一种海藻多糖的应用
一种海藻多糖的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学技术领域，具体是一种海藻多糖的应用。
【背景技术】
[0002]随着我国养殖业的飞速发展，特别是近年来集约化养殖业发展很快，目前，畜禽疾病防治也面临很多问题。畜禽传染病根据其病原特性大体可分为病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病、支原体病等。而病毒性疾病是目前尚无特效药物和治疗方法的“疑难”。而目前针对病毒性传染疾病主要采取的措施是注射疫苗、运用抗病毒药物等治疗方法。这两种方法都存在一定的缺陷，疫苗注射只是针对于某一种病毒有效，不具有广谱性，而运用抗病毒药物进行治疗也具有一定的局限性，它们可以抑制普通的病毒，但对有些病毒的抗性却不够理想，而且长期使用会产生耐药性。
[0003]研宄报道，多糖作为免疫增强剂可以提高传染性法氏囊炎病毒疫苗、新城疫疫苗的效果。海藻多糖已被发现具有多种生物学活性，目前已经公开报道的活性包括海藻多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血等活性，但对于海藻多糖作为免疫增强剂，尤其是其在预防和治疗禽流感病毒方面的用途还未见报道。相对于油乳剂全病毒灭活疫苗而言，海藻多糖具有原料来源丰富，生产成本低，制备工艺简单等若干优势，且其对动物体没有伤害，并同时具有提高动物免疫力、抗病毒、抗氧化、抗菌等功效。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种海藻多糖的应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种海藻多糖的应用，海藻多糖作为制备抗病毒或免疫的制剂。
[0007]所述海藻多糖作为制备抗畜禽养殖动物的病毒或其免疫的制剂。
[0008]所述海藻多糖作为制备抗禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒的制剂。
[0009]所述海藻多糖作为制备增强T细胞或脾淋巴细胞增殖及活性的增强制剂。
[0010]所述海藻多糖是从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖；
[0011]或，将从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖通过降解的方式获得的低分子量多糖或寡糖。
[0012]上述获得海藻多糖由单糖组成，主要为鼠李糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca和Mg，硫酸根含量在2% -40%之间，其中，粗糖分子量为400KDa-1000KDa，经降解后平均分子量在lKDa_400KDa范围内。
[0013]本发明具有的优点:
[0014]本发明中的海藻多糖均来源于大型经济海藻，原料来源丰富，生产成本低，并且海藻多糖属于绿色环保产品，长期使用不存在对养殖动物的伤害作用；通过细胞模型和体内动物实验表明，所得到的的海藻多糖具有明显的抗病毒作用和免疫增强作用，可以对多种病毒具有治疗效果，因此具有广谱性。
[0015]利用本发明中的海藻多糖直接作用于被病毒侵染的细胞、鸡胚，即可反映证明该海藻多糖具有抗病毒作用。按多糖浓度lmg/ml或0.2mg/ml使用，直接作用于细胞或鸡胚。海藻多糖可以显著抑制H9N2流感病毒及传染性法式囊炎B87病毒的活性，如血凝效价降低，病毒拷贝数降低，细胞因子表达升高等。
[0016]本发明海藻多糖调节动物体液免疫力(见实施例2)。以腹腔注射为方法，利用上述海藻多糖为原料，可验证该多糖对抗体反应的免疫调节作用。按动物(小型动物)体重比10mg/kg或50mg/kg使用。海藻多糖与禽流感病毒(AIV)灭活病毒混匀后，按正常免疫剂量，腹腔注射免疫动物。其特征在于:与疫苗相比，海藻多糖效果更好，如抗体水平提升显著，同时免疫调节作用明显。
[0017]同时海藻多糖也能够增强动物细胞免疫力的调节作用(见实施例3)。利用本发明中的海藻多糖与疫苗联合作用，即可证明该海藻多糖具有调节细胞介导的免疫反应的作用。按动物(小型动物)体重比10mg/kg或50mg/kg使用。海藻多糖与AIV灭活病毒混匀后，按正常免疫剂量，腹腔注射免疫动物。其特征在于:与疫苗相比，海藻多糖效果更好，如细胞因子产生水平提高，T淋巴细胞的分型提高，促进脾脏细胞生长活性等。
【附图说明】
[0018]图1为本发明实施例提供的多糖体外抗H9N2病毒血凝效价图，其中，星号表示和对照之间存在显著差异(以下同)。
[0019]图2为本发明实施例提供的多糖体外抗H9N2病毒H9N2相对表达量图。
[0020]图3为本发明实施例提供的多糖对病毒阻断作用相对细胞活性图。
[0021]图4为本发明实施例提供的多糖对病毒抑制作用相对细胞活性图。
