一种肉桂提取物的制备方法及对白血病k562细胞的作用
一种肉桂提取物的制备方法及对白血病k562细胞的作用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学技术领域，涉及一种肉桂提取物的制备方法及对白血病K562细 胞的作用。
【背景技术】
[0002] 三阳血傣因治疗肿瘤具有良效和埃及卫生部有国际合作研宄[1]，其中所用到的 肉桂是属于樟科家族的常绿乔木的外皮，含有多种活性成分如精油（肉桂醛，肉桂醛），鞣 质，粘液和碳水化合物。近年来，全世界对肉桂的药用功效已有很多研宄，肉桂的另一种水 溶性成分，MHCP(甲基羟查耳酮聚合物），最近被认为对胰岛素模拟物的性能有影响[2]。美 国农业部的研宄人员使用肉桂作用于淋巴瘤，惊人的是在24小时内肉桂通过中断细胞的 G2/M期来使细胞停止增殖，这意味着有丝分裂（细胞分裂）被终止，尽管在细胞周期的合 成期（S)不是这样。但是肉桂可能是通过抑制细胞的某些可促进有丝分裂的磷酸酶[3]， 因此，研宄这些致病因素，针对可能有助于预防白血病的关键来实现。在以前的报告中有报 道，肉桂提取物具有抗肿瘤作用，也具有通过抑制NFkappaB的APl和小鼠黑色素瘤模型联 系起来来增强促凋亡活性[4]。
[0003] 近年来，利用人结肠癌上皮细胞Caco-2模型在药物研宄方面因其特殊的结构和 生理生化作用取得了令人鼓舞的进展。该细胞单层模型和人体小肠上皮细胞相类似。采用 中药经transwell转运池 Caco-2细胞模型吸收转运后的过滤液作用于研宄的白血病细胞， 可替代中药血清学方法，更能体现中药在体内的真正作用情形。
【发明内容】
[0004] 本发明揭示肉桂提取物对白血病K562细胞的作用。
[0005] 肉桂提取物的制备方法按照以下步骤：
[0006] 步骤1 :肉桂的干燥粉末，用乙醇：水为80:20作为溶剂，萃取三次；
[0007] 步骤2 :减压回流除去溶剂后，得到残余物；
[0008] 步骤3 :将残余物溶解在丙酮中，过滤，将丙酮溶液在真空中蒸发得到的丙酮可 溶提取物，将其悬浮在水中；
[0009] 步骤4 :然后用石油醚和EtOAc利用沸点不同进行分离，得到水溶性提取物；
[0010] 步骤5 :水溶性提取物经硅胶柱层析，用氯仿：甲醇：水为80:20:2. 5得到肉桂提 取物。
【附图说明】
[0011] 图 lA(-)-(7，S，8S，8，R)-4,4，-dihydroxy-3,3，，5,5，
[0012] -tetramethoxy-7' ，9-epoxylignan_9' -〇l_7-〇ne ;
[0013] 图 IB(_)-Iyoniresinol 3 a-〇-β-d
[0014] -glucopyranoside ；
[0015] 图 1C3, 4, 5-trimethoxyphenolβ _d - apiofuranosyl(I - 6)-β _d
[0016] -glucopyranoside ；
[0017] 图2Α扫描电子显微镜15000 X ;
[0018] 图2B扫描电子显微镜3000 X ;
[0019] 图2C透射电子显微镜20000 X ;
[0020] 图3A普萘洛尔标准品；
[0021] 图3B普萘洛尔经transwell吸收；
[0022] 图3C阿替洛尔标准品；
[0023] 图3D阿替洛尔经transwell吸收；
[0024] 图4A:肉桂提取物A标准品；
[0025] 图4B:经transwell吸收的附子提取物肉桂提取物A ;
[0026] 图4C:肉桂提取物B标准品；
[0027] 图4D :经transwell吸收的附子提取物肉桂提取物B ;
[0028] 图4E:肉桂提取物C标准品；
[0029] 图4F:经transwell吸收的附子提取物肉桂提取物C ;
[0030] 图5A:肉桂提取物A;
[0031] 图5B:肉桂提取物B;
[0032] 图5C:肉桂提取物C;
[0033] 图6A阴性对照组的K562细胞；
[0034] 图6B50 μ M肉桂提取物A作用K562细胞72h ;
[0035] 图6C50 μ M肉桂提取物B作用K562细胞72h ;
[0036] 图6D50 μ M肉桂提取物C作用K562细胞72h ;
[0037] 图7K562细胞系各阶段细胞周期分布和DNA含量分析；
[0038] 图850 μ M和75 μ M肉桂提取物A, B，C作用K562细胞72h对细胞周期的影响；
[0039] 图9A肉桂提取物作用K562细胞72h对细胞凋亡的影响，阴性组；
[0040] 图9B肉桂提取物作用K562细胞72h对细胞凋亡的影响，50 μ M肉桂提取物；
[0041] 图9C肉桂提取物作用Κ562细胞72h对细胞凋亡的影响，75 μ M肉桂提取物；
[0042] 图10Α:Κ562细胞分化抗原图，PE-CD36 ;
[0043] 图 10Β:Κ562 细胞分化抗原图，FITC-CD13 ;
[0044] 图 10C:K562 细胞分化抗原图，FITC-CD33 ;
[0045] 图 10D:K562 细胞分化抗原图，PE-CD235a ;
[0046] 图 10E:K562 细胞分化抗原图，FITC-CD61 ;
[0047] 图10F:K562细胞分化抗原图，PE-CD41 ;
[0048] 图10G:K562细胞分化抗原图，PE-CD34 ;
[0049] 图 10H:K562 细胞分化抗原图，FITC-CD38。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0051] 本发明肉桂提取物的制备方法为：
[0052] 肉桂（50公斤）的干燥粉末，用乙醇-水（80:20) (3X 90升）萃取三次，减压回流 除去溶剂后，得到残余物（7.5千克）。将残余物溶解在丙酮中，过滤，将丙酮溶液在真空中 蒸发得到的丙酮可溶提取物（5. 0千克），将其悬浮在水中，然后用石油醚和EtOAc利用沸点 不同进行分离。水溶性提取物（1.5千克）经硅胶柱层析（CC) (20X120厘米，7.5公斤）， 用氯仿：甲醇：水（80:20:2. 5,25L，V/V(体积比））得到三个组分，A-C。
