲和性与其细胞毒性能力正相关。 关于CD3+-化rkat细胞上的CD3-结合、CH〇egfkviii细胞上的EGFRvIII-结合W及细胞毒性能 力，对W结构域顺序VlGDS-VhEgfkvIII-VlEgfkvIII-VhGD3与对CD3具有不同亲和力的不同CD3-结合 结构域组合的全部含有相同EGFRWII结合结构域化i3G30)的多于20个的EGFRvIII/CD3串 联双抗体进行分析。CD3-结合Kd值的范围是InM至约500nM。对于每个所分析的串联双抗体 而言，相对于CD3-结合Kd值，对EGFRvIII-结合Kd值和细胞毒性ECso值作图。虽然TandAb显示 EGFRvIII-结合Kd值仅有小的变化，但随着串联双抗体的CD3-结合Kd值升高，细胞毒性ECso 显示几乎线性升高。
[0081 ] 图12显示概念研究（cone邱t study)的体内验证结果。对含有相同EGFRvIII-结合 结构域化i3G30)但不同CD3结合结构域或结构域顺序的两个EGFRvII I/CD3串联双抗体分析 了皮下F98EWKVIII移植瘤生长的剂量依赖性抑制效果，并与W高得多的浓度水平给药的西妥 昔单抗的效果进行比较。（A)由具有结构域顺序VlGDS-VhEgfkvIII-化egfkvIII-VhGD3的egfrvII 1/ CD3VS串联双抗体引起的剂量依赖性肿瘤生长抑制；（B)由含有不同高亲和力CD3-结合结构 域并具有结构域顺序VhEwkviiI-Vl?3-Vh?3-VlEwkviii的EGFRVIII/CD3串联双抗体引起的剂量 依赖性肿瘤生长抑制。
[0082] 通过W下实施例进一步说明本发明，但本发明不限于此。
[0083] 实施例1 :EGi^vIII特异性结合蛋白的发现和亲和力成熟：
[0084] Li3G30 的发现：
[0085] 对基于IgM来源的人scFv序列的隧菌体展示文库进行两至Ξ轮淘选(panning) W 富集对EGF RWII有特异性的结合物(binders)。在每轮淘选前，将所述文库用EGFR-Fc预解 育W耗尽（deplete)野生型形式EGFR的结合物或融合蛋白化部分的结合物。在EGFRvIII包 被的固相上和在溶液中平行进行选择(selection)。两轮和Ξ轮淘选后，挑选出单克隆，诱 导可溶性S cFv表达并筛选与EGFRv III -Fc和EGFR-Fc结合的提取物。
[0086] 根据本发明，描述了与EGFRvIII结合的全人的高特异性可变抗体结构域， 的缺失突变体，其W突变的形式专口在肿瘤中而非在健康组织上表达。本 文描述的全人EGFRvIII特异性结构域最初在使用基于IgM来源的全人scFv文库的隧菌体展 示筛选中发现。令人惊讶的是，尽管对野生型EGFR抗原使用耗尽步骤（depletion procedure)进行了两或Ξ轮淘选，运应富集对EGFRvin有特异性的结合物，但是在化ISA中 大多数所得的scFv对两种蛋白巧GFRvI Π 和野生型EGFR)都结合。鉴定了 一条高EGFRvH I特 异性的序列，命名为Li3G30。除了在VH和化的N末端有很小的差异，重链和轻链的框架区W 及CDR1和CDR2分别与种系编码的序列V册-51和化3-25完全相同。Li3G30从第Ξ轮液相淘选 中鉴定出来。
[0087] 亲和力成熟：
[0088] 抗体框架对V册-51/VL3-25的文库用从Distribute地io订购的算法来设计。鉴定 Li3G30的特异性决定残基并将其包含在文库设计中。该设计包括52个随机化的CDR位点，每 个CDR位点都有单独定义的氨基酸分布。将Ξ种不同的环长度构建到化CDR3中。编码VH和 化的随机化位点的基因片段订购自Geneart/Lifetechnologies，并通过TRIM-技术合成。将 所述片段克隆至隧菌体展示载体祀XHAM(Schwarz et al.2004)中，达到3.7E+8个转化的大 肠杆菌细胞的最终文库大小。将该文库包装到隧菌体颗粒中，并经过淘选和筛选步骤W分 离具有提高的亲和力并保留对EGFRvIII有特异性的变体。用固定在蛋白结合塑料表面上的 EGFRvIII-Fc抗原进行淘选。通过实施W下步骤将淘选步骤设计为有利于具有低解离速率 化OFF)的EGFRvIII结合的scFv:洗涂步骤，包括持续长达30分钟的若干个洗涂缓冲液解育步 骤，W有利于选择缓慢解离的scFv。另一个步骤基于与可溶性EGFRvIII的过夜竞争。为了确 保在亲和力成熟的过程中不会选出EGFR-EGFRvIII交叉反应抗体或结合化的抗体，在第一 个淘选步骤之前，通过对野生型EGFR-Fc的预解育使文库耗尽可能的野生型EGFR结合物。而 且，由于在对固定的EGFRvIII进行淘选步骤的过程中可溶性EGFR的存在，筛选方案不利于 交叉反应结合物。
[0089] 在流式细胞仪中，进一步测试唯一的EGFRvIII特异性scFv对表达EGFRvIII的转染 的CH0和F98细胞的结合。将显示结合表达野生型EGFR的细胞和/或未转染的细胞的ScFv排 除在下一步分析之外。用Biacore X100中的初始Kd排名鉴定与初始克隆Li3G30相比对 egfrwii具有提高的亲和力的scFv。最好的变体在详细的sra测量和基于巧光的稳定性试 验中进行了表征。
[0090] 对于化CDR3,用于亲和力成熟的初始文库包括Ξ种不同的环长度，已知所有长度 与VH5-51/化3-25框架兼容。令人惊讶的是，在选择过程中，中间的环长度明显被偏爱。因 此，与亲代抗EGFRWII抗体相比，所有亲和力成熟的变体的化CDR3都缩短了一个氨基酸 (表1，图1)。将所选择的scFv的序列与输入文库作比较，该分析表明了化CDR3中的3个有益 突变。亲代抗EGFRvIII抗体的重链和轻链的CDR1和CDR2与种系序列V册-51和化3-25各自编 码的序列相同。在75%的位点中，各个种系编码的残基被重构(reconstituted)或者明显被 偏爱。表明了一个有益的突变在VH CDR1中，一个在化CDR1中（图1)。剩余的随机化位点中 的氨基酸分布非常接近于进行选择之前文库中的分布。
[0091] 实施例2:在Biacore中测量scFV对EGFRvII I和野生型EGFR的结合：
[0092] 制备抗hu Fc IgG CM5-忍片：
[0093]根据制造商的说明书，通过使用胺偶联试剂盒(Amine-Coupling-Kit)(GE)进行共 价胺偶联来制备抗hu Fc IgG CM5-忍片。将IgG在提供的固定缓冲液（lOmM乙酸钢，pH 5.0) 中稀释至浓度为25μg/ml。对于偶联步骤，应用Biacore T200控制软件的预定义方法"胺 (Aminer。实现所有4个流通池中5000-10000抓的祀水平。在注入重组蛋白溶液前，用邸C/ NHS活化忍片的表面。用乙醇胺封闭表面上空余的结合位点。选择IX皿S-P+作为整个偶联 步骤的运行缓冲液。
[0094] SPRii量中使用的单链Fv ' S (scFv)的浓度范围：
[0095] 在Sra测量之前，使用化η化op通过A280测定检查ScFv浓度。储备液的浓度(C)根据 W下等式计算：
[0096] C[mg/ml] = (A280)/(2.25[cmVmg] X 1 [cm])
[0097] 用"Expasy Protparam"预测工具（http: //web. expasy. org/protparam/)计算不 同的消光系数。为了计算化s标签的scFv抗体的摩尔浓度，假定分子量为约28kD。通过在IX 皿S-P+缓冲液中进行连续稀释将scFv调整至下面提到的终浓度。制备W下浓度：430nM、 86nM、17.2nM、3.44nM、0.688nM和OnM。
[009引 ScFv的测量条件：
[0099] 将EGFRvIII-Fc和野生型EGFR-Fc融合蛋白在1 X皿S-P+中稀释至浓度为6.25nM。 W ΙΟμΙ/min的流速注入两种抗原，EGFRvII I-Fc: 75秒，野生型EGFR-Fc: 90秒。将EGFRWII- Fc注入流通池2，野生型EGFR-Fc注入流通池4。流通池1和3为空白。
[0100] 将IX皿S-P+用作整个程序的运行缓冲液。将scFv抗体W30化/min的流速注入所 有四个流通池，持续180秒。将在未捕获抗原的流通池1中测量的信号从流通池2中的信号中 减去W校正结合曲线的背景结合。将在未捕获抗原的流通池3中测量的信号从流通池4的信 号中减去W校正结合曲线的背景结合。在540秒的解离时间后，如下所述重新生成忍片。
[0101] 抗hu Fc IgG忍片通过注入高盐缓冲液3.0M MgCl2(30秒，10化/min)重新生成。每 次测量前，在没有scFv的情况下，执行4个"启动（stad-up)循环"。从最低至最高浓度测量 ScFv溶液。包括无运行缓冲液(化Μ)的一个循环。
[0102] 在MCK(Multi切cle Kinetic)测量中测定scFv抗体的动力学。为了估算表观结合 亲和力，用Biacore评估软件中包含的"动力学化inetic)"方法评估结合曲线。通过运个方 法，使用"Langmuir 1:1相互作用模型"用所述软件全部拟合结合曲线。结果示于表3中。
[0103] 所应用的亲和力成熟筛选步骤旨在通过使具有降低的解离速率化OFF)的结合物的 选择更容易来提高EGFRvIII特异性结合结构域的EGFRWII结合亲和力。然而，令人惊讶的 是，所得的亲和力成熟的结合物(表3)展示出大幅增加的结合速率化ON)，而koFF的降低对于 scFv的提高达100倍的结合仅作出较小的贡献，同时一些结合物显示出低于l(K)pM的Kd(表 3)。尤其让人惊讶的是，虽然筛选步骤有利于选择koFF降低的scFv，但是实现Kd的降低主要 是由于koN的提高。运也是令人惊讶的，因为抗体的亲和力成熟通常与koFF的降低有关 (Schier et al.,1996,Pini et al.,1998,Boder et al.,2000)。
[0104] 表3:对scFv结合亲和力的总结（"Vr是scFv的可变重链结构域，"VL"是scFv的可 变轻链结构域）。在Biacore (SPR) 1:1结合模型中测量的scFv形式的不同EGFRvΠI结合结构 域对重组EGFRvIII-Fc抗原的Kd值、结合速率化QN)和解离速率化(W);"提高系数"是指相对 于亲代3。。￥，目化13630(￥!1沈9 10^:25和化沈9 10^:26)的倍数变化。
[0105]
[0106] 11个亲和力成熟的scFv中有8个显示出与亲代scFv相比koN至少5倍的提高；它们中 的Ξ个具有20倍高的koN。与koN的提高相比，亲和力成熟对koFF的影响相当小。只有3个亲和 力成熟的scFv显示出4-5倍提高的koFF。有趣的是，它们中有两个从竞争性选择方法中分离 出来，该方法与延长在洗涂缓冲液中的解育相比可能是选择koF帷低的scFv的更有效的方 法。
[0107] 通过差示扫描巧光测定法(DSF)测定的所选择的亲和力成熟的候选者的解链溫度 的平均值为62.2°C，范围为53°C-67.2°C。 巧…引 在亲和力成熟的过程中维持相对于野生型EGFR的对EGFRvIII的高特异性
[0109] 通常亲和力成熟常常伴有结合表位的小变化，该小变化可影响特异性/交叉反应 性（Barbas et al,1994,Parsons et al.,1996,Winkler et al.,2000)。由于野生型EGFR 胞外结构域(外显子2-7)的269个氨基酸的框内缺失形成了相对于野生型EGFR的EGFRvII I 新表位，并且预测其是相当小的：它由新的氨基酸并列（氨基酸5融合至氨基酸274)和在缺 失位点处的一个新的化Y氨基酸组成。预期在运种情况下即使结合表位的小变化也会快速 破坏对EGFRvII I的异常特异性并可得到也能识别天然EGFR的交叉反应结合物。
[0110] 令人惊讶的是，本文描述的亲和力成熟导致对抗EGFRWII抗体提高达100倍的结 合而不损失对EGFRvIII的专口特异性(表3，图2)。
[0111] 在选择亲和力成熟的结合物期间，在流式细胞仪中检测了唯一的EGFRvin特异性 scFv对表达EGFRv ΠI的C册细胞(C册EWKviii)和F98细胞(F98EWKVIII)的结合W及对表达人野 生型EGFR的C册细胞(C册EWK)和F98细胞(F98EWK)及未转染的C册和F98细胞的结合。
[011引更详细地表征了没有任何可测量的与野生型EGFR阳性细胞(CH0eg?)或未转染的 CHO细胞的背景结合的11个高特异性抗EGFRVIII ScFV。在最好的情况下，测量到了对 EGFRvHI抗原的80pM的亲和力，对应于与亲代scFv相比的100倍的提高系数(表3)。同时，所 检测的抗EGFRvIII scFv都没有显示出与野生型EGFR抗原的任何交叉反应性（图2)。
[0113] 据我们所知，之前从未观察到与对EGFRvin的排他性特异性结合的人抗体结构域 对EGFRvII I的如此高的亲和力，并且没有可测量的与野生型EGFR的交叉反应性。Saf dar i和 同事最近描述了人源化鼠 EGFRvIII结合抗体结构域MRl的结果(Safdari et al. ,2014)，W 其鼠（murine)形式的MRl最先由Lorimer和同事描述化orimer et al.,1996,Beers et al.，2000，Kuan et al. ,2000)。在人源化方法中，他们实现了humMRl的亲和力提高，达到了 于此报导的相似的皮摩尔Kd值，然而，与本发明相反，他们没有完全消除所述抗体结构域与 野生型EGFR的交叉反应性，运可W在他们的出版物(Safdari et al. ,2014)的图4中清楚地 看出。因此，在SDS PAGE和蛋白质印迹后，humMR 1不只对EGFRvIII (145KD)有特异性，也识别 EGFR(170KD)(Safdari et al. ,2014)。在亲和力成熟前后，申请人广泛地检测了本申请 EGFRvIII结合结构域的特异性和交叉反应性，并惊讶地发现在Biacore(图2)，或在SDS PAGE和蛋白质印迹（图4)或在化ISA(图5)的分析中都没有发现与野生型EGFR，或与纯化的 重组野生型EGFR抗原的交叉反应性的信号。本申请的EGFRvin结合结构域同样没有展示出 与转染的CH0细胞(CH〇ew)或F98神经胶质瘤细胞(F98EG?)的细胞表面上过表达的野生型 EGFR的任何交叉反应性(图3)。
[0114] 实施例3:通过流式细胞术评估EGFRvII I特异性scFv抗体对过表达EGFRvII I的F98 大鼠神经胶质瘤细胞(F98EGWVIII)或稳定转染的过表达EGFRvIII的CH0细胞(C册EGWviii)的 高特异性和高亲和力；没有与过表达天然EGFR的F98细胞(F98EWK)或未转染的F98细胞 (F98)的结合，W及没有与过表达天然EGFR的C册细胞(C册EG?)或未转染的C册细胞(C册)的 务主厶 台口口 〇
[0115] 材料(培养基、缓冲液和试剂）：
[0116] 抗His IgG 13/45/31(Dianova)、FCS(Invitrogen)、Ficoll Paque 化US(GE Healthcare)、FITC缀合的山羊抗人IgG(Dianova)、FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG、min X (Dianova)、L谷氨酷胺（Invitrogen)、化化（姑rl Roth)、PBS(Invit;rogen)、青霉素/链霉素 (Invitrogen)、舰化丙晚（Propidium iodide) (Sigma)、RPMI-1640(Invit;rogen)。
[0117] 细胞和细胞系：
[0118] F98大鼠神经胶质瘤细胞、过表达EGFR的F98细胞(F98EGFK) W及过表达EGFRvII I的 F98细胞(F98EgfRviii)购自美国典型培养物收藏中屯、（American type culUire collection (ATCC))并根据所推荐的方案进行培养。
[0119] F98 (ATCC〔化-2397)
[0120] F98EGFR (ATCC C化-2948)
[0121] p98"pEgfRvIii (ATCC C化-2949)
[0122] 稳定转染的表达重组EGFR或EGFRvIII的C册细胞根据W下方案在Affimed生成：
[0123] 编码野生型EGFR或缺失突变体EGFRWII的基因由Life Technologies/GeneAd (雷根斯堡，德国）合成，并亚克隆至哺乳动物表达载体PCDNA5/FRT中。表达重组野生型EGFR 或EGFRWII的稳定的CHO细胞系基于先前适应悬浮生长的宿主细胞系Flp-In CHO化ife Technologies)生成。在转染前一天，将Flp-In C册细胞在补充有心谷氨酷胺、肌补充剂和 青霉素/链霉素的HyClone CDM4C册中进行传代培养(没有博来霉素(Zeocin))。稳定的表达 细胞系通过使用聚乙締亚胺(PEI)转染试剂，用基于PCDNA5/FRT的产物表达和整合质粒和 Flp重组酶表达质粒P0G44化ife Technologies)共转染Flp-In C册细胞系来生成。将2.扣g 总DNA稀释于50化化tiMEMI培养基中并与稀释于50化化tiMEMI培养基中的7.扣g阳I合 并。将混合物解育10分钟，然后加入到悬浮在ImL CHO-S-SFMII培养基的2X106个Flp-In C册细胞中。在转染后一天，将细胞在补充有500yg/mL潮霉素 B的CHO-S-SFMII培养基中稀释 至密度为1 X 1〇5个活细胞/mL，并在T75培养瓶中接种。Flp重组酶通过位点特异性的DNA重 组介导Flp-In表达构建体在整合的FRT位点插入到基因组中。在选择阶段，一周一次或两次 测量活细胞密度，将细胞离屯、并W1X105个活细胞/mL的最大密度重悬于新鲜的选择培养 基中。在使用50化g/mL潮霉素 B选择约2-3周后，回收表达EGFR或EGFRvIII的稳定的细胞，然 后将所述细胞转移至HyClone CDM4CH0悬浮培养基中。将稳定的表达野生型EGFR或 EGFRvIII的细胞冷冻保存于含50%Pro化eeze(Lonza)和7.5%DMS0的培养基中。
[0124] 为了测定稳定转染细胞系上野生型EGFR或EGFRvIII细胞表面抗原的密度，根据制 造商的说明书使用流式细胞间接免疫巧光测定(QIFIKIT，Dako)，并证明了CH妒WK稳定转染 细胞上野生型EGFR的密度与CH〇ewkviii稳定转染细胞上egFRvH I的密度近似相等，而在未转 染C册细胞上没有检测到野生型EGFR或EGFRvIII结合位点。
[0125] 通过流式细胞术测定抗体结合和亲和力：
[0126] 将细胞与所指示的scFv抗体从10化g/mL(约3300nM)开始在FACS缓冲液中的10化L 连续稀释液在冰上解育45min(分钟）。用FACS缓冲液洗涂3次后，将细胞在同一缓冲液中与 0.1 mL lOyg/mL小鼠单克隆抗His抗体克隆13/45/31在冰上解育45min。在第二个洗涂循环 之后，在与前相同的条件下，将细胞与O.lmL 15yg/mL FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG抗体解 育。作为对照，在没有scFv的情况下，将细胞与抗化S IgG 13/45/31解育，然后与FITC缀合 的山羊抗小鼠 IgG抗体解育。然后将细胞再次洗涂并重悬于含化g/mL舰化丙晚的0.2mL FACS缓冲液中W排除死细胞。使用用MXP软件的Beckman-Coulter FC500M化流式细胞仪 (Beckman-Coulter，克雷菲尔德，德国）或用In巧te软件的Mi 11 ipore Guava Easy切te流式 细胞仪(Merck Millipore，施瓦尔己赫，德国）测量1 X ΙΟ4个活细胞的巧光。细胞样品的平 均巧光强度用CXP软件（Beckman-Coulter，克雷费尔德，德国）或Incyte软件（Merck Millipore，施瓦尔己赫，德国）计算。
[0127] 如果用Beckman-Coulter FC500M化流式细胞仪进行分析，使用0.5X106个细胞/ 染色，如果用Millipore Guava化syCyte流式细胞仪，仅使用0.25X 106个细胞/染色。
[0128] 在减去单独用二级和Ξ级试剂染色的细胞的巧光强度值后，采用GraphPad Prism 软件（用于Windows的Gra地Pad Prism 6.00版，Gra地化d Software,加利福尼亚拉荷亚，美 国）的单位点结合的等式(双曲线)计算KD值。
[0 129] 结果示于图3。
[0130] 实施例4:SDS PAGE和蛋白质印迹分析结合EGFRvIII的抗体的结合特异性。
[0131] 为了检测含有不同结合结构域的EGFRvII I/CD3串联双抗体对EGFRWII抗原的结 合特异性W及为了证明不存在与野生型EGFR抗原的结合，实施了十二烷基硫酸钢聚丙締酷 胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析。
[0132] 通过重组DNA技术将编码野生型EGFR或截短型EGFRvIII的胞外结构域的序列融合 至人IgG抗体的化部分。将DNA构建体转染至将作为可溶性蛋白的重组的野生型EGFR-化或 EGFRvIII-化分泌至细胞培养上清液中的C册细胞中，使用蛋白A层析法从所述细胞培养上 清液中纯化所述重组的野生型EGFR-Fc或EGFRW II-Fc。通过化部分中分子内二硫键的形 成，野生型EGFR-Fc(或EGFRWII-Fc)融合抗原形成有两条相同的链的二聚体。由于 EGFRvIII-特异性267个氨基酸缺失，EGFRvIII-Fc比EGFR-化小约25kD，导致二聚体形式的 Fc融合蛋白有约50kD的大小差异。
