一种兰科植物组织培养方法
一种兰科植物组织培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤：a.制备兰科植物的生根苗；b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；c.菌化生根苗移栽；所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉。本发明先后对兰科植物接种白蘑科真菌和摩西球囊霉，并选用多不饱和脂肪酸促进二者与兰科植物共生，使组培时兰科植物的生根苗获得优异的抗旱、抗高温、抗湿等抗逆特性，无需经历炼苗便可直接移栽，不但有效缩短了生产周期，提高生产效率，更能有效地促进植物的生长。
【专利说明】一种兰科植物组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种兰科植物组织培养方法。
【背景技术】
[0002]兰科植物是是最难繁殖的一类单子叶植物，传统的兰科植物繁殖通常是采用分株繁殖法实现的，其繁殖系数小，产业化程度低。而兰科植物中的一些富有经济价值的物种，比如天麻、石斛、金线莲等，利用传统育种方法实现其繁殖尤为困难。特别是其中的金线莲，是一种濒危珍稀的药用植物。自然条件下金线莲种子难以萌发(萌发率低于5% )。金线莲植株矮小，根系不发达，再生能力差。金线莲由种子到开花需要3~4年，常需与某些真菌，共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率低、生长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生金线莲资源的掠夺式采挖，其生境被严重破坏，致使野生金线莲濒临灭绝。现对兰科的培养主要集中在组织诱导、基
本培养条件筛选和理化因子的考查等方面。还没有找到一个切实有效地培养技术用以解决兰科植物诱导和增殖中存在的疑点和难点，从而影响了台湾金线莲的深入研究和应用。自然环境中兰科幼苗的生长需某些真菌与其共生，内生真菌除了可为兰科植物提供营养物质外，还可以促进其对矿物质的吸收，产生植物生长发育所需维生素及植物激素类物质，增强植物抗逆性及抗病力(参考周德平等发表在《上海农业学报》第2005.21 (3)期《兰科植物内生真菌的功能及应用前景[J]》)。由此可见，采用兰科植物组培苗与菌根真菌共生的方法，有着可促进植物生长、增强植物抗逆性及抗病力等优点，可以克服目前组培苗生长缓慢、抗逆性弱、死亡率高等一些缺点。目前，在兰科植物共生方面，国外尚未报道，国内郭顺星等采用石斛小燕(Mycenadendrobii),紫萁小燕(Mycena osmundicola),兰小燕(Mycenaorchidicola),开唇兰小燕(Mycena anoectochila)与金线莲共生(专利申请号:02100779.9 ;专利号:ZL200510117703.3)，效果并不理想(高微微、郭顺星等《中药草》第2002.33(6)期中《三种内生真菌对铁皮石斛、金线莲生长影响的研究》)，主要表现在菌种难以侵染植物组织、难以在植物组织内正常生长、对植物抗逆性的增强效果不明显等。同时上述方法需采用紫萁小菇等罕见的菌`种实现，成本较高而不利于技术的推广。由于现有技术中通过组织培养技术获得的兰科植物幼苗生命力低，在培养瓶中经历制备愈伤组织、诱导愈伤组织生根等处理中兰科植物幼苗往往因为瓶中湿度高而发生软腐病；在移栽前幼苗还需移出培养瓶进行的炼苗，以增强其对外界的适应能力。炼苗处理耗时较长，且在炼苗过程中幼苗成活率较低。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明提供一种成本低廉、成活率高、培养周期短的兰科植物组织培养方法。
[0004]一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗。[0005]b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0006]所述生根苗可通过制备愈伤组织，并诱导其生根获得；或直接诱导腋芽发育获得生根苗。除此以外，任意一种通过组织培养制备兰科植物生根苗的方法均适用于本发明。通过组织培养方法培育生根苗的过程通常需要在将其浸泡遭高温、高湿的密封培养瓶中进行，但兰科植物的组织普遍存在畏热怕湿的问题，在上述环境中容易发生软腐病。白蘑科真菌是一种常见的食用菌，将其菌种与生根苗共同接种至共生培养基中，可有效提高其对培养瓶内的高湿、高温条件的耐受能力，从而提高生根苗培养阶段的成活率。所述摩西球囊霉是一种自然界常见的真菌，通常的宿主为黄瓜、番茄等葫芦科或茄科的植物。本发明的发明人在研究中发现，本发明中接种摩西球囊霉的兰科植物生根苗具有优秀的抗旱等耐受外界环境的抗逆特性，有一定证据表明上述抗逆特性是在所述白蘑科真菌及摩西球囊霉协效产生的，从而使本发明中的丛生芽无需经历漫长的炼苗即可进行移栽培养。但摩西球囊霉对兰科植物的侵染率较低，特别是当前序处理中生根苗已被接种白蘑科真菌的前提下，存在优势菌群的情况下摩西球囊霉很难成功地成为移栽的丛生芽的内生菌。因此本发明特在丛生芽移栽至移栽基质并接种摩西球囊霉后，对生根苗及移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。经实验验证，多不饱和脂肪酸能够有效提高摩西球囊霉对本发明丛生芽的侵染效率，降低白蘑科真菌与摩西球囊霉的拮抗作用，使之能够与白蘑科真菌共同成为丛生芽的内生菌，使得上述的生根苗的抗逆特性表达更加稳定。同时，多不饱和脂肪酸本身对生根苗的生长同一具有明显的促进作用，因此本发明选用喷洒的方式施加多不饱和脂肪酸培养液，使之能够与生根苗地面部分 解除，从而获得刺激生根苗生长的效果。
[0007]所述多不饱和脂肪酸为花生四烯酸/亚油酸/共轭亚油酸/ a -亚麻酸/ Y -亚麻酸/全顺式_4，7，10, 13，16，19- 二十二碳六烯酸/全顺式_5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸中的一种或多种的混合物；所述培养液为浓度在lmL/L-3ml/L的所述多不饱和脂肪酸与水的乳浊液。
