甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用
甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤源于正常细胞中基因和表观遗传学的积累变化，这种改变驱使正常细胞转变 为恶性肿瘤。这个复杂病理变化过程决定了不同肿瘤在发生、维持以及转移中机制的多样 性。目前，手术切除、化疗和放疗是临床治疗肿瘤常用的方法，然而手术切除肿瘤易复发， 放、化疗毒副作用大。
[0003] 15~20 %人类的癌症与病毒感染有关，如乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)与肝癌、人乳头瘤病毒（HPV)与宫颈癌等。
[0004] 甲病毒属病毒属于披膜病毒科，是一类有包膜结构的单正链RNA病毒，主要通过 节肢动物作为传播媒介。29种甲病毒中有13种可引起人、畜疾病（David M.Knipe，Peter M. Howley, Chapter23, Alphaviruses, Fields Virology6th edition :651-685,2013)〇
[0005] 甲病毒委内瑞拉马脑炎病毒可作为载体转导树突细胞治疗肿瘤（Moran TPj Burgents JEj Long Bj et al:Alphaviral vector-transduced dendritic cells are successful therapeutic vaccines against neu-〇verexpressing tumors in wild-type mice. Vaccine25:6604-6612, 2007)。然而，这种病毒曾引起人类发热、抽搐、流产甚至死亡， 因此选择性与安全性问题严重影响病毒在抗肿瘤治疗中的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种安全有效的病毒抗肿瘤药物。
[0007] 本发明的进一步目的在于提供一种针对特定肿瘤类型的安全有效的病毒抗肿瘤 药物。
[0008] 本发明的进一步目的在于针对特定的个体/肿瘤提供一种安全有效的病毒抗肿 瘤药物。
[0009] 本发明的进一步目的在于提供一种有效的抗肿瘤用药系统及用药方法。
[0010] 本发明的进一步目的在于提供一种更为有效的抗肿瘤药物和肿瘤治疗方法。
[0011] 发明通过以下技术方案实现上述目的。
[0012] 发明提供了甲病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的甲病毒为Ml病毒或盖塔 病毒。
[0013] Ml病毒（Alphavirus Ml)属于甲病毒属（Alphavirus)，于1964年从中国海南岛库 蚊属（Culex)蚊虫中分离得到（Li XD, et al: Isolation of Getah virus from mosquitos collected on Hainan Island，China，and results of a serosurvey. Southeast Asian J Trop Med Public Health23:730-734, 1992.)。2008年Ml病毒的全基因组序列被测定（Zhai YGj et al:Complete sequence characterization of isolates of Getah virus(genus Alphavirus，family Togaviridae) from China. J Gen Virol89:1446-1456, 2008·)。其获取 方式可选但不限于通过上述文献方法获得，或者通过以下保藏信息获得（保藏编号：CCTCC V201423 ;保藏时间：2014年7月17日；分类命名：Alphavirus Ml ;保藏单位：中国典型培 养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学）。
[0014] 本发明研究者此前对Ml病毒的研究结果表明，其对一些肿瘤细胞具有杀伤作用， 例如对大鼠恶性胶质瘤细胞C6,人恶性胶质瘤细胞U251和U-87 ;然而，对另外一些肿瘤细 胞则不具备杀伤作用，例如对人恶性胶质瘤细胞T98G。这些研究并不能确定Ml病毒具备有 效抗肿瘤效应。
[0015] 本发明进一步提供了该病毒所适用的肿瘤类型，以提高Ml病毒作为抗肿瘤药物 时的治疗有效性。
[0016] 进一步优选地，本发明以Ml病毒作为抗肿瘤药物所适用的肿瘤类型包括肝癌、结 直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌 中的一种或多种。
[0017] 发明人发现，Ml病毒对各种肿瘤细胞引起不同程度的细胞死亡。Ml病毒（Μ0Ι = 10)处理肿瘤细胞48小时，胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤细胞死亡率超过50% ;结 直肠癌（L〇V〇、HCT-8、SW620和SW480)、肝癌〇fep3B、Huh-7和Huh-6)、膀胱癌和乳腺癌细胞 死亡率超过40% ;胶质瘤、宫颈癌、肺癌细胞死亡率超过30% ;胃癌细胞死亡率超过20%。 上述结果提示Ml病毒作为抗肿瘤药物效果最显著的针对以下癌症类型：胰腺癌、鼻咽癌、 前列腺癌和黑色素瘤；其次为：结直肠癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌；再其次为：胶质瘤、宫颈 癌、肺癌；而最不显著的为胃癌。
[0018] 鉴于Ml病毒属于盖塔相似病毒，其与盖塔病毒同源性高达97. 8%，本领域技术人 员有理由认可，基于Ml病毒的抗肿瘤效果，盖塔病毒也可类似地与Ml病毒起到相似的作用 和效果。
[0019] 进一步地，本发明提供了一种可以针对特定个体/肿瘤更为准确有效地给予治疗 方案和治疗药物的方法，以及针对特定个体/肿瘤相关的药物。
[0020] 发明人首次发现，所述的病毒适合用于治疗ZAP低表达肿瘤或ZAP阴性肿瘤，优选 用于治疗ZAP低表达的实体瘤或ZAP阴性的实体瘤。
[0021] Ml病毒治疗肿瘤的有效性，与肿瘤ZAP表达调控密切相关。Ml病毒的复制受到 ZAP的抑制，并且ZAP在多种肿瘤中低表达或阴性，Ml病毒可选择性地治疗ZAP低表达或 ZAP阴性的肿瘤/个体。
[0022] ZAP是锌指CCCH型抗病毒蛋白1缩写，其英文名是Zinc finger CCCH-type antiviral proteinl，它由zc3havl基因编码。文献报道细胞内ZAP通过诱导RNA降解和 翻译抑制的机制来抑制某些病毒的复制，比如埃博拉病毒和马尔堡病毒，但ZAP对其他病 毒复制无抑制作用，例如水疱疹性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒和黄热病病毒等。