[0022]图5为本发明实施例提供的多糖对病毒直接杀灭作用细胞活性图。
[0023]图6为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验存活率图。
[0024]图7为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验血凝效价图。
[0025]图8为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验细胞因子IL-4表达水平图。
[0026]图9为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验细胞因子IFN-γ表达水平图。
[0027]图10为本发明实施例提供的两次免疫后小鼠体内AIV特异性抗体含量图。
[0028]图11为本发明实施例提供的细胞因子IFN-Y含量图。
[0029]图12为本发明实施例提供的细胞因子IL-4含量图。
[0030]图13为本发明实施例提供的T淋巴细胞分型⑶3+⑶4+含量图。
[0031]图14为本发明实施例提供的T淋巴细胞分型⑶3+⑶8+含量图。
[0032]图15为本发明实施例提供的不同浓度海藻粗多糖对淋巴细胞增殖的影响图。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
[0034]分别以蜈蚣藻、孔石莼和马尾藻为例提取海藻多糖的:
[0035]取破碎后的蜈蚁藻(Grateloupia filicina) 100g，加入5000g蒸饱水，于100°C水浴中浸提2小时；分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得蜈蚣藻多糖，待用。
[0036]破碎后的孔石莼(Ulva Pertusa)加40倍的蒸馏水，于125°C水浴中浸提4小时；分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得孔石莼多糖，待用。
[0037]马尾藻(Sargassumqingdaoense) 10g 加入 3000g 蒸饱水，于 91°C水浴中浸提 4小时。分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得马尾藻多糖，待用。
[0038]分别以蜈蚣藻、孔石莼和马尾藻提取海藻多糖为例进一步获得低分子量的多糖或寡糖:
[0039]将上述分别获得不同藻的多糖(粗糖)用水分别配制0.1 %-4%水溶液，向其中依次加入盐酸终浓度为0-2mol/L和双氧水终浓度为1-10%，然后在功率为50-1000W的微波辅助下，以50-90°C降解5-60min，反应后溶液用碱液中和至中性，透析、浓缩、醇沉、离心收集沉淀，冷冻干燥即得平均分子量在lKDa-400KDa范围内各大型海藻中低分子量的海藻多糖或寡糖。
[0040]上述所得海藻多糖的单糖组成，主要为鼠李糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca和Mg，硫酸根含量在2% -40%之间。
[0041]实施例2
[0042]体外抗病毒实验
[0043]I)抗H9N2禽流感病毒
[0044]Madin-Darby canine kidney (MDCK)细胞于24孔细胞培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中长成单层后，弃掉培养液，用PBS冲洗两遍后接种H9N2病毒，吸附一小时后弃掉病毒，PBS冲洗两遍后加含有100ug/ml或20ug/ml的上述实施例获得海藻多糖及I %胎牛血清的DMEM培养基，阴性对照组不加多糖。37°C ,5% CO2环境中培养24h。取培养液测定血凝效价(Hemagglutinat1n test, HA)，冲洗两遍后提取细胞RNA，反转录之后通过荧光定量PCR检测H9N2表达量。实验表明，加入上述实施例获得海藻多糖后，H9N2的血凝效价有了一定的降低，而H9N2的表达量有显著降低。其中0.2mg/ml孔石药多糖及lmg/ml马尾藻多糖处理组的血凝效价均有显著降低，其余处理组也有一定降低，见附图1。在荧光定量PCR中，lmg/ml蜈蚣藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.26倍，0.2mg/ml的蜈蚣藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.20倍，说明蜈蚣藻多糖对H9N2病毒有非常明显的抑制作用孔石莼处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.40倍，0.2mg/ml的孔石莼处理组的H9N2表 达量为阴性对照组的0.23倍，说明孔石莼多糖对H9N2病毒具有明显的抑制作用马尾藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.64倍，0.2mg/ml的马尾藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.49倍，说明马尾藻多糖对H9N2病毒具有显著的抑制作用，见附图2。