[0053] 馏分八(3.1克）适用于1^-180：(3.0\3.0厘米的806)洗脱梯度，用甲醇水溶液 (10:90, 30:70, 50:50, 70:30,90:10,1L，每次，V/V (体积比）），得到两种馏分，Al 和 A2。组分 A2 (1 克）进行MCI 凝胶 CHP20P CC (2. 0 X 50 厘米，100 克）纯化，用 Me0H/H20 (30:70,40:60， 50:50,60:40, 70:30,80:20, 700 毫升，每次，V/V)，得到 3 馏分，A2A-A2C。组分 A2C (300 毫 克）通过制备！1(：纯化，用01(：13/^6〇!1(11:1，100毫升，￥/￥)，得到化合物4(19.7毫克） 纯化。
[0054] 馏分B (155克）进行交联葡聚糖LH-20CC (6. OX 125厘米，500克）（MeOH)纯化，得 到两部分，Bl和B2。馏分Bl (5.2克），用RP-18CC (3. OX 50厘米，200克）纯化，用MeOH/ !120(10:90,30:70,50:50,70:30,90:10，1升，体积/体积），提供了三个组分，组分813-81(：。 组分Blb的（462毫克）通过制备TLC纯化，用CHC13/Me0H/H20 (3:1:0. 05, 200毫升，体积/ 体积/体积），得到B (3. 9毫克）洗脱。组分BlC (240毫克）通过制备TLC纯化，用CHC13/ Me0H/H20 (6:1:0. 05,150毫升，体积/体积/体积），得到化合物C (42. 8毫克）洗脱。
[0055] 图1中的A、B、C表达了三种肉桂提取物的结构。其中，
[0056] A:已知的成分鉴定如下（-)-(7' S, 8S, 8' R)_4, 4' -dihydroxy-3, 3'，5, 5'
[0057] -tetramethoxy-7' ，9-epoxylignan_9' -〇l_7-〇ne[5]〇
[0058] B: (_)-Iyoniresinol 3 a-〇-β-d
[0059] -glucopyranoside[6]〇
[0060] C:3, 4, 5-trimethoxyphenolβ _d - apiofuranosyl(I - 6)-β _d
[0061] -glucopyranoside[7]〇
[0062] 本发明肉桂提取物对于白血病K562细胞的作用：
[0063] 细胞培养
[0064] 将白血病Κ562细胞株接种到含10 %胎牛血清（Fetal calf serum，FBS)中，添加 100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素到RPMI-1640培养液中，在37°C含5% CO2的培养箱内 将细胞培养传代。每2-3天换液1次，所有实验均在细胞生长的对数期内进行。
[0065] Transwell转运池细胞培养法的建立
[0066] 将0&(3〇-2细胞接种于含10%胎牛血清、10(^/1111青霉素和100^8/1111链霉素的 DMEM培养液中，在37°C含5% 0)2的培养箱内培养。如果细胞已长满（汇合达80-90% )， 即可进行传代培养。当Caco-2细胞达到80%汇合时，将细胞消化记数，用DMEM-10稀释至 1.0 X 105-2· 5X 105/ml。将I. 5ml的已充分混合的细胞悬浮液加入transwell的顶端绒毛 面，将2. 6ml的DMEM-10完全培养基加入底端基底面。而后将transwell放入37°C含5% 〇)2的培养箱内培养。每隔一天换液一次，直至第21天，测定培养21天的Caco-2细胞单 层的电阻值，每孔均大于500 Ω/cm2,表明其具有足够的紧密连接和完整性。可用来进行药 物吸收和转运机制的试验研宄。
[0067] 肉桂提取物对Caco-2细胞的毒性
[0068] 取对数生长期Caco-2细胞，0. 25%胰酶消化，制成4X IO4Ail的单细胞悬液，接种 于96孔培养板，200 μ 1/孔，培养24h，吸净培养液，分别加入8个浓度梯度的肉桂提取物， 经0.22 μ m滤膜过滤除菌，溶解到Hanks平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution， HBSS)中（0、50、100、200、400、600、800、1000 μ g/ml)，并设空白对照为细胞加入到 HBSS 中。 孵育2h后加入MTT (5mg/ml)，20 μ 1/孔。培养4h后，去上清液，加入DMS0150 μ 1/孔，摇床 振荡lOmin，使结晶物充分溶解。酶标仪测波长490nm处光密度（Optical density，0D)值 [8]，计算肉桂提取物对Caco-2细胞的生长抑制率。
[0069] 选择细胞存活率大于80 %的药物浓度作为无毒浓度进行下一步细胞实验。
[0070] 抑制率=(空白组A值-实验组A值）/空白组A值X 100%。
[0071] 注：空白组A值=只加 HBSS的Caco-2细胞悬浮液经上述处理后用490nm滤光片 在酶标仪上测定的吸光度。
[0072] 实验组A值=将药物溶解在HBSS的Caco-2细胞悬浮液经上述处理后用490nm滤 光片在酶标仪上测定的吸光度。
[0073] 中药提取物经Transwell转运池