[0023] 发明人发现Ml病毒能够显著在ZAP低表达/ZAP阴性的细胞株中引起细胞死亡， Ml病毒在荷瘤动物体内富集于ZAP低表达/ZAP阴性的肿瘤组织，并抑制肿瘤生长，同时Ml 病毒抑制ZAP低表达/ZAP阴性的人离体活肿瘤组织的存活。
[0024] 发明人首次发现在多个不同种类肿瘤中，ZAP的表达量在肿瘤组织中低于癌旁非 瘤组织。临床多种肿瘤病理标本的免疫组化分析表明，在69%的肝癌、52%的结直肠癌和 61 %的膀胱癌组织中ZAP表达水平显著低于相对应的癌旁非瘤组织。Ml病毒可用于选择性 治疗ZAP低表达/ZAP阴性的肿瘤。
[0025] 发明人的实验结果首次证明Ml病毒的复制受到ZAP抑制，ZAP表达水平是Ml病毒 选择性引起肿瘤细胞死亡和抑制肿瘤生长的决定因素。发明人的研究发现Ml病毒抗肿瘤 效果与ZAP的表达水平直接相关。发明人发现，敲低ZAP后的肿瘤细胞感染Ml病毒，肿瘤 细胞存活率较未敲低ZAP的细胞显著降低。因此，作为一种可选的优选治疗方案，可以在给 予癌症患者Ml病毒治疗时，同时或预先给予ZAP抑制剂，以提高肿瘤对Ml病毒的敏感性。
[0026] 因此，为了进一步提高Ml病毒作为抗肿瘤药物治疗的有效率，在治疗方案的选择 中，可以首先判断患者肿瘤的ZAP表达情况，再针对性地给予Ml病毒的治疗方案，以此来提 高治疗方案的有效性，避免无效给药所造成的时间上的拖延和药物滥用。例如，在给药前先 测定患者肿瘤ZAP表达情况，如果是ZAP低表达或ZAP阴性的肿瘤，可直接给以Ml病毒治 疗；如果是ZAP正常表达/ZAP高表达肿瘤，则可在Ml病毒给药前或同时给予ZAP抑制剂 (例如ZAP表达或功能抑制剂，ZAP干扰片段，或者ZAP抗体等），以提高肿瘤对Ml病毒的 敏感性，提高治疗有效性。肿瘤ZAP表达量的高低直接影响到Ml治疗的有效性。ZAP表达 量越低的肿瘤越有利于Ml的治疗效果。判断某个体/肿瘤是否适于利用Ml进行治疗，可 先检测肿瘤ZAP的表达水平。判断ZAP表达水平高低可以优选但不限于以下方式 ：
[0027] ZAP低或高表达是指两组（个）样本之间ZAP mRNA或者蛋白质数量比较后得出的 结论，如果一组（个）样本比另外一组（个）ZAP mRNA或者蛋白质数量少或多称为该样本 ZAP低或高表达；ZAP阴性是指样本完全不表达ZAP mRNA或蛋白。用于ZAP mRNA和蛋白质 的数量比较的样本可以是肿瘤细胞和正常细胞、肿瘤组织与癌旁非瘤组织，或者Ml治疗有 效与无效的肿瘤。
[0028] 作为一种可选的方式，肿瘤的ZAP高、低或阴性表达均指肿瘤组织与相应癌旁非 瘤组织比较，ZAP mRNA和蛋白质的数量多、少或者无表达。若前者的ZAP的mRN A或蛋白质 均一化表达量比后者少（即肿瘤组织较癌旁非瘤组织的ZAP均一化表达量比值〈1)，则属 于ZAP低表达，适于利用Ml进行治疗。更为有效的治疗对象为肿瘤组织较癌旁非瘤组织的 ZAP均一化表达量比值〈0. 8的肿瘤，更优选〈0. 6,更优选〈0. 4,更优选〈0. 3,更优选〈0. 2， 更优选〈〇. 1，最为优选的，是肿瘤组织ZAP阴性。这些肿瘤组织与相应癌旁非瘤组织包括 但不限于病理穿刺手术或外科切除手术来源组织样本。临床调查发现，在有些肿瘤组织中 ZAP表达量甚至高于癌旁非瘤组织，这些肿瘤或肿瘤患者将不适宜直接利用Ml进行治疗。
[0029] ZAP mRNA或蛋白检测方法包括但不限于QRT_PCR、Northern Blot、Western Blot、 免疫组织化学、ELISA等。为准确判定不同样本之间ZAP mRNA或蛋白数量的差异，首先计算 出每一个样本ZAP mRNA或蛋白的均一化表达量。均一化表达量是指每个样本的ZAP mRNA 或蛋白值和样本内参ZAP mRNA或蛋白平相除，进行均一化处理得出该样本ZAP均一化表达 量。在不同检测方法中内参可以不同，其共同特征是在不同细胞或组织样本中内参表达量 一致，这样经过均一化处理的不同样本的ZAP表达量才具备可比性，用于判断样本之间ZAP mRNA或蛋白的数量差异。
[0030] 在本发明的一个示例性实施例中（图4)，Ml病毒对人离体培养的活肝癌组织和 结直肠癌组织具有不同的抑制生长效果（表2和表3)，肿瘤生长抑制率超过10 %的样本合 计达到32例，而肿瘤生长抑制率小于等于10 %的19例。进一步通过QRT-PCR方法分析这 两组每个肿瘤组织中ZAP和内参mRNA的表达水平（各自，用每个样本的2<h ap除以 2#^#获得各自ZAP均一化表达量。对上述两组样本的ZAP均一化表达量统计分析发现， 抑制率超过10%样品组的ZAP均一化表达量为0. 117±0. 890,低于抑制率小于等于10%组 (0· 791 ±0. 108)，二者均数比值为 0· 148。
[0031] 作为另一种可选的方式，肿瘤的ZAP高、低或阴性表达指肿瘤细胞（例如来源于肿 瘤患者的培养肿瘤细胞）与正常细胞比较，ZAP mRNA和蛋白质的数量多、少或者无表达。若 前者的ZAP的mRNA或蛋白质均一化表达量比后者少（即肿瘤细胞较正常细胞的ZAP均一 化表达量比值〈1)，则属于ZAP低表达，适于利用Ml进行治疗。更为有效的治疗对象为肿瘤 细胞较正常细胞的ZAP均一化表达量比值〈0. 8的肿瘤，更优选〈0. 6,更优选〈0. 4,更优选 〈0. 3,更优选〈0. 2,更优选〈0. 1，最为优选的，是肿瘤细胞ZAP阴性。
[0032] 在本发明的一个示例性实施例中（图3c)，运用Western Blot方法测定HepG2肝 癌细胞细胞株和L-02正常肝细胞株ZAP蛋白表达水平差异，同时测定作为不同样本之间表 达量一致的标准参照β -actin，Western blot检测条带灰度代表被检测分子数量，ZAP均 一化蛋白表达量=ZAP条带灰度平均值/ β -actin条带灰度平均值。HepG2的ZAP均一化 蛋白表达量与L-02的比值为0. 8, ZAP在H印G2低表达。在感染Ml病毒后，！fep G2细胞 存活率只有70. 4% ± 3. 5 %，而同样处理的L-02存活率达100. 3 ± 10. 0 %，二者存活率差异 具备统计学意义。
[0033] 在另一个示例性实施例中（图3a和图3b)，肿瘤细胞株T24、SCaBER、LoVo和H印3B 的ZAP无论mRNA(图3a)还是蛋白质（图3b)在通过QRT-PCR和Western blot检测后，分 别与各自内参比较后的均一化表达量为未检出或接近于〇 (〈〇. 1)，即ZAP表达阴性或接近 阴性（〈0.1 ) ;M1感染后这些肿瘤细胞后引起细胞死亡，细胞存活率显著下降到T2421. 1%、 SCaBER 11. 5%、LoVo 6. 9%和H印3B 3.8% (表1)。而图3a和图3b中的正常细胞L-02 和HEB中ZAP无论mRNA (图3a)还是蛋白质的均一化表达量与上述肿瘤细胞的比值大于1， 属于ZAP高表达，在Ml感染后没有引起这些正常细胞存活率明显下降，L-02为100. 3%， HEB98. 8% (表 1)。
[0034] 由此，发明同时提供了一种抗肿瘤用药系统，其特征在于包括ZAP表达水平检测 试剂，以及甲病毒；所述的甲病毒为Ml病毒或盖塔病毒。通过先检测患者肿瘤的ZAP表达 水平，再针对性地采取合适的给药方案。