[0045]2)抗传染性法氏囊炎B87病毒
[0046]按常规的方法将Vero细胞进行消化传代，细胞数调整到I X 16个/ml，加至96孔细胞培养板中，10ul/孔(每孔I X 15个),5% CO 2培养箱37°C培养24h，待细胞生长成单层后，测定上述实施例获得海藻多糖对于病毒的阻断作用、抑制作用和直接杀灭作用。
[0047]阻断作用:在安全浓度的基础上将上述实施例获得海藻多糖分别稀释成3个稀释度(lmg/ml，0.5mg/ml，0.2mg/ml)，加到长成单层Vero细胞的96孔细胞培养板上，10ul/孔，每个稀释度重复4孔。37°C作用4h，弃掉药液，每孔加入10TCID5ci病毒液100ul，37°C吸附1.5h，弃去病毒液，用PBS液洗2次，加入含I %胎牛血清的DMEM培养基，另设细胞对照和病毒对照组。37°C、5% CO2培养箱中培养48h后用MTT法测细胞活性。见附图3。
[0048]抑制作用:将10CID5ci病毒液接种至长成单层的Vero的96孔细胞培养板上，10ul/孔，37°C吸附1.5h，弃去病毒液，用PBS液洗2次，将上述实施例获得海藻多糖分别稀释成3个稀释度(lmg/ml，0.5mg/ml，0.2mg/ml)，10ul/孔，每个稀释度重复6孔，另设置细胞对照和病毒对照。37°C、5% CO2培养箱中培养48h后用MTT法测定细胞活性。结果表明，加入上述实施例获得海藻多糖后，细胞活性相比病毒对照组均有提高，但仍低于细胞对照组。见附图4。
[0049]直接杀灭作用:将上述实施例获得海藻多糖分别稀释成3个稀释度(lmg/ml，
0.5mg/ml，0.2mg/ml)，分别与等体积的10TCID5ci病毒液混合，37°C作用2h，加到长成单层的vero细胞的96孔细胞培养板上，10ul/孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照和病毒对照，37°C，5% CO2培养箱中培养48h后，记录方法同上。结果同样表现出多糖具有一定的直接杀灭病毒的作用。见附图5。
[0050]3)体内抗病毒作用
[0051]多糖能够促进鸡胚抵御病毒，以此为基础，将三种提取上述实施例获得海藻多糖(孔石莼多糖、马尾藻多糖和蜈蚣藻多糖)分别以10g/L、5g/L、lg/L三种不同浓度与禽流感H9N2病毒10EID5tl稀释液等量混合，在37°C孵育2h后，取上述实施例获得海藻多糖与病毒混和液，以生理盐水和病毒稀释液分别做阳性和阴性对照，接种于9-10日龄SPF鸡胚的尿囊腔，每只接种0.2ml，37°C培养72h，观察鸡胚存活情况；取尿囊液测血凝效价，提取RNA，测定细胞因子的表达水平。试验结果如下:马尾藻多糖在浓度为5m g/mL的情况下，活胚率最高，为80%，蜈蚣藻多糖在浓度为0.2mg/mL情况下活胚率最低，为40%，其它条件下活胚率为50%以上，明显好于病毒组，见附图6。血凝效价检测显示，0.2mg/mL孔石莼多糖处理组降低最为显著，降低3个滴度，其余处理组降低均在1-2个滴度，说明多糖有一定的抗病毒作用，见附图7。提取RNA，检测鸡胚中IL-4和IFN-Y的含量，结果表明三种多糖均能明显提高细胞因子的表达，其中马尾藻多糖在5mg/mL浓度中提高最明显，见附图8，9。其马尾藻多糖中多糖的抗病毒效果好于孔石莼多糖和蜈蚣藻。
[0052]实施例3动物免疫及体液免疫作用
[0053]多糖能够促进B细胞的增殖、分化，从而导致抗体的产生。以此为基础，将80只6周龄昆明小鼠随机分为8组，每组10只。以终浓度分别为10mg/kg和50mg/kg的蜈蚣藻、孔石莼、马尾藻多糖和H9N2禽流感灭活病毒混合后以腹腔接种的方式分别进行两次免疫，同时设两组对照组，单独注射PBS和灭活病毒，分别在两次免疫后14天，采血，分离血清。通过用酶联免疫吸附法测定血清AIV特异性抗体来评价海藻多糖对机体免疫功能的影响。通过该实验可以发现多糖能明显刺激特异性抗体的产生，且与剂量密切相关。见附图10。
[0054]实施例4细胞免疫试验
[0055]I)细胞免疫反应检测:
[0056]细胞免疫的表现形式有多种，其中细胞因子在免疫反应中起重要作用，可以调节多种反应。脾淋巴细胞增殖和T细胞亚型等也是细胞免疫反应的常用指标。
[0057]2)细胞因子检测:
[0058]采用ELISA方法，用试剂盒(Longtun，China)检测血清中IL-4和IFN- γ的含量。在对小鼠第二次免疫后14天，采血分离血清。按说明书操作。结果表明，海藻多糖能促进免疫相关细胞因子的分泌，且效果不同。对于IFN-γ，蜈蚣藻多糖、孔石莼多糖及马尾藻多糖的10mg/kg组的多糖效果均好于50mg/kg组，且处理组均显著高于疫苗对照组及PBS对照组，见附图11。而对于IL-4，50mg/kg蜈蚣藻多糖、孔石莼多糖及马尾藻多糖的效果均高于10mg/kg，且处理组均高于疫苗对照组和PBS对照组，见附图12。
[0059]3) T细胞分型检测:
[0060]采用三色法检测T细胞亚型。在第二次免疫后14天，采血。加入PE、FITC和PE_Cy5标记的CD3、CD4和CD8单抗(eB1science，USA)室温作用30分钟，在流氏细胞仪(BD，LSR)上分析细胞亚型。结果表明，海藻多糖能明显刺激T细胞的分化，且对⑶3+⑶4+诱导效果较为明显，蜈蚁藻多糖、孔石药多糖及马尾藻多糖浓度为50mg/kg时效果略高于10mg/kg，见附图13，14。
[0061]4)脾淋巴细胞增殖试验:
[0062]无菌分离小鼠脾脏淋巴细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基悬浮细胞，加多糖样品致终浓度分别为20ug/ml，100ug/ml，500ug/ml后培养，以CCK8细胞数目测定试剂盒测小鼠脾淋巴细胞的相对数量。结果表明，蜈蚣藻多糖浓度为20 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.5倍，并且当蜈蚣藻多糖的浓度为100 μ g/ml和500 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量比多糖浓度为20 μ g/ml时并没有明显差别。说明蜈蚣藻多糖具有非常好的免疫增强作用。孔石莼多糖浓度为20 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.4倍，并且当孔石莼多糖的浓度为100 μ g/ml和500 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.3倍。说明孔石莼多糖具有一定的免疫增强作用。马尾藻多糖浓度为20 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.6倍，当马尾藻多糖的浓度为100 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.9倍，当马尾藻多糖的浓度为500 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的2.5倍。说明马尾藻多糖具有非常好的免疫增强作用，且免疫增强效果随马尾藻浓度增加而增加。见附图15。
【主权项】
1.一种海藻多糖的应用，其特征在于:海藻多糖作为制备抗病毒或免疫的制剂。
2.按权利要求1所述的海藻多糖的应用，其特征在于:所述海藻多糖作为制备抗畜禽养殖动物的病毒或其免疫的制剂。
3.按权利要求2所述的海藻多糖的应用，其特征在于:所述海藻多糖作为制备抗禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒的制剂。
4.按权利要求2所述的海藻多糖的应用，其特征在于:所述海藻多糖作为制备增强T细胞或脾淋巴细胞增殖及活性的增强制剂。
5.按权利要求1所述的海藻多糖的应用，其特征在于:所述海藻多糖是从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖； 或，将从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖通过降解的方式获得的低分子量多糖或寡糖。
【专利摘要】本发明属于生物医学技术领域，具体是一种海藻多糖的应用。海藻多糖作为制备抗病毒或免疫的制剂。细胞模型和体内动物实验表明，海藻多糖能够显著提高动物免疫力，同时可促进细胞因子的产生，T淋巴细胞的分型和小鼠脾脏细胞的增殖，从而激活细胞免疫反应。本发明涉及的功能海藻多糖是从大型海藻海带、马尾藻、蜈蚣藻、麒麟菜、孔石莼、浒苔、龙须菜、泡叶藻、萱藻等海藻中提取得到的天然多糖，也可以是经不同制备方法将海藻多糖降解制得的低分子量海藻多糖或海藻寡糖。单种海藻的多糖提取物或多种海藻的多糖提取物混合物可以作为一种新型的抗病毒和免疫增强剂应用到畜禽、鱼虾贝饲料中，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61K36-02, A61P31-16, A61P31-12, A61P37-04
【公开号】CN104814985
【申请号】CN201510240673
【发明人】李鹏程, 宋琳, 陈晓琳, 邢荣娥, 刘松, 于华华, 秦玉坤, 李克成, 李荣峰, 王雪芹
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月13日