[0074] 取6孔transwell板将Caco-2细胞接种在上面，分别在第3d和第14d用HBSS 洗聚碳酯膜上的单层细胞2次，随后用4. 9mmol/L的钙，镁和含0. 5 % Triton- 100磷酸 盐缓冲溶液溶解细胞，放置冰上孵育lh，以15000r/min离心10min，取细胞上清液，使 用AKP试剂盒测定Caco-2细胞的AKP活性。在transwe11的AP侧加入体积为0. 5ml， 0. lmmol/1普萘洛尔和lmmol/1阿替洛尔的HBSS溶液，BL侧加入HBSS的体积为I. 5ml， 在37°C水中振摇温育lh，收集BL侧溶液，HPLC测转运量，计算表观渗透系数（Apparent permeabilitycoefficient，Papp) [10]。Papp = dQ/dtXl/60Xl/C。。Papp 单位为 cm/ s。上式中，Q是积累转运量（cumulative amount oftransport)，代表化合物在接收端 (receiver)出现的总量，单位为μ g (在计算时需要累加上取样时取走的化合物的量）； dQ/dt是速率，单位为yg/min;^!是化合物在给予端（donor)的初始浓度，单位为yg/L;A 是聚碳醋膜的表面积，单位为cm2。Caco-2细胞单层细胞模型成功建立后，取出transwell， 小心吸弃原培养基，用HBSS轻轻漂洗一遍，加入已过滤除菌的HBSS缓冲盐溶液，测各孔电 阻值，TEER = (Rs-Rb) X4. 67cm2,当T > 150时，该穴可用。弃去上穴吸收池内缓冲液，加入 1.5ml已配好的样品液肉桂提取物和附子提取物（无菌HBSS配制），置二氧化碳培养箱中 作用2小时。2小时后，各孔下穴的全部样品液分别用青霉素小瓶盛装，作好标记。膜完整 性检测，样品全部取出后再加入HBSS缓冲盐溶液，测其电阻，以检测细胞单层膜药物作用 后是否完整。如果完整，则可将下穴的全部样品液汇集，浓缩，待上高效液相色谱仪检测。
[0075] 肉桂提取物的高效液相色谱检测
[0076] 色谱柱：250mmX4. 6mm i. d.，5 μ m, Zorbax SB-C18 柱。检测波长：310nm ;柱温： 40°C;流动相：甲醇-水（60 : 45);流速流动相A为甲醇，流动相B为水。供 试品为提取好的肉桂的有效成分〇.〇〇l〇g，溶解于10ml HBSS溶液于IOml比色皿中。超声 IOmin助溶。供试品溶液是肉桂提取物A，B，C溶解在流动相中。经0. 2 ym微孔滤膜滤过 后，分别取10 μ 1样品进样分析。在上述条件下，供试品溶液中的肉桂色谱峰分离良好，峰 形对称，理论塔板数以肉桂提取物单体的峰计不低于2000。
[0077] MTT法测定中药标准品对Κ562细胞增殖作用的抑制
[0078] 将稀释好的K562细胞悬液以1.0XlOVml的浓度接种于96孔培养板中，每孔 100 μ 1。96孔周围用200 μ IPBS填充。分别加入配成5组不同浓度肉桂提取物A，B，C的药 物培养液5 μ M，10 μ M，25 μ M，50 μ M，75 μ M，100 μ M K562细胞。同时也设空白对照组。每种 浓度均行五个平行复孔，置37°C、5% 0)2培养箱培养内分别孵育24h，48h，72h。实验结束前 4h于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ml的MTT溶液20 μ 1，4h，终止培养。 将96孔培养板以3000rpm离心10min，弃去上孔培养液，每孔加 DMS0150 μ 1，震荡lOmin，使 结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值（A)， 以A值间接反映活细胞数量，计算不同浓度肉桂提取物A，B，C作用K562细胞不同时间的抑 制率。记录结果。实验重复3次。
[0079] 细胞抑制率％ = A对照-A处理/A对照X 100 %
[0080] 肉桂提取物A, B，C作用K562细胞
[0081] 收集对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为IXlOVml，用肉桂提取物终浓度 为50以 8/1111、75以8/1111，作用1(562细胞7211。同时设立对照组。分别收集细胞。实验重复 3次。
[0082] 透射电子显微镜（TEM)标本制作步骤及观察
[0083] 透射电子显微镜参照早期研宄的步骤进行操作[11]。50 μΜ肉桂提取物A，B，C和 对照组分别用4%多聚甲醛和2%戊二醛的0.1 M磷酸钠缓冲液（pH7. 4)在室温温度（24°C) 作用4h。其次将组织片在0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4)中洗涤，然后将它们放置在2%四 氧化锇的0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4)中，在室温下作用2小时。用无水乙醇处理，随后在 60°C条件下的Epon812嵌入聚合48小时。使用ULTRA⑶T超切片机（莱卡微系统有限公 司，韦茨拉尔，德国）超薄切片（50-70纳米），过200目筛网。用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对 切片进行双重染色，然后在80千伏（FEI公司，希尔斯伯勒，0R，美国）配备的SIS米加视图 II C⑶照相机的FEI的Tecnai-12双透射电子显微镜下进行分析。
[0084] K562细胞表面分化抗原检测
[0085] 流式细胞仪参照早期研宄的步骤进行操作[12]。将浓度为50 μΜ、75 μM的肉桂 提取物A, B，C分别诱导72h及阴性对照组Κ562细胞，取收集的Κ562,用生理盐水洗涤后用 PBS液调整细胞浓度为l〇7ml，再取50 μ 1细胞悬液，分别加入⑶235a，⑶36,⑶41，⑶61， ⑶13,⑶33,⑶14,⑶34,⑶38单克隆荧光抗体，室温孵育30min，用PBS液洗去未结合的抗 体。以侧向角散射光（Side scatter，SSC)强度为横坐标和细胞结合⑶45荧光强度为纵坐 标设门，用流式细胞仪分别测定相应抗体荧光强度，每组分析5000个细胞，数据经FCM所带 软件处理后计算出相应表型阳性细胞百分率。实验重复3次。
[0086] K562细胞周期检测