[0133] 将等量的纯化的野生型EGFR-Fc(和EGFRvIII-Fc)与非还原性2XSDS PAGE样品缓 冲液或含二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂的还原性2 X SDS PAGE样品缓冲液混合。将含DTT的 样品在95°C加热5分钟，然后加载到4-20%标准TGX预制SDS PAGE凝胶(Biorad)上。每个泳 道使用化g的蛋白样品。为了在凝胶中分离蛋白，SDS-PAGE在300V下，在IX化is/甘氨酸/ SDS缓冲液(Biorad)中运行约25min。使用标准无染色分子成像系统(Biorad)使总蛋白在凝 胶中可视化。将化ge Ruler未染色蛋白梯带(Thermo Scientific)用作分子量标记物。然后 用BioRad的半干快速印迹(Semi-化y blotting化S忧lot)系统将凝胶印迹在PVDF膜上。在 室溫下将膜在溶于1XTBS的3%(w/v)脱脂奶粉中封闭30min。将膜切成小块，每一块含有所 印迹的相似的蛋白样品。将不同的串联双抗体在溶于1XTBS的3%(w/v)脱脂奶粉中稀释至 浓度为化g/ml，并在摇动平台上与单独的膜块解育1小时。将10μg/ml浓度的抗EGFR抗体西 妥昔单抗用作对照。将膜用TBST (TBS+0.1 % (v/v)吐溫20)洗涂3次，每次10分钟，用TBS洗涂 一次，然后与在溶于TBS的3%脱脂奶粉中Wl:5000稀释的HRP缀合的二级检测抗体Penta HI S-HRP (QIAGEN)(用于检测串联双抗体)或蛋白kHRP (Thermo Sc ientif iC)(用于检测西 妥昔单抗)在摇动平台上解育1小时。将膜用TBST(TBS+0.1 % (v/v)吐溫20)洗涂3次，每次10 分钟，用TBS洗涂一次。通过加入溶于TBS的0.06%048+0.02%0〇(：12+0.015%出02而启动膜 上HRP介导的显色。通过添加水终止反应。将膜干燥并扫描。
[0134] 结果示于图4。
[0135] 实施例5:通过酶联免疫吸附测定化LISA)分析含有不同EGFRWII结合结构域的 EGFRVIII/CD3串联双抗体对EGFRWII抗原的结合和对CD3的结合，W及在不结合野生型 EGFR抗原情况下它们对EGFRvII I的结合的特异性。
[0136] ELISA 步骤：
[0137] 将96孔E：LISA板（Immuno MaxiSo;rp;Nunc)在4°C下用在lOOmM碳酸盐-碳酸氨盐缓 冲液中的EGFRvIII-Fc、野生型EGFR-化或CD3 丫 ε重组抗原包被过夜。为了获得接近相同的 抗原摩尔包被密度，EGFRvIII斗cW化g/ml的浓度包被，EGFR-Fc W化g/ml的浓度包被，CD3 丫 ε抗原W1.扣g/ml的浓度包被。在使用溶于PBS的3%(w/v)脱脂奶粉(Merck)进行封闭步 骤后，将溶于含0.3 % (w/v)脱脂奶粉(Merck)的PBS中的范围为200ngAil-6.5 X l〇-6ngAil的 不同EGFRVIH/CD3串联双抗体的11个连续稀释液在25°C下在板上解育1.化。解育后，将板用 300μ1/孔的含0.1 % (v/v)吐溫20(Serva)的PBS洗涂3次。加入50ng/ml的蛋白kWP并在25 °〇下在板上解育化。用30化1/孔的含0.1 % (v/v)吐溫20的PBS洗涂3次后，加入四甲基联苯 胺(TMB)底物(Seramun)进行检测。在约2分钟后通过加入10化1/孔的0.5M出S化终止反应。 用多孔板读取器(Victor,F*erkin Elmer)在450nm下测量孔的吸光度。
[0138] 使用Gra曲Pad Prism软件(Gra曲化d Software,加州圣地亚哥，加拿大）将吸光值 在图中绘制成线。
[0139] 结果示于图5中。
[0140] 实施例6:通过Sra测量串联双抗体与EGFRvIII的结合：
[0141] 制备抗hu Fc IgG CM5-忍片
[0142] 如上所述(实施例2)制备抗hu Fc IgG CM5-忍片。
[0143] SPR测量中使用的串联双抗体的浓度范围：
[0144] 在Sra测量之前，使用化ndrop通过A280测定检查串联双抗体浓度。储备液的浓度 (C)根据W下等式计算：
[0145] C[mg/ml ] = (A280)/(2.25[cmVmg] X 1 [cm])
[0146] 用"Expasy Protparam"预测工具（http: //web. expasy. org/protparam/)计算不 同的消光系数。为了计算摩尔浓度，假定所有串联双抗体的分子量为105kD。通过在IX皿S- P+缓冲液中进行连续稀释将串联双抗体调整至下面提到的终浓度。制备W下浓度：150nM、 30nM、6nM、1.化]?、0.24nM、0.048nM和OnM;或90nM、30nM、lOnM、3.3：3nM、1.1 lnM、0.37nM、 0.123nM、0.041nM和OnM，或所指示的浓度。
[0147] 串联双抗体KD测量的结合测定条件
[0148] 将EGFRvII I-Fc融合蛋白在1 X皿S-P+中稀释至浓度为6.25nM。对于EGFRvII I-Fc， W ΙΟμΙ/min的流速注入抗原溶液持续40秒。将抗原注入流通池2。流通池1为参考池。
[0149] 将IX皿S-P+用作整个程序的运行缓冲液。将串联双抗体稀释液W30化/min的流 速注入所有四个流通池持续180秒。将在未捕获抗原的流通池1中测量的信号从流通池2的 信号中减去W校正结合曲线的背景结合。在540秒的解离时间后，如下所述重新生成忍片。
[0150] 抗hu Fc IgG忍片通过注入高盐缓冲液3.0M MgCl2(3X15秒，lOyL/min)重新生 成。每次测量前，在没有串联双抗体的情况下，执行3个"启动循环"。从最低至最高浓度测量 串联双抗体溶液。包括无运行缓冲液(化Μ)的一个循环。
[0151] 在MCK(Multi切cle Kinetic)测量中测定串联双抗体的结合参数。为了估算表观 结合亲和力，用Biacore X100评估软件中包含的"动力学化inetic)"方法评估结合曲线。通 过运个方法，使用"Langmuir 1:1相互作用模型"用所述软件全部或部分地拟合结合曲线。
[0152] 串联双抗体的结合参数
[0153] 为了分析将两个egFRWII结合结构域组合至二价或多价或多特异性分子如 EGFRVIII/CD3串联双抗体中的效果，应用BiacoreXlOO通过Sra测量EGFRVIII/CD3串联双抗 体对EGFRvIII抗原的表观亲和力（图6)。
[0154] 对于所有检测的分子，EGFRvII 1/串联双抗体中EGFRWII特异性结合结构域的表 观亲和力提高，最好的结合串联双抗体实现了 llpM的Kd。相对于对应的含有亲代EGFRWII 结合结构域的串联双抗体，含有亲和力成熟的结构域的串联双抗体的Kd降低高达25倍。相 对于单价结合scFv的测量的Kd，Kd的提高也高达25倍。有趣的是，与通过主要由提高的koN驱 动的亲和力成熟实现的提高相反，在二价串联双抗体形式中结合亲和力的进一步提高很大 程度上通过更慢的knf(师实现(表4)。
[0155] 因此，串联双抗体形式提供了一种在维持抗体结合结构域的特异性的同时进一步 增强结合亲和力的方法。
[0156] 表4:在SPR 1:1结合模型中对含有二价亲代的或亲和力成熟的EGFRvin特异性结
[0157] 合结构域的结构域顺序为化gdS-VhEgfkvIII-VlEgfkviiI-VhGD3的不同EGFRvIII/CD3串联双抗体与 重组EGFRvIII-Fc抗原的结合所测量的Kd、结合速率化QN)和解离速率化(W)的总结。
[015 引
[0159] 实施例7:用抗EGFRWII双特异性双抗体或西妥昔单抗进行实体瘤组织切片的免 疫组化（1肥)染色
[0160] 与在健康组织上广泛表达的野生型EGFR相比，突变受体EGFRvin的表达是高度肿 瘤特异性的。然而，神经胶质瘤细胞中EGFRvin的高频表达与文献中描述的一致，EGFRvII I 的表达广泛度和它在其它肿瘤中表达的同质性仍是有争议的。
[0161] 开始了一项小的免疫组化（IHC)研究，分析了来自各3例患有成胶质细胞瘤(GB)、 头颈化&N)癌、前列腺癌、Her2-阴性乳腺癌W及非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者的组织切 片与根据本发明的二价双抗体形式的EGFRvin特异性结合结构域的反应性(图7)。
[0162] 实施所述免疫组化研究W评估在不同肿瘤中EGFRWII的表达W及EGFRWII结合 抗体的肿瘤特异性。W含有WVhEwkviiI-VlEwkviii排列的EGFRvin结合结构域Li3G30的二价 双抗体形式，检测了 EGFRvin特异性可变结构域的EGFRWII结合。二级检测通过双抗体蛋 白上的化S标签实施。作为对照，使用了对天然EGFR有特异性的IgG抗体西妥昔单抗(爱必妥 化rbitux))。
[0163] 所有的人组织切片购自Bio化ain Institute,Inc.，并根据供应商的说明书处理 切片。使组织切片适应于室溫并与MK0过氧化物酶阻断剂解育，然后用10%山羊血清封闭。 将EGFRvin特异性双抗体W0.扣g/m巧日0.化g/ml的两个浓度水平解育1小时，然后与抗化S 抗体(Dianova)解育并通过Envi S ion+皿P-DAB系统检测小鼠抗体(DAK0)。根据制造商的说 明书，使用Klear人HRP-聚合物DAB检测系统(GBI Labs)，WlOg/ml的浓度实施用对照项爱 必妥(Merck KGaA)进行的组织切片染色。
[0164] 最终，将切片用苏木精染色并用封固介质（mountant medium)(Shandon Consul Mount?，Thermo Scientific斌片。
[016引结果示于图7。
[0166] Ξ个成胶质细胞瘤样品中有两个显示出与EGFRvIII特异性双抗体的明显且特异 性的反应性。令人惊讶的是，所有Ξ个头颈癌样品都显示出强且明显的EGFRvIII阳性，并且 同样地对于前列腺癌、乳腺癌和NS化C，用本文描述的EGFRvin特异性抗体获得了肿瘤组织 的特异性染色（图7)。
[0167] 基于运些特性，在此描述的EGFRWII结合结构域，诸如，例如，EGFRVIII/CD3双特 异性串联双抗体，极好地适用于开发多特异性的、多价的、免疫效应细胞参与，肿瘤祀向抗 体疗法。
[0168] 实施例8:在基于FACS的细胞毒性测定中评估由EGFRVIII/CD3串联双抗体介导的 细胞毒活性
[0169] 在基于细胞的细胞毒性测定中，分析了 EGFRWII/CD3串联双抗体抗体，其含有与 不同CD3结合结构域结合的亲代的或亲和力成熟的EGFRWII特异性结构域和/或在所述串 联双抗体分子中具有不同的顺序的各个结合结构域(图8)。通过将表达EGFRvΠI的CH0细胞 (CH〇ewkviii )、表达野生型EGFR的C册细胞(CH妒WK)和未转染C册细胞用作祀细胞来分析祀介 导的依赖性、串联双抗体的特异性和T细胞介导的杀伤性。
[0170] 材料(培养基、缓冲液和试剂）：
[0171] DMSO(Sigma)、化375邱?^!'细胞富集试剂盒（Stem Cell Technologies(干细胞技 术公司））、EasySep?人CD4+T细胞富集试剂盒（Stem Cell Technologies)、EasySep?人CD8 巧细胞富集试剂盒（Stem Cell Technologies)、The Big Easy EasySep?磁极（Stem Cell Technologies)、FCS( Invitrogen)、Lymphoprep(Stem Cell)、L-谷氨酉先胺（Invitrogen)、 mlgGl FITC(ADG)、CD16-FITC(MEM-154)(Thermo Fisher Scientific)、mlgGl-FITC/ mlgGl-PE/mlgGl-ECD(Beckman Coulter)、mlgGl-PE(Beckman Coulter)、mIgGl-PC5 (Beckman Coulter)、mIgGl-P口（Beckman Coulter)、CD8-FITC/CD4-PE/CD3-ECD(Beckman Coulter)、CD16-P巧（Beckman Coulter)、CD19-PC7(Beckman Coulter)、CD16-FITC/CD56- PE/CD3-ECD(Beckman Coulter)、CD14-PC7(Beckman Coulter)、CD33-PE(MACS Miltenyi Biotech)、化化（Roth)、PBS( Invitrogen)、青霉素/链霉素（Invitrogen)、PK册7绿色巧光细 胞标记化inke;r)Midi试剂盒（Sigma)、Gammano;rm人IgG(0ctapha;rma)、舰化丙晚（Sigma)、 RPMI-1640(Invitrogen)
[0172] 从血沉栋黄色层(buffy coat)分离PBMC并富集Τ细胞：
[0173] 在抽血当天从Deutsches Rotes Kreuz,DRK-Blutspendedienst Baden- Wudtemberg-化ssen(曼海姆，德国）购买血沉栋黄色层;血沉栋黄色层制备物在室溫下保 存过夜，然后通过密度梯度离屯、分离PBMC。将血沉栋黄色层样品用两到Ξ倍体积的PBS稀 释，在Lymphoprep垫层（cushion)上分层并在室溫w/o制动（brake)下W800Xg离屯、25min。 收集位于界面处的PBMC，并用PBS洗涂3次，然后将它们用于富集T细胞或流式细胞分析。根 据制造商的说明书使用EasySep?人T细胞富集试剂盒（用于免疫磁性分离未接触的人T细 胞）和Big Easy EasySeip?磁铁从PBMC群富集T细胞。
[0174] 通过流式细胞分析表征效应细胞：
[0Π 日]为了评估PBMC亚群的分布和富集的PBMC或T细胞子群（subset)的纯度，实施PBMC 染色。
[0176]对于流式细胞分析，将分离的PBMC或富集的PBMC亚群重悬于补充有2%热灭活的 FCS和0.1 %叠氮化钢(被称为FACS缓冲液)及Img/mL多克隆人IgG的PBS中，至密度为0.5-2 XloVmL。然后根据制造商所推荐的W下方案将0.5ml细胞悬浮液的等份试样在黑暗中与 抗体解育15min。
[01 W] 表5:通过流式细胞术表征PBMC和分级的PBMC的移液方案
[017 引
[0179] 解育后，在MXP采集软件(Beckman-Coulter)中，使用为PBMC和多色染色(門TC PE ECD PC5PC7;FITC 阳 ECD;門TC 阳 PC5PC7)制定的方案在Beckman-Coulter FC500M化流 式细胞仪(Beckman-Coulter，克雷费尔德，德国）上W3、4、5、6、l、2的顺序测量样品。对于分 析和数据绘图，使用了CXP分析软件(Beckman-Coulter)。
[0180] 细胞毒性测定：
[0181] 如前所述，通过流式细胞术表征用作效应细胞的T细胞。细胞毒性测定中使用的祀 细胞是稳定转染W过表达EGFRvIII的C册细胞(CH〇eg?viii)，稳定转染W表达野生型EGFR的 C册细胞(C册EWK)或未转染的C册细胞(C册）。如先前所述生成细胞系，并如前所述在标准条 件下培养。对于细胞毒性测定，将祀细胞收集起来，用不含FCS的RPMI 1640培养基洗涂两次 并重悬于PKH67绿色巧光细胞标记Midi试剂盒所提供的稀释液C中至密度为2 X lOVmL。然 后根据制造商的说明书，将细胞悬液与等体积的双倍浓缩的PKH67-标记溶液（例如，1化 PKH在25化L稀释液C中）混合，并在室溫解育2-5min，并定期混合。染色反应通过加入等体积 的FCS并解育Imin来终止。用完全RPMI培养基洗涂标记的祀细胞后，进行细胞计数并将细胞 在完全RPMI培养基中重悬至密度为2Xl05/mL。
[018引然后将2X 104个祀细胞与T细胞W5:1的E:T比例和所指示的抗体一起接种在圆底 96孔微板的各孔中，总体积为20化L/孔。通常检测9个从3化g/mL开始的连续1:5稀释液。在 每个平板上至少一式Ξ份测定没有抗体的情况下自然的细胞死亡和效应子(effectors)引 起的祀杀伤。串联双抗体介导的杀伤通常一式两份地测定。
[0183] 在室溫下W200g离屯、2min后，将测定板在37°C，含5%C02的加湿空气中，解育40h- 4她。解育后，将培养物用FACS缓冲液洗涂一次，然后重悬于补充有化g/mL PI的15化L FACS 缓冲液中。特征为阳性绿色PKH67染色但PI染色为阴性的活的祀细胞的绝对数量用 Millipore Guava liasyCyte流式细胞仪(Merck Millipore)来测量。
[0184] 基于所测量的剩余的活的祀细胞，根据W下公式计算特异性细胞裂解的百分比： [1-(活的祀细胞数目(協。η))/(活的祀细胞数目（齡柳）]X 100%。使用GraphPad Prism软件 (用于Windows的Gra地Pad Prism 6.00版，GraphF*ad Software,加利福尼亚拉荷亚，美国） 通过非线性回归/4参数逻辑拟合来计算Sigmoidal剂量响应曲线和EC50值。
[018 引数据分析：
[0186] 对于给定的抗体浓度所获得的裂解值一式两份地测定，使用Prism软件（用于 Windows的Gra地Pad Prism 6.00版，Graph化d Software,加利福尼亚拉荷亚，美国）通过 Sigmoidal剂量响应/4参数逻辑拟合分析来进行分析，并用于计算EC50平均值和裂解百分 比的重复的SD。
[0187] 结果示于图8和表6。
[0188] 所有检测的串联双抗体均显示出对表达EGFRvH I的细胞的浓度依赖性、高度的特 异性、细胞毒性和高效能，而EGFRvIII阴性细胞的存活并不受损害。在用表达EGFRwt-的细 胞或未转染的细胞检测的任何串联双抗体的全部浓度范围内，没有观察到可检测的细胞毒 性。因此，EGFRvII I/CD3串联双抗体介导的细胞毒性是严格地祀向依赖性的。在细胞毒性测 定中，含有亲和力成熟之前的亲代EGFRvIII结合结构域且结构域顺序为Vl?3-VhEwkviiI- VlEwkviiI-Vh?3的串联双抗体的ECso为25pM(图8)。对应的串联双抗体W相同的结构域顺序 (化?3-VhEwk"iI-VlE胃iiI-Vh?3 )含有亲和力提高的EGFRvII I结合结构域，同样表现出增强的 细胞毒性效力，在最好的情况下，达到1.5pM的EC50(表6)。细胞毒活性的相对提高在具有位 于外部位置中的EGFRvIII特异性结构域的串联双抗体(结构域顺序VhEwkviiI-Vl?3-VhEd 3- 化EWKviii)中更加明显(表6)。在运些串联双抗体中，高达70倍提高的细胞毒性效力可通过在 运些串联双抗体中用亲和力提高的结构域替换低亲和力EGFRWII结合结构域Li3G30来实 现（图8,表6)。
[0189] 表6:对细胞毒性测定中用不同的EGFRVIII/CD3串联双抗体测量的EC50值的总结， 所述不同的EGFRWII/CD3串联双抗体W两种不同的结构域顺序含有亲和力成熟的 EGFRvH I特异性结合结构域。示出了相对于对应的含有亲代EGFRvH I结合结构域的串联双 抗体的提高系数。
[0190]
[0191] Ch〇ietal.(Proc^tlAcadSciUSA.2013^n2;110(l):270-5;W02013/ 7185010)描述了t EGFRWII/CD3的comparator,即EGFRvIII/CD3双特异性Τ-细胞衔接器 (bispecific T-cell engager) (BiTE)，其具有一个EGFRvin结合位点（基于鼠 MRl结构域） 和一个CD3结合位点（基于抗CD3的抗体0KT3)。在基于细胞的细胞毒性测定中，该抗体在约 l(T2μg/ml的浓度下实现了50%的最大地获得的特异性裂解，其对应于52kD BiTE的约20化1 的摩尔EC50浓度(化oi et al.，2013的图4C)。比较显示本文描述的含有亲代的而非亲和力 成熟的EGFRWII结合结构域的串联双抗体的细胞毒性甚至比EGFRWII/CD3BiTE的高约10 倍。而且本发明的含有亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体甚至展示出相对于 EGFRvIII/CD3BiTE的高100倍的细胞毒性。
[0192] 实施例9:在表达重组EGFRWII的C册细胞(CH妒GFKviii)或表达重组EGFRvII I的F98 细胞(F98EGFKVIII)上由EGFRv III /CD3串联双抗体引起的EGFRv III受体内化
[0193] 为了评估由EGFRvII I/CD3串联双抗体引起的EGFRvII I调控，将表达重组EGFRvII I 的C册细胞(CH妒GFKviii)或表达重组EGFRvIII的F98细胞(F98Egfkviii)W2.5X1〇5个细胞的等 份试样在圆底96孔微板各单孔中，在补充有10%FCS、2mM k谷氨酷胺、lOOIU/mL青霉素 G钢 盐、lOOyg/mL硫酸链霉素、lOOyg/mL丙酬酸钢(本文中称为完全RPMI培养基;所有组分购自 英杰公司）的RPMI 1640培养基中与浓度渐增的EGFRWII/CD3串联双抗体在37°C，5%C02 下，在加湿解育器中解育24小时。在没有抗体的情况下培养若干等份的细胞，用作检测最高 EGFRvIII细胞表面水平的对照样品和单独用二级试剂用作进行的染色的阴性对照。
[0194] 解育后，将细胞用冰冷的补充有2 %热灭活的FCS( Invi化ogen)和0.1 %叠氮化钢 (尺〇1:11，卡尔斯鲁厄，德国）的憐酸盐缓冲盐水。135，1]1￥；[1：1'0旨6]1)(在本文中称为。4〔5缓冲 液)洗涂2次，然后用饱和浓度(1化g/mL)的抗体(该抗体和在调整培养期间与细胞解育的抗 体是相同的）染色W评估对应于细胞表面上剩余EGFRWII抗原的最大的抗体结合。将在没 有抗体的情况下培养的细胞的等份试样用饱和浓度的同一抗体染色，W测定对应于细胞表 面上的最大可测量的EGFRvin水平的最大抗体结合能力。用FACS缓冲液洗涂3次后，用串联 双抗体处理细胞并用lOyg/mL抗His mAb(Dia910，Dianova)染色，然后用15yg/mL FITC缀合 的山羊抗小鼠 IgG(Dianova)染色。用FACS缓冲液反复洗涂后，将细胞重悬于含化g/mL舰化 丙晚（Sigma)的FACS缓冲液中W排除死细胞。使用MXP软件和FC500M化流式细胞仪 (Beckman-Coul ter，克雷费尔德，德国）分析来自每个样品的约5 X 103个舰化丙晚阴性细 胞，用CXP软件（Beckman-Coulter)测定所测量的样品的平均巧光强度（MFI)或者使用 In巧te软件(Merck Millipore，施瓦尔己赫，德国）用Millipore Guava E；asy切te流式细胞 仪分析细胞。
[019引在减去获自单独用二级试剂进行的细胞染色的信号之后，使用GraphPad Prism软 件(Gra地化d Software,加州圣地亚哥，加拿大)将所测量样品的平均巧光强度在图中绘制 成线，并使用通过在没有EGFRVIII/CD3串联双抗体的情况下在37°C下对未处理的细胞样品 进行染色而获得的巧光信号(其被设置为代表100%的细胞表面EGFRvIII)来计算细胞表面 上剩余EGFRvII I的相对量。
[0196] 结果示于图9。