[0008]任意一种市售的多不饱和脂肪酸均能够实现本发明的效果，经发明人验证，当多不饱和脂肪酸为碳链长18-22、含有2-6个不饱和键的多不饱和脂肪酸时，其对摩西球囊霉侵染效率、生根苗生长效率的促进效果最优。在这个范围的多不饱和脂肪酸中，花生四烯酸、亚油酸、共轭亚油酸、a-亚麻酸、Y-亚麻酸、全顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸、全顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸，均是在现有工业体系中较易获得、成本低廉的品种。尤其是其中的亚油酸，其对摩西球囊霉的侵染效率、生根苗生长笑了的促进作用特别明显，远超等价的其他多不饱和脂肪酸。因此特别有利于在大规模的栽培中使用。所述营养液可以是多不饱和脂肪酸与水混合成的温度乳浊液。
[0009]进一步的，所述共生培养基中白蘑科真菌的浓度为0.01mg-0.5mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为70-120g/100株移栽苗。
[0010]白蘑科真菌的起始浓度过低，则其要经历一较长时间的适应期方能进入对数生长期，不易于侵染生根苗成为生根苗内的优势菌种，从而导致本发明所追求的技术效果无法实现；而白蘑科真菌的浓度过高，则一方面容易导致成本的升高，也会较大程度上地阻碍后续摩西球囊霉的接种。摩西球囊霉的接种量过低会受白蘑科真菌的抑制而无法成功与生根苗共生，而其接种量过高将同样会升高生产成本，不利于推广使用。因此在本发明中，每植有100株的移栽苗接种70-120g摩西球囊霉。
[0011]优选的，所述白蘑科真菌为蜜环菌属或小蜜环菌属中的一种或多种真菌。
[0012]蜜环菌属本身是兰科植物中的天麻内常见的共生菌，但由于现有的技术通常只接种蜜环菌这一单一菌种，无法有效提升兰科植物幼苗的抗逆能力，因此培育时还需要较长时间的炼苗，其幼苗存活率较低。而在本发明中，蜜环菌与摩西球囊霉在多不饱和脂肪酸的作用下同时与兰科植物的生根苗共生，则能有效地提升兰科植物幼苗的抗逆特性，不但可缩短或减免炼苗时间，其幼苗的成活率、生长速率也有较大的提升。小蜜环菌属，主要包含了假蜜环菌这一物种。在本发明中，采用假蜜环菌与兰科植物生根苗共生，在多不饱和脂肪酸及摩西球囊霉的作用下，能使生根苗表现出优秀的抗逆特性及生命力，其生长速率远超采用现有技术处理的空白对照组。特别要指出的是，发明人发现，在亚油酸的作用下，将假蜜环菌与摩西球囊霉接种至金线莲生根苗中，其促进生根苗生长的效果尤其明显，经处理有，金线莲生根苗的生物量涨幅可比未经处理时高出30%以上。这一效果尚未有相关现有技术记载。
[0013]所述向所述生根苗和/或移栽基质喷洒喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液是指向生根苗和/或移栽基质喷洒3-4mL/10株生根苗的亚油酸水溶液。
[0014]亚油酸浓度过低，其效果并不能充分发挥。有鉴于亚油酸成本较高，施用亚油酸含量过高也不利于控制成本。根据小蜜环菌和蜜环菌属的生长规律，本发明特别限定了亚油酸的使用量，可在保证作用效果的前提下，最大程度地降低生产成本。
[0015]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0016]本发明可以`在培养基被菌索覆盖时——即白蘑科真菌成功与生根苗共生时将生根苗移栽。但考虑到共生初期，尚未在生根苗内形成数量足够的菌群，生根苗活力较弱，本发明在生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm时，方将生根苗植入移栽基质。
[0017]所述步骤b中光照强度为30001ux，培养温度为23_27°C。
[0018]更进一步，所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚或密闭林地下培育，追肥，并以2-3天对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。
[0019]本发明的追肥可选用任一种适用于兰科植物的追肥方法，特别优选的，可选用市售的氨基酸肥或Hogland营养液进行追肥。所述灌溉可选用喷灌或滴灌的方式进行，以保持移栽基质湿润而不造成积水为标准。除大棚和密闭林地外，任意一种湿润、阴凉而适于培育兰科植物的环境均可适用于本发明。对兰科植物的培育过程中的其他操作，均可采用现有做法实现。
[0020]所述兰科植物包括石斛、天麻或金线莲。
[0021]所述兰科植物为金线莲；所述白蘑科真菌为假蜜环菌；所述将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养是指将所述生根苗与假蜜环菌共同接种至共生培养基中，直至蓝色菌索覆盖培养基。
[0022]本发明先后对兰科植物接种白蘑科真菌和摩西球囊霉，并选用多不饱和脂肪酸促进二者与兰科植物共生，使组培时兰科植物的生根苗获得优异的抗旱、抗高温、抗湿等抗逆特性，无需经历炼苗便可直接移栽，不但有效缩短了生产周期，提高生产效率，更能有效地促进植物的生长；同时本发明更对两种共生微生物的接种量、接种时机及多不饱和脂肪酸的施加量进行了设计，确保其作用最大化的同时有效控制了生产成本，使本发明的产业化成为可能。
【具体实施方式】
[0023]为了便于本领域技术人员理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详细描述: 实施例1
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。[0024]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为小蜜环菌属的假蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3ml浓度为2ml/L的亚油酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0025]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为0.05mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重100g摩西球囊霉菌剂。
[0026]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为6cm。
[0027]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为25°C。光照时间为24小时每天。