[0087] 流式细胞仪参照早期研宄的步骤进行操作[12]，流式细胞周期分析参照早期研宄 文献[13]。将浓度为50 μΜ、75 μΜ的肉桂提取物A, B，C分别诱导72h及阴性对照组K562 细胞离心后，制成单细胞悬液，1300rpmin离心5min，弃去培养液用4°C预冷的PBS洗1次， 离心弃去PBS，加入100-150 μ I PBS制成单细胞悬液，吸取细胞悬液迅速吹入70 %预冷 的乙醇中振荡混匀，4°C冰箱固定过夜。离心弃去固定液，用ImlPBS重悬，离心，弃去上清， 加 Iml PBS，吹打均匀，过300目筛网。细胞计数。将细胞调成l〇7ml单细胞悬液。离心细 胞，去上清。加入核糖核酸酶A(RibonucleaseA，RnaseA酶）（工作浓度20 μ g/ml)，体积为 500 μ I，酶溶于PBS中，室温避光孵育30min。提前准备好冰水混合物，将避光孵育的细胞悬 液冰浴l-2min。终止酶的作用。离心，除去上清。加入碘化丙啶（Propidium iodide，PI) (工作浓度50 μ g/ml)，体积为500 μ 1，酶溶于PBS中，室温避光孵育30min后上机检测。实 验重复3次。
[0088] K562细胞凋亡检测
[0089] 流式细胞仪参照早期研宄的步骤进行操作[12]。将浓度为50 μ Μ、75 μ M的肉桂提 取物A，B，C分别诱导72h及阴性对照组Κ562细胞离心后，制成单细胞悬液，用PBS洗二次， 收集1-5X IO5个细胞。在细胞中加入500 μ 1的Binding buffer (固定液）混匀。其中样 本管和阴性管均加。样本管加入5μ1 Annexin V-FITC混匀后，加入5μ1 PI混匀。室温 避光反应5-15min。在1小时内，进行流式细胞仪的检测。实验重复3次。
[0090] 数据统计和分析
[0091] 计量资料以均数土标准差（歹土S:)表示，组间比较采用完全随机设计的方差分 析，组内比较采用重复测量资料的方差分析，差异有统计学意义行SNK-q检验。用SPSS11. 5 软件进行统计学处理，F〈0.05为差异有统计学意义。
[0092] 结果
[0093] 系统适用性试验
[0094] AKP是小肠表皮刷状缘细胞的标志酶。Caco-2细胞生长到一定阶段后，可通过测 定Caco-2细胞的酶活性对其分化的生物化学特性进行初步判断。本实验中，Caco-2细胞在 接种第3d，细胞未完全汇合时，不能水解AKP底物对硝基苯磷酸盐，使其生成对硝基苯酚， 显示没有AKP活性，而在接种第14d，能够水解对硝基苯磷酸盐生成对硝基苯酚，具有AKP 活性，显示Caco-2细胞在第14d已经基本分化完成，具备药物转运需要的各种载体和酶。 Caco-2细胞单层的顶侧的微绒毛特性如下（图2)，其中，A:扫描电子显微镜15000X。B: 扫描电子显微镜3000X。C:透射电子显微镜20000X。本实验采用国际公认在Caco-2细 胞单层吸收良好的普萘洛尔和吸收不好的阿替洛尔为对照物，得出两者在Caco-2细胞单 层的Papp值分别为2. 54X l(T5Cm/S和3. 35X KTcm/s，与文献[11]值基本相符，表明其具 有良好的完整性与转运能力。通过高效液相色谱法检测到普萘洛尔和阿替洛尔通过Caco-2 细胞单层吸收模型（图3)，其中，A:普萘洛尔标准品；B:普萘洛尔经transwell吸收；C:阿 替洛尔标准品；D:阿替洛尔经transwell吸收。
[0095] 细胞毒性试验结果
[0096] 利用酶标仪测定96孔板空白对照和加入肉桂的HBSS溶液后的吸收度A值，并计 算其对Caco-2细胞的抑制率，结果见表1。
[0097] 由表1可知，Caco-2细胞抑制率随着肉桂的浓度增加而增加，当浓度低于IOOyg/ ml时，肉桂的抑制率小于20%，因此，在细胞膜转运实验中选择的浓度为100 μ g/ml可认为 无细胞毒性。
[0098] 对于Caco-2细胞，细胞毒性均随肉桂浓度增大而增强，实验结果显示肉桂浓度高 于200 μ g/ml时，细胞毒性增大，而存活率低于（58. 35±13. 36) % ; 100 μ g/ml浓度与阴性 对照组比较均无显著性差异，细胞存活率在80%以上。而浓度为50 μ g/ml，100 μ g/ml经过 Cac〇-2transwell吸收模型的中药含量降低，需要多次试验。
[0099] 表1肉桂的细胞毒实验结果（η = 3) (I 土S) (% )
[0100]
【主权项】
1. 肉桂提取物对白血病K562细胞的作用。
2. 按照权利要求1所述肉桂提取物对白血病K562细胞的作用，其特征在于：所述肉桂 提取物的制备方法按照以下步骤： 步骤1 :肉桂的干燥粉末，用乙醇：水为80:20作为溶剂，萃取三次； 步骤2 :减压回流除去溶剂后，得到残余物； 步骤3 :将残余物溶解在丙酮中，过滤，将丙酮溶液在真空中蒸发得到的丙酮可溶提取 物，将其悬浮在水中； 步骤4 :然后用石油醚和EtOAc利用沸点不同进行分离，得到水溶性提取物； 步骤5 :水溶性提取物经硅胶柱层析，用氯仿：甲醇：水为80:20:2. 5得到肉桂提取物。
【专利摘要】一种肉桂提取物的制备方法及对白血病K562细胞的作用。本发明公开了肉桂提取物对白血病K562细胞的作用。肉桂提取物的制备方法按照以下步骤：步骤1：肉桂的干燥粉末，用乙醇：水为80:20作为溶剂，萃取三次；步骤2：减压回流除去溶剂后，得到残余物；步骤3：将残余物溶解在丙酮中，过滤，将丙酮溶液在真空中蒸发得到的丙酮可溶提取物，将其悬浮在水中；步骤4：然后用石油醚和EtOAc利用沸点不同进行分离，得到水溶性提取物；步骤5：水溶性提取物经硅胶柱层析，用氯仿：甲醇：水为80:20:2.5得到肉桂提取物。通过Annexin V/PI染色法测定细胞凋亡变化。肉桂提取物A,B,C作用K562细胞72h后凋亡率明显增加。
【IPC分类】A61P35-02, A61K36-54
【公开号】CN104815000
【申请号】CN201510051319
【发明人】杨同华, 关心, 刘阳, 欧阳红梅, 蒋雅先, 朱红艳, 胡芃, 杨艳梅, 赖洵, 张海溪
【申请人】云南省第一人民医院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年1月31日