[0197] 若干文献报告描述了与天然EGFR相比缺失突变体EGFRvIII显示出受损的内化 (F'enstermaker et al.2000,化η et al.2006,Grandal et al.2007,Gan et al.2009)。尽 管如此，关于EGFRvII I特异性抗体或针对也结合EGFRvH I的野生型EGFR的抗体(例如西妥 昔单抗）的若干公开的报告，描述了在结合各自的抗体之后表达EGFRvIII的细胞中 EGFRvIII 的快速内化和降解(Reist et al. 1995，Foulon et al. 2000，Kuan et al. 2000， Patel et al.2007,Jutten et al.2009,Dreier et al.2012)〇
[019引对于内化测定，使用过表达EGFRWII的转染CH妒GFKviii细胞。将运些表达EGFRvII I 的细胞与不同浓度的EGFRvIII/CD3串联双抗体在37°C下解育24小时，描述了其它EGFRvIII 结合抗体的上下文中的条件W诱导强的内化。在本调整(期间抗体-受体复合体可W内化或 不内化)之后，用各抗体W l0μg/ml的饱和浓度给细胞表面上所有剩余的EGFRvII I受体分子 染色（图9)。图9呈现的结果表明，在将细胞暴露于EGFRWII-结合串联双抗体之后，在所有 检测条件下未处理细胞上存在的多于80%且高达140%的EGFRWII受体分子仍是可用的 (140%或更多的>100%的一般值是指与细胞表面上受体的数目减少(细胞内化)相反，用串 联双抗体处理的细胞显示出细胞表面上受体的增加。内化至100%来自与未处理的细胞的 对比）。运些结果表明，本发明的EGFRvIII/CD3串联双抗体令人惊讶地没有显示出任何内化 趋势（图9)。本发明的EGFRvIII特异性结构域的结合，没有诱导内化，而是甚至可能抑制内 化并导致细胞表面上EGFRWII受体水平增加。图9呈现的结果表明，相对于未处理的细胞， 在所有检测条件下，在将细胞暴露于EGFRvIII-结合抗体之后，至少多于80%仍保留在细胞 表面上。运些结果表明，本发明的EGFRvIII/CD3抗体，尤其是EGFRvIII/CD3串联双抗体，令 人惊讶地没有显示出任何内化趋势（图9)。本发明的EGFRvIII特异性结构域的结合，没有诱 导内化，而是可能抑制内化或促进EGFRvII I表达增加，导致其细胞表面密度增加。
[0199] 实施例10:评估在EGFRvIII/CD3(或EGFRVIII/CD16A)串联双抗体的存在下PBMC培 养物中的细胞增殖
[0200] 为了评估在不存在EGFRvIir祀细胞的情况下EGFRvIII/CD3(或EGFRVIII/CD16A) 串联双抗体是否诱导T细胞的激活和后续的增殖，在浓度渐增的EGFRVIII/CD3串联双抗体 的存在下培养人PBMC。解育5天后，在漠脱氧尿巧渗入试验(Br加 inccxrporation assay)中 评估增殖。
[0201] 材料(培养基、缓冲液和试剂）
[0202] FCSdnvihogen)、人血清（Sigma)、Lymphoprep(Stemcell Technologies)、心谷 氨酷胺（Invitrogen)、0KT3(Biolegend)、PBS(Invit;rogen)、β-琉基乙醇（Invitrogen)、青 霉素/链霉素（11^1付〇旨日11)、1^〇-1640(1醇1付〇旨日11)、丙酬酸钢（11^1化〇旨日11)、化加细胞增 殖化 ISA(Roche)。
[0203] 细胞；
[0204]在抽血当天从Deutsches Rotes Kreuz,DRK-Blutspendedienst Baden- Wudtemberg-化ssen(曼海姆，德国）购买血沉栋黄色层;在分离PBMC之前，将血沉栋黄色层 制备物在室溫下保存过夜。
[020引从血沉栋黄色层分离PBMC并富集T细胞：
[0206] 通过密度梯度离屯、从血沉栋黄色层分离PBMC。将血沉栋黄色层样品用两到Ξ倍体 积的PBS稀释，在Lymphopr巧垫层上分层并在室溫w/o制动下WSOOXg离屯、25min。收集位于 界面处的PBMC，并用PBS洗涂3次，然后将它们用于增殖试验。
[0207] 增殖试验
[0208] 将所有测定板在室溫下用补充有10%热灭活的人血清、4mM k谷氨酷胺、lOOU/mL 青霉素 G钢盐、lOOyg/mL硫酸链霉素、ImM丙酬酸钢、0.05mMf3-琉基乙醇的RPMI1640培养基 (本文中称为完全RPMI培养基)封闭2小时W防止抗体与塑料表面的非特异性结合。在除去 封闭培养基后，将4 X 105个PBMC与所指示浓度的检测项和对照项一起接种在平底96孔微板 的每个孔中的完全RPMI培养基中，总体积为20化L/孔，每个样品测定Ξ次。将IgG抗CD3的克 隆0KT3用作阳性对照。为了评估自发增殖，在6个重复中，在没有抗体的情况下培养细胞。然 后将板在37°C和5%C02下，在加湿的空气中解育4天。在解育终止前18小时，将细胞培养物 用1(Κ)μΜ化加脉冲处理(pulsed)。根据制造商的说明书，用化加增殖ELISA试剂盒对渗入的 化加定量。通过加入lOOmM此5化终止显色后，用多标签酶标仪(plate reader) (Victor 3, Perkin Elmer)在450nm下测量吸光值。分析吸光度值并使用GraphPad Prism软件（用于 Windows的Gra地Pad Prism 6.00版，Gra地化d Software,加利福尼亚拉荷亚，美国）将平均 值和SD绘制成线。
[0209] 结果示于图10。
[0210]实施例11:EGFRvIII/CD3的串联双抗体CD3结合亲和力与细胞毒性效力的相关性 [0211]构建并表达了含有相同EGFRWII结合结构域化i3G30)和不同CD3结合结构域(其 对CD3T细胞抗原具有一些亲和力）的EGFRVIII/CD3串联双抗体并测定了与CD3^urkat细胞 和EGFRvII rCH〇EWKviii细胞的结合;此外，实施了将ch〇ewkviii细胞用作祀细胞和将PBMC细胞 用作效应细胞的细胞毒性测定。在本实施例中检测的所有检测的串联双抗体的各VH和化 (重链和轻链)结构域的顺序都相同:Vl?3-VhE胃iiI-VlE胃iiI-Vh?3。
[0引引如先前实施例中所述，对结合EGFRvII rCH0EGFKviii细胞的抗体和由EGFRvIII/CDS 串联双抗体介导的细胞毒活性进行流式细胞术评估。
[021引用渐增浓度的串联双抗体对CD3 +化rkat细胞染色后，通过流式细胞仪测定 EGFRVIII/CD3串联双抗体对CD3+细胞的表观亲和力。使用通过流式细胞术测定的各串联双 抗体浓度的平均巧光值，通过非线性回归/双曲线计算KD值。
[0214] 材料(培养基、缓冲液和试剂）：
[0215] 抗His IgG 13/45/31(Dianova)、FCS(Invi化ogen)、FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG min X(Dianova)、心谷氨酷胺（Invitrogen)、Na化（Carl Roth)、PBS(Invit;rogen)、青霉素/ 链霉素（Invitrogen)、舰化丙晚（Sigma)、RPMI-1640(Invit;rogen)
[0216] 细胞；
[0217] 将化rkat细胞（由G. Mo 1 denhauer博± (DKFZ，海德尔堡，德国）惠赠)培养在补充有 2mM k谷氨酷胺和lOOIU/mL青霉素 G钢盐和10化g/mL硫酸链霉素的RPMI 1640培养基中（所 有组分均来自Invitrogen，本文中称为完全RPMI 1640培养基）。
[0218] 通过流式细胞术测定对CD3+细胞的抗体亲和力：
[0219] 将细胞与所指示的抗体在补充有2%热灭活的FCS和0.1 %叠氮化钢的冰冷PBS(称 为FACS缓冲液）中从lOOyg/mL(约lOOOnM)开始的100化连续稀释液在冰上解育45min。用 FACS缓冲液洗涂3次后，将细胞在同一缓冲液中与0.1 mL lOyg/mL小鼠单克隆抗化S抗体克 隆13/45/31在冰上一起解育45min。在第二个洗涂循环之后，在与前相同的条件下，将细胞 与0.1 mL 15yg/mL FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG抗体一起解育。作为对照，在没有一抗的情况 下，将细胞与抗His IgG 13/45/31解育，然后与FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG抗体解育。然后 将细胞再次洗涂，并重悬于含化g/mL舰化丙晚的0.2mL FACS缓冲液中W排除死细胞。使用 用MXP软件的Beckman-Coulter FC500M化流式细胞仪（Beckman-Coulter,克雷菲尔德，德 国）或用Inc^yte软件的Millipore Guava Easy切te流式细胞仪(Merck Millipore，施瓦尔 己赫，德国）测量lXl04个活细胞的巧光。细胞样品的平均巧光强度用CXP软件(Beckman- Coulter，克雷费尔德，德国）或Inc^yte软件(Merck Millipore，施瓦尔己赫，德国）计算。如 果用Beckman-Coulter F巧OOMI^L流式细胞仪进行分析，使用0.5 X 106个细胞/染色，如果用 Millipore Guava E：asyCyte流式细胞仪，仅使用0.25X 106个细胞/染色。
[0220] 在减去单独用二级和Ξ级试剂染色的细胞的巧光强度值后，将巧光强度值和 Gra曲化d Prism软件（用于Windows的Gra曲Pad PrismG.00版，Gra地化d Software,加利福 尼亚拉荷亚，美国）的单位点结合的等式(双曲线）用于计算KD值。
[0221] 对于每个分析的串联双抗体，将结合EGFRvH I的KD值和细胞毒性的EC50绘制成结 合CD3的KD值的函数。当串联双抗体的结合EGFRvII I的KD值仅显示出很小的可变性时，E巧0 细胞毒性值显示出了伴随着串联双抗体渐增的CD3结合值几乎成线性增加(图11)。
[022引实施例12:由EGFRVIII/CD3引起的F98EWKVIII异种移植瘤抑审ij(体内概念验证） [022引在第0天(dO)，通过皮下（S.C.)注射与来自健康供体的1X107个纯化的人PBMC混 合的4X106个F9SnpEG?viii细胞的悬浮液，对9个实验组的免疫缺陷NOD/scid小鼠（NOD/ MrkBomTac-Prkdcscid，Taconic Denmark)进行异种移植。为了解释PBMC可能的供体可变 性，将每个实验组再分成两队（cohorts )，每队仅接受一个个体供体的PBMC。在肿瘤细胞接 种后化，随后是2地、4她、7化和96h，将l(K)yg、10yg或化g的各串联双抗体测试项通过尾静脉 (i.v.)对动物进行给药。对照组仅接受载体。从do开始，一周两次用Img西妥昔单抗（爱必 妥)对另一对照进行给药（i.P.)。表6总结了剂量组和供体分配。从第3天至第52天一周3次 通过用卡尺测量肿瘤的大直径和小直径来监控肿瘤体积。根据W下公式用直径计算肿瘤体 积:体积=(小直径)2 X大直径X 0.5。
[0224] 表7:动物的剂量组
[0225]
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【主权项】
1. 一种具有至少一个EGFRvIII结合位点的EGFRvIII结合蛋白，其包含抗体可变重链结 构域和/或抗体可变轻链结构域，所述抗体可变重链结构域包含选自SEQ ID NO: 27、33、42、 46、49、53的CDR1，选自 SEQ ID N0:28、38、43、50、54、61、63的CDR2和SEQIDN0:29的CDR3， 所述抗体可变轻链结构域包含选自SEQ ID NO: 30、34、36、39、44、47、51、56、59、64的CDR1， 选自 SEQ ID N0:31、40、57的CDR2和选自 SEQ ID N0:32、35、37、41、45、48、52、55、58、60、62 和65的CDR3。2. 根据权利要求1所述的具有至少一个EGFRvIII结合位点的EGFRvIII结合蛋白，其包 含选自SEQ ID如：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和25的抗体可变重链结构域和/或选自 SEQ ID 从)：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和26的抗体可变轻链结构域。3. 根据权利要求1或2所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述可变重链结构结构域和可 变轻链结构域的EGFRvIII结合位点选自下组： (i) SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2， (ii) SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4， (iii) SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6， (iv) SEQIDN0:7和SEQIDN0:8， (v) SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:10， (vi) SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12， (vii) SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14， (viii) SEQIDN0:15和SEQIDN0:16， (ix) SEQIDN0:17和SEQIDN0:18， (x) SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20， (xi) SEQ ID NO:21 和SEQ ID NO:22,以及 (xii) SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的EGFRvII I结合蛋白，其中，细胞在37°C、所述 EGFRvIII结合蛋白的饱和状态下暴露于所述结合蛋白24小时之后，至少80%的存在于未处 理细胞上的EGFRvII I受体分子仍是可用的。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述蛋白包括至少一个 其他功能结构域。6. 根据权利要求5所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述至少一个其他功能结构域是效 应子结构域。7. 根据权利要求6所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述其他效应子结构域是包含形成 CD3抗原结合位点的至少一个抗体可变重链结构域和至少一个可变轻链结构域的CD3结合 位点。8. 根据权利要求7所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述⑶3结合位点包含具有SEQ ID NO: 23氨基酸序列的可变重链结构域和具有SEQ ID NO: 24氨基酸序列的可变轻链结构域。9. 根据权利要求1-8中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是人源化 的或全人的。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是弹性 抗体。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是二聚 蛋白。12. 根据权利要求1-11中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是双特 异性的。13. 根据权利要求11或12所述的二聚EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是串联双 抗体，其中在每个多肽中，四个可变链结构域按以下顺序通过肽接头LI、L2和L3彼此融合： (i)VL(CD3)-L1-VH(EGFRvIII)-L2-VL(EGFRvIII)-L3-VH(CD3);或 (i i)VH(CD3)-L1-VL(EGFRvIII)-L2-VH(EGFRvIII)-L3-VL(CD3);或 (i i i)VL(EGFRvIII)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(EGFRvIII);或 (i v)VH(EGFRvIII)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(EGFRvIII)。14. 根据权利要求13所述的串联双抗体，其中，所述接头LI、L2和L3由约12个或更少的 氨基酸残基组成。15. 根据权利要求14所述的串联双抗体，其中，所述接头是GGSGGS。16. -种编码权利要求1-11中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白或权利要求12-15中任 一项所述的双特异性串联双抗体的多核苷酸。17. -种包含权利要求16所述的多核苷酸的载体。18. -种用权利要求17所述的载体转化或转染的宿主细胞。19. 一种药物组合物，其包含：（i)权利要求1-12中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，权 利要求14-15中任一项所述的双特异性串联双抗体，权利要求17所述的载体或权利要求18 所述的宿主细胞；以及（ii)药学上可接受的载体。
【专利摘要】本申请描述了特异性结合EGFRvIII的结合蛋白和特异性结合EGFRvIII和CD3的多特异性结合蛋白。进一步描述了结合EGFRvIII和CD3的多特异性串联双抗体。进一步描述了用于募集T细胞以专门有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高细胞毒性EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体。
【IPC分类】C07K16/30, A61P35/00, A61K39/395, C07K16/46, C07K16/28
【公开号】CN105555804
【申请号】CN201480045405
【发明人】克里斯蒂娜·埃尔旺格, 乌维·罗伊施, 伊维卡·法斯克, 斯特凡·奈克马斯, 薇拉·莫尔肯斯恩, 梅尔文·利特尔, 尤金·朱可夫斯基
【申请人】阿菲姆德股份有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年8月7日
【公告号】CA2920173A1, EP3030581A1, US20160152728, WO2015018527A1
【专利说明】对EGFRvI I I有特异性的抗体结合位点
[0001 ]本发明设及特异性结合EGFRvII I的结合蛋白和特异性结合EGFRvH I和CD3的多特 异性结合蛋白。本发明进一步延伸到结合EGFRWII和CD3的多特异性串联双抗体（tandem diabody)。特别是，本发明设及用于募集T细胞W专口有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高 细胞毒性EGFRvII I/CD3双特异性串联双抗体(TandA b?)。
[0002] EGFR失调与许多癌症相关联，小分子和EGFR祀向抗体均已成功用于临床。然而，由 于EGFR的广泛的正常组织表达，被批准用于临床应用的抗体W及那些处于开发中的抗体均 具有严重的副作用。具有截短的胞外结构域并确保配体非依赖性固有活性的EGFR的缺失突 变体(deletion variantHiKEGFRWII)，是与致癌性转化相关的最常见的突变体形式。 EGFRvIII专口在癌组织中表达，并与各种实体瘤类型相关。癌细胞上受限制的EGFRvIII表 达提供了开发专口祀向癌症同时保护正常组织并充分降低与EGFR治疗相关的副作用的细 胞毒性抗体的机会。
[0003] 在本发明的第一个方面中，本文描述了全人的、高特异性的、高亲和力EGFRvin结 合蛋白。所描述的EGFRvIII结合蛋白具有如下优势：
[0004] 它们不促进或促进来自祀向阳性分子的细胞表面的非常低的EGFRvIII内化，运有 利于募集细胞毒性T-细胞或NK-细胞。图9中的结果显示，根据本发明，细胞在所有测试条件 下暴露于EGFRWII结合蛋白之后，相对于未处理的细胞，EGFRWII受体分子仍保留在细胞 表面上。运些结果表明，本发明的EGFRVIII/CD3结合蛋白令人惊讶地不显示任何内化趋势 (图9)。本发明的EGFRvIII特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可 能促进EGFRvII I表达的增加，从而导致其细胞表面密度增加。
[000引可使用亲和力成熟技术(affinity maUiration technique)使运些高亲和力结合 蛋白的亲和力得到进一步大幅提高W获得对EGFRWII有特异性、Kd在l(K)pM范围或更低的 结合蛋白。令人惊讶的事实是，运些结合蛋白展示了结合EGFRvIII的异常特异性，且对天然 EGFR(野生型EGFR或EGFRwt)没有交叉反应性。由于来自EGFR细胞外结构域(外显子2-7)的 269个氨基酸的框内（in-打ame)缺失，因此相对于EGFRwt，在EGFRWII中形成新表位(neo- epitope)，且预计该新表位相当小：其由新的氨基酸并列(novel化xtaposition of amino acidsK氨基酸5融合于氨基酸274)和缺失位点处的一个新的GLY氨基酸组成。
[0006] 亲和力成熟筛选方法的目的在于通过促进解离速率化OFF)降低的结合蛋白的选择 来提高结合亲和力。然而，令人惊讶的是，所显示的亲和力成熟的结合蛋白大大增加了结合 速率化ON)，而koFF的降低对结合蛋白的提高达100倍的结合仅有小的贡献，其中一些可变抗 体结构域显示Kd小于lOOpM。
[0007] 运些独特的性质使运些本文所描述的对EGFRvIII有特异性的可变抗体结构域特 别适用于开发多特异性的，例如双特异性的、多价的、免疫效应细胞参与（immune effector cell engaging)、肿瘤祀向抗体治疗，诸如，例如EGFRvII I/CD3双特异性串联双抗体 (TandAb").