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学技术领域，具体是一种海藻多糖的应用。
【背景技术】
[0002]随着我国养殖业的飞速发展，特别是近年来集约化养殖业发展很快，目前，畜禽疾病防治也面临很多问题。畜禽传染病根据其病原特性大体可分为病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病、支原体病等。而病毒性疾病是目前尚无特效药物和治疗方法的“疑难”。而目前针对病毒性传染疾病主要采取的措施是注射疫苗、运用抗病毒药物等治疗方法。这两种方法都存在一定的缺陷，疫苗注射只是针对于某一种病毒有效，不具有广谱性，而运用抗病毒药物进行治疗也具有一定的局限性，它们可以抑制普通的病毒，但对有些病毒的抗性却不够理想，而且长期使用会产生耐药性。
[0003]研宄报道，多糖作为免疫增强剂可以提高传染性法氏囊炎病毒疫苗、新城疫疫苗的效果。海藻多糖已被发现具有多种生物学活性，目前已经公开报道的活性包括海藻多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血等活性，但对于海藻多糖作为免疫增强剂，尤其是其在预防和治疗禽流感病毒方面的用途还未见报道。相对于油乳剂全病毒灭活疫苗而言，海藻多糖具有原料来源丰富，生产成本低，制备工艺简单等若干优势，且其对动物体没有伤害，并同时具有提高动物免疫力、抗病毒、抗氧化、抗菌等功效。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种海藻多糖的应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种海藻多糖的应用，海藻多糖作为制备抗病毒或免疫的制剂。
[0007]所述海藻多糖作为制备抗畜禽养殖动物的病毒或其免疫的制剂。
[0008]所述海藻多糖作为制备抗禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒的制剂。
[0009]所述海藻多糖作为制备增强T细胞或脾淋巴细胞增殖及活性的增强制剂。
[0010]所述海藻多糖是从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖；
[0011]或，将从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖通过降解的方式获得的低分子量多糖或寡糖。
[0012]上述获得海藻多糖由单糖组成，主要为鼠李糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca和Mg，硫酸根含量在2% -40%之间，其中，粗糖分子量为400KDa-1000KDa，经降解后平均分子量在lKDa_400KDa范围内。
[0013]本发明具有的优点:
[0014]本发明中的海藻多糖均来源于大型经济海藻，原料来源丰富，生产成本低，并且海藻多糖属于绿色环保产品，长期使用不存在对养殖动物的伤害作用；通过细胞模型和体内动物实验表明，所得到的的海藻多糖具有明显的抗病毒作用和免疫增强作用，可以对多种病毒具有治疗效果，因此具有广谱性。
[0015]利用本发明中的海藻多糖直接作用于被病毒侵染的细胞、鸡胚，即可反映证明该海藻多糖具有抗病毒作用。按多糖浓度lmg/ml或0.2mg/ml使用，直接作用于细胞或鸡胚。海藻多糖可以显著抑制H9N2流感病毒及传染性法式囊炎B87病毒的活性，如血凝效价降低，病毒拷贝数降低，细胞因子表达升高等。
[0016]本发明海藻多糖调节动物体液免疫力(见实施例2)。以腹腔注射为方法，利用上述海藻多糖为原料，可验证该多糖对抗体反应的免疫调节作用。按动物(小型动物)体重比10mg/kg或50mg/kg使用。海藻多糖与禽流感病毒(AIV)灭活病毒混匀后，按正常免疫剂量，腹腔注射免疫动物。其特征在于:与疫苗相比，海藻多糖效果更好，如抗体水平提升显著，同时免疫调节作用明显。
[0017]同时海藻多糖也能够增强动物细胞免疫力的调节作用(见实施例3)。利用本发明中的海藻多糖与疫苗联合作用，即可证明该海藻多糖具有调节细胞介导的免疫反应的作用。按动物(小型动物)体重比10mg/kg或50mg/kg使用。海藻多糖与AIV灭活病毒混匀后，按正常免疫剂量，腹腔注射免疫动物。其特征在于:与疫苗相比，海藻多糖效果更好，如细胞因子产生水平提高，T淋巴细胞的分型提高，促进脾脏细胞生长活性等。
【附图说明】
[0018]图1为本发明实施例提供的多糖体外抗H9N2病毒血凝效价图，其中，星号表示和对照之间存在显著差异(以下同)。
[0019]图2为本发明实施例提供的多糖体外抗H9N2病毒H9N2相对表达量图。
[0020]图3为本发明实施例提供的多糖对病毒阻断作用相对细胞活性图。
[0021]图4为本发明实施例提供的多糖对病毒抑制作用相对细胞活性图。
[0022]图5为本发明实施例提供的多糖对病毒直接杀灭作用细胞活性图。