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学技术领域，涉及一种肉桂提取物的制备方法及对白血病K562细 胞的作用。
【背景技术】
[0002] 三阳血傣因治疗肿瘤具有良效和埃及卫生部有国际合作研宄[1]，其中所用到的 肉桂是属于樟科家族的常绿乔木的外皮，含有多种活性成分如精油（肉桂醛，肉桂醛），鞣 质，粘液和碳水化合物。近年来，全世界对肉桂的药用功效已有很多研宄，肉桂的另一种水 溶性成分，MHCP(甲基羟查耳酮聚合物），最近被认为对胰岛素模拟物的性能有影响[2]。美 国农业部的研宄人员使用肉桂作用于淋巴瘤，惊人的是在24小时内肉桂通过中断细胞的 G2/M期来使细胞停止增殖，这意味着有丝分裂（细胞分裂）被终止，尽管在细胞周期的合 成期（S)不是这样。但是肉桂可能是通过抑制细胞的某些可促进有丝分裂的磷酸酶[3]， 因此，研宄这些致病因素，针对可能有助于预防白血病的关键来实现。在以前的报告中有报 道，肉桂提取物具有抗肿瘤作用，也具有通过抑制NFkappaB的APl和小鼠黑色素瘤模型联 系起来来增强促凋亡活性[4]。
[0003] 近年来，利用人结肠癌上皮细胞Caco-2模型在药物研宄方面因其特殊的结构和 生理生化作用取得了令人鼓舞的进展。该细胞单层模型和人体小肠上皮细胞相类似。采用 中药经transwell转运池 Caco-2细胞模型吸收转运后的过滤液作用于研宄的白血病细胞， 可替代中药血清学方法，更能体现中药在体内的真正作用情形。
【发明内容】
[0004] 本发明揭示肉桂提取物对白血病K562细胞的作用。
[0005] 肉桂提取物的制备方法按照以下步骤：
[0006] 步骤1 :肉桂的干燥粉末，用乙醇：水为80:20作为溶剂，萃取三次；
[0007] 步骤2 :减压回流除去溶剂后，得到残余物；
[0008] 步骤3 :将残余物溶解在丙酮中，过滤，将丙酮溶液在真空中蒸发得到的丙酮可 溶提取物，将其悬浮在水中；
[0009] 步骤4 :然后用石油醚和EtOAc利用沸点不同进行分离，得到水溶性提取物；
[0010] 步骤5 :水溶性提取物经硅胶柱层析，用氯仿：甲醇：水为80:20:2. 5得到肉桂提 取物。
【附图说明】
[0011] 图 lA(-)-(7，S，8S，8，R)-4,4，-dihydroxy-3,3，，5,5，
[0012] -tetramethoxy-7' ，9-epoxylignan_9' -〇l_7-〇ne ;
[0013] 图 IB(_)-Iyoniresinol 3 a-〇-β-d
[0014] -glucopyranoside ；
[0015] 图 1C3, 4, 5-trimethoxyphenolβ _d - apiofuranosyl(I - 6)-β _d
[0016] -glucopyranoside ；
[0017] 图2Α扫描电子显微镜15000 X ;
[0018] 图2B扫描电子显微镜3000 X ;
[0019] 图2C透射电子显微镜20000 X ;
[0020] 图3A普萘洛尔标准品；
[0021] 图3B普萘洛尔经transwell吸收；
[0022] 图3C阿替洛尔标准品；
[0023] 图3D阿替洛尔经transwell吸收；
[0024] 图4A:肉桂提取物A标准品；
[0025] 图4B:经transwell吸收的附子提取物肉桂提取物A ;
[0026] 图4C:肉桂提取物B标准品；
[0027] 图4D :经transwell吸收的附子提取物肉桂提取物B ;
[0028] 图4E:肉桂提取物C标准品；
[0029] 图4F:经transwell吸收的附子提取物肉桂提取物C ;
[0030] 图5A:肉桂提取物A;
[0031] 图5B:肉桂提取物B;
[0032] 图5C:肉桂提取物C;
[0033] 图6A阴性对照组的K562细胞；
[0034] 图6B50 μ M肉桂提取物A作用K562细胞72h ;
[0035] 图6C50 μ M肉桂提取物B作用K562细胞72h ;
[0036] 图6D50 μ M肉桂提取物C作用K562细胞72h ;
[0037] 图7K562细胞系各阶段细胞周期分布和DNA含量分析；
[0038] 图850 μ M和75 μ M肉桂提取物A, B，C作用K562细胞72h对细胞周期的影响；
[0039] 图9A肉桂提取物作用K562细胞72h对细胞凋亡的影响，阴性组；
[0040] 图9B肉桂提取物作用K562细胞72h对细胞凋亡的影响，50 μ M肉桂提取物；
[0041] 图9C肉桂提取物作用Κ562细胞72h对细胞凋亡的影响，75 μ M肉桂提取物；
[0042] 图10Α:Κ562细胞分化抗原图，PE-CD36 ;
[0043] 图 10Β:Κ562 细胞分化抗原图，FITC-CD13 ;
[0044] 图 10C:K562 细胞分化抗原图，FITC-CD33 ;
[0045] 图 10D:K562 细胞分化抗原图，PE-CD235a ;
[0046] 图 10E:K562 细胞分化抗原图，FITC-CD61 ;
[0047] 图10F:K562细胞分化抗原图，PE-CD41 ;
[0048] 图10G:K562细胞分化抗原图，PE-CD34 ;
[0049] 图 10H:K562 细胞分化抗原图，FITC-CD38。
【具体实施方式】
[0050] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0051] 本发明肉桂提取物的制备方法为：
[0052] 肉桂（50公斤）的干燥粉末，用乙醇-水（80:20) (3X 90升）萃取三次，减压回流 除去溶剂后，得到残余物（7.5千克）。将残余物溶解在丙酮中，过滤，将丙酮溶液在真空中 蒸发得到的丙酮可溶提取物（5. 0千克），将其悬浮在水中，然后用石油醚和EtOAc利用沸点 不同进行分离。水溶性提取物（1.5千克）经硅胶柱层析（CC) (20X120厘米，7.5公斤）， 用氯仿：甲醇：水（80:20:2. 5,25L，V/V(体积比））得到三个组分，A-C。