[0008] 在本发明的进一步方面中，提供了多价EGFRWII结合抗体，其对EGFRWII具有两 个结合位点，或在多价双特异性抗体的情况下，除对EGFRvHI具有两个结合位点之外，还对 T-细胞抗原CD3或特异性表达于天然杀伤(NK)细胞上的CD16A具有结合位点。
[0009] 在一个实施例中，使用对EGFRWII具有两个结合位点并另外包含对CD3具有两个 结合位点的EGFRvII I/CD3串联双抗体，并测试了它们与重组EGFRvII I-或EGFR-Fc融合抗原 的结合。在非还原条件下（由于完整的二硫键，分子结构仍部分保留），或在还原条件下（蛋 白结构完全变性），EGFRvIII-或EGFR-Fc融合抗原通过SDS-PAGE分离，通过蛋白质印迹 (Western Blotting)转移至PVDF膜，并使用不同的EGFRVIII/CD3串联双抗体抗体(diabody ant化ody)或EGFR-结合IgG西妥昔单抗来评估结合W修饰(decorate)印迹（图4)。该实施例 显示，包含对EGFRvIII具有两个结合位点的亲代EGFRvIII结合结构域和亲和力成熟的 EGFRvH I结合结构域在多价抗体形式中也保持其对EGFRvH I的选择特异性。在还原和非还 原条件下，所有EGFRWII/CD3串联双抗体均能识别EGFRvIII，但在任意的运些条件下均不 能识别全长野生型EGFR。该实施例还证明，本文所描述的EGFRWII特异性结合结构域能识 别线性表位，且其反应性不需要完整的Ξ维结构。运与EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗(爱必 妥化rbitux))相反，EGFR-结合IgG抗体西妥昔单抗能识别野生型EGFR和成熟的EGFRvIII， 但其反应性显然需要完整二硫键与构象表位(图4)。
[0010] 在另一个实施例中，使用包含与不同CD3结合结构域组合的亲代的或亲和力成熟 的EGFRvIII特异性结构域和/或在串联双抗体分子中具有不同顺序单个结合结构域的 EGFRvII I/CD3串联双抗体。具有结构域顺序Vl?3-VhEwkviiI-VlEwkviiI-Vh?3的串联双抗体在串 联双抗体分子的中部含有二价EGFRvIII结合位点，而具有结构域顺序VhEwkviiI-化?3-Vh?3- 化EGWviii的串联双抗体在外面的位置具有两个EGFRvIII结合位点且在中部具有两个CD3结 合位点。在ELISA中，分析串联双抗体的不同EGFRvIII-结构域和结构域顺序突变体与 EGFRvIII抗原、野生型EGFR抗原的浓度依赖性结合W及与CD3抗原的浓度依赖性结合（图 6)。所有含有亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体均显示了与EGFRvIII结合的 大幅提高，清楚地表现为相应的结合曲线向较低浓度移位大于两个数量级（图6)。没有观察 到任何串联双抗体与野生型EGFR抗原的结合。
[0011 ] 可通过隧菌体展示文库（phase display libraries)选择和鉴定抗EGFRWiUjt 体，例如选择性地结合成熟的而非天然形式(native form)的EGFR的抗原-结合蛋白。Τ细胞 是不能由天然抗体募集的有效的肿瘤杀伤效应细胞。因此，在本发明的进一步方面中，本发 明提供了一组多特异性EGFRVIII/CD3抗原-结合蛋白，特别是串联双抗体，其能募集Τ细胞、 具有宽范围的结合特性和细胞毒性特性。在一组体外试验中表征了本发明的抗原-结合蛋 白的结合特性、Τ细胞介导的细胞毒性活性和祀标介导的Τ细胞活化的特征。在FACS中，本发 明的抗原-结合蛋白对Biacore、ELISA和EGFRvIII-阳性细胞中的EGFRvIII抗原显示异常的 特异性。在测试的全浓度范围内，没有观察到任何结合蛋白与EGFR抗原或与EGFRwt表达细 胞的可检测的结合。最有效的高亲和力串联双抗体对表达EGFRvII I的F98神经胶质瘤细胞 和C册细胞显示EC50为IpM-lOpM的细胞毒性;剩余的串联双抗体显示EC50高达约lOOOOpM的 细胞毒性。也试验了运些串联双抗体对作为结合至天然形式的残基的更敏感探针的EGFRwt +细胞的细胞毒性。直至最大评估的串联双抗体浓度为0 .化Μ时，才在EGFRwt+细胞或其他 EGFRvIII-阴性细胞上观察到细胞毒性。与CD3的高亲和力结合对有效的T细胞募集是至关 重要的，然而，在体外不存在EGFRvIIr祀细胞时，如由增殖缺乏测量，本发明的串联双抗体 没有引起τ细胞活化，运有助于良好的临床前安全性（图10)。总之，抗肿瘤细胞毒性的严格 特异性和高效性由EGFRvII I/CD3串联双抗体介导。
[001引产生了具有CD3结合Kd范围为1. InM至约500nM但相对恒定的EGFRvin结合Kd(范围 为2. OnM-6.7nM)的串联双抗体，其显示了对表达EGFRvH I的细胞的CD3结合强度和细胞毒 性效力的良好相关性，其ECso值范围为25pM至约lOOOOpM(图11)。
[0013] 虽然本发明的抗原-结合蛋白对EGFRWII的亲和力已得到显著提高，但特异性没 有损失。
[0014] TandAb'^是用于表示串联双抗体的Affimed Therapeutics的商标化ipriyanov et al.,1999,J.Mol.Biol,293:41-56；Cochlovius et al.,2000,Cancer Res.,60:4336- 4341;Reusch et al.,2004,Int.J.化ncer,112:509-518,Kipriyanov,2009,Methods Mol Biol,562:177_93;McAleese and Eser,2012,Future Oncol.8:687-95)。在本发明的上下 文中，TandAb和串联双抗体作为同义词使用。
[0015] 野生型EGFR基因和蛋白的序列是已知的。EGFRvIII是野生型EGFR基因的外显子2- 7(8(Ubp)的框内缺失的结果，导致受体外部结构域的267个氨基酸缺失，并在外显子1和8的 接点处产生新的甘氨酸残基。EGFR胞外结构域内的该新的氨基酸并列产生肿瘤特异性和免 疫原性表位。
[0016] 根据本发明的第一个方面，描述了对至少EGFRWII具有特异性的结合蛋白，其不 与野生型EGFR交叉反应。该结合蛋白优选包括选自下表1A中所描述的CDR的抗体可变重链 的CDR1、CDR2、CDR3和抗体可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3。
[0017] 表1A:来自特异性结合EGFRWII的结合蛋白的人类轻链和重链CDR的氨基酸序列 的序列标识号 [001 引
[0019]
[0020] 因此，本发明的实施方案是具有至少一个EGFRWII结合位点的EGFRvIII结合蛋 白，包含抗体可变重链结构域和/或抗体可变轻链结构域;其中，所述抗体可变重链结构域 包含选自沈Q ID 側：27、33、42、46、49、53的〔〇1?1，选自沈01〇側：28、38、43、50、54、61、63 的〔032和沈9 10顯:29的〔01?;所述抗体可变轻链结构域包含选自569 10^:30、34、36、 39、44、47、51、56、59、64的〔01?1，选自沈9 10側：31、40、57的〔01?2和选自沈9 10側：32、35、 37、41、45、48、52、55、58、60、62和65的〔0尺3。
[0021] 根据进一步的实施方案，所述结合蛋白包含具有选自如表1B所示的SEQ ID N0:1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和25的抗体可变重链结构域和/或选自如表18所示的569 10 N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和26的抗体可变轻链结构域的至少一个EGFRvIII结合 位点。Ξ个可变轻链CDR和Ξ个可变重链CDR的氨基酸序列在表1中W粗体显示且加有下划 线。运些结构位点显示对EGFRvIII的亲和力提高，而特异性没有损失。运些抗原-结合蛋白 不与野生型EGFR抗原交叉反应。
[0022] 进一步地，本发明的运些抗原-结合蛋白在结合EGFRWII时没有显示或仅显示最 小化的EGFRvIII内化。根据本发明，在根据实施例9的测试条件下，在细胞暴露于EGFRvIII- 结合抗体之后，大于80%，优选大于90%，最优选大于95%的EGFRvin受体分子仍保留在细 胞表面。本发明的EGFRvin特异性结合蛋白的结合可能抑制内化，而不是诱导内化，或者可 能促进EGFRvII I的表达增加，从而导致其细胞表面密度增加。
[0023] 术语"结合蛋白"是指具有抗原结合性质的免疫球蛋白衍生物，即含有抗原结合位 点的免疫球蛋白多肤或其片段。该结合蛋白包含抗体的可变结构域或其片段。每个抗原-结 合结构域都由结合相同表位的抗体即免疫球蛋白、可变重链结构域(VH)和抗体可变轻链结 构域(VL)形成。本发明的可变轻链结构域或可变重链结构域是包含CDRUCDR2和CDR3的多 肤。优选地，本发明的结合蛋白缺乏免疫球蛋白恒定结构域。术语"结合蛋白"也指抗体片段 或衍生物，包括化b Jab '、F(ab '）2、Fv片段、单链Fv、双抗体、串联双抗体(TandAbK ；)、弹性 抗体 ^1姑16〇(17，胖003/025018)、串联单链尸￥((3。尸￥)2)。
[0024] 表1B:所有抗-EGFRvin可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)的氨基酸序 列（CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列W粗体显示且加有下划线）
[0025]
[0026]
[0027]
[0028] 在优选的实施方案中，赋予对EGFRWII具有特异性的结合蛋白包含来自表1所示 的可变重链结构域和可变轻链结构域的W下组合之一的抗原结合位点：
[0029] (i)沈Q ID N0:1 和沈Q ID N0:2，
[0030] 。1)沈9 10^):3和沈9 10^):4，
[0031 ] (iii)沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6，
[0032] (iv)沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8，
[0033] (V)沈Q ID N0:9和沈Q ID N0:10，
[0034] (vi)沈Q ID NO: 11和沈Q ID NO: 12，
[0035] (乂^)569 10^):13和沈9 10^):14，
[0036] (乂^1)沈9 10^):15和沈9 10^):16，
[0037] (ix)沈Q ID NO:17和沈Q ID NO: 18，
[003引（x)WQIDN0:l^PWQIDN0:20，
[0039] (xi)沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:22,或
[0040] (又11)56910^):25和沈910^):26。
[0041] 本发明还提供不仅对EGFRvIII具有特异性，而且还具有至少一个其他功能结构域 的结合蛋白。在进一步的实施方案中，所述至少一个其他功能结构域是效应子结构域 (effector domain)。"效应子结构域"是对效应细胞有特异性的结合位点，其可刺激或触发 细胞毒性、吞隧、抗原呈递、细胞因子释放。运样的效应细胞是，例如但不限于，T-细胞或NK- 细胞。特别是，所述其他效应子结构域包含形成CD3优选人类CD3的抗原结合位点的至少一 个抗体可变重链结构域和至少一个可变轻链结构域。
[0042] 因此，本发明的EGFRvIII结合蛋白可W是多特异性的。本文所用的术语"多特异性 的"意思是指本发明的结合蛋白对不同的表位具有至少两个抗原结合位点，其中至少一个 用于EGFRvIII。例如，结合蛋白可W是Ξ特异性的，并且对肿瘤细胞上的两个不同的表位 和/或抗原具有结合位点且对效应细胞诸如例如CD3上的表位或抗原具有至少一个结合位 点。结合蛋白对相同抗原的不同表位和/或不同抗原的表位可具有结合位点。运样的多特异 性结合蛋白包括单链双抗体、（scFv)2、串联双抗体pTandAb?；)和弹性抗体（参见Le Gall et al.，1999F邸S Letts 453:164-168和WO 03/025018)。在本发明的具体实施方案中，结 合蛋白是对EGFRv III和CD3双特异性的。
[0043] 本发明的多特异性结合蛋白的CD3结合位点可由如下组成:如表2所示的可变重链 结构域(SEQ ID NO:23)和可变轻链结构域(SEQID NO:24)，或与CDR序列仅两个氨基酸不同 的该序列的密切同源物山1〇36 homolog)，或对CD3(称为CD3)有特异性的任何其他全人的、 人源化的或非人可变抗体结构域，诸如，例如，对CD3，特别是CD3e有特异性的可变抗体结构 域或任何其他全人的、人源化的或非人可变抗体结构域，诸如，例如UCHT1或0KT3的可变抗 体结构域。
[0044] 表2:全人抗-CD3可变重链结构域（VH)和可变轻链结构域（VL)的氨基酸序列 (CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列W粗体显示且加有下划线）
[0045]
[0046] 此外，本发明的EGFRWII结合蛋白可W是多价的。本文所用的术语"多价的"意思 是指，本发明的结合蛋白包含至少两个抗原结合位点。抗原结合位点可具有相同或不同的 特异性。在本发明的实施方案中，结合蛋白W至少两个结合位点即二价方式结合相同表位。 二价的结合蛋白的实例是双抗体，至少四价的结合蛋白的实例是串联双抗体。
[0047] 在本发明进一步的方面中，所述的EGFRWII结合蛋白W及双特异性EGFRWIKP CD3结合位点是人源化的或全人的，即人源的。在本发明进一步的方面中，EGFRvIII结合蛋 白或多特异性EGFRvIII和CD3结合蛋白是二聚体，即包含两个具有EGFRvIII和CD3抗原结合 位点的多肤。
[004引根据本发明，W串联双抗体(TandAb'K)的形式提供二聚双特异性EGFRWII和CD3 结合蛋白。运样的串联双抗体通过连接能够同源二聚的四个抗体可变结合结构域(单基因 构建体中的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)(参见McAleese and Eser ,2012， 化ture化col. 8:687-95))来构建。在运样的串联双抗体中，接头（1 inker)长度是其防止可 变结构域的分子间配对W致分子不能折叠回其本身上来形成单链双抗体，而是被迫与另一 条链的互补结构域(complementary domain)配对。对运些结构域还可W运样排列，即使得 相应的VH和化结构域在二聚期间配对。由单个基因构建表达后，两条同样的多肤链头尾折 叠形成约llOkDa的功能性非共价同源二聚体(McAleese and Eser,2012,Ρ\ι1:ι?Γθ Oncol.8: 687-95)。尽管不存在分子内共价键，同源二聚体一旦形成即是高度稳定的，保持完整并且 不恢复为单体形式。
[0049] 在多特异性串联双抗体的一个实施方案中，提供了人源化的双特异性四价抗体 (TandAb?)，其对CD巧蛇GFRvII I各具有两个结合位点巧GFRvII I/CD3 REC民Urr-TandAb、3 )，W利用T细胞的细胞毒性能力治疗成胶质细胞瘤(GB)、前列腺癌、头颈癌W及其他表皮生 长因子受体突变体VIII阳性化GFRVIII+)癌。
[0050 ] 相对于传统单克隆抗体，串联双抗体具有提供优势的大量性质，还具有较小的多 特异性分子。串联双抗体在不存在糖基化时是全功能性的。串联双抗体可仅含有抗体可变 结构域，并因此可没有可与化部分相关的任何副作用。因为双特异性串联双抗体允许二价 结合至EGFRWII和CD3中的每一个，因此，其亲合力（avidity)与IgG的亲合力相同。串联双 抗体的大小约为ll〇W)a，小于IgG，运可增强肿瘤渗透。然而，与基于抗体-结合结构域或非 抗体支架的较小的双特异性形式相比，该大小远高于首过清除（first-pass clearance)的 肾阔，运提供了药代动力学优势。例如1(19'17日11〇￥5]\1:]\161}1〇(13]\1〇1.81〇1.2009;562:177- 93、Kip;riyanov SM:Methods Mol.Biol.2003;207:323-33或McAleese and Eser,2012, 化化re化col.8:687-95中描述了运样的串联双抗体的产生和制备。
[0051] 串联双抗体在C册细胞中良好表达。可W使有效的上游和下游制造工艺落实到位。
[0052] 将本发明的EGFRWII和CD3双特异性串联双抗体设计为通过募集细胞毒性T细胞 特异性祀向EGFRWir肿瘤细胞。抗体不能直接募集细胞毒性T细胞。相反，通过雇用 (engage)在运些细胞上特异性表达的CD3分子，串联双抗体可使细胞毒性T细胞与EGFRvII I +肿瘤细胞W高度特异性的方式交联，从而显著增加运些分子的细胞毒作用。串联双抗体显 示强的、特异性的和有效的细胞毒性。显著的证据是T细胞能在控制肿瘤生长中起作用。例 如，大肠肿瘤W及来自饥正患者的淋己结中细胞毒性T细胞的存在显示与更好的临床结果相 互关联。此外，对于黑色素瘤疫苗，W及针对CTLA-4即T-细胞活化的负调节剂的抗体，已证 明了经设计诱导T-细胞应答的疗法的潜力。本发明的串联双抗体通过结合表面表达的CD3、 优选CD3e雇用细胞毒性T细胞，CD3e形成T-细胞受体的一部分。该串联双抗体与在特定肿瘤 细胞表面上表达的CD3和EGFRWII的同时结合引起T-细胞活化并调节随后的肿瘤细胞裂 解。
[0053] "二聚体"是指两个多肤的复合体。优选地，所述两个多肤彼此非共价相关，特别是 在两个多肤之间没有共价键的条件下。优选地，双特异性二聚体是同源二聚体，即包含两个 相同多肤。然而，Ξ特异性或其他多特异性二聚体可W是异源二聚体并包含两个不同的多 肤，例如可变轻链结构域的至少一个结合位点位于一个多肤上且可变重链结构域位于其他 结构域上。术语"多肤"是指由酷胺键连接的氨基酸残基的聚合物。优选地，多肤是未分枝的 单链融合蛋白。在该多肤中，可变抗体结构域相继连接。除可变结构域N-端和/或C-端之外， 该多肤还可具有连续的（contiguous)氨基酸残基。例如，运样连续的氨基酸残基可包括可 有益于多肤纯化的化g序列，优选在C-端。
[0054] 双特异性串联双抗体的每个多肤都包含至少四个可变结构域，即CD3结合蛋白的 可变轻链(VL)和可变重链(VH)W及EGFRvin结合蛋白的可变轻链(VL)和可变重链(VH)。四 个结合结构域由肤接头L1、L2和L3连接，并可从N-端至C-端进行如下排列：
[005引（i)VL(CD3)-L1-VH化GFRvIII)-L2-化化GFRvIII)-L3-VH(CD3);或
[0056] (i i)VH(CD3)-L1-VL(EGFRvIII)-L2-VH(EGFRvIII)-L3-VL(CD3);或
[0057] (i i i)VL(EGFRvIII)-LI-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(EGFRvIII);或