[0023]图6为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验存活率图。
[0024]图7为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验血凝效价图。
[0025]图8为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验细胞因子IL-4表达水平图。
[0026]图9为本发明实施例提供的鸡胚抗病毒实验细胞因子IFN-γ表达水平图。
[0027]图10为本发明实施例提供的两次免疫后小鼠体内AIV特异性抗体含量图。
[0028]图11为本发明实施例提供的细胞因子IFN-Y含量图。
[0029]图12为本发明实施例提供的细胞因子IL-4含量图。
[0030]图13为本发明实施例提供的T淋巴细胞分型⑶3+⑶4+含量图。
[0031]图14为本发明实施例提供的T淋巴细胞分型⑶3+⑶8+含量图。
[0032]图15为本发明实施例提供的不同浓度海藻粗多糖对淋巴细胞增殖的影响图。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
[0034]分别以蜈蚣藻、孔石莼和马尾藻为例提取海藻多糖的:
[0035]取破碎后的蜈蚁藻(Grateloupia filicina) 100g，加入5000g蒸饱水，于100°C水浴中浸提2小时；分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得蜈蚣藻多糖，待用。
[0036]破碎后的孔石莼(Ulva Pertusa)加40倍的蒸馏水，于125°C水浴中浸提4小时；分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得孔石莼多糖，待用。
[0037]马尾藻(Sargassumqingdaoense) 10g 加入 3000g 蒸饱水，于 91°C水浴中浸提 4小时。分别用100 0,200目和300目筛絹将滤渣滤出，滤液透析除盐后用减压浓缩设备进行浓缩为原体积的1/10，用4倍体积的95%的乙醇醇沉24小时，离心，沉淀冻干，即得马尾藻多糖，待用。
[0038]分别以蜈蚣藻、孔石莼和马尾藻提取海藻多糖为例进一步获得低分子量的多糖或寡糖:
[0039]将上述分别获得不同藻的多糖(粗糖)用水分别配制0.1 %-4%水溶液，向其中依次加入盐酸终浓度为0-2mol/L和双氧水终浓度为1-10%，然后在功率为50-1000W的微波辅助下，以50-90°C降解5-60min，反应后溶液用碱液中和至中性，透析、浓缩、醇沉、离心收集沉淀，冷冻干燥即得平均分子量在lKDa-400KDa范围内各大型海藻中低分子量的海藻多糖或寡糖。
[0040]上述所得海藻多糖的单糖组成，主要为鼠李糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、糖醛酸、蛋白质、K、Na、Ca和Mg，硫酸根含量在2% -40%之间。
[0041]实施例2
[0042]体外抗病毒实验
[0043]I)抗H9N2禽流感病毒
[0044]Madin-Darby canine kidney (MDCK)细胞于24孔细胞培养板上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中长成单层后，弃掉培养液，用PBS冲洗两遍后接种H9N2病毒，吸附一小时后弃掉病毒，PBS冲洗两遍后加含有100ug/ml或20ug/ml的上述实施例获得海藻多糖及I %胎牛血清的DMEM培养基，阴性对照组不加多糖。37°C ,5% CO2环境中培养24h。取培养液测定血凝效价(Hemagglutinat1n test, HA)，冲洗两遍后提取细胞RNA，反转录之后通过荧光定量PCR检测H9N2表达量。实验表明，加入上述实施例获得海藻多糖后，H9N2的血凝效价有了一定的降低，而H9N2的表达量有显著降低。其中0.2mg/ml孔石药多糖及lmg/ml马尾藻多糖处理组的血凝效价均有显著降低，其余处理组也有一定降低，见附图1。在荧光定量PCR中，lmg/ml蜈蚣藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.26倍，0.2mg/ml的蜈蚣藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.20倍，说明蜈蚣藻多糖对H9N2病毒有非常明显的抑制作用孔石莼处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.40倍，0.2mg/ml的孔石莼处理组的H9N2表 达量为阴性对照组的0.23倍，说明孔石莼多糖对H9N2病毒具有明显的抑制作用马尾藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.64倍，0.2mg/ml的马尾藻处理组的H9N2表达量为阴性对照组的0.49倍，说明马尾藻多糖对H9N2病毒具有显著的抑制作用，见附图2。