[0053] 馏分八(3.1克）适用于1^-180：(3.0\3.0厘米的806)洗脱梯度，用甲醇水溶液 (10:90, 30:70, 50:50, 70:30,90:10,1L，每次，V/V (体积比）），得到两种馏分，Al 和 A2。组分 A2 (1 克）进行MCI 凝胶 CHP20P CC (2. 0 X 50 厘米，100 克）纯化，用 Me0H/H20 (30:70,40:60， 50:50,60:40, 70:30,80:20, 700 毫升，每次，V/V)，得到 3 馏分，A2A-A2C。组分 A2C (300 毫 克）通过制备！1(：纯化，用01(：13/^6〇!1(11:1，100毫升，￥/￥)，得到化合物4(19.7毫克） 纯化。
[0054] 馏分B (155克）进行交联葡聚糖LH-20CC (6. OX 125厘米，500克）（MeOH)纯化，得 到两部分，Bl和B2。馏分Bl (5.2克），用RP-18CC (3. OX 50厘米，200克）纯化，用MeOH/ !120(10:90,30:70,50:50,70:30,90:10，1升，体积/体积），提供了三个组分，组分813-81(：。 组分Blb的（462毫克）通过制备TLC纯化，用CHC13/Me0H/H20 (3:1:0. 05, 200毫升，体积/ 体积/体积），得到B (3. 9毫克）洗脱。组分BlC (240毫克）通过制备TLC纯化，用CHC13/ Me0H/H20 (6:1:0. 05,150毫升，体积/体积/体积），得到化合物C (42. 8毫克）洗脱。
[0055] 图1中的A、B、C表达了三种肉桂提取物的结构。其中，
[0056] A:已知的成分鉴定如下（-)-(7' S, 8S, 8' R)_4, 4' -dihydroxy-3, 3'，5, 5'
[0057] -tetramethoxy-7' ，9-epoxylignan_9' -〇l_7-〇ne[5]〇
[0058] B: (_)-Iyoniresinol 3 a-〇-β-d
[0059] -glucopyranoside[6]〇
[0060] C:3, 4, 5-trimethoxyphenolβ _d - apiofuranosyl(I - 6)-β _d
[0061] -glucopyranoside[7]〇
[0062] 本发明肉桂提取物对于白血病K562细胞的作用：
[0063] 细胞培养
[0064] 将白血病Κ562细胞株接种到含10 %胎牛血清（Fetal calf serum，FBS)中，添加 100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素到RPMI-1640培养液中，在37°C含5% CO2的培养箱内 将细胞培养传代。每2-3天换液1次，所有实验均在细胞生长的对数期内进行。
[0065] Transwell转运池细胞培养法的建立
[0066] 将0&(3〇-2细胞接种于含10%胎牛血清、10(^/1111青霉素和100^8/1111链霉素的 DMEM培养液中，在37°C含5% 0)2的培养箱内培养。如果细胞已长满（汇合达80-90% )， 即可进行传代培养。当Caco-2细胞达到80%汇合时，将细胞消化记数，用DMEM-10稀释至 1.0 X 105-2· 5X 105/ml。将I. 5ml的已充分混合的细胞悬浮液加入transwell的顶端绒毛 面，将2. 6ml的DMEM-10完全培养基加入底端基底面。而后将transwell放入37°C含5% 〇)2的培养箱内培养。每隔一天换液一次，直至第21天，测定培养21天的Caco-2细胞单 层的电阻值，每孔均大于500 Ω/cm2,表明其具有足够的紧密连接和完整性。可用来进行药 物吸收和转运机制的试验研宄。
[0067] 肉桂提取物对Caco-2细胞的毒性
[0068] 取对数生长期Caco-2细胞，0. 25%胰酶消化，制成4X IO4Ail的单细胞悬液，接种 于96孔培养板，200 μ 1/孔，培养24h，吸净培养液，分别加入8个浓度梯度的肉桂提取物， 经0.22 μ m滤膜过滤除菌，溶解到Hanks平衡盐溶液（Hank's Balanced Salt Solution， HBSS)中（0、50、100、200、400、600、800、1000 μ g/ml)，并设空白对照为细胞加入到 HBSS 中。 孵育2h后加入MTT (5mg/ml)，20 μ 1/孔。培养4h后，去上清液，加入DMS0150 μ 1/孔，摇床 振荡lOmin，使结晶物充分溶解。酶标仪测波长490nm处光密度（Optical density，0D)值 [8]，计算肉桂提取物对Caco-2细胞的生长抑制率。
[0069] 选择细胞存活率大于80 %的药物浓度作为无毒浓度进行下一步细胞实验。
[0070] 抑制率=(空白组A值-实验组A值）/空白组A值X 100%。
[0071] 注：空白组A值=只加 HBSS的Caco-2细胞悬浮液经上述处理后用490nm滤光片 在酶标仪上测定的吸光度。
[0072] 实验组A值=将药物溶解在HBSS的Caco-2细胞悬浮液经上述处理后用490nm滤 光片在酶标仪上测定的吸光度。
[0073] 中药提取物经Transwell转运池