[0035] 同时，发明还提供了一种抗肿瘤药物，其包括甲病毒和ZAP抑制剂；所述甲病毒为 Ml病毒或盖塔病毒。所述的ZAP抑制剂为ZAP表达或功能抑制剂、ZAP干扰片段或者ZAP 抗体等。
[0036] 为了避免Ml病毒同时对正常细胞的杀伤作用，优选地，所给予的ZAP抑制剂针对 性地给予或靶向于肿瘤组织，为肿瘤靶向性ZAP抑制剂。
[0037] 作为可选的实施方案，本发明所提供的抗肿瘤药物可以是注射剂、片剂、胶囊、贴 剂等。作为优选的实施方案，本发明的抗肿瘤药物是注射剂；优选地，可采用静脉注射。
[0038] 作为可选的给药方式，本发明Ml病毒可以通过静脉或瘤内注射方式给药。瘤内 注射方式每天给予2 X 105PFU/kg~2 X 109PFU/kg ;以静脉注射的方式每天给予2 X IO6PFU/ kg~2X lO^FU/kg。与溶剂对照组相比，Ml病毒组显著抑制了肿瘤的生长。
[0039] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0040] 本发明所提供的抗肿瘤药物，可用于治疗多种肿瘤，包括肝癌、结直肠癌、膀胱癌、 乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌。细胞学实验证明 Ml病毒引起多种肿瘤细胞的死亡；动物实验证明Ml病毒在体内显著抑制肝癌、结直肠癌的 生长；在人离体活肿瘤组织培养实验证明Ml病毒显著抑制肝癌、结直肠癌组织存活。
[0041] 本发明所提供的抗肿瘤药物，可优先的治疗ZAP低表达/ZAP阴性肿瘤，包括但不 限于肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽 癌、月市癌、胃癌。
[0042] 本发明所提供的抗肿瘤药物，具有选择性抗肿瘤作用，安全性良好。Ml病毒能选择 性引起肿瘤细胞死亡，而对正常细胞的存活无影响，表明Ml病毒具有肿瘤细胞选择性；在 荷瘤裸鼠体内，经尾静脉注射的Ml病毒能高度富集于肿瘤组织，而在正常组织内病毒量较 低，二者病毒量相差约IO 2~IO6倍，进一步阐明了 Ml病毒的肿瘤选择性。同时给予Ml病 毒并不影响裸鼠体重和精神状态，表明Ml病毒安全性良好。
[0043] 本发明首次针对特定的个体/肿瘤提供安全有效的病毒抗肿瘤药物。本发明药物 选择性地治疗ZAP低表达/ZAP阴性的肿瘤，由此提高了用药有效率，防止无效给药和药物 滥用。
[0044] 本发明提供了更为有效的用药方法和用药系统，通过先检测患者肿瘤的ZAP表达 水平，再针对性地给予药物治疗，或者辅以其他手段给予治疗，可以提高Ml病毒的治疗针 对性和有效性。
[0045] 本发明提供了更为有效的抗肿瘤药物和肿瘤治疗方法，在给药前或给药同时，辅 以ZAP抑制剂，从而可以提高了肿瘤对药物的敏感性。
【附图说明】
[0046] 图IMl病毒显著引起肿瘤细胞病变效应；
[0047] a)Ml病毒感染引起肿瘤细胞形态学病变；
[0048] b) Ml病毒感染对正常细胞株形态学没有影响，Control表示0ptiPR0?SFM培养基 对照组，Ml表示Ml病毒感染实验组。
[0049] 图2M1病毒有效抑制荷瘤鼠肿瘤生长；
[0050] a)Ml病毒瘤内注射后对H印3B荷瘤鼠肿瘤体积与动物体重的影响，Ml表示Ml病 毒处理组，溶剂表示0ptiPR0?SFM培养基溶剂对照组，η = 9 ;
[0051] b)Ml病毒瘤内注射后对LoVo荷瘤鼠肿瘤体积与动物体重的影响，η = 11 ;
[0052] c)Ml病毒静脉注射后对H印3Β荷瘤鼠肿瘤体积与动物体重的影响，η = 9 ;
[0053] d) QRT-PCR检测静脉注射Ml病毒后在H印3Β荷瘤鼠的组织分布，η = 6 ;
[0054] 肿瘤体积与体重数据以平均值土标准差表示，ANOVA法统计；箭头表示Ml病毒处 理组，圆圈表示0ptiPR0?SFM培养基对照组，ns表示无统计学差异；i. t表示瘤内注射，i. V 表不静脉注射；*表不未检测到Ml病毒的mRNA表达。
[0055] 图3M1病毒选择性引起ZAP低表达/ZAP阴性肿瘤细胞死亡；
[0056] a) ZAP mRNA表达量在不同细胞中的差异表达；ND表示未检测到ZAP的mRNA表达；
[0057] b)ZAP的蛋白表达量在不同细胞中的差异表达；β-actin是内参；
[0058] c)细胞ZAP蛋白水平与Ml病毒感染引起的细胞存活率改变。β-actin是内参， students' t检验统计分析，林P〈0. 01 ;
[0059] d)Ml病毒显著引起敲低ZAP水平后的正常细胞L -02、肿瘤细胞PLC和HCTl 16死 亡。空心圆/空心三角/空心倒三角表示干扰敲低ZAP，实心圆/实心三角/实心倒三角表 示乱码干扰阴性对照，采用students't检验统计分析，*/#/&表示P〈0. 05, &&表示P〈0. 01， ns表示无统计学差异；
[0060] e)在敲低ZAP的正常细胞L-02、肿瘤细胞PLC和HCT116中Ml病毒相对滴度增加， 采用students' t检验统计分析，*表示Ρ〈0· 05 ;
[0061] f)在敲低ZAP的正常细胞L-02、肿瘤细胞PLC和HCT116中Ml病毒RNA表达增加， 采用students' t检验统计分析，*表示Ρ〈0· 05, **表示P〈0. 01 ;
[0062] g)在敲低ZAP的正常细胞L-02、肿瘤细胞PLC和HCTl 16中Ml病毒蛋白NS3, El 表达增加，GAPDH作为内参；
[0063] h)过表达ZAP部分阻断由Ml病毒引起的肿瘤细胞死亡，采用students't检验统 计分析，#表示P〈〇. 05, ns表示无统计学差异；
[0064] i)过表达ZAP的肿瘤细胞中病毒Ml病毒相对滴度减少，采用students't检验统 计分析，**表示Ρ〈〇· 01 ;
[0065] j)过表达ZAP的肿瘤细胞中病毒Ml病毒的RNA减少，采用students't检验统计 分析，**表示P〈〇. 01 ;
[0066] k)过表达ZAP的肿瘤细胞中，Ml病毒的蛋白NS3, El表达增加 ，β -actin作为内 参。
[0067] 图4M1病毒对人离体活肿瘤组织抑制率与ZAP mRNA表达水平负相关；
[0068] QRT-PCR检测ZAP的mRNA表达，比较Ml病毒无效组（抑制率彡10 % )与Ml病毒 有效组（抑制率>10% ) ZAP相对表达量的差别，Ml病毒处理抑制率小于等于10 %的肿瘤 组织ZAP均一化表达量中位数是0. 414,大于10%的肿瘤组织ZAP表达量中位数为0. 075。 采用秩和检验统计分析，P〈〇. 05。
[0069] 图5ZAP在多种肿瘤临床病理组织中低表达；
[0070] a)免疫组化染色检测临床肿瘤病理组织中ZAP的表达情况，N :癌旁非瘤组，T :肿 瘤组；
[0071] b)在多种肿瘤临床病理组织中，肿瘤组ZAP表达显著低于癌旁非瘤组，N :癌旁非 瘤组，T :肿瘤组；N与T秩和检验进打统计分析，***P〈0. 001 ;