[0058] av)VH(EGFRvIII)-Ll-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(EGFRvIII)。
[0059] 在本发明的实施方案中，四个可变结构域按化(CD3)-Ll-VmEGFRWII)-L2-VL 化GFRパII)-L3-VH(CD3)排列。具有结构域顺序VLGD3-VHEGFRv…-化EGFRvΠI-VHCD 3并含有不同 EGFRWII结合序列的串联双抗体，尽管对EGFRvII I具有不同亲和力，所有都显示出对第二 特异性CD3非常相似的结合，如CD3 丫 ε抗原上通过化ISA所示（图5A)。在含有外面位置的 EGFRvIII结合结构域和中部的两个CD3结合位点的其他串联双抗体结构域顺序(VhEwkviiI- VlGdS-VhGdS-VlEgwviii)中，EGFRvin与亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的结合的显著提高 同样是明显的，而串联双抗体中部结构域与CD3的结合稍弱，且在单个串联双抗体之间比第 一结构域顺序变化更多（图5B)。当用不同CD3结构域（SEQ ID N0:23和24)构建含有不同 EGFRvIII-结合结构域的串联双抗体时，进行了相似的观察(图5C)。
[0060] 接头的长度影响抗原-结合串联双抗体的柔初性（flexibility)。例如， Todorovska et al.，2001Journal of Immunological Methods 248:47-66;Perisic et al.，1994Structure 2:11217-1226;Le Gall et al.,2004,Protein Engineering 17: 357-366和W094/13804中描述了接头长度对形成二聚抗原-结合蛋白的影响。
[0061] 根据本发明，优选肤接头L1、L2和L3的长度是可使一个多肤的结构域与另一个多 肤的结构域分子间结合W形成二聚抗原-结合串联双抗体。运样的接头是"短的"，即由〇、1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基组成。因此，所述接头由约12个或更少的氨基酸 残基组成。在0个氨基酸残基的情况中，所述接头是肤键。运样的短接头通过在不同多肤的 抗体可变轻链结构域和抗体可变重链结构域之间结合和形成正确的抗原-结合位点有利于 两个多肤的分子间二聚。约12个或更少氨基酸残基的短接头通常防止同一多肤链的相邻结 构域彼此分子间相互作用。在本发明的一个实施方案中，运些接头由约3个至约10个，例如4 个、5个或6个连续氨基酸残基组成。
[0062] 关于运些接头的氨基酸组成，选择不干扰两个多肤二聚化的肤。例如，包含甘氨酸 和丝氨酸残基的接头通常提供蛋白酶抗性。接头的氨基酸序列，例如，可通过隧菌体展示法 (地age-display method)来优化，W提高抗原结合和抗原-结合多肤二聚体的产率。适于本 发明的串联双抗体的肤接头的实例是GGSGGS(SEQ ID N0:66)、GGSG(SEQ ID N0:67)或 GGSGG(SEQ ID N0:68)。
[0063] 本文所述的EGFRvIII结合蛋白和多特异性串联双抗体可通过表达编码串联双抗 体多肤的多核巧酸产生，所述串联双抗体的多肤与另一个相同多肤结合W形成抗原-结合 串联双抗体。因此，本发明进一步的实施方案是编码本文所述的抗原-结合串联双抗体多肤 的多核巧酸，例如DNA或RNA。
[0064] 多核巧酸可通过本领域技术人员已知的方法构建，例如，通过将编码由编码肤接 头的序列隔开的或由肤键直接连接的至少四个抗体可变结构域的基因组合到单基因构建 体中，并在细菌或其他适当的表达系统诸如例如CK)细胞中表达，所述单基因构建体与合适 的启动子、可选地用于检测和纯化的蛋白标签，W及合适的转录终止子可操作地连接。根据 所使用的载体系统和宿主，可使用任何数量的包括构成和诱导启动子的合适的转录和翻译 元件。选择启动子W使其驱动多核巧酸在各自宿主细胞中的表达。
[0065] 作为本发明进一步的实施方案，可将多核巧酸插入到载体中，优选表达载体中。该 重组载体可根据本领域技术人员已知的方法构建。
[0066] 各种表达载体/宿主系统可用于包含或表达编码本发明多肤的多核巧酸。用于在 大肠杆菌化.coli)中表达的表达载体的实例是pSKK化e Gall et al.，J I讓unol Methods. (2004)285(1) :111-27)或用于在哺乳动物细胞中表达的pcDNA5(Invitrogen(英 杰公司））。
[0067] 因此，本文所述的抗原-结合串联双抗体可通过将编码上文所述多肤的载体引入 到宿主细胞并在所述多肤链表达、可从所述培养基分离W及任选地此后纯化的条件下培养 所述细胞。
[0068] 在进一步的实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其包含EGFRvIII结合蛋白， 抗原-结合串联双抗体，包含编码抗原结合串联双抗体的多肤的多核巧酸的载体或由该载 体转化的宿主细胞，W及至少一种药学上可接受的载体。术语"药学上可接受的载体"的意 思是指包括不干扰成分生物活性的效力并且对所施用的患者没有毒性的任何载体。合适的 药学上的载体实例是本领域已知的，包括生理盐水、憐酸盐缓冲生理盐水、水、乳化液例如 油/水乳化液、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。运样的载体可通过传统方法配制，并W合适 的剂量施用于个体。优选地，该组合物是无菌的。运些组合物也可包含佐剂，例如防腐剂、乳 化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保预防微生物的作用。
[0069] 通过使用本领域已知的成熟技术和标准方法，技术人员会没有过度负担地容易构 建并获得抗原-结合蛋白如本文所述的串联双抗体，参见，例如Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory ManuaK分子克隆实验室手册），Cold Spring 化rbor Laboratoiy (1989)N.Y,;The Protein Protocols 化n化ook(蛋白质实验指南手册），John M.Wa化er编 车茸，Humana Press Inc. (2002);或Antibody engineering:methods and protocols(抗体 工程：方法和方案）/Benny K.C.Lo编辑；Benny K.C. II Se;ries:Methods in molecular biology(分子生物学方法）（Totowa，N.J.)。
【附图说明】
[0070] 图1说明亲和力成熟后衍生的EGFRvIII特异性高亲和力结合结构域中可变序列的 位置。不同于亲代序列的重链和轻链可变区的CDR位置用星号标出，各自的氨基酸用灰色高 亮显示。具有有益突变的位置用深灰色高亮显示。
[0071 ] 图2显示Biacore T200中，多循环动力学测量不同scFv抗体结合至重组EGFRvIII- Fc抗原或野生型EGFR-Fc抗原的结果。Sensogram显示在4个不同scFv抗体浓度水平（86nM， 17.2碰，3.4碰，0.69碰)下随时间测量的表面等离子体共振(5?1〇响应单元(抓)的动力学。 测量结合180秒，此后测量解离。使用1:1结合模型分析数据。
[0072] 图3显示流式细胞仪测量scFv抗体结合至(A)过表达EGFRvin的F98大鼠神经胶质 瘤细胞(F98Ewkviii)、（b)过表达天然EGFR的F98细胞(F98Ewk)、（c)未转染的F98细胞(F98)的 结果，W及相似的scFv抗体结合至(D)过表达EGFRvIII的C册细胞(C册ewkviii)、(e)过表达天 然EGFR的C册细胞(CH〇ewkviii )和(F)未转染的Oro细胞(CH0)的结果。
[0073] 图4说明含有不同EGFRvH I结合结构域的串联双抗体与由SDA-PAGE分离并通过蛋 白质印迹转移至PDVF膜的纯化的EGFRWII-或天然EGFR-Fc融合抗原（非还原蛋白或用DTT 还原的蛋白）的结合。Fc融合蛋白通过二硫键在Fc部分二聚，但用DTT还原后是单体。 EGFRvIII-特异性抗体W还原或非还原的构象结合至EGFRvIII-融合蛋白，但不与天然EGFR 结合。该抗-EGFR抗体西妥昔单抗用作对照，并识别非还原性EGFRvIII-Fc和非还原性EGFR- Fc抗原，但不识别DTT-处理的抗原。
[0074] 图5显示了化ISA中分析的不同EGFRVIII/CD3特异性串联双抗体与EGFRWII-Fc、 EGFR-化和CD3 丫 ε重组抗原的浓度依赖性结合。（A)显示了具有结构域顺序VlGDS-VhEGWvIII- 化ewkviiI-Vh?3的EGFRVIII/CD3特异性串联双抗体的结合信号，（B)显示了具有结构域顺序 VHEGFKvni-VLGD3-VHGD3-VLEGFRvIII的egfRvIII/CDS特异性串联双抗体的结合信号，W及(C)显示 了含有SEQ ID NO: 23、24的CD3结构域并具有结构域顺序化gdS-VhEgfkviiI-VlEgfkviiI-VhGd3的 EGFRWII /CD3特异性串联双抗体的结合信号。含有亲和力成熟的EGFRWII -结合结构域的 串联双抗体与EGFRvIII的结合的提高是明显可检测到的，在所有形式/结构域顺序中作为 各自结合曲线向较低浓度的移位。
[0075] 图6显示Biacore T200中，多循环动力学测量含有结构域顺序为化GDS-VHEGFKvm- 化egfkviiI-Vh?3的不同二价EGFRW II结合结构域的EGFRvII I/CD3特异性串联双抗体结合至 重组EGFRvII I-Fc抗原的结果。Sensogram显示在不同串联双抗体浓度水平下随时间测量的 表面等离子体共振(SPR)响应单元(RU)的动力学。测量结合180秒，此后测量解离。使用1:1 结合模型分析数据。
[0076] 图7显示来自（Α)Ξ个个体头颈化&N)癌患者、（Β)Ξ个个体成胶质细胞瘤患者的组 织切片的免疫组织化学（IHC)染色结果，W及(C)来自前列腺癌、乳腺癌化erfneg)和非小细 胞肺癌(NS化C)的代表性结果。切片用巧巾不同浓度的二价构象的含有EGFRWII -特异性结 合结构域Li3G30的EGFRvIII-特异性双抗体进行染色，所述二价构象类似于EGFRWn祀向 串联双抗体抗体(例如，（Vl?3-)VhEWKvIII-VlEWKvIii(-Vh?3))的排列但缺少CD3结合部分。作为 对照，切片用识别EGFR(存在于健康组织W及癌组织上）W及EGFRvin的EGFR-特异性IgG抗 体西妥昔单抗进行染色。染色的特异性由在不含EGFR-或EGFRvIII-特异性初级抗体的二级 试剂中解育的对照切片证实。
[OOW]图8说明在EGFRWII阳性细胞上，与含有亲和力成熟之前的亲代EGFRWII结合结 构域化i3G30)的EGFRvIII和CD3各自的串联双抗体相比，含有不同亲和力成熟的EGFRvIII- 特异性结合结构域的EGFRVIII/CD3串联双抗体的细胞毒性能力、有效性和祀标依赖性特异 性的提高：（A)含有EGFRvIII/CDS串联双抗体的ABC 470，（B)含有EGFRVIII/CD3串联双抗体 的ABC 471，（C)含有EGFRWII/CD3串联双抗体的ABC 472。在使用表达EGFRWII的C册细胞 (CH〇egfkviii)、表达EGFRvIII阴性EGFR的C册细胞(CH妒GFK)或未转染的C册细胞作为祀细胞并 且使用人类PBMC作为效应细胞，在基于流式细胞术的分析中，测量抗体浓度依赖性细胞毒 性。在各图版（A-C)中，含有单个EGFRvIII结合结构域和CD3结构域v64、顺序为VlEdS- VhEWKvIII-VlEWKvIII-VhED3的串联双抗体示于左侦L含有与不同CD3结构域组合的单个 EGFRvIII结合结构域、顺序为VhEwkviiI-Vl?3-Vh?3-VlEwkviii的串联双抗体示于右侧。
[0078] 图9显示结合EGFRvIII-特异性抗体时，评估EGFRvIII受体从细胞表面内化的结 果。在37°C下用不同浓度的立种不同的具有结构域顺序化wS-VhEWKvIII-VlEWKvIII-Vh?3。)或 VHEGFRvni-VLCD3-VHGD3-VLEGFRvniQv)，和/或含有不同 CD3-结合结构域的 EGFRvIII/CDS 串联双 抗体抗体将表达EGFRvHI的细胞解育24小时。调整之后，用10μg/ml饱和浓度的各自的串联 双抗体抗体染色细胞表面所有剩余的EGFRvII I受体分子。
[0079] 图10显示在EGFRvIII/CD3(或EGFRVIII/CD16A)串联双抗体抗体的存在下，评估人 类PBMC培养物中细胞增殖(Br加 incoporation)的结果。PBMC用作阳性对照，其在CD3结合 抗体0KT3或植物凝集素 (plant lectin phytohemagglutinin) (PHA)的存在下增殖。在不存 在EGFRvIII-阳性祀细胞的情况下，用不同的EGFRWII/CD3串联双抗体解育PBMC不诱导 PBMC的活化和增殖。
[0080] 图11说明EGFRVIII/CD3串联双抗体的CD3-结合亲和性与其细胞毒性能力正相关。 关于CD3+-化rkat细胞上的CD3-结合、CH〇egfkviii细胞上的EGFRvIII-结合W及细胞毒性能 力，对W结构域顺序VlGDS-VhEgfkvIII-VlEgfkvIII-VhGD3与对CD3具有不同亲和力的不同CD3-结合 结构域组合的全部含有相同EGFRWII结合结构域化i3G30)的多于20个的EGFRvIII/CD3串 联双抗体进行分析。CD3-结合Kd值的范围是InM至约500nM。对于每个所分析的串联双抗体 而言，相对于CD3-结合Kd值，对EGFRvIII-结合Kd值和细胞毒性ECso值作图。虽然TandAb显示 EGFRvIII-结合Kd值仅有小的变化，但随着串联双抗体的CD3-结合Kd值升高，细胞毒性ECso 显示几乎线性升高。
[0081 ] 图12显示概念研究（cone邱t study)的体内验证结果。对含有相同EGFRvIII-结合 结构域化i3G30)但不同CD3结合结构域或结构域顺序的两个EGFRvII I/CD3串联双抗体分析 了皮下F98EWKVIII移植瘤生长的剂量依赖性抑制效果，并与W高得多的浓度水平给药的西妥 昔单抗的效果进行比较。（A)由具有结构域顺序VlGDS-VhEgfkvIII-化egfkvIII-VhGD3的egfrvII 1/ CD3VS串联双抗体引起的剂量依赖性肿瘤生长抑制；（B)由含有不同高亲和力CD3-结合结构 域并具有结构域顺序VhEwkviiI-Vl?3-Vh?3-VlEwkviii的EGFRVIII/CD3串联双抗体引起的剂量 依赖性肿瘤生长抑制。
[0082] 通过W下实施例进一步说明本发明，但本发明不限于此。
[0083] 实施例1 :EGi^vIII特异性结合蛋白的发现和亲和力成熟：
[0084] Li3G30 的发现：
[0085] 对基于IgM来源的人scFv序列的隧菌体展示文库进行两至Ξ轮淘选(panning) W 富集对EGF RWII有特异性的结合物(binders)。在每轮淘选前，将所述文库用EGFR-Fc预解 育W耗尽（deplete)野生型形式EGFR的结合物或融合蛋白化部分的结合物。在EGFRvIII包 被的固相上和在溶液中平行进行选择(selection)。两轮和Ξ轮淘选后，挑选出单克隆，诱 导可溶性S cFv表达并筛选与EGFRv III -Fc和EGFR-Fc结合的提取物。
[0086] 根据本发明，描述了与EGFRvIII结合的全人的高特异性可变抗体结构域， 的缺失突变体，其W突变的形式专口在肿瘤中而非在健康组织上表达。本 文描述的全人EGFRvIII特异性结构域最初在使用基于IgM来源的全人scFv文库的隧菌体展 示筛选中发现。令人惊讶的是，尽管对野生型EGFR抗原使用耗尽步骤（depletion procedure)进行了两或Ξ轮淘选，运应富集对EGFRvin有特异性的结合物，但是在化ISA中 大多数所得的scFv对两种蛋白巧GFRvI Π 和野生型EGFR)都结合。鉴定了 一条高EGFRvH I特 异性的序列，命名为Li3G30。除了在VH和化的N末端有很小的差异，重链和轻链的框架区W 及CDR1和CDR2分别与种系编码的序列V册-51和化3-25完全相同。Li3G30从第Ξ轮液相淘选 中鉴定出来。
[0087] 亲和力成熟：
[0088] 抗体框架对V册-51/VL3-25的文库用从Distribute地io订购的算法来设计。鉴定 Li3G30的特异性决定残基并将其包含在文库设计中。该设计包括52个随机化的CDR位点，每 个CDR位点都有单独定义的氨基酸分布。将Ξ种不同的环长度构建到化CDR3中。编码VH和 化的随机化位点的基因片段订购自Geneart/Lifetechnologies，并通过TRIM-技术合成。将 所述片段克隆至隧菌体展示载体祀XHAM(Schwarz et al.2004)中，达到3.7E+8个转化的大 肠杆菌细胞的最终文库大小。将该文库包装到隧菌体颗粒中，并经过淘选和筛选步骤W分 离具有提高的亲和力并保留对EGFRvIII有特异性的变体。用固定在蛋白结合塑料表面上的 EGFRvIII-Fc抗原进行淘选。通过实施W下步骤将淘选步骤设计为有利于具有低解离速率 化OFF)的EGFRvIII结合的scFv:洗涂步骤，包括持续长达30分钟的若干个洗涂缓冲液解育步 骤，W有利于选择缓慢解离的scFv。另一个步骤基于与可溶性EGFRvIII的过夜竞争。为了确 保在亲和力成熟的过程中不会选出EGFR-EGFRvIII交叉反应抗体或结合化的抗体，在第一 个淘选步骤之前，通过对野生型EGFR-Fc的预解育使文库耗尽可能的野生型EGFR结合物。而 且，由于在对固定的EGFRvIII进行淘选步骤的过程中可溶性EGFR的存在，筛选方案不利于 交叉反应结合物。
[0089] 在流式细胞仪中，进一步测试唯一的EGFRvIII特异性scFv对表达EGFRvIII的转染 的CH0和F98细胞的结合。将显示结合表达野生型EGFR的细胞和/或未转染的细胞的ScFv排 除在下一步分析之外。用Biacore X100中的初始Kd排名鉴定与初始克隆Li3G30相比对 egfrwii具有提高的亲和力的scFv。最好的变体在详细的sra测量和基于巧光的稳定性试 验中进行了表征。
[0090] 对于化CDR3,用于亲和力成熟的初始文库包括Ξ种不同的环长度，已知所有长度 与VH5-51/化3-25框架兼容。令人惊讶的是，在选择过程中，中间的环长度明显被偏爱。因 此，与亲代抗EGFRWII抗体相比，所有亲和力成熟的变体的化CDR3都缩短了一个氨基酸 (表1，图1)。将所选择的scFv的序列与输入文库作比较，该分析表明了化CDR3中的3个有益 突变。亲代抗EGFRvIII抗体的重链和轻链的CDR1和CDR2与种系序列V册-51和化3-25各自编 码的序列相同。在75%的位点中，各个种系编码的残基被重构(reconstituted)或者明显被 偏爱。表明了一个有益的突变在VH CDR1中，一个在化CDR1中（图1)。剩余的随机化位点中 的氨基酸分布非常接近于进行选择之前文库中的分布。