[0074] 取6孔transwell板将Caco-2细胞接种在上面，分别在第3d和第14d用HBSS 洗聚碳酯膜上的单层细胞2次，随后用4. 9mmol/L的钙，镁和含0. 5 % Triton- 100磷酸 盐缓冲溶液溶解细胞，放置冰上孵育lh，以15000r/min离心10min，取细胞上清液，使 用AKP试剂盒测定Caco-2细胞的AKP活性。在transwe11的AP侧加入体积为0. 5ml， 0. lmmol/1普萘洛尔和lmmol/1阿替洛尔的HBSS溶液，BL侧加入HBSS的体积为I. 5ml， 在37°C水中振摇温育lh，收集BL侧溶液，HPLC测转运量，计算表观渗透系数（Apparent permeabilitycoefficient，Papp) [10]。Papp = dQ/dtXl/60Xl/C。。Papp 单位为 cm/ s。上式中，Q是积累转运量（cumulative amount oftransport)，代表化合物在接收端 (receiver)出现的总量，单位为μ g (在计算时需要累加上取样时取走的化合物的量）； dQ/dt是速率，单位为yg/min;^!是化合物在给予端（donor)的初始浓度，单位为yg/L;A 是聚碳醋膜的表面积，单位为cm2。Caco-2细胞单层细胞模型成功建立后，取出transwell， 小心吸弃原培养基，用HBSS轻轻漂洗一遍，加入已过滤除菌的HBSS缓冲盐溶液，测各孔电 阻值，TEER = (Rs-Rb) X4. 67cm2,当T > 150时，该穴可用。弃去上穴吸收池内缓冲液，加入 1.5ml已配好的样品液肉桂提取物和附子提取物（无菌HBSS配制），置二氧化碳培养箱中 作用2小时。2小时后，各孔下穴的全部样品液分别用青霉素小瓶盛装，作好标记。膜完整 性检测，样品全部取出后再加入HBSS缓冲盐溶液，测其电阻，以检测细胞单层膜药物作用 后是否完整。如果完整，则可将下穴的全部样品液汇集，浓缩，待上高效液相色谱仪检测。
[0075] 肉桂提取物的高效液相色谱检测
[0076] 色谱柱：250mmX4. 6mm i. d.，5 μ m, Zorbax SB-C18 柱。检测波长：310nm ;柱温： 40°C;流动相：甲醇-水（60 : 45);流速流动相A为甲醇，流动相B为水。供 试品为提取好的肉桂的有效成分〇.〇〇l〇g，溶解于10ml HBSS溶液于IOml比色皿中。超声 IOmin助溶。供试品溶液是肉桂提取物A，B，C溶解在流动相中。经0. 2 ym微孔滤膜滤过 后，分别取10 μ 1样品进样分析。在上述条件下，供试品溶液中的肉桂色谱峰分离良好，峰 形对称，理论塔板数以肉桂提取物单体的峰计不低于2000。
[0077] MTT法测定中药标准品对Κ562细胞增殖作用的抑制
[0078] 将稀释好的K562细胞悬液以1.0XlOVml的浓度接种于96孔培养板中，每孔 100 μ 1。96孔周围用200 μ IPBS填充。分别加入配成5组不同浓度肉桂提取物A，B，C的药 物培养液5 μ M，10 μ M，25 μ M，50 μ M，75 μ M，100 μ M K562细胞。同时也设空白对照组。每种 浓度均行五个平行复孔，置37°C、5% 0)2培养箱培养内分别孵育24h，48h，72h。实验结束前 4h于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ml的MTT溶液20 μ 1，4h，终止培养。 将96孔培养板以3000rpm离心10min，弃去上孔培养液，每孔加 DMS0150 μ 1，震荡lOmin，使 结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值（A)， 以A值间接反映活细胞数量，计算不同浓度肉桂提取物A，B，C作用K562细胞不同时间的抑 制率。记录结果。实验重复3次。
[0079] 细胞抑制率％ = A对照-A处理/A对照X 100 %
[0080] 肉桂提取物A, B，C作用K562细胞
[0081] 收集对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为IXlOVml，用肉桂提取物终浓度 为50以 8/1111、75以8/1111，作用1(562细胞7211。同时设立对照组。分别收集细胞。实验重复 3次。
[0082] 透射电子显微镜（TEM)标本制作步骤及观察
[0083] 透射电子显微镜参照早期研宄的步骤进行操作[11]。50 μΜ肉桂提取物A，B，C和 对照组分别用4%多聚甲醛和2%戊二醛的0.1 M磷酸钠缓冲液（pH7. 4)在室温温度（24°C) 作用4h。其次将组织片在0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4)中洗涤，然后将它们放置在2%四 氧化锇的0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.4)中，在室温下作用2小时。用无水乙醇处理，随后在 60°C条件下的Epon812嵌入聚合48小时。使用ULTRA⑶T超切片机（莱卡微系统有限公 司，韦茨拉尔，德国）超薄切片（50-70纳米），过200目筛网。用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对 切片进行双重染色，然后在80千伏（FEI公司，希尔斯伯勒，0R，美国）配备的SIS米加视图 II C⑶照相机的FEI的Tecnai-12双透射电子显微镜下进行分析。
[0084] K562细胞表面分化抗原检测
[0085] 流式细胞仪参照早期研宄的步骤进行操作[12]。将浓度为50 μΜ、75 μM的肉桂 提取物A, B，C分别诱导72h及阴性对照组Κ562细胞，取收集的Κ562,用生理盐水洗涤后用 PBS液调整细胞浓度为l〇7ml，再取50 μ 1细胞悬液，分别加入⑶235a，⑶36,⑶41，⑶61， ⑶13,⑶33,⑶14,⑶34,⑶38单克隆荧光抗体，室温孵育30min，用PBS液洗去未结合的抗 体。以侧向角散射光（Side scatter，SSC)强度为横坐标和细胞结合⑶45荧光强度为纵坐 标设门，用流式细胞仪分别测定相应抗体荧光强度，每组分析5000个细胞，数据经FCM所带 软件处理后计算出相应表型阳性细胞百分率。实验重复3次。
[0086] K562细胞周期检测