[0072] c)在多种肿瘤临床病理组织中，肿瘤组织ZAP表达低于癌旁非瘤组织的病例比 率。
【具体实施方式】
[0073] 以下实施方式是对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不局限于以下的实 施例介绍，凡依照本发明的原理或理念所作的等同的变化或变通都应视为本发明保护的范 畴。
[0074] 在没有特别指明的情况下，本发明采用的材料及实验方法为常规材料及方法。
[0075] 实施例1 Ml病毒选择性引起肿瘤细胞死亡
[0076] 1)M1病毒显著引起肿瘤细胞形态学病变
[0077] 材料：
[0078] 肝细胞癌H印3B、人膀胱移行细胞癌T24、人结直肠癌LoVo,人永生化正常肝细胞 株L-02, Ml病毒，高糖DMEM培养基，F-12培养基，倒置相差显微镜。
[0079] 方法：
[0080] a)细胞的培养：人肝细胞癌细胞株H印3B细胞株，人膀胱移行上皮细胞癌细胞株 T24,人永生化正常肝细胞株L-02,生长在含10% FBS、100U/ml青霉素及0. lmg/ml链霉 素的DMEM完全培养基中；人结直肠癌细胞株LoVo生长在含10% FBS、100U/ml青霉素及 0. lmg/ml链霉素的F-12完全培养基中。所有细胞株均置于5% C02, 37°C恒温密闭式孵箱 (相对湿度95%)内培养传代，倒置显微镜观察生长情况。大约2~3天传代一次，取处于 对数生长期的细胞用于正式实验。
[0081] b)细胞显微镜下观察：选择对数生长期细胞，DMEM或F-12完全培养液（含10% 胎牛血清、1 %双抗）制成细胞悬液，细胞以2. 5 X IO4/孔的密度接种在24孔培养板内。用 Ml病毒（Μ0Ι = 1)感染48小时后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态学的变化。
[0082] 结果：
[0083] 相差显微镜下观察细胞形态，Hep3B细胞，T24细胞和LoVo细胞均是单层贴壁生 长，并且细胞紧密排列，表型一致。而Ml病毒（Μ0Ι = 1)处理48h后，细胞的形态发生了明 显改变，较对照组细胞，感染病毒组细胞数目明显减少，胞体收缩成球状，折光率明显增强， 呈死亡病变样，如图la。如图Ib显示了 Ml病毒感染对正常细胞的影响，采用同样滴度的 Ml病毒感染L-02细胞，没有发现细胞数目，形态有明显的变化。结果表明Ml病毒对肿瘤细 胞有选择性引起细胞死亡，而对正常细胞存活没有影响。
[0084] 2) Ml病毒选择性地降低肿瘤细胞株存活
[0085] 材料：
[0086] 34株肿瘤细胞株（见表1)、3株人永生化正常细胞株（见表1)、M1病毒、高糖DMEM 培养基、F-12培养基、MTT (四甲基偶氮唑蓝）。
[0087] 方法：
[0088] a)接种细胞、给药处理：选择对数生长期细胞，DMEM(或F-12)完全培养液（含 10 %胎牛血清、1 %双抗）制成细胞悬液，以每孔4 X IO3/孔的密度接种在96孔培养板内。 12小时后见细胞完全贴壁，实验分实验组和对照组，实验组：Ml病毒（Μ0Ι = 10)感染细胞； 对照组：高糖DMEM溶剂对照组，两组均设5个复孔。
[0089] b)MTT与细胞内的琥珀酸脱氢酶反应：培养至48h时，每孔加入ΜΤΤ15μ l(5mg/ ml)，继续孵育4小时，此时镜检可观察到、活细胞内形成的颗粒状蓝紫色甲臜结晶。
[0090] C)溶解甲臜颗粒：小心吸去上清，加 DMSOlOOy 1/孔溶解形成的结晶，在微型振荡 器上震荡5min，然后在酶联检测仪上用波长570nm检测各孔的光密度（0D值）。每组实验 重复3次。细胞存活率=药物处理组OD值/对照组OD值X 100%。
[0091] 结果：
[0092] 如表1所示，Ml病毒（Μ0Ι = 10)处理肿瘤细胞48小时，胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌 和黑色素瘤细胞死亡率超过50% ;结直肠癌（LoVo、HCT-8、SW620和SW480)、肝癌〇fep3B、 Huh-7和Huh-6)、膀胱癌和乳腺癌细胞死亡率超过40% ;胶质瘤、宫颈癌、肺癌细胞死亡率 超过30%;胃癌细胞死亡率超过20%。而3株正常细胞（L-02、HEB和SV-HUC-1)以及PLC 和HCT116细胞存活率没有统计学显著变化。结果表明Ml病毒感染选择性引起大部分肿瘤 细胞死亡。
[0093] 表1. Ml病毒显著降低肿瘤细胞存活率
[0094]
【主权项】
1. 甲病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的甲病毒为Ml病毒或盖塔病 毒。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺 癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为ZAP低表达肿瘤或ZAP阴性肿 瘤。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为ZAP低表达的实体瘤或ZAP阴 性的实体瘤。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为ZAP低表达或ZAP阴性的肝癌、 结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃 癌。
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为注射剂、片剂、胶囊或贴剂；优 选地，所述的药物为注射剂。
7. -种抗肿瘤用药系统，其特征在于包括ZAP表达水平检测试剂，以及甲病毒；所述的 甲病毒为Ml病毒或盖塔病毒。
8. -种抗肿瘤药物，其特征在于包括甲病毒和ZAP抑制剂；所述甲病毒为Ml病毒或盖 塔病毒。
9. 如权利要求7所述的药物，其特征在于所述的ZAP抑制剂为肿瘤靶向ZAP抑制剂。 10. ZAP抑制剂在制备甲病毒抗肿瘤增敏剂/耐药逆转剂方面的应用；所述甲病毒为Ml 病毒或盖塔病毒。
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，涉及甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述的甲病毒为M1病毒或盖塔病毒。进一步地本发明确定了对上述甲病毒治疗敏感的特定肿瘤类型，从而为抗肿瘤用药方案提供了更为安全有效的解决方案。CCTCC V20142320140717
【IPC分类】A61K35-768, A61K45-00, A61P35-00
【公开号】CN104814984
【申请号】CN201410425510
【发明人】颜光美, 肖晓, 胡骏, 李凯, 梁剑开, 林园, 张海鹏