[0045]2)抗传染性法氏囊炎B87病毒
[0046]按常规的方法将Vero细胞进行消化传代，细胞数调整到I X 16个/ml，加至96孔细胞培养板中，10ul/孔(每孔I X 15个),5% CO 2培养箱37°C培养24h，待细胞生长成单层后，测定上述实施例获得海藻多糖对于病毒的阻断作用、抑制作用和直接杀灭作用。
[0047]阻断作用:在安全浓度的基础上将上述实施例获得海藻多糖分别稀释成3个稀释度(lmg/ml，0.5mg/ml，0.2mg/ml)，加到长成单层Vero细胞的96孔细胞培养板上，10ul/孔，每个稀释度重复4孔。37°C作用4h，弃掉药液，每孔加入10TCID5ci病毒液100ul，37°C吸附1.5h，弃去病毒液，用PBS液洗2次，加入含I %胎牛血清的DMEM培养基，另设细胞对照和病毒对照组。37°C、5% CO2培养箱中培养48h后用MTT法测细胞活性。见附图3。
[0048]抑制作用:将10CID5ci病毒液接种至长成单层的Vero的96孔细胞培养板上，10ul/孔，37°C吸附1.5h，弃去病毒液，用PBS液洗2次，将上述实施例获得海藻多糖分别稀释成3个稀释度(lmg/ml，0.5mg/ml，0.2mg/ml)，10ul/孔，每个稀释度重复6孔，另设置细胞对照和病毒对照。37°C、5% CO2培养箱中培养48h后用MTT法测定细胞活性。结果表明，加入上述实施例获得海藻多糖后，细胞活性相比病毒对照组均有提高，但仍低于细胞对照组。见附图4。
[0049]直接杀灭作用:将上述实施例获得海藻多糖分别稀释成3个稀释度(lmg/ml，
0.5mg/ml，0.2mg/ml)，分别与等体积的10TCID5ci病毒液混合，37°C作用2h，加到长成单层的vero细胞的96孔细胞培养板上，10ul/孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照和病毒对照，37°C，5% CO2培养箱中培养48h后，记录方法同上。结果同样表现出多糖具有一定的直接杀灭病毒的作用。见附图5。
[0050]3)体内抗病毒作用
[0051]多糖能够促进鸡胚抵御病毒，以此为基础，将三种提取上述实施例获得海藻多糖(孔石莼多糖、马尾藻多糖和蜈蚣藻多糖)分别以10g/L、5g/L、lg/L三种不同浓度与禽流感H9N2病毒10EID5tl稀释液等量混合，在37°C孵育2h后，取上述实施例获得海藻多糖与病毒混和液，以生理盐水和病毒稀释液分别做阳性和阴性对照，接种于9-10日龄SPF鸡胚的尿囊腔，每只接种0.2ml，37°C培养72h，观察鸡胚存活情况；取尿囊液测血凝效价，提取RNA，测定细胞因子的表达水平。试验结果如下:马尾藻多糖在浓度为5m g/mL的情况下，活胚率最高，为80%，蜈蚣藻多糖在浓度为0.2mg/mL情况下活胚率最低，为40%，其它条件下活胚率为50%以上，明显好于病毒组，见附图6。血凝效价检测显示，0.2mg/mL孔石莼多糖处理组降低最为显著，降低3个滴度，其余处理组降低均在1-2个滴度，说明多糖有一定的抗病毒作用，见附图7。提取RNA，检测鸡胚中IL-4和IFN-Y的含量，结果表明三种多糖均能明显提高细胞因子的表达，其中马尾藻多糖在5mg/mL浓度中提高最明显，见附图8，9。其马尾藻多糖中多糖的抗病毒效果好于孔石莼多糖和蜈蚣藻。
[0052]实施例3动物免疫及体液免疫作用
[0053]多糖能够促进B细胞的增殖、分化，从而导致抗体的产生。以此为基础，将80只6周龄昆明小鼠随机分为8组，每组10只。以终浓度分别为10mg/kg和50mg/kg的蜈蚣藻、孔石莼、马尾藻多糖和H9N2禽流感灭活病毒混合后以腹腔接种的方式分别进行两次免疫，同时设两组对照组，单独注射PBS和灭活病毒，分别在两次免疫后14天，采血，分离血清。通过用酶联免疫吸附法测定血清AIV特异性抗体来评价海藻多糖对机体免疫功能的影响。通过该实验可以发现多糖能明显刺激特异性抗体的产生，且与剂量密切相关。见附图10。
[0054]实施例4细胞免疫试验
[0055]I)细胞免疫反应检测:
[0056]细胞免疫的表现形式有多种，其中细胞因子在免疫反应中起重要作用，可以调节多种反应。脾淋巴细胞增殖和T细胞亚型等也是细胞免疫反应的常用指标。
[0057]2)细胞因子检测:
[0058]采用ELISA方法，用试剂盒(Longtun，China)检测血清中IL-4和IFN- γ的含量。在对小鼠第二次免疫后14天，采血分离血清。按说明书操作。结果表明，海藻多糖能促进免疫相关细胞因子的分泌，且效果不同。对于IFN-γ，蜈蚣藻多糖、孔石莼多糖及马尾藻多糖的10mg/kg组的多糖效果均好于50mg/kg组，且处理组均显著高于疫苗对照组及PBS对照组，见附图11。而对于IL-4，50mg/kg蜈蚣藻多糖、孔石莼多糖及马尾藻多糖的效果均高于10mg/kg，且处理组均高于疫苗对照组和PBS对照组，见附图12。