[0091] 实施例2:在Biacore中测量scFV对EGFRvII I和野生型EGFR的结合：
[0092] 制备抗hu Fc IgG CM5-忍片：
[0093]根据制造商的说明书，通过使用胺偶联试剂盒(Amine-Coupling-Kit)(GE)进行共 价胺偶联来制备抗hu Fc IgG CM5-忍片。将IgG在提供的固定缓冲液（lOmM乙酸钢，pH 5.0) 中稀释至浓度为25μg/ml。对于偶联步骤，应用Biacore T200控制软件的预定义方法"胺 (Aminer。实现所有4个流通池中5000-10000抓的祀水平。在注入重组蛋白溶液前，用邸C/ NHS活化忍片的表面。用乙醇胺封闭表面上空余的结合位点。选择IX皿S-P+作为整个偶联 步骤的运行缓冲液。
[0094] SPRii量中使用的单链Fv ' S (scFv)的浓度范围：
[0095] 在Sra测量之前，使用化η化op通过A280测定检查ScFv浓度。储备液的浓度(C)根据 W下等式计算：
[0096] C[mg/ml] = (A280)/(2.25[cmVmg] X 1 [cm])
[0097] 用"Expasy Protparam"预测工具（http: //web. expasy. org/protparam/)计算不 同的消光系数。为了计算化s标签的scFv抗体的摩尔浓度，假定分子量为约28kD。通过在IX 皿S-P+缓冲液中进行连续稀释将scFv调整至下面提到的终浓度。制备W下浓度：430nM、 86nM、17.2nM、3.44nM、0.688nM和OnM。
[009引 ScFv的测量条件：
[0099] 将EGFRvIII-Fc和野生型EGFR-Fc融合蛋白在1 X皿S-P+中稀释至浓度为6.25nM。 W ΙΟμΙ/min的流速注入两种抗原，EGFRvII I-Fc: 75秒，野生型EGFR-Fc: 90秒。将EGFRWII- Fc注入流通池2，野生型EGFR-Fc注入流通池4。流通池1和3为空白。
[0100] 将IX皿S-P+用作整个程序的运行缓冲液。将scFv抗体W30化/min的流速注入所 有四个流通池，持续180秒。将在未捕获抗原的流通池1中测量的信号从流通池2中的信号中 减去W校正结合曲线的背景结合。将在未捕获抗原的流通池3中测量的信号从流通池4的信 号中减去W校正结合曲线的背景结合。在540秒的解离时间后，如下所述重新生成忍片。
[0101] 抗hu Fc IgG忍片通过注入高盐缓冲液3.0M MgCl2(30秒，10化/min)重新生成。每 次测量前，在没有scFv的情况下，执行4个"启动（stad-up)循环"。从最低至最高浓度测量 ScFv溶液。包括无运行缓冲液(化Μ)的一个循环。
[0102] 在MCK(Multi切cle Kinetic)测量中测定scFv抗体的动力学。为了估算表观结合 亲和力，用Biacore评估软件中包含的"动力学化inetic)"方法评估结合曲线。通过运个方 法，使用"Langmuir 1:1相互作用模型"用所述软件全部拟合结合曲线。结果示于表3中。
[0103] 所应用的亲和力成熟筛选步骤旨在通过使具有降低的解离速率化OFF)的结合物的 选择更容易来提高EGFRvIII特异性结合结构域的EGFRWII结合亲和力。然而，令人惊讶的 是，所得的亲和力成熟的结合物(表3)展示出大幅增加的结合速率化ON)，而koFF的降低对于 scFv的提高达100倍的结合仅作出较小的贡献，同时一些结合物显示出低于l(K)pM的Kd(表 3)。尤其让人惊讶的是，虽然筛选步骤有利于选择koFF降低的scFv，但是实现Kd的降低主要 是由于koN的提高。运也是令人惊讶的，因为抗体的亲和力成熟通常与koFF的降低有关 (Schier et al.,1996,Pini et al.,1998,Boder et al.,2000)。
[0104] 表3:对scFv结合亲和力的总结（"Vr是scFv的可变重链结构域，"VL"是scFv的可 变轻链结构域）。在Biacore (SPR) 1:1结合模型中测量的scFv形式的不同EGFRvΠI结合结构 域对重组EGFRvIII-Fc抗原的Kd值、结合速率化QN)和解离速率化(W);"提高系数"是指相对 于亲代3。。￥，目化13630(￥!1沈9 10^:25和化沈9 10^:26)的倍数变化。
[0105]
[0106] 11个亲和力成熟的scFv中有8个显示出与亲代scFv相比koN至少5倍的提高；它们中 的Ξ个具有20倍高的koN。与koN的提高相比，亲和力成熟对koFF的影响相当小。只有3个亲和 力成熟的scFv显示出4-5倍提高的koFF。有趣的是，它们中有两个从竞争性选择方法中分离 出来，该方法与延长在洗涂缓冲液中的解育相比可能是选择koF帷低的scFv的更有效的方 法。
[0107] 通过差示扫描巧光测定法(DSF)测定的所选择的亲和力成熟的候选者的解链溫度 的平均值为62.2°C，范围为53°C-67.2°C。 巧…引 在亲和力成熟的过程中维持相对于野生型EGFR的对EGFRvIII的高特异性
[0109] 通常亲和力成熟常常伴有结合表位的小变化，该小变化可影响特异性/交叉反应 性（Barbas et al,1994,Parsons et al.,1996,Winkler et al.,2000)。由于野生型EGFR 胞外结构域(外显子2-7)的269个氨基酸的框内缺失形成了相对于野生型EGFR的EGFRvII I 新表位，并且预测其是相当小的：它由新的氨基酸并列（氨基酸5融合至氨基酸274)和在缺 失位点处的一个新的化Y氨基酸组成。预期在运种情况下即使结合表位的小变化也会快速 破坏对EGFRvII I的异常特异性并可得到也能识别天然EGFR的交叉反应结合物。
[0110] 令人惊讶的是，本文描述的亲和力成熟导致对抗EGFRWII抗体提高达100倍的结 合而不损失对EGFRvIII的专口特异性(表3，图2)。
[0111] 在选择亲和力成熟的结合物期间，在流式细胞仪中检测了唯一的EGFRvin特异性 scFv对表达EGFRv ΠI的C册细胞(C册EWKviii)和F98细胞(F98EWKVIII)的结合W及对表达人野 生型EGFR的C册细胞(C册EWK)和F98细胞(F98EWK)及未转染的C册和F98细胞的结合。
[011引更详细地表征了没有任何可测量的与野生型EGFR阳性细胞(CH0eg?)或未转染的 CHO细胞的背景结合的11个高特异性抗EGFRVIII ScFV。在最好的情况下，测量到了对 EGFRvHI抗原的80pM的亲和力，对应于与亲代scFv相比的100倍的提高系数(表3)。同时，所 检测的抗EGFRvIII scFv都没有显示出与野生型EGFR抗原的任何交叉反应性（图2)。
[0113] 据我们所知，之前从未观察到与对EGFRvin的排他性特异性结合的人抗体结构域 对EGFRvII I的如此高的亲和力，并且没有可测量的与野生型EGFR的交叉反应性。Saf dar i和 同事最近描述了人源化鼠 EGFRvIII结合抗体结构域MRl的结果(Safdari et al. ,2014)，W 其鼠（murine)形式的MRl最先由Lorimer和同事描述化orimer et al.,1996,Beers et al.，2000，Kuan et al. ,2000)。在人源化方法中，他们实现了humMRl的亲和力提高，达到了 于此报导的相似的皮摩尔Kd值，然而，与本发明相反，他们没有完全消除所述抗体结构域与 野生型EGFR的交叉反应性，运可W在他们的出版物(Safdari et al. ,2014)的图4中清楚地 看出。因此，在SDS PAGE和蛋白质印迹后，humMR 1不只对EGFRvIII (145KD)有特异性，也识别 EGFR(170KD)(Safdari et al. ,2014)。在亲和力成熟前后，申请人广泛地检测了本申请 EGFRvIII结合结构域的特异性和交叉反应性，并惊讶地发现在Biacore(图2)，或在SDS PAGE和蛋白质印迹（图4)或在化ISA(图5)的分析中都没有发现与野生型EGFR，或与纯化的 重组野生型EGFR抗原的交叉反应性的信号。本申请的EGFRvin结合结构域同样没有展示出 与转染的CH0细胞(CH〇ew)或F98神经胶质瘤细胞(F98EG?)的细胞表面上过表达的野生型 EGFR的任何交叉反应性(图3)。
[0114] 实施例3:通过流式细胞术评估EGFRvII I特异性scFv抗体对过表达EGFRvII I的F98 大鼠神经胶质瘤细胞(F98EGWVIII)或稳定转染的过表达EGFRvIII的CH0细胞(C册EGWviii)的 高特异性和高亲和力；没有与过表达天然EGFR的F98细胞(F98EWK)或未转染的F98细胞 (F98)的结合，W及没有与过表达天然EGFR的C册细胞(C册EG?)或未转染的C册细胞(C册)的 务主厶 台口口 〇
[0115] 材料(培养基、缓冲液和试剂）：
[0116] 抗His IgG 13/45/31(Dianova)、FCS(Invitrogen)、Ficoll Paque 化US(GE Healthcare)、FITC缀合的山羊抗人IgG(Dianova)、FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG、min X (Dianova)、L谷氨酷胺（Invitrogen)、化化（姑rl Roth)、PBS(Invit;rogen)、青霉素/链霉素 (Invitrogen)、舰化丙晚（Propidium iodide) (Sigma)、RPMI-1640(Invit;rogen)。
[0117] 细胞和细胞系：
[0118] F98大鼠神经胶质瘤细胞、过表达EGFR的F98细胞(F98EGFK) W及过表达EGFRvII I的 F98细胞(F98EgfRviii)购自美国典型培养物收藏中屯、（American type culUire collection (ATCC))并根据所推荐的方案进行培养。
[0119] F98 (ATCC〔化-2397)
[0120] F98EGFR (ATCC C化-2948)
[0121] p98"pEgfRvIii (ATCC C化-2949)
[0122] 稳定转染的表达重组EGFR或EGFRvIII的C册细胞根据W下方案在Affimed生成：
[0123] 编码野生型EGFR或缺失突变体EGFRWII的基因由Life Technologies/GeneAd (雷根斯堡，德国）合成，并亚克隆至哺乳动物表达载体PCDNA5/FRT中。表达重组野生型EGFR 或EGFRWII的稳定的CHO细胞系基于先前适应悬浮生长的宿主细胞系Flp-In CHO化ife Technologies)生成。在转染前一天，将Flp-In C册细胞在补充有心谷氨酷胺、肌补充剂和 青霉素/链霉素的HyClone CDM4C册中进行传代培养(没有博来霉素(Zeocin))。稳定的表达 细胞系通过使用聚乙締亚胺(PEI)转染试剂，用基于PCDNA5/FRT的产物表达和整合质粒和 Flp重组酶表达质粒P0G44化ife Technologies)共转染Flp-In C册细胞系来生成。将2.扣g 总DNA稀释于50化化tiMEMI培养基中并与稀释于50化化tiMEMI培养基中的7.扣g阳I合 并。将混合物解育10分钟，然后加入到悬浮在ImL CHO-S-SFMII培养基的2X106个Flp-In C册细胞中。在转染后一天，将细胞在补充有500yg/mL潮霉素 B的CHO-S-SFMII培养基中稀释 至密度为1 X 1〇5个活细胞/mL，并在T75培养瓶中接种。Flp重组酶通过位点特异性的DNA重 组介导Flp-In表达构建体在整合的FRT位点插入到基因组中。在选择阶段，一周一次或两次 测量活细胞密度，将细胞离屯、并W1X105个活细胞/mL的最大密度重悬于新鲜的选择培养 基中。在使用50化g/mL潮霉素 B选择约2-3周后，回收表达EGFR或EGFRvIII的稳定的细胞，然 后将所述细胞转移至HyClone CDM4CH0悬浮培养基中。将稳定的表达野生型EGFR或 EGFRvIII的细胞冷冻保存于含50%Pro化eeze(Lonza)和7.5%DMS0的培养基中。
[0124] 为了测定稳定转染细胞系上野生型EGFR或EGFRvIII细胞表面抗原的密度，根据制 造商的说明书使用流式细胞间接免疫巧光测定(QIFIKIT，Dako)，并证明了CH妒WK稳定转染 细胞上野生型EGFR的密度与CH〇ewkviii稳定转染细胞上egFRvH I的密度近似相等，而在未转 染C册细胞上没有检测到野生型EGFR或EGFRvIII结合位点。
[0125] 通过流式细胞术测定抗体结合和亲和力：
[0126] 将细胞与所指示的scFv抗体从10化g/mL(约3300nM)开始在FACS缓冲液中的10化L 连续稀释液在冰上解育45min(分钟）。用FACS缓冲液洗涂3次后，将细胞在同一缓冲液中与 0.1 mL lOyg/mL小鼠单克隆抗His抗体克隆13/45/31在冰上解育45min。在第二个洗涂循环 之后，在与前相同的条件下，将细胞与O.lmL 15yg/mL FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG抗体解 育。作为对照，在没有scFv的情况下，将细胞与抗化S IgG 13/45/31解育，然后与FITC缀合 的山羊抗小鼠 IgG抗体解育。然后将细胞再次洗涂并重悬于含化g/mL舰化丙晚的0.2mL FACS缓冲液中W排除死细胞。使用用MXP软件的Beckman-Coulter FC500M化流式细胞仪 (Beckman-Coulter，克雷菲尔德，德国）或用In巧te软件的Mi 11 ipore Guava Easy切te流式 细胞仪(Merck Millipore，施瓦尔己赫，德国）测量1 X ΙΟ4个活细胞的巧光。细胞样品的平 均巧光强度用CXP软件（Beckman-Coulter，克雷费尔德，德国）或Incyte软件（Merck Millipore，施瓦尔己赫，德国）计算。
[0127] 如果用Beckman-Coulter FC500M化流式细胞仪进行分析，使用0.5X106个细胞/ 染色，如果用Millipore Guava化syCyte流式细胞仪，仅使用0.25X 106个细胞/染色。
[0128] 在减去单独用二级和Ξ级试剂染色的细胞的巧光强度值后，采用GraphPad Prism 软件（用于Windows的Gra地Pad Prism 6.00版，Gra地化d Software,加利福尼亚拉荷亚，美 国）的单位点结合的等式(双曲线)计算KD值。
[0 129] 结果示于图3。
[0130] 实施例4:SDS PAGE和蛋白质印迹分析结合EGFRvIII的抗体的结合特异性。
[0131] 为了检测含有不同结合结构域的EGFRvII I/CD3串联双抗体对EGFRWII抗原的结 合特异性W及为了证明不存在与野生型EGFR抗原的结合，实施了十二烷基硫酸钢聚丙締酷 胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析。
[0132] 通过重组DNA技术将编码野生型EGFR或截短型EGFRvIII的胞外结构域的序列融合 至人IgG抗体的化部分。将DNA构建体转染至将作为可溶性蛋白的重组的野生型EGFR-化或 EGFRvIII-化分泌至细胞培养上清液中的C册细胞中，使用蛋白A层析法从所述细胞培养上 清液中纯化所述重组的野生型EGFR-Fc或EGFRW II-Fc。通过化部分中分子内二硫键的形 成，野生型EGFR-Fc(或EGFRWII-Fc)融合抗原形成有两条相同的链的二聚体。由于 EGFRvIII-特异性267个氨基酸缺失，EGFRvIII-Fc比EGFR-化小约25kD，导致二聚体形式的 Fc融合蛋白有约50kD的大小差异。
[0133] 将等量的纯化的野生型EGFR-Fc(和EGFRvIII-Fc)与非还原性2XSDS PAGE样品缓 冲液或含二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂的还原性2 X SDS PAGE样品缓冲液混合。将含DTT的 样品在95°C加热5分钟，然后加载到4-20%标准TGX预制SDS PAGE凝胶(Biorad)上。每个泳 道使用化g的蛋白样品。为了在凝胶中分离蛋白，SDS-PAGE在300V下，在IX化is/甘氨酸/ SDS缓冲液(Biorad)中运行约25min。使用标准无染色分子成像系统(Biorad)使总蛋白在凝 胶中可视化。将化ge Ruler未染色蛋白梯带(Thermo Scientific)用作分子量标记物。然后 用BioRad的半干快速印迹(Semi-化y blotting化S忧lot)系统将凝胶印迹在PVDF膜上。在 室溫下将膜在溶于1XTBS的3%(w/v)脱脂奶粉中封闭30min。将膜切成小块，每一块含有所 印迹的相似的蛋白样品。将不同的串联双抗体在溶于1XTBS的3%(w/v)脱脂奶粉中稀释至 浓度为化g/ml，并在摇动平台上与单独的膜块解育1小时。将10μg/ml浓度的抗EGFR抗体西 妥昔单抗用作对照。将膜用TBST (TBS+0.1 % (v/v)吐溫20)洗涂3次，每次10分钟，用TBS洗涂 一次，然后与在溶于TBS的3%脱脂奶粉中Wl:5000稀释的HRP缀合的二级检测抗体Penta HI S-HRP (QIAGEN)(用于检测串联双抗体)或蛋白kHRP (Thermo Sc ientif iC)(用于检测西 妥昔单抗)在摇动平台上解育1小时。将膜用TBST(TBS+0.1 % (v/v)吐溫20)洗涂3次，每次10 分钟，用TBS洗涂一次。通过加入溶于TBS的0.06%048+0.02%0〇(：12+0.015%出02而启动膜 上HRP介导的显色。通过添加水终止反应。将膜干燥并扫描。
[0134] 结果示于图4。
[0135] 实施例5:通过酶联免疫吸附测定化LISA)分析含有不同EGFRWII结合结构域的 EGFRVIII/CD3串联双抗体对EGFRWII抗原的结合和对CD3的结合，W及在不结合野生型 EGFR抗原情况下它们对EGFRvII I的结合的特异性。
[0136] ELISA 步骤：
[0137] 将96孔E：LISA板（Immuno MaxiSo;rp;Nunc)在4°C下用在lOOmM碳酸盐-碳酸氨盐缓 冲液中的EGFRvIII-Fc、野生型EGFR-化或CD3 丫 ε重组抗原包被过夜。为了获得接近相同的 抗原摩尔包被密度，EGFRvIII斗cW化g/ml的浓度包被，EGFR-Fc W化g/ml的浓度包被，CD3 丫 ε抗原W1.扣g/ml的浓度包被。在使用溶于PBS的3%(w/v)脱脂奶粉(Merck)进行封闭步 骤后，将溶于含0.3 % (w/v)脱脂奶粉(Merck)的PBS中的范围为200ngAil-6.5 X l〇-6ngAil的 不同EGFRVIH/CD3串联双抗体的11个连续稀释液在25°C下在板上解育1.化。解育后，将板用 300μ1/孔的含0.1 % (v/v)吐溫20(Serva)的PBS洗涂3次。加入50ng/ml的蛋白kWP并在25 °〇下在板上解育化。用30化1/孔的含0.1 % (v/v)吐溫20的PBS洗涂3次后，加入四甲基联苯 胺(TMB)底物(Seramun)进行检测。在约2分钟后通过加入10化1/孔的0.5M出S化终止反应。 用多孔板读取器(Victor,F*erkin Elmer)在450nm下测量孔的吸光度。