【申请人】中山大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2014年8月26日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤源于正常细胞中基因和表观遗传学的积累变化，这种改变驱使正常细胞转变 为恶性肿瘤。这个复杂病理变化过程决定了不同肿瘤在发生、维持以及转移中机制的多样 性。目前，手术切除、化疗和放疗是临床治疗肿瘤常用的方法，然而手术切除肿瘤易复发， 放、化疗毒副作用大。
[0003] 15~20 %人类的癌症与病毒感染有关，如乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)与肝癌、人乳头瘤病毒（HPV)与宫颈癌等。
[0004] 甲病毒属病毒属于披膜病毒科，是一类有包膜结构的单正链RNA病毒，主要通过 节肢动物作为传播媒介。29种甲病毒中有13种可引起人、畜疾病（David M.Knipe，Peter M. Howley, Chapter23, Alphaviruses, Fields Virology6th edition :651-685,2013)〇
[0005] 甲病毒委内瑞拉马脑炎病毒可作为载体转导树突细胞治疗肿瘤（Moran TPj Burgents JEj Long Bj et al:Alphaviral vector-transduced dendritic cells are successful therapeutic vaccines against neu-〇verexpressing tumors in wild-type mice. Vaccine25:6604-6612, 2007)。然而，这种病毒曾引起人类发热、抽搐、流产甚至死亡， 因此选择性与安全性问题严重影响病毒在抗肿瘤治疗中的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种安全有效的病毒抗肿瘤药物。
[0007] 本发明的进一步目的在于提供一种针对特定肿瘤类型的安全有效的病毒抗肿瘤 药物。
[0008] 本发明的进一步目的在于针对特定的个体/肿瘤提供一种安全有效的病毒抗肿 瘤药物。
[0009] 本发明的进一步目的在于提供一种有效的抗肿瘤用药系统及用药方法。
[0010] 本发明的进一步目的在于提供一种更为有效的抗肿瘤药物和肿瘤治疗方法。
[0011] 发明通过以下技术方案实现上述目的。
[0012] 发明提供了甲病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的甲病毒为Ml病毒或盖塔 病毒。
[0013] Ml病毒（Alphavirus Ml)属于甲病毒属（Alphavirus)，于1964年从中国海南岛库 蚊属（Culex)蚊虫中分离得到（Li XD, et al: Isolation of Getah virus from mosquitos collected on Hainan Island，China，and results of a serosurvey. Southeast Asian J Trop Med Public Health23:730-734, 1992.)。2008年Ml病毒的全基因组序列被测定（Zhai YGj et al:Complete sequence characterization of isolates of Getah virus(genus Alphavirus，family Togaviridae) from China. J Gen Virol89:1446-1456, 2008·)。其获取 方式可选但不限于通过上述文献方法获得，或者通过以下保藏信息获得（保藏编号：CCTCC V201423 ;保藏时间：2014年7月17日；分类命名：Alphavirus Ml ;保藏单位：中国典型培 养物保藏中心；保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学）。
[0014] 本发明研究者此前对Ml病毒的研究结果表明，其对一些肿瘤细胞具有杀伤作用， 例如对大鼠恶性胶质瘤细胞C6,人恶性胶质瘤细胞U251和U-87 ;然而，对另外一些肿瘤细 胞则不具备杀伤作用，例如对人恶性胶质瘤细胞T98G。这些研究并不能确定Ml病毒具备有 效抗肿瘤效应。
[0015] 本发明进一步提供了该病毒所适用的肿瘤类型，以提高Ml病毒作为抗肿瘤药物 时的治疗有效性。
[0016] 进一步优选地，本发明以Ml病毒作为抗肿瘤药物所适用的肿瘤类型包括肝癌、结 直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌 中的一种或多种。
[0017] 发明人发现，Ml病毒对各种肿瘤细胞引起不同程度的细胞死亡。Ml病毒（Μ0Ι = 10)处理肿瘤细胞48小时，胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤细胞死亡率超过50% ;结 直肠癌（L〇V〇、HCT-8、SW620和SW480)、肝癌〇fep3B、Huh-7和Huh-6)、膀胱癌和乳腺癌细胞 死亡率超过40% ;胶质瘤、宫颈癌、肺癌细胞死亡率超过30% ;胃癌细胞死亡率超过20%。 上述结果提示Ml病毒作为抗肿瘤药物效果最显著的针对以下癌症类型：胰腺癌、鼻咽癌、 前列腺癌和黑色素瘤；其次为：结直肠癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌；再其次为：胶质瘤、宫颈 癌、肺癌；而最不显著的为胃癌。
[0018] 鉴于Ml病毒属于盖塔相似病毒，其与盖塔病毒同源性高达97. 8%，本领域技术人 员有理由认可，基于Ml病毒的抗肿瘤效果，盖塔病毒也可类似地与Ml病毒起到相似的作用 和效果。
[0019] 进一步地，本发明提供了一种可以针对特定个体/肿瘤更为准确有效地给予治疗 方案和治疗药物的方法，以及针对特定个体/肿瘤相关的药物。
[0020] 发明人首次发现，所述的病毒适合用于治疗ZAP低表达肿瘤或ZAP阴性肿瘤，优选 用于治疗ZAP低表达的实体瘤或ZAP阴性的实体瘤。
[0021] Ml病毒治疗肿瘤的有效性，与肿瘤ZAP表达调控密切相关。Ml病毒的复制受到 ZAP的抑制，并且ZAP在多种肿瘤中低表达或阴性，Ml病毒可选择性地治疗ZAP低表达或 ZAP阴性的肿瘤/个体。
[0022] ZAP是锌指CCCH型抗病毒蛋白1缩写，其英文名是Zinc finger CCCH-type antiviral proteinl，它由zc3havl基因编码。文献报道细胞内ZAP通过诱导RNA降解和 翻译抑制的机制来抑制某些病毒的复制，比如埃博拉病毒和马尔堡病毒，但ZAP对其他病 毒复制无抑制作用，例如水疱疹性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒和黄热病病毒等。
[0023] 发明人发现Ml病毒能够显著在ZAP低表达/ZAP阴性的细胞株中引起细胞死亡， Ml病毒在荷瘤动物体内富集于ZAP低表达/ZAP阴性的肿瘤组织，并抑制肿瘤生长，同时Ml 病毒抑制ZAP低表达/ZAP阴性的人离体活肿瘤组织的存活。