[0028]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚或密闭林地下培育，追肥，并以2-3天对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。
[0029]实施例2
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0030]本实施例中，所述生根苗是通过诱导兰科植物腋芽生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为小蜜环菌属的假蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用4ml浓度为lml/L的亚油酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0031]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为0.5mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重70g摩西球囊霉菌剂。
[0032]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为7cm。
[0033]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为23°C。光照时间为24小时每天。
[0034]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的密闭林地下培育，采用氨基酸肥追肥，并以2-3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0035]实施例3
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0036]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中， 所述白蘑科真菌为小蜜环菌属的假蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3ml浓度为3ml/L的亚油酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0037]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为0.01mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重120g摩西球囊霉菌剂。
[0038]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3cm。
[0039]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为27°C。光照时间为24小时每天。
[0040]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚或密闭林地下培育，采用氨基酸肥追肥，并以2-3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0041]实施例4
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0042]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为小蜜环菌属的假蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3.5ml浓度为2.5ml/L的亚油酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。[0043]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为0.lmg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重90g摩西球囊霉菌剂。
[0044]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0045]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为26°C。光照时间为24小时每天。
[0046]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚培育，采用Hogland营养液追肥，并以2-3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0047]实施例5
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生 根苗和移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0048]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3ml浓度为3ml/L的a -亚麻酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0049]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中蜜环菌的浓度为菌体干重0.09mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重70-120g摩西球囊霉菌剂。
[0050]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0051]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为27°C。光照时间为24小时每天。
[0052]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的密闭林地下培育，采用Hogland营养液追肥，并以2_3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0053]实施例6