[0087] 流式细胞仪参照早期研宄的步骤进行操作[12]，流式细胞周期分析参照早期研宄 文献[13]。将浓度为50 μΜ、75 μΜ的肉桂提取物A, B，C分别诱导72h及阴性对照组K562 细胞离心后，制成单细胞悬液，1300rpmin离心5min，弃去培养液用4°C预冷的PBS洗1次， 离心弃去PBS，加入100-150 μ I PBS制成单细胞悬液，吸取细胞悬液迅速吹入70 %预冷 的乙醇中振荡混匀，4°C冰箱固定过夜。离心弃去固定液，用ImlPBS重悬，离心，弃去上清， 加 Iml PBS，吹打均匀，过300目筛网。细胞计数。将细胞调成l〇7ml单细胞悬液。离心细 胞，去上清。加入核糖核酸酶A(RibonucleaseA，RnaseA酶）（工作浓度20 μ g/ml)，体积为 500 μ I，酶溶于PBS中，室温避光孵育30min。提前准备好冰水混合物，将避光孵育的细胞悬 液冰浴l-2min。终止酶的作用。离心，除去上清。加入碘化丙啶（Propidium iodide，PI) (工作浓度50 μ g/ml)，体积为500 μ 1，酶溶于PBS中，室温避光孵育30min后上机检测。实 验重复3次。
[0088] K562细胞凋亡检测
[0089] 流式细胞仪参照早期研宄的步骤进行操作[12]。将浓度为50 μ Μ、75 μ M的肉桂提 取物A，B，C分别诱导72h及阴性对照组Κ562细胞离心后，制成单细胞悬液，用PBS洗二次， 收集1-5X IO5个细胞。在细胞中加入500 μ 1的Binding buffer (固定液）混匀。其中样 本管和阴性管均加。样本管加入5μ1 Annexin V-FITC混匀后，加入5μ1 PI混匀。室温 避光反应5-15min。在1小时内，进行流式细胞仪的检测。实验重复3次。
[0090] 数据统计和分析
[0091] 计量资料以均数土标准差（歹土S:)表示，组间比较采用完全随机设计的方差分 析，组内比较采用重复测量资料的方差分析，差异有统计学意义行SNK-q检验。用SPSS11. 5 软件进行统计学处理，F〈0.05为差异有统计学意义。
[0092] 结果
[0093] 系统适用性试验
[0094] AKP是小肠表皮刷状缘细胞的标志酶。Caco-2细胞生长到一定阶段后，可通过测 定Caco-2细胞的酶活性对其分化的生物化学特性进行初步判断。本实验中，Caco-2细胞在 接种第3d，细胞未完全汇合时，不能水解AKP底物对硝基苯磷酸盐，使其生成对硝基苯酚， 显示没有AKP活性，而在接种第14d，能够水解对硝基苯磷酸盐生成对硝基苯酚，具有AKP 活性，显示Caco-2细胞在第14d已经基本分化完成，具备药物转运需要的各种载体和酶。 Caco-2细胞单层的顶侧的微绒毛特性如下（图2)，其中，A:扫描电子显微镜15000X。B: 扫描电子显微镜3000X。C:透射电子显微镜20000X。本实验采用国际公认在Caco-2细 胞单层吸收良好的普萘洛尔和吸收不好的阿替洛尔为对照物，得出两者在Caco-2细胞单 层的Papp值分别为2. 54X l(T5Cm/S和3. 35X KTcm/s，与文献[11]值基本相符，表明其具 有良好的完整性与转运能力。通过高效液相色谱法检测到普萘洛尔和阿替洛尔通过Caco-2 细胞单层吸收模型（图3)，其中，A:普萘洛尔标准品；B:普萘洛尔经transwell吸收；C:阿 替洛尔标准品；D:阿替洛尔经transwell吸收。
[0095] 细胞毒性试验结果
[0096] 利用酶标仪测定96孔板空白对照和加入肉桂的HBSS溶液后的吸收度A值，并计 算其对Caco-2细胞的抑制率，结果见表1。
[0097] 由表1可知，Caco-2细胞抑制率随着肉桂的浓度增加而增加，当浓度低于IOOyg/ ml时，肉桂的抑制率小于20%，因此，在细胞膜转运实验中选择的浓度为100 μ g/ml可认为 无细胞毒性。
[0098] 对于Caco-2细胞，细胞毒性均随肉桂浓度增大而增强，实验结果显示肉桂浓度高 于200 μ g/ml时，细胞毒性增大，而存活率低于（58. 35±13. 36) % ; 100 μ g/ml浓度与阴性 对照组比较均无显著性差异，细胞存活率在80%以上。而浓度为50 μ g/ml，100 μ g/ml经过 Cac〇-2transwell吸收模型的中药含量降低，需要多次试验。
[0099] 表1肉桂的细胞毒实验结果（η = 3) (I 土S) (% )
[0100]
【主权项】
1. 肉桂提取物对白血病K562细胞的作用。
2. 按照权利要求1所述肉桂提取物对白血病K562细胞的作用，其特征在于：所述肉桂 提取物的制备方法按照以下步骤： 步骤1 :肉桂的干燥粉末，用乙醇：水为80:20作为溶剂，萃取三次； 步骤2 :减压回流除去溶剂后，得到残余物； 步骤3 :将残余物溶解在丙酮中，过滤，将丙酮溶液在真空中蒸发得到的丙酮可溶提取 物，将其悬浮在水中； 步骤4 :然后用石油醚和EtOAc利用沸点不同进行分离，得到水溶性提取物； 步骤5 :水溶性提取物经硅胶柱层析，用氯仿：甲醇：水为80:20:2. 5得到肉桂提取物。
【专利摘要】一种肉桂提取物的制备方法及对白血病K562细胞的作用。本发明公开了肉桂提取物对白血病K562细胞的作用。肉桂提取物的制备方法按照以下步骤：步骤1：肉桂的干燥粉末，用乙醇：水为80:20作为溶剂，萃取三次；步骤2：减压回流除去溶剂后，得到残余物；步骤3：将残余物溶解在丙酮中，过滤，将丙酮溶液在真空中蒸发得到的丙酮可溶提取物，将其悬浮在水中；步骤4：然后用石油醚和EtOAc利用沸点不同进行分离，得到水溶性提取物；步骤5：水溶性提取物经硅胶柱层析，用氯仿：甲醇：水为80:20:2.5得到肉桂提取物。通过Annexin V/PI染色法测定细胞凋亡变化。肉桂提取物A,B,C作用K562细胞72h后凋亡率明显增加。
【IPC分类】A61P35-02, A61K36-54
【公开号】CN104815000
【申请号】CN201510051319
【发明人】杨同华, 关心, 刘阳, 欧阳红梅, 蒋雅先, 朱红艳, 胡芃, 杨艳梅, 赖洵, 张海溪
【申请人】云南省第一人民医院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年1月31日
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