[0024] 发明人首次发现在多个不同种类肿瘤中，ZAP的表达量在肿瘤组织中低于癌旁非 瘤组织。临床多种肿瘤病理标本的免疫组化分析表明，在69%的肝癌、52%的结直肠癌和 61 %的膀胱癌组织中ZAP表达水平显著低于相对应的癌旁非瘤组织。Ml病毒可用于选择性 治疗ZAP低表达/ZAP阴性的肿瘤。
[0025] 发明人的实验结果首次证明Ml病毒的复制受到ZAP抑制，ZAP表达水平是Ml病毒 选择性引起肿瘤细胞死亡和抑制肿瘤生长的决定因素。发明人的研究发现Ml病毒抗肿瘤 效果与ZAP的表达水平直接相关。发明人发现，敲低ZAP后的肿瘤细胞感染Ml病毒，肿瘤 细胞存活率较未敲低ZAP的细胞显著降低。因此，作为一种可选的优选治疗方案，可以在给 予癌症患者Ml病毒治疗时，同时或预先给予ZAP抑制剂，以提高肿瘤对Ml病毒的敏感性。
[0026] 因此，为了进一步提高Ml病毒作为抗肿瘤药物治疗的有效率，在治疗方案的选择 中，可以首先判断患者肿瘤的ZAP表达情况，再针对性地给予Ml病毒的治疗方案，以此来提 高治疗方案的有效性，避免无效给药所造成的时间上的拖延和药物滥用。例如，在给药前先 测定患者肿瘤ZAP表达情况，如果是ZAP低表达或ZAP阴性的肿瘤，可直接给以Ml病毒治 疗；如果是ZAP正常表达/ZAP高表达肿瘤，则可在Ml病毒给药前或同时给予ZAP抑制剂 (例如ZAP表达或功能抑制剂，ZAP干扰片段，或者ZAP抗体等），以提高肿瘤对Ml病毒的 敏感性，提高治疗有效性。肿瘤ZAP表达量的高低直接影响到Ml治疗的有效性。ZAP表达 量越低的肿瘤越有利于Ml的治疗效果。判断某个体/肿瘤是否适于利用Ml进行治疗，可 先检测肿瘤ZAP的表达水平。判断ZAP表达水平高低可以优选但不限于以下方式 ：
[0027] ZAP低或高表达是指两组（个）样本之间ZAP mRNA或者蛋白质数量比较后得出的 结论，如果一组（个）样本比另外一组（个）ZAP mRNA或者蛋白质数量少或多称为该样本 ZAP低或高表达；ZAP阴性是指样本完全不表达ZAP mRNA或蛋白。用于ZAP mRNA和蛋白质 的数量比较的样本可以是肿瘤细胞和正常细胞、肿瘤组织与癌旁非瘤组织，或者Ml治疗有 效与无效的肿瘤。
[0028] 作为一种可选的方式，肿瘤的ZAP高、低或阴性表达均指肿瘤组织与相应癌旁非 瘤组织比较，ZAP mRNA和蛋白质的数量多、少或者无表达。若前者的ZAP的mRN A或蛋白质 均一化表达量比后者少（即肿瘤组织较癌旁非瘤组织的ZAP均一化表达量比值〈1)，则属 于ZAP低表达，适于利用Ml进行治疗。更为有效的治疗对象为肿瘤组织较癌旁非瘤组织的 ZAP均一化表达量比值〈0. 8的肿瘤，更优选〈0. 6,更优选〈0. 4,更优选〈0. 3,更优选〈0. 2， 更优选〈〇. 1，最为优选的，是肿瘤组织ZAP阴性。这些肿瘤组织与相应癌旁非瘤组织包括 但不限于病理穿刺手术或外科切除手术来源组织样本。临床调查发现，在有些肿瘤组织中 ZAP表达量甚至高于癌旁非瘤组织，这些肿瘤或肿瘤患者将不适宜直接利用Ml进行治疗。
[0029] ZAP mRNA或蛋白检测方法包括但不限于QRT_PCR、Northern Blot、Western Blot、 免疫组织化学、ELISA等。为准确判定不同样本之间ZAP mRNA或蛋白数量的差异，首先计算 出每一个样本ZAP mRNA或蛋白的均一化表达量。均一化表达量是指每个样本的ZAP mRNA 或蛋白值和样本内参ZAP mRNA或蛋白平相除，进行均一化处理得出该样本ZAP均一化表达 量。在不同检测方法中内参可以不同，其共同特征是在不同细胞或组织样本中内参表达量 一致，这样经过均一化处理的不同样本的ZAP表达量才具备可比性，用于判断样本之间ZAP mRNA或蛋白的数量差异。
[0030] 在本发明的一个示例性实施例中（图4)，Ml病毒对人离体培养的活肝癌组织和 结直肠癌组织具有不同的抑制生长效果（表2和表3)，肿瘤生长抑制率超过10 %的样本合 计达到32例，而肿瘤生长抑制率小于等于10 %的19例。进一步通过QRT-PCR方法分析这 两组每个肿瘤组织中ZAP和内参mRNA的表达水平（各自，用每个样本的2<h ap除以 2#^#获得各自ZAP均一化表达量。对上述两组样本的ZAP均一化表达量统计分析发现， 抑制率超过10%样品组的ZAP均一化表达量为0. 117±0. 890,低于抑制率小于等于10%组 (0· 791 ±0. 108)，二者均数比值为 0· 148。
[0031] 作为另一种可选的方式，肿瘤的ZAP高、低或阴性表达指肿瘤细胞（例如来源于肿 瘤患者的培养肿瘤细胞）与正常细胞比较，ZAP mRNA和蛋白质的数量多、少或者无表达。若 前者的ZAP的mRNA或蛋白质均一化表达量比后者少（即肿瘤细胞较正常细胞的ZAP均一 化表达量比值〈1)，则属于ZAP低表达，适于利用Ml进行治疗。更为有效的治疗对象为肿瘤 细胞较正常细胞的ZAP均一化表达量比值〈0. 8的肿瘤，更优选〈0. 6,更优选〈0. 4,更优选 〈0. 3,更优选〈0. 2,更优选〈0. 1，最为优选的，是肿瘤细胞ZAP阴性。
[0032] 在本发明的一个示例性实施例中（图3c)，运用Western Blot方法测定HepG2肝 癌细胞细胞株和L-02正常肝细胞株ZAP蛋白表达水平差异，同时测定作为不同样本之间表 达量一致的标准参照β -actin，Western blot检测条带灰度代表被检测分子数量，ZAP均 一化蛋白表达量=ZAP条带灰度平均值/ β -actin条带灰度平均值。HepG2的ZAP均一化 蛋白表达量与L-02的比值为0. 8, ZAP在H印G2低表达。在感染Ml病毒后，！fep G2细胞 存活率只有70. 4% ± 3. 5 %，而同样处理的L-02存活率达100. 3 ± 10. 0 %，二者存活率差异 具备统计学意义。
[0033] 在另一个示例性实施例中（图3a和图3b)，肿瘤细胞株T24、SCaBER、LoVo和H印3B 的ZAP无论mRNA(图3a)还是蛋白质（图3b)在通过QRT-PCR和Western blot检测后，分 别与各自内参比较后的均一化表达量为未检出或接近于〇 (〈〇. 1)，即ZAP表达阴性或接近 阴性（〈0.1 ) ;M1感染后这些肿瘤细胞后引起细胞死亡，细胞存活率显著下降到T2421. 1%、 SCaBER 11. 5%、LoVo 6. 9%和H印3B 3.8% (表1)。而图3a和图3b中的正常细胞L-02 和HEB中ZAP无论mRNA (图3a)还是蛋白质的均一化表达量与上述肿瘤细胞的比值大于1， 属于ZAP高表达，在Ml感染后没有引起这些正常细胞存活率明显下降，L-02为100. 3%， HEB98. 8% (表 1)。
[0034] 由此，发明同时提供了一种抗肿瘤用药系统，其特征在于包括ZAP表达水平检测 试剂，以及甲病毒；所述的甲病毒为Ml病毒或盖塔病毒。通过先检测患者肿瘤的ZAP表达 水平，再针对性地采取合适的给药方案。