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0054]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3-4ml浓度为2ml/L的a-亚麻酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0055]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中蜜环菌的浓度为菌体干重0.2mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重70-120g摩西球囊霉菌剂。
[0056]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0057]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为23_27°C。光照时间为24小时每天。
[0058]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的密闭林地下培育，采用Hogland营养液追肥，并以2_3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0059]实施例7
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0060]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述`白蘑科真菌为蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为4ml浓度为3ml/L的花生四烯酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0061]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为菌体干重0.03mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重100g摩西球囊霉菌剂。
[0062]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0063]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为25°C。光照时间为24小时每天。
[0064]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的密闭林地下培育，采用Hogland营养液追肥，并以2_3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0065]分别采用实施例1-7的方法培育金线莲每组20株，。60日后测试一次平均幼苗的生物量，其结果如表1所示。
[0066]分别采用实施例1-7的方法培育天麻，每组20株，60日后检测其平均幼苗生物量增长情况，其结果如表2所示。
[0067]对照例I
本对照例提供一种兰科植物组培方法，其未使用多不饱和脂肪酸，其余步骤与实施例1一致。
[0068]对照例2
本对照例提供一种兰科植物组培方法，其未对生根苗接种白蘑科真菌，其余步骤与实施例I 一致。
[0069]对照例3
本对照例提供一种兰科植物组培方法，其未对生根苗接种摩西球囊霉，其余步骤与实施例I 一致。
[0070]对照例4
本对照例提供一种兰科植物组培方法，其未对生根苗接种摩西球囊霉、白蘑科真菌，亦未施用多不饱和脂肪酸。其余步骤与实施例1 一致。
[0071 ] 采用对照例1-4的组培方法培育金线莲，每组20株，60日后检测其平均生物量，其结果如表1所示。
[0072]采用对照例1-4的组培方法培育天麻，每组20株，60日后检测其平均生物量，其结果如表2所示。
[0073]表1培养60日金线莲生物量及多糖含量_
【权利要求】
1.一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤: a.制备兰科植物的生根苗； b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗； c.菌化生根苗移栽； 所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
2.根据权利要求1所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述多不饱和脂肪酸为花生四烯酸、亚油酸、共轭亚油酸、a -亚麻酸、Y -亚麻酸、全顺式-4，7，10, 13，16，19-二十二碳六烯酸、全顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸中的一种或多种的混合物；所述培养液为浓度在lmL/L-3ml/L的所述多不饱和脂肪酸与水的乳浊液。
3.根据权利要求2所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述共生培养基中白蘑科真菌的浓度为0.01mg-0.5mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为70_120g/100株移栽苗。
4.根据权利要求1-3任一项所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述白蘑科真菌为蜜环菌属或小蜜环菌属中的一种或多种真菌。
5.根据权利要求4所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述向所述生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液是指生根苗和/或移栽基质喷洒3-4mL/10株生根苗培养液。
6.根据权利要求5所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
7.根据权利要求5-6任一项所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为23-27°C。
8.根据权利要求5-6任一项所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚或密闭林地下培育，追肥，并以2-3天的频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。