[0138] 使用Gra曲Pad Prism软件(Gra曲化d Software,加州圣地亚哥，加拿大）将吸光值 在图中绘制成线。
[0139] 结果示于图5中。
[0140] 实施例6:通过Sra测量串联双抗体与EGFRvIII的结合：
[0141] 制备抗hu Fc IgG CM5-忍片
[0142] 如上所述(实施例2)制备抗hu Fc IgG CM5-忍片。
[0143] SPR测量中使用的串联双抗体的浓度范围：
[0144] 在Sra测量之前，使用化ndrop通过A280测定检查串联双抗体浓度。储备液的浓度 (C)根据W下等式计算：
[0145] C[mg/ml ] = (A280)/(2.25[cmVmg] X 1 [cm])
[0146] 用"Expasy Protparam"预测工具（http: //web. expasy. org/protparam/)计算不 同的消光系数。为了计算摩尔浓度，假定所有串联双抗体的分子量为105kD。通过在IX皿S- P+缓冲液中进行连续稀释将串联双抗体调整至下面提到的终浓度。制备W下浓度：150nM、 30nM、6nM、1.化]?、0.24nM、0.048nM和OnM;或90nM、30nM、lOnM、3.3：3nM、1.1 lnM、0.37nM、 0.123nM、0.041nM和OnM，或所指示的浓度。
[0147] 串联双抗体KD测量的结合测定条件
[0148] 将EGFRvII I-Fc融合蛋白在1 X皿S-P+中稀释至浓度为6.25nM。对于EGFRvII I-Fc， W ΙΟμΙ/min的流速注入抗原溶液持续40秒。将抗原注入流通池2。流通池1为参考池。
[0149] 将IX皿S-P+用作整个程序的运行缓冲液。将串联双抗体稀释液W30化/min的流 速注入所有四个流通池持续180秒。将在未捕获抗原的流通池1中测量的信号从流通池2的 信号中减去W校正结合曲线的背景结合。在540秒的解离时间后，如下所述重新生成忍片。
[0150] 抗hu Fc IgG忍片通过注入高盐缓冲液3.0M MgCl2(3X15秒，lOyL/min)重新生 成。每次测量前，在没有串联双抗体的情况下，执行3个"启动循环"。从最低至最高浓度测量 串联双抗体溶液。包括无运行缓冲液(化Μ)的一个循环。
[0151] 在MCK(Multi切cle Kinetic)测量中测定串联双抗体的结合参数。为了估算表观 结合亲和力，用Biacore X100评估软件中包含的"动力学化inetic)"方法评估结合曲线。通 过运个方法，使用"Langmuir 1:1相互作用模型"用所述软件全部或部分地拟合结合曲线。
[0152] 串联双抗体的结合参数
[0153] 为了分析将两个egFRWII结合结构域组合至二价或多价或多特异性分子如 EGFRVIII/CD3串联双抗体中的效果，应用BiacoreXlOO通过Sra测量EGFRVIII/CD3串联双抗 体对EGFRvIII抗原的表观亲和力（图6)。
[0154] 对于所有检测的分子，EGFRvII 1/串联双抗体中EGFRWII特异性结合结构域的表 观亲和力提高，最好的结合串联双抗体实现了 llpM的Kd。相对于对应的含有亲代EGFRWII 结合结构域的串联双抗体，含有亲和力成熟的结构域的串联双抗体的Kd降低高达25倍。相 对于单价结合scFv的测量的Kd，Kd的提高也高达25倍。有趣的是，与通过主要由提高的koN驱 动的亲和力成熟实现的提高相反，在二价串联双抗体形式中结合亲和力的进一步提高很大 程度上通过更慢的knf(师实现(表4)。
[0155] 因此，串联双抗体形式提供了一种在维持抗体结合结构域的特异性的同时进一步 增强结合亲和力的方法。
[0156] 表4:在SPR 1:1结合模型中对含有二价亲代的或亲和力成熟的EGFRvin特异性结
[0157] 合结构域的结构域顺序为化gdS-VhEgfkvIII-VlEgfkviiI-VhGD3的不同EGFRvIII/CD3串联双抗体与 重组EGFRvIII-Fc抗原的结合所测量的Kd、结合速率化QN)和解离速率化(W)的总结。
[015 引
[0159] 实施例7:用抗EGFRWII双特异性双抗体或西妥昔单抗进行实体瘤组织切片的免 疫组化（1肥)染色
[0160] 与在健康组织上广泛表达的野生型EGFR相比，突变受体EGFRvin的表达是高度肿 瘤特异性的。然而，神经胶质瘤细胞中EGFRvin的高频表达与文献中描述的一致，EGFRvII I 的表达广泛度和它在其它肿瘤中表达的同质性仍是有争议的。
[0161] 开始了一项小的免疫组化（IHC)研究，分析了来自各3例患有成胶质细胞瘤(GB)、 头颈化&N)癌、前列腺癌、Her2-阴性乳腺癌W及非小细胞肺癌(NSCLC)的癌症患者的组织切 片与根据本发明的二价双抗体形式的EGFRvin特异性结合结构域的反应性(图7)。
[0162] 实施所述免疫组化研究W评估在不同肿瘤中EGFRWII的表达W及EGFRWII结合 抗体的肿瘤特异性。W含有WVhEwkviiI-VlEwkviii排列的EGFRvin结合结构域Li3G30的二价 双抗体形式，检测了 EGFRvin特异性可变结构域的EGFRWII结合。二级检测通过双抗体蛋 白上的化S标签实施。作为对照，使用了对天然EGFR有特异性的IgG抗体西妥昔单抗(爱必妥 化rbitux))。
[0163] 所有的人组织切片购自Bio化ain Institute,Inc.，并根据供应商的说明书处理 切片。使组织切片适应于室溫并与MK0过氧化物酶阻断剂解育，然后用10%山羊血清封闭。 将EGFRvin特异性双抗体W0.扣g/m巧日0.化g/ml的两个浓度水平解育1小时，然后与抗化S 抗体(Dianova)解育并通过Envi S ion+皿P-DAB系统检测小鼠抗体(DAK0)。根据制造商的说 明书，使用Klear人HRP-聚合物DAB检测系统(GBI Labs)，WlOg/ml的浓度实施用对照项爱 必妥(Merck KGaA)进行的组织切片染色。
[0164] 最终，将切片用苏木精染色并用封固介质（mountant medium)(Shandon Consul Mount?，Thermo Scientific斌片。
[016引结果示于图7。
[0166] Ξ个成胶质细胞瘤样品中有两个显示出与EGFRvIII特异性双抗体的明显且特异 性的反应性。令人惊讶的是，所有Ξ个头颈癌样品都显示出强且明显的EGFRvIII阳性，并且 同样地对于前列腺癌、乳腺癌和NS化C，用本文描述的EGFRvin特异性抗体获得了肿瘤组织 的特异性染色（图7)。
[0167] 基于运些特性，在此描述的EGFRWII结合结构域，诸如，例如，EGFRVIII/CD3双特 异性串联双抗体，极好地适用于开发多特异性的、多价的、免疫效应细胞参与，肿瘤祀向抗 体疗法。
[0168] 实施例8:在基于FACS的细胞毒性测定中评估由EGFRVIII/CD3串联双抗体介导的 细胞毒活性
[0169] 在基于细胞的细胞毒性测定中，分析了 EGFRWII/CD3串联双抗体抗体，其含有与 不同CD3结合结构域结合的亲代的或亲和力成熟的EGFRWII特异性结构域和/或在所述串 联双抗体分子中具有不同的顺序的各个结合结构域(图8)。通过将表达EGFRvΠI的CH0细胞 (CH〇ewkviii )、表达野生型EGFR的C册细胞(CH妒WK)和未转染C册细胞用作祀细胞来分析祀介 导的依赖性、串联双抗体的特异性和T细胞介导的杀伤性。
[0170] 材料(培养基、缓冲液和试剂）：
[0171] DMSO(Sigma)、化375邱?^!'细胞富集试剂盒（Stem Cell Technologies(干细胞技 术公司））、EasySep?人CD4+T细胞富集试剂盒（Stem Cell Technologies)、EasySep?人CD8 巧细胞富集试剂盒（Stem Cell Technologies)、The Big Easy EasySep?磁极（Stem Cell Technologies)、FCS( Invitrogen)、Lymphoprep(Stem Cell)、L-谷氨酉先胺（Invitrogen)、 mlgGl FITC(ADG)、CD16-FITC(MEM-154)(Thermo Fisher Scientific)、mlgGl-FITC/ mlgGl-PE/mlgGl-ECD(Beckman Coulter)、mlgGl-PE(Beckman Coulter)、mIgGl-PC5 (Beckman Coulter)、mIgGl-P口（Beckman Coulter)、CD8-FITC/CD4-PE/CD3-ECD(Beckman Coulter)、CD16-P巧（Beckman Coulter)、CD19-PC7(Beckman Coulter)、CD16-FITC/CD56- PE/CD3-ECD(Beckman Coulter)、CD14-PC7(Beckman Coulter)、CD33-PE(MACS Miltenyi Biotech)、化化（Roth)、PBS( Invitrogen)、青霉素/链霉素（Invitrogen)、PK册7绿色巧光细 胞标记化inke;r)Midi试剂盒（Sigma)、Gammano;rm人IgG(0ctapha;rma)、舰化丙晚（Sigma)、 RPMI-1640(Invitrogen)
[0172] 从血沉栋黄色层(buffy coat)分离PBMC并富集Τ细胞：
[0173] 在抽血当天从Deutsches Rotes Kreuz,DRK-Blutspendedienst Baden- Wudtemberg-化ssen(曼海姆，德国）购买血沉栋黄色层;血沉栋黄色层制备物在室溫下保 存过夜，然后通过密度梯度离屯、分离PBMC。将血沉栋黄色层样品用两到Ξ倍体积的PBS稀 释，在Lymphoprep垫层（cushion)上分层并在室溫w/o制动（brake)下W800Xg离屯、25min。 收集位于界面处的PBMC，并用PBS洗涂3次，然后将它们用于富集T细胞或流式细胞分析。根 据制造商的说明书使用EasySep?人T细胞富集试剂盒（用于免疫磁性分离未接触的人T细 胞）和Big Easy EasySeip?磁铁从PBMC群富集T细胞。
[0174] 通过流式细胞分析表征效应细胞：
[0Π 日]为了评估PBMC亚群的分布和富集的PBMC或T细胞子群（subset)的纯度，实施PBMC 染色。
[0176]对于流式细胞分析，将分离的PBMC或富集的PBMC亚群重悬于补充有2%热灭活的 FCS和0.1 %叠氮化钢(被称为FACS缓冲液)及Img/mL多克隆人IgG的PBS中，至密度为0.5-2 XloVmL。然后根据制造商所推荐的W下方案将0.5ml细胞悬浮液的等份试样在黑暗中与 抗体解育15min。
[01 W] 表5:通过流式细胞术表征PBMC和分级的PBMC的移液方案
[017 引
[0179] 解育后，在MXP采集软件(Beckman-Coulter)中，使用为PBMC和多色染色(門TC PE ECD PC5PC7;FITC 阳 ECD;門TC 阳 PC5PC7)制定的方案在Beckman-Coulter FC500M化流 式细胞仪(Beckman-Coulter，克雷费尔德，德国）上W3、4、5、6、l、2的顺序测量样品。对于分 析和数据绘图，使用了CXP分析软件(Beckman-Coulter)。
[0180] 细胞毒性测定：
[0181] 如前所述，通过流式细胞术表征用作效应细胞的T细胞。细胞毒性测定中使用的祀 细胞是稳定转染W过表达EGFRvIII的C册细胞(CH〇eg?viii)，稳定转染W表达野生型EGFR的 C册细胞(C册EWK)或未转染的C册细胞(C册）。如先前所述生成细胞系，并如前所述在标准条 件下培养。对于细胞毒性测定，将祀细胞收集起来，用不含FCS的RPMI 1640培养基洗涂两次 并重悬于PKH67绿色巧光细胞标记Midi试剂盒所提供的稀释液C中至密度为2 X lOVmL。然 后根据制造商的说明书，将细胞悬液与等体积的双倍浓缩的PKH67-标记溶液（例如，1化 PKH在25化L稀释液C中）混合，并在室溫解育2-5min，并定期混合。染色反应通过加入等体积 的FCS并解育Imin来终止。用完全RPMI培养基洗涂标记的祀细胞后，进行细胞计数并将细胞 在完全RPMI培养基中重悬至密度为2Xl05/mL。
[018引然后将2X 104个祀细胞与T细胞W5:1的E:T比例和所指示的抗体一起接种在圆底 96孔微板的各孔中，总体积为20化L/孔。通常检测9个从3化g/mL开始的连续1:5稀释液。在 每个平板上至少一式Ξ份测定没有抗体的情况下自然的细胞死亡和效应子(effectors)引 起的祀杀伤。串联双抗体介导的杀伤通常一式两份地测定。
[0183] 在室溫下W200g离屯、2min后，将测定板在37°C，含5%C02的加湿空气中，解育40h- 4她。解育后，将培养物用FACS缓冲液洗涂一次，然后重悬于补充有化g/mL PI的15化L FACS 缓冲液中。特征为阳性绿色PKH67染色但PI染色为阴性的活的祀细胞的绝对数量用 Millipore Guava liasyCyte流式细胞仪(Merck Millipore)来测量。
[0184] 基于所测量的剩余的活的祀细胞，根据W下公式计算特异性细胞裂解的百分比： [1-(活的祀细胞数目(協。η))/(活的祀细胞数目（齡柳）]X 100%。使用GraphPad Prism软件 (用于Windows的Gra地Pad Prism 6.00版，GraphF*ad Software,加利福尼亚拉荷亚，美国） 通过非线性回归/4参数逻辑拟合来计算Sigmoidal剂量响应曲线和EC50值。
[018 引数据分析：
[0186] 对于给定的抗体浓度所获得的裂解值一式两份地测定，使用Prism软件（用于 Windows的Gra地Pad Prism 6.00版，Graph化d Software,加利福尼亚拉荷亚，美国）通过 Sigmoidal剂量响应/4参数逻辑拟合分析来进行分析，并用于计算EC50平均值和裂解百分 比的重复的SD。
[0187] 结果示于图8和表6。
[0188] 所有检测的串联双抗体均显示出对表达EGFRvH I的细胞的浓度依赖性、高度的特 异性、细胞毒性和高效能，而EGFRvIII阴性细胞的存活并不受损害。在用表达EGFRwt-的细 胞或未转染的细胞检测的任何串联双抗体的全部浓度范围内，没有观察到可检测的细胞毒 性。因此，EGFRvII I/CD3串联双抗体介导的细胞毒性是严格地祀向依赖性的。在细胞毒性测 定中，含有亲和力成熟之前的亲代EGFRvIII结合结构域且结构域顺序为Vl?3-VhEwkviiI- VlEwkviiI-Vh?3的串联双抗体的ECso为25pM(图8)。对应的串联双抗体W相同的结构域顺序 (化?3-VhEwk"iI-VlE胃iiI-Vh?3 )含有亲和力提高的EGFRvII I结合结构域，同样表现出增强的 细胞毒性效力，在最好的情况下，达到1.5pM的EC50(表6)。细胞毒活性的相对提高在具有位 于外部位置中的EGFRvIII特异性结构域的串联双抗体(结构域顺序VhEwkviiI-Vl?3-VhEd 3- 化EWKviii)中更加明显(表6)。在运些串联双抗体中，高达70倍提高的细胞毒性效力可通过在 运些串联双抗体中用亲和力提高的结构域替换低亲和力EGFRWII结合结构域Li3G30来实 现（图8,表6)。
[0189] 表6:对细胞毒性测定中用不同的EGFRVIII/CD3串联双抗体测量的EC50值的总结， 所述不同的EGFRWII/CD3串联双抗体W两种不同的结构域顺序含有亲和力成熟的 EGFRvH I特异性结合结构域。示出了相对于对应的含有亲代EGFRvH I结合结构域的串联双 抗体的提高系数。
[0190]
[0191] Ch〇ietal.(Proc^tlAcadSciUSA.2013^n2;110(l):270-5;W02013/ 7185010)描述了t EGFRWII/CD3的comparator,即EGFRvIII/CD3双特异性Τ-细胞衔接器 (bispecific T-cell engager) (BiTE)，其具有一个EGFRvin结合位点（基于鼠 MRl结构域） 和一个CD3结合位点（基于抗CD3的抗体0KT3)。在基于细胞的细胞毒性测定中，该抗体在约 l(T2μg/ml的浓度下实现了50%的最大地获得的特异性裂解，其对应于52kD BiTE的约20化1 的摩尔EC50浓度(化oi et al.，2013的图4C)。比较显示本文描述的含有亲代的而非亲和力 成熟的EGFRWII结合结构域的串联双抗体的细胞毒性甚至比EGFRWII/CD3BiTE的高约10 倍。而且本发明的含有亲和力成熟的EGFRvIII结合结构域的串联双抗体甚至展示出相对于 EGFRvIII/CD3BiTE的高100倍的细胞毒性。
[0192] 实施例9:在表达重组EGFRWII的C册细胞(CH妒GFKviii)或表达重组EGFRvII I的F98 细胞(F98EGFKVIII)上由EGFRv III /CD3串联双抗体引起的EGFRv III受体内化
[0193] 为了评估由EGFRvII I/CD3串联双抗体引起的EGFRvII I调控，将表达重组EGFRvII I 的C册细胞(CH妒GFKviii)或表达重组EGFRvIII的F98细胞(F98Egfkviii)W2.5X1〇5个细胞的等 份试样在圆底96孔微板各单孔中，在补充有10%FCS、2mM k谷氨酷胺、lOOIU/mL青霉素 G钢 盐、lOOyg/mL硫酸链霉素、lOOyg/mL丙酬酸钢(本文中称为完全RPMI培养基;所有组分购自 英杰公司）的RPMI 1640培养基中与浓度渐增的EGFRWII/CD3串联双抗体在37°C，5%C02 下，在加湿解育器中解育24小时。在没有抗体的情况下培养若干等份的细胞，用作检测最高 EGFRvIII细胞表面水平的对照样品和单独用二级试剂用作进行的染色的阴性对照。
[0194] 解育后，将细胞用冰冷的补充有2 %热灭活的FCS( Invi化ogen)和0.1 %叠氮化钢 (尺〇1:11，卡尔斯鲁厄，德国）的憐酸盐缓冲盐水。135，1]1￥；[1：1'0旨6]1)(在本文中称为。4〔5缓冲 液)洗涂2次，然后用饱和浓度(1化g/mL)的抗体(该抗体和在调整培养期间与细胞解育的抗 体是相同的）染色W评估对应于细胞表面上剩余EGFRWII抗原的最大的抗体结合。将在没 有抗体的情况下培养的细胞的等份试样用饱和浓度的同一抗体染色，W测定对应于细胞表 面上的最大可测量的EGFRvin水平的最大抗体结合能力。用FACS缓冲液洗涂3次后，用串联 双抗体处理细胞并用lOyg/mL抗His mAb(Dia910，Dianova)染色，然后用15yg/mL FITC缀合 的山羊抗小鼠 IgG(Dianova)染色。用FACS缓冲液反复洗涂后，将细胞重悬于含化g/mL舰化 丙晚（Sigma)的FACS缓冲液中W排除死细胞。使用MXP软件和FC500M化流式细胞仪 (Beckman-Coul ter，克雷费尔德，德国）分析来自每个样品的约5 X 103个舰化丙晚阴性细 胞，用CXP软件（Beckman-Coulter)测定所测量的样品的平均巧光强度（MFI)或者使用 In巧te软件(Merck Millipore，施瓦尔己赫，德国）用Millipore Guava E；asy切te流式细胞 仪分析细胞。