[0035] 同时，发明还提供了一种抗肿瘤药物，其包括甲病毒和ZAP抑制剂；所述甲病毒为 Ml病毒或盖塔病毒。所述的ZAP抑制剂为ZAP表达或功能抑制剂、ZAP干扰片段或者ZAP 抗体等。
[0036] 为了避免Ml病毒同时对正常细胞的杀伤作用，优选地，所给予的ZAP抑制剂针对 性地给予或靶向于肿瘤组织，为肿瘤靶向性ZAP抑制剂。
[0037] 作为可选的实施方案，本发明所提供的抗肿瘤药物可以是注射剂、片剂、胶囊、贴 剂等。作为优选的实施方案，本发明的抗肿瘤药物是注射剂；优选地，可采用静脉注射。
[0038] 作为可选的给药方式，本发明Ml病毒可以通过静脉或瘤内注射方式给药。瘤内 注射方式每天给予2 X 105PFU/kg~2 X 109PFU/kg ;以静脉注射的方式每天给予2 X IO6PFU/ kg~2X lO^FU/kg。与溶剂对照组相比，Ml病毒组显著抑制了肿瘤的生长。
[0039] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0040] 本发明所提供的抗肿瘤药物，可用于治疗多种肿瘤，包括肝癌、结直肠癌、膀胱癌、 乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌。细胞学实验证明 Ml病毒引起多种肿瘤细胞的死亡；动物实验证明Ml病毒在体内显著抑制肝癌、结直肠癌的 生长；在人离体活肿瘤组织培养实验证明Ml病毒显著抑制肝癌、结直肠癌组织存活。
[0041] 本发明所提供的抗肿瘤药物，可优先的治疗ZAP低表达/ZAP阴性肿瘤，包括但不 限于肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽 癌、月市癌、胃癌。
[0042] 本发明所提供的抗肿瘤药物，具有选择性抗肿瘤作用，安全性良好。Ml病毒能选择 性引起肿瘤细胞死亡，而对正常细胞的存活无影响，表明Ml病毒具有肿瘤细胞选择性；在 荷瘤裸鼠体内，经尾静脉注射的Ml病毒能高度富集于肿瘤组织，而在正常组织内病毒量较 低，二者病毒量相差约IO 2~IO6倍，进一步阐明了 Ml病毒的肿瘤选择性。同时给予Ml病 毒并不影响裸鼠体重和精神状态，表明Ml病毒安全性良好。
[0043] 本发明首次针对特定的个体/肿瘤提供安全有效的病毒抗肿瘤药物。本发明药物 选择性地治疗ZAP低表达/ZAP阴性的肿瘤，由此提高了用药有效率，防止无效给药和药物 滥用。
[0044] 本发明提供了更为有效的用药方法和用药系统，通过先检测患者肿瘤的ZAP表达 水平，再针对性地给予药物治疗，或者辅以其他手段给予治疗，可以提高Ml病毒的治疗针 对性和有效性。
[0045] 本发明提供了更为有效的抗肿瘤药物和肿瘤治疗方法，在给药前或给药同时，辅 以ZAP抑制剂，从而可以提高了肿瘤对药物的敏感性。
【附图说明】
[0046] 图IMl病毒显著引起肿瘤细胞病变效应；
[0047] a)Ml病毒感染引起肿瘤细胞形态学病变；
[0048] b) Ml病毒感染对正常细胞株形态学没有影响，Control表示0ptiPR0?SFM培养基 对照组，Ml表示Ml病毒感染实验组。
[0049] 图2M1病毒有效抑制荷瘤鼠肿瘤生长；
[0050] a)Ml病毒瘤内注射后对H印3B荷瘤鼠肿瘤体积与动物体重的影响，Ml表示Ml病 毒处理组，溶剂表示0ptiPR0?SFM培养基溶剂对照组，η = 9 ;
[0051] b)Ml病毒瘤内注射后对LoVo荷瘤鼠肿瘤体积与动物体重的影响，η = 11 ;
[0052] c)Ml病毒静脉注射后对H印3Β荷瘤鼠肿瘤体积与动物体重的影响，η = 9 ;
[0053] d) QRT-PCR检测静脉注射Ml病毒后在H印3Β荷瘤鼠的组织分布，η = 6 ;
[0054] 肿瘤体积与体重数据以平均值土标准差表示，ANOVA法统计；箭头表示Ml病毒处 理组，圆圈表示0ptiPR0?SFM培养基对照组，ns表示无统计学差异；i. t表示瘤内注射，i. V 表不静脉注射；*表不未检测到Ml病毒的mRNA表达。
[0055] 图3M1病毒选择性引起ZAP低表达/ZAP阴性肿瘤细胞死亡；
[0056] a) ZAP mRNA表达量在不同细胞中的差异表达；ND表示未检测到ZAP的mRNA表达；
[0057] b)ZAP的蛋白表达量在不同细胞中的差异表达；β-actin是内参；
[0058] c)细胞ZAP蛋白水平与Ml病毒感染引起的细胞存活率改变。β-actin是内参， students' t检验统计分析，林P〈0. 01 ;
[0059] d)Ml病毒显著引起敲低ZAP水平后的正常细胞L -02、肿瘤细胞PLC和HCTl 16死 亡。空心圆/空心三角/空心倒三角表示干扰敲低ZAP，实心圆/实心三角/实心倒三角表 示乱码干扰阴性对照，采用students't检验统计分析，*/#/&表示P〈0. 05, &&表示P〈0. 01， ns表示无统计学差异；
[0060] e)在敲低ZAP的正常细胞L-02、肿瘤细胞PLC和HCT116中Ml病毒相对滴度增加， 采用students' t检验统计分析，*表示Ρ〈0· 05 ;
[0061] f)在敲低ZAP的正常细胞L-02、肿瘤细胞PLC和HCT116中Ml病毒RNA表达增加， 采用students' t检验统计分析，*表示Ρ〈0· 05, **表示P〈0. 01 ;
[0062] g)在敲低ZAP的正常细胞L-02、肿瘤细胞PLC和HCTl 16中Ml病毒蛋白NS3, El 表达增加，GAPDH作为内参；
[0063] h)过表达ZAP部分阻断由Ml病毒引起的肿瘤细胞死亡，采用students't检验统 计分析，#表示P〈〇. 05, ns表示无统计学差异；
[0064] i)过表达ZAP的肿瘤细胞中病毒Ml病毒相对滴度减少，采用students't检验统 计分析，**表示Ρ〈〇· 01 ;
[0065] j)过表达ZAP的肿瘤细胞中病毒Ml病毒的RNA减少，采用students't检验统计 分析，**表示P〈〇. 01 ;
[0066] k)过表达ZAP的肿瘤细胞中，Ml病毒的蛋白NS3, El表达增加 ，β -actin作为内 参。
[0067] 图4M1病毒对人离体活肿瘤组织抑制率与ZAP mRNA表达水平负相关；
[0068] QRT-PCR检测ZAP的mRNA表达，比较Ml病毒无效组（抑制率彡10 % )与Ml病毒 有效组（抑制率>10% ) ZAP相对表达量的差别，Ml病毒处理抑制率小于等于10 %的肿瘤 组织ZAP均一化表达量中位数是0. 414,大于10%的肿瘤组织ZAP表达量中位数为0. 075。 采用秩和检验统计分析，P〈〇. 05。
[0069] 图5ZAP在多种肿瘤临床病理组织中低表达；
[0070] a)免疫组化染色检测临床肿瘤病理组织中ZAP的表达情况，N :癌旁非瘤组，T :肿 瘤组；
[0071] b)在多种肿瘤临床病理组织中，肿瘤组ZAP表达显著低于癌旁非瘤组，N :癌旁非 瘤组，T :肿瘤组；N与T秩和检验进打统计分析，***P〈0. 001 ;
[0072] c)在多种肿瘤临床病理组织中，肿瘤组织ZAP表达低于癌旁非瘤组织的病例比 率。
【具体实施方式】