9.根据权利要求1-3、5-6任一项所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述兰科植物包括石斛、天麻或金线莲。
10.根据权利要求 9所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述兰科植物为金线连。
【文档编号】A01H4/00GK103704138SQ201310728135
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】魏晓辰 申请人:魏晓辰
【专利摘要】本发明公开了一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤：a.制备兰科植物的生根苗；b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；c.菌化生根苗移栽；所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉。本发明先后对兰科植物接种白蘑科真菌和摩西球囊霉，并选用多不饱和脂肪酸促进二者与兰科植物共生，使组培时兰科植物的生根苗获得优异的抗旱、抗高温、抗湿等抗逆特性，无需经历炼苗便可直接移栽，不但有效缩短了生产周期，提高生产效率，更能有效地促进植物的生长。
【专利说明】一种兰科植物组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种兰科植物组织培养方法。
【背景技术】
[0002]兰科植物是是最难繁殖的一类单子叶植物，传统的兰科植物繁殖通常是采用分株繁殖法实现的，其繁殖系数小，产业化程度低。而兰科植物中的一些富有经济价值的物种，比如天麻、石斛、金线莲等，利用传统育种方法实现其繁殖尤为困难。特别是其中的金线莲，是一种濒危珍稀的药用植物。自然条件下金线莲种子难以萌发(萌发率低于5% )。金线莲植株矮小，根系不发达，再生能力差。金线莲由种子到开花需要3~4年，常需与某些真菌，共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率低、生长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生金线莲资源的掠夺式采挖，其生境被严重破坏，致使野生金线莲濒临灭绝。现对兰科的培养主要集中在组织诱导、基
本培养条件筛选和理化因子的考查等方面。还没有找到一个切实有效地培养技术用以解决兰科植物诱导和增殖中存在的疑点和难点，从而影响了台湾金线莲的深入研究和应用。自然环境中兰科幼苗的生长需某些真菌与其共生，内生真菌除了可为兰科植物提供营养物质外，还可以促进其对矿物质的吸收，产生植物生长发育所需维生素及植物激素类物质，增强植物抗逆性及抗病力(参考周德平等发表在《上海农业学报》第2005.21 (3)期《兰科植物内生真菌的功能及应用前景[J]》)。由此可见，采用兰科植物组培苗与菌根真菌共生的方法，有着可促进植物生长、增强植物抗逆性及抗病力等优点，可以克服目前组培苗生长缓慢、抗逆性弱、死亡率高等一些缺点。目前，在兰科植物共生方面，国外尚未报道，国内郭顺星等采用石斛小燕(Mycenadendrobii),紫萁小燕(Mycena osmundicola),兰小燕(Mycenaorchidicola),开唇兰小燕(Mycena anoectochila)与金线莲共生(专利申请号:02100779.9 ;专利号:ZL200510117703.3)，效果并不理想(高微微、郭顺星等《中药草》第2002.33(6)期中《三种内生真菌对铁皮石斛、金线莲生长影响的研究》)，主要表现在菌种难以侵染植物组织、难以在植物组织内正常生长、对植物抗逆性的增强效果不明显等。同时上述方法需采用紫萁小菇等罕见的菌`种实现，成本较高而不利于技术的推广。由于现有技术中通过组织培养技术获得的兰科植物幼苗生命力低，在培养瓶中经历制备愈伤组织、诱导愈伤组织生根等处理中兰科植物幼苗往往因为瓶中湿度高而发生软腐病；在移栽前幼苗还需移出培养瓶进行的炼苗，以增强其对外界的适应能力。炼苗处理耗时较长，且在炼苗过程中幼苗成活率较低。
【发明内容】
[0003]有鉴于此，本发明提供一种成本低廉、成活率高、培养周期短的兰科植物组织培养方法。
[0004]一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗。[0005]b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0006]所述生根苗可通过制备愈伤组织，并诱导其生根获得；或直接诱导腋芽发育获得生根苗。除此以外，任意一种通过组织培养制备兰科植物生根苗的方法均适用于本发明。通过组织培养方法培育生根苗的过程通常需要在将其浸泡遭高温、高湿的密封培养瓶中进行，但兰科植物的组织普遍存在畏热怕湿的问题，在上述环境中容易发生软腐病。白蘑科真菌是一种常见的食用菌，将其菌种与生根苗共同接种至共生培养基中，可有效提高其对培养瓶内的高湿、高温条件的耐受能力，从而提高生根苗培养阶段的成活率。所述摩西球囊霉是一种自然界常见的真菌，通常的宿主为黄瓜、番茄等葫芦科或茄科的植物。本发明的发明人在研究中发现，本发明中接种摩西球囊霉的兰科植物生根苗具有优秀的抗旱等耐受外界环境的抗逆特性，有一定证据表明上述抗逆特性是在所述白蘑科真菌及摩西球囊霉协效产生的，从而使本发明中的丛生芽无需经历漫长的炼苗即可进行移栽培养。但摩西球囊霉对兰科植物的侵染率较低，特别是当前序处理中生根苗已被接种白蘑科真菌的前提下，存在优势菌群的情况下摩西球囊霉很难成功地成为移栽的丛生芽的内生菌。因此本发明特在丛生芽移栽至移栽基质并接种摩西球囊霉后，对生根苗及移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。经实验验证，多不饱和脂肪酸能够有效提高摩西球囊霉对本发明丛生芽的侵染效率，降低白蘑科真菌与摩西球囊霉的拮抗作用，使之能够与白蘑科真菌共同成为丛生芽的内生菌，使得上述的生根苗的抗逆特性表达更加稳定。同时，多不饱和脂肪酸本身对生根苗的生长同一具有明显的促进作用，因此本发明选用喷洒的方式施加多不饱和脂肪酸培养液，使之能够与生根苗地面部分 解除，从而获得刺激生根苗生长的效果。
[0007]所述多不饱和脂肪酸为花生四烯酸/亚油酸/共轭亚油酸/ a -亚麻