[0059]3) T细胞分型检测:
[0060]采用三色法检测T细胞亚型。在第二次免疫后14天，采血。加入PE、FITC和PE_Cy5标记的CD3、CD4和CD8单抗(eB1science，USA)室温作用30分钟，在流氏细胞仪(BD，LSR)上分析细胞亚型。结果表明，海藻多糖能明显刺激T细胞的分化，且对⑶3+⑶4+诱导效果较为明显，蜈蚁藻多糖、孔石药多糖及马尾藻多糖浓度为50mg/kg时效果略高于10mg/kg，见附图13，14。
[0061]4)脾淋巴细胞增殖试验:
[0062]无菌分离小鼠脾脏淋巴细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基悬浮细胞，加多糖样品致终浓度分别为20ug/ml，100ug/ml，500ug/ml后培养，以CCK8细胞数目测定试剂盒测小鼠脾淋巴细胞的相对数量。结果表明，蜈蚣藻多糖浓度为20 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.5倍，并且当蜈蚣藻多糖的浓度为100 μ g/ml和500 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量比多糖浓度为20 μ g/ml时并没有明显差别。说明蜈蚣藻多糖具有非常好的免疫增强作用。孔石莼多糖浓度为20 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.4倍，并且当孔石莼多糖的浓度为100 μ g/ml和500 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.3倍。说明孔石莼多糖具有一定的免疫增强作用。马尾藻多糖浓度为20 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.6倍，当马尾藻多糖的浓度为100 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的1.9倍，当马尾藻多糖的浓度为500 μ g/ml时，小鼠脾淋巴细胞的数量为对照组的2.5倍。说明马尾藻多糖具有非常好的免疫增强作用，且免疫增强效果随马尾藻浓度增加而增加。见附图15。
【主权项】
1.一种海藻多糖的应用，其特征在于:海藻多糖作为制备抗病毒或免疫的制剂。
2.按权利要求1所述的海藻多糖的应用，其特征在于:所述海藻多糖作为制备抗畜禽养殖动物的病毒或其免疫的制剂。
3.按权利要求2所述的海藻多糖的应用，其特征在于:所述海藻多糖作为制备抗禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊炎病毒、传染性支气管炎病毒或轮状病毒的制剂。
4.按权利要求2所述的海藻多糖的应用，其特征在于:所述海藻多糖作为制备增强T细胞或脾淋巴细胞增殖及活性的增强制剂。
5.按权利要求1所述的海藻多糖的应用，其特征在于:所述海藻多糖是从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖； 或，将从海带、马尾藻、裙带菜、泡叶藻、墨角藻、蜈蚣藻、麒麟菜、龙须菜、江蓠、石花菜、琼脂、萱藻、浒苔和孔石莼中的一种或几种大型海藻中提取的粗多糖通过降解的方式获得的低分子量多糖或寡糖。
【专利摘要】本发明属于生物医学技术领域，具体是一种海藻多糖的应用。海藻多糖作为制备抗病毒或免疫的制剂。细胞模型和体内动物实验表明，海藻多糖能够显著提高动物免疫力，同时可促进细胞因子的产生，T淋巴细胞的分型和小鼠脾脏细胞的增殖，从而激活细胞免疫反应。本发明涉及的功能海藻多糖是从大型海藻海带、马尾藻、蜈蚣藻、麒麟菜、孔石莼、浒苔、龙须菜、泡叶藻、萱藻等海藻中提取得到的天然多糖，也可以是经不同制备方法将海藻多糖降解制得的低分子量海藻多糖或海藻寡糖。单种海藻的多糖提取物或多种海藻的多糖提取物混合物可以作为一种新型的抗病毒和免疫增强剂应用到畜禽、鱼虾贝饲料中，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】A61K36-02, A61P31-16, A61P31-12, A61P37-04
【公开号】CN104814985
【申请号】CN201510240673
【发明人】李鹏程, 宋琳, 陈晓琳, 邢荣娥, 刘松, 于华华, 秦玉坤, 李克成, 李荣峰, 王雪芹
【申请人】中国科学院海洋研究所
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月13日
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