[019引在减去获自单独用二级试剂进行的细胞染色的信号之后，使用GraphPad Prism软 件(Gra地化d Software,加州圣地亚哥，加拿大)将所测量样品的平均巧光强度在图中绘制 成线，并使用通过在没有EGFRVIII/CD3串联双抗体的情况下在37°C下对未处理的细胞样品 进行染色而获得的巧光信号(其被设置为代表100%的细胞表面EGFRvIII)来计算细胞表面 上剩余EGFRvII I的相对量。
[0196] 结果示于图9。
[0197] 若干文献报告描述了与天然EGFR相比缺失突变体EGFRvIII显示出受损的内化 (F'enstermaker et al.2000,化η et al.2006,Grandal et al.2007,Gan et al.2009)。尽 管如此，关于EGFRvII I特异性抗体或针对也结合EGFRvH I的野生型EGFR的抗体(例如西妥 昔单抗）的若干公开的报告，描述了在结合各自的抗体之后表达EGFRvIII的细胞中 EGFRvIII 的快速内化和降解(Reist et al. 1995，Foulon et al. 2000，Kuan et al. 2000， Patel et al.2007,Jutten et al.2009,Dreier et al.2012)〇
[019引对于内化测定，使用过表达EGFRWII的转染CH妒GFKviii细胞。将运些表达EGFRvII I 的细胞与不同浓度的EGFRvIII/CD3串联双抗体在37°C下解育24小时，描述了其它EGFRvIII 结合抗体的上下文中的条件W诱导强的内化。在本调整(期间抗体-受体复合体可W内化或 不内化)之后，用各抗体W l0μg/ml的饱和浓度给细胞表面上所有剩余的EGFRvII I受体分子 染色（图9)。图9呈现的结果表明，在将细胞暴露于EGFRWII-结合串联双抗体之后，在所有 检测条件下未处理细胞上存在的多于80%且高达140%的EGFRWII受体分子仍是可用的 (140%或更多的>100%的一般值是指与细胞表面上受体的数目减少(细胞内化)相反，用串 联双抗体处理的细胞显示出细胞表面上受体的增加。内化至100%来自与未处理的细胞的 对比）。运些结果表明，本发明的EGFRvIII/CD3串联双抗体令人惊讶地没有显示出任何内化 趋势（图9)。本发明的EGFRvIII特异性结构域的结合，没有诱导内化，而是甚至可能抑制内 化并导致细胞表面上EGFRWII受体水平增加。图9呈现的结果表明，相对于未处理的细胞， 在所有检测条件下，在将细胞暴露于EGFRvIII-结合抗体之后，至少多于80%仍保留在细胞 表面上。运些结果表明，本发明的EGFRvIII/CD3抗体，尤其是EGFRvIII/CD3串联双抗体，令 人惊讶地没有显示出任何内化趋势（图9)。本发明的EGFRvIII特异性结构域的结合，没有诱 导内化，而是可能抑制内化或促进EGFRvII I表达增加，导致其细胞表面密度增加。
[0199] 实施例10:评估在EGFRvIII/CD3(或EGFRVIII/CD16A)串联双抗体的存在下PBMC培 养物中的细胞增殖
[0200] 为了评估在不存在EGFRvIir祀细胞的情况下EGFRvIII/CD3(或EGFRVIII/CD16A) 串联双抗体是否诱导T细胞的激活和后续的增殖，在浓度渐增的EGFRVIII/CD3串联双抗体 的存在下培养人PBMC。解育5天后，在漠脱氧尿巧渗入试验(Br加 inccxrporation assay)中 评估增殖。
[0201] 材料(培养基、缓冲液和试剂）
[0202] FCSdnvihogen)、人血清（Sigma)、Lymphoprep(Stemcell Technologies)、心谷 氨酷胺（Invitrogen)、0KT3(Biolegend)、PBS(Invit;rogen)、β-琉基乙醇（Invitrogen)、青 霉素/链霉素（11^1付〇旨日11)、1^〇-1640(1醇1付〇旨日11)、丙酬酸钢（11^1化〇旨日11)、化加细胞增 殖化 ISA(Roche)。
[0203] 细胞；
[0204]在抽血当天从Deutsches Rotes Kreuz,DRK-Blutspendedienst Baden- Wudtemberg-化ssen(曼海姆，德国）购买血沉栋黄色层;在分离PBMC之前，将血沉栋黄色层 制备物在室溫下保存过夜。
[020引从血沉栋黄色层分离PBMC并富集T细胞：
[0206] 通过密度梯度离屯、从血沉栋黄色层分离PBMC。将血沉栋黄色层样品用两到Ξ倍体 积的PBS稀释，在Lymphopr巧垫层上分层并在室溫w/o制动下WSOOXg离屯、25min。收集位于 界面处的PBMC，并用PBS洗涂3次，然后将它们用于增殖试验。
[0207] 增殖试验
[0208] 将所有测定板在室溫下用补充有10%热灭活的人血清、4mM k谷氨酷胺、lOOU/mL 青霉素 G钢盐、lOOyg/mL硫酸链霉素、ImM丙酬酸钢、0.05mMf3-琉基乙醇的RPMI1640培养基 (本文中称为完全RPMI培养基)封闭2小时W防止抗体与塑料表面的非特异性结合。在除去 封闭培养基后，将4 X 105个PBMC与所指示浓度的检测项和对照项一起接种在平底96孔微板 的每个孔中的完全RPMI培养基中，总体积为20化L/孔，每个样品测定Ξ次。将IgG抗CD3的克 隆0KT3用作阳性对照。为了评估自发增殖，在6个重复中，在没有抗体的情况下培养细胞。然 后将板在37°C和5%C02下，在加湿的空气中解育4天。在解育终止前18小时，将细胞培养物 用1(Κ)μΜ化加脉冲处理(pulsed)。根据制造商的说明书，用化加增殖ELISA试剂盒对渗入的 化加定量。通过加入lOOmM此5化终止显色后，用多标签酶标仪(plate reader) (Victor 3, Perkin Elmer)在450nm下测量吸光值。分析吸光度值并使用GraphPad Prism软件（用于 Windows的Gra地Pad Prism 6.00版，Gra地化d Software,加利福尼亚拉荷亚，美国）将平均 值和SD绘制成线。
[0209] 结果示于图10。
[0210]实施例11:EGFRvIII/CD3的串联双抗体CD3结合亲和力与细胞毒性效力的相关性 [0211]构建并表达了含有相同EGFRWII结合结构域化i3G30)和不同CD3结合结构域(其 对CD3T细胞抗原具有一些亲和力）的EGFRVIII/CD3串联双抗体并测定了与CD3^urkat细胞 和EGFRvII rCH〇EWKviii细胞的结合;此外，实施了将ch〇ewkviii细胞用作祀细胞和将PBMC细胞 用作效应细胞的细胞毒性测定。在本实施例中检测的所有检测的串联双抗体的各VH和化 (重链和轻链)结构域的顺序都相同:Vl?3-VhE胃iiI-VlE胃iiI-Vh?3。
[0引引如先前实施例中所述，对结合EGFRvII rCH0EGFKviii细胞的抗体和由EGFRvIII/CDS 串联双抗体介导的细胞毒活性进行流式细胞术评估。
[021引用渐增浓度的串联双抗体对CD3 +化rkat细胞染色后，通过流式细胞仪测定 EGFRVIII/CD3串联双抗体对CD3+细胞的表观亲和力。使用通过流式细胞术测定的各串联双 抗体浓度的平均巧光值，通过非线性回归/双曲线计算KD值。
[0214] 材料(培养基、缓冲液和试剂）：
[0215] 抗His IgG 13/45/31(Dianova)、FCS(Invi化ogen)、FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG min X(Dianova)、心谷氨酷胺（Invitrogen)、Na化（Carl Roth)、PBS(Invit;rogen)、青霉素/ 链霉素（Invitrogen)、舰化丙晚（Sigma)、RPMI-1640(Invit;rogen)
[0216] 细胞；
[0217] 将化rkat细胞（由G. Mo 1 denhauer博± (DKFZ，海德尔堡，德国）惠赠)培养在补充有 2mM k谷氨酷胺和lOOIU/mL青霉素 G钢盐和10化g/mL硫酸链霉素的RPMI 1640培养基中（所 有组分均来自Invitrogen，本文中称为完全RPMI 1640培养基）。
[0218] 通过流式细胞术测定对CD3+细胞的抗体亲和力：
[0219] 将细胞与所指示的抗体在补充有2%热灭活的FCS和0.1 %叠氮化钢的冰冷PBS(称 为FACS缓冲液）中从lOOyg/mL(约lOOOnM)开始的100化连续稀释液在冰上解育45min。用 FACS缓冲液洗涂3次后，将细胞在同一缓冲液中与0.1 mL lOyg/mL小鼠单克隆抗化S抗体克 隆13/45/31在冰上一起解育45min。在第二个洗涂循环之后，在与前相同的条件下，将细胞 与0.1 mL 15yg/mL FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG抗体一起解育。作为对照，在没有一抗的情况 下，将细胞与抗His IgG 13/45/31解育，然后与FITC缀合的山羊抗小鼠 IgG抗体解育。然后 将细胞再次洗涂，并重悬于含化g/mL舰化丙晚的0.2mL FACS缓冲液中W排除死细胞。使用 用MXP软件的Beckman-Coulter FC500M化流式细胞仪（Beckman-Coulter,克雷菲尔德，德 国）或用Inc^yte软件的Millipore Guava Easy切te流式细胞仪(Merck Millipore，施瓦尔 己赫，德国）测量lXl04个活细胞的巧光。细胞样品的平均巧光强度用CXP软件(Beckman- Coulter，克雷费尔德，德国）或Inc^yte软件(Merck Millipore，施瓦尔己赫，德国）计算。如 果用Beckman-Coulter F巧OOMI^L流式细胞仪进行分析，使用0.5 X 106个细胞/染色，如果用 Millipore Guava E：asyCyte流式细胞仪，仅使用0.25X 106个细胞/染色。
[0220] 在减去单独用二级和Ξ级试剂染色的细胞的巧光强度值后，将巧光强度值和 Gra曲化d Prism软件（用于Windows的Gra曲Pad PrismG.00版，Gra地化d Software,加利福 尼亚拉荷亚，美国）的单位点结合的等式(双曲线）用于计算KD值。
[0221] 对于每个分析的串联双抗体，将结合EGFRvH I的KD值和细胞毒性的EC50绘制成结 合CD3的KD值的函数。当串联双抗体的结合EGFRvII I的KD值仅显示出很小的可变性时，E巧0 细胞毒性值显示出了伴随着串联双抗体渐增的CD3结合值几乎成线性增加(图11)。
[022引实施例12:由EGFRVIII/CD3引起的F98EWKVIII异种移植瘤抑审ij(体内概念验证） [022引在第0天(dO)，通过皮下（S.C.)注射与来自健康供体的1X107个纯化的人PBMC混 合的4X106个F9SnpEG?viii细胞的悬浮液，对9个实验组的免疫缺陷NOD/scid小鼠（NOD/ MrkBomTac-Prkdcscid，Taconic Denmark)进行异种移植。为了解释PBMC可能的供体可变 性，将每个实验组再分成两队（cohorts )，每队仅接受一个个体供体的PBMC。在肿瘤细胞接 种后化，随后是2地、4她、7化和96h，将l(K)yg、10yg或化g的各串联双抗体测试项通过尾静脉 (i.v.)对动物进行给药。对照组仅接受载体。从do开始，一周两次用Img西妥昔单抗（爱必 妥)对另一对照进行给药（i.P.)。表6总结了剂量组和供体分配。从第3天至第52天一周3次 通过用卡尺测量肿瘤的大直径和小直径来监控肿瘤体积。根据W下公式用直径计算肿瘤体 积:体积=(小直径)2 X大直径X 0.5。
[0224] 表7:动物的剂量组
[0225]
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【主权项】
1. 一种具有至少一个EGFRvIII结合位点的EGFRvIII结合蛋白，其包含抗体可变重链结 构域和/或抗体可变轻链结构域，所述抗体可变重链结构域包含选自SEQ ID NO: 27、33、42、 46、49、53的CDR1，选自 SEQ ID N0:28、38、43、50、54、61、63的CDR2和SEQIDN0:29的CDR3， 所述抗体可变轻链结构域包含选自SEQ ID NO: 30、34、36、39、44、47、51、56、59、64的CDR1， 选自 SEQ ID N0:31、40、57的CDR2和选自 SEQ ID N0:32、35、37、41、45、48、52、55、58、60、62 和65的CDR3。2. 根据权利要求1所述的具有至少一个EGFRvIII结合位点的EGFRvIII结合蛋白，其包 含选自SEQ ID如：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和25的抗体可变重链结构域和/或选自 SEQ ID 从)：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和26的抗体可变轻链结构域。3. 根据权利要求1或2所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述可变重链结构结构域和可 变轻链结构域的EGFRvIII结合位点选自下组： (i) SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2， (ii) SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4， (iii) SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6， (iv) SEQIDN0:7和SEQIDN0:8， (v) SEQ ID N0:9和SEQ ID N0:10， (vi) SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12， (vii) SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14， (viii) SEQIDN0:15和SEQIDN0:16， (ix) SEQIDN0:17和SEQIDN0:18， (x) SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20， (xi) SEQ ID NO:21 和SEQ ID NO:22,以及 (xii) SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的EGFRvII I结合蛋白，其中，细胞在37°C、所述 EGFRvIII结合蛋白的饱和状态下暴露于所述结合蛋白24小时之后，至少80%的存在于未处 理细胞上的EGFRvII I受体分子仍是可用的。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述蛋白包括至少一个 其他功能结构域。6. 根据权利要求5所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述至少一个其他功能结构域是效 应子结构域。7. 根据权利要求6所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述其他效应子结构域是包含形成 CD3抗原结合位点的至少一个抗体可变重链结构域和至少一个可变轻链结构域的CD3结合 位点。8. 根据权利要求7所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述⑶3结合位点包含具有SEQ ID NO: 23氨基酸序列的可变重链结构域和具有SEQ ID NO: 24氨基酸序列的可变轻链结构域。9. 根据权利要求1-8中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是人源化 的或全人的。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是弹性 抗体。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是二聚 蛋白。12. 根据权利要求1-11中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是双特 异性的。13. 根据权利要求11或12所述的二聚EGFRvIII结合蛋白，其中，所述结合蛋白是串联双 抗体，其中在每个多肽中，四个可变链结构域按以下顺序通过肽接头LI、L2和L3彼此融合： (i)VL(CD3)-L1-VH(EGFRvIII)-L2-VL(EGFRvIII)-L3-VH(CD3);或 (i i)VH(CD3)-L1-VL(EGFRvIII)-L2-VH(EGFRvIII)-L3-VL(CD3);或 (i i i)VL(EGFRvIII)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(EGFRvIII);或 (i v)VH(EGFRvIII)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(EGFRvIII)。14. 根据权利要求13所述的串联双抗体，其中，所述接头LI、L2和L3由约12个或更少的 氨基酸残基组成。15. 根据权利要求14所述的串联双抗体，其中，所述接头是GGSGGS。16. -种编码权利要求1-11中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白或权利要求12-15中任 一项所述的双特异性串联双抗体的多核苷酸。17. -种包含权利要求16所述的多核苷酸的载体。18. -种用权利要求17所述的载体转化或转染的宿主细胞。19. 一种药物组合物，其包含：（i)权利要求1-12中任一项所述的EGFRvIII结合蛋白，权 利要求14-15中任一项所述的双特异性串联双抗体，权利要求17所述的载体或权利要求18 所述的宿主细胞；以及（ii)药学上可接受的载体。
【专利摘要】本申请描述了特异性结合EGFRvIII的结合蛋白和特异性结合EGFRvIII和CD3的多特异性结合蛋白。进一步描述了结合EGFRvIII和CD3的多特异性串联双抗体。进一步描述了用于募集T细胞以专门有效地杀死几种类型实体瘤癌症的高细胞毒性EGFRvIII/CD3双特异性串联双抗体。
【IPC分类】C07K16/30, A61P35/00, A61K39/395, C07K16/46, C07K16/28
【公开号】CN105555804
【申请号】CN201480045405
【发明人】克里斯蒂娜·埃尔旺格, 乌维·罗伊施, 伊维卡·法斯克, 斯特凡·奈克马斯, 薇拉·莫尔肯斯恩, 梅尔文·利特尔, 尤金·朱可夫斯基
【申请人】阿菲姆德股份有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2014年8月7日
【公告号】CA2920173A1, EP3030581A1, US20160152728, WO2015018527A1
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