[0073] 以下实施方式是对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不局限于以下的实 施例介绍，凡依照本发明的原理或理念所作的等同的变化或变通都应视为本发明保护的范 畴。
[0074] 在没有特别指明的情况下，本发明采用的材料及实验方法为常规材料及方法。
[0075] 实施例1 Ml病毒选择性引起肿瘤细胞死亡
[0076] 1)M1病毒显著引起肿瘤细胞形态学病变
[0077] 材料：
[0078] 肝细胞癌H印3B、人膀胱移行细胞癌T24、人结直肠癌LoVo,人永生化正常肝细胞 株L-02, Ml病毒，高糖DMEM培养基，F-12培养基，倒置相差显微镜。
[0079] 方法：
[0080] a)细胞的培养：人肝细胞癌细胞株H印3B细胞株，人膀胱移行上皮细胞癌细胞株 T24,人永生化正常肝细胞株L-02,生长在含10% FBS、100U/ml青霉素及0. lmg/ml链霉 素的DMEM完全培养基中；人结直肠癌细胞株LoVo生长在含10% FBS、100U/ml青霉素及 0. lmg/ml链霉素的F-12完全培养基中。所有细胞株均置于5% C02, 37°C恒温密闭式孵箱 (相对湿度95%)内培养传代，倒置显微镜观察生长情况。大约2~3天传代一次，取处于 对数生长期的细胞用于正式实验。
[0081] b)细胞显微镜下观察：选择对数生长期细胞，DMEM或F-12完全培养液（含10% 胎牛血清、1 %双抗）制成细胞悬液，细胞以2. 5 X IO4/孔的密度接种在24孔培养板内。用 Ml病毒（Μ0Ι = 1)感染48小时后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态学的变化。
[0082] 结果：
[0083] 相差显微镜下观察细胞形态，Hep3B细胞，T24细胞和LoVo细胞均是单层贴壁生 长，并且细胞紧密排列，表型一致。而Ml病毒（Μ0Ι = 1)处理48h后，细胞的形态发生了明 显改变，较对照组细胞，感染病毒组细胞数目明显减少，胞体收缩成球状，折光率明显增强， 呈死亡病变样，如图la。如图Ib显示了 Ml病毒感染对正常细胞的影响，采用同样滴度的 Ml病毒感染L-02细胞，没有发现细胞数目，形态有明显的变化。结果表明Ml病毒对肿瘤细 胞有选择性引起细胞死亡，而对正常细胞存活没有影响。
[0084] 2) Ml病毒选择性地降低肿瘤细胞株存活
[0085] 材料：
[0086] 34株肿瘤细胞株（见表1)、3株人永生化正常细胞株（见表1)、M1病毒、高糖DMEM 培养基、F-12培养基、MTT (四甲基偶氮唑蓝）。
[0087] 方法：
[0088] a)接种细胞、给药处理：选择对数生长期细胞，DMEM(或F-12)完全培养液（含 10 %胎牛血清、1 %双抗）制成细胞悬液，以每孔4 X IO3/孔的密度接种在96孔培养板内。 12小时后见细胞完全贴壁，实验分实验组和对照组，实验组：Ml病毒（Μ0Ι = 10)感染细胞； 对照组：高糖DMEM溶剂对照组，两组均设5个复孔。
[0089] b)MTT与细胞内的琥珀酸脱氢酶反应：培养至48h时，每孔加入ΜΤΤ15μ l(5mg/ ml)，继续孵育4小时，此时镜检可观察到、活细胞内形成的颗粒状蓝紫色甲臜结晶。
[0090] C)溶解甲臜颗粒：小心吸去上清，加 DMSOlOOy 1/孔溶解形成的结晶，在微型振荡 器上震荡5min，然后在酶联检测仪上用波长570nm检测各孔的光密度（0D值）。每组实验 重复3次。细胞存活率=药物处理组OD值/对照组OD值X 100%。
[0091] 结果：
[0092] 如表1所示，Ml病毒（Μ0Ι = 10)处理肿瘤细胞48小时，胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌 和黑色素瘤细胞死亡率超过50% ;结直肠癌（LoVo、HCT-8、SW620和SW480)、肝癌〇fep3B、 Huh-7和Huh-6)、膀胱癌和乳腺癌细胞死亡率超过40% ;胶质瘤、宫颈癌、肺癌细胞死亡率 超过30%;胃癌细胞死亡率超过20%。而3株正常细胞（L-02、HEB和SV-HUC-1)以及PLC 和HCT116细胞存活率没有统计学显著变化。结果表明Ml病毒感染选择性引起大部分肿瘤 细胞死亡。
[0093] 表1. Ml病毒显著降低肿瘤细胞存活率
[0094]
【主权项】
1. 甲病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的甲病毒为Ml病毒或盖塔病 毒。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺 癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为ZAP低表达肿瘤或ZAP阴性肿 瘤。
4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为ZAP低表达的实体瘤或ZAP阴 性的实体瘤。
5. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为ZAP低表达或ZAP阴性的肝癌、 结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃 癌。
6. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的药物为注射剂、片剂、胶囊或贴剂；优 选地，所述的药物为注射剂。
7. -种抗肿瘤用药系统，其特征在于包括ZAP表达水平检测试剂，以及甲病毒；所述的 甲病毒为Ml病毒或盖塔病毒。
8. -种抗肿瘤药物，其特征在于包括甲病毒和ZAP抑制剂；所述甲病毒为Ml病毒或盖 塔病毒。
9. 如权利要求7所述的药物，其特征在于所述的ZAP抑制剂为肿瘤靶向ZAP抑制剂。 10. ZAP抑制剂在制备甲病毒抗肿瘤增敏剂/耐药逆转剂方面的应用；所述甲病毒为Ml 病毒或盖塔病毒。
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，涉及甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述的甲病毒为M1病毒或盖塔病毒。进一步地本发明确定了对上述甲病毒治疗敏感的特定肿瘤类型，从而为抗肿瘤用药方案提供了更为安全有效的解决方案。CCTCC V20142320140717
【IPC分类】A61K35-768, A61K45-00, A61P35-00
【公开号】CN104814984
【申请号】CN201410425510
【发明人】颜光美, 肖晓, 胡骏, 李凯, 梁剑开, 林园, 张海鹏
【申请人】中山大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2014年8月26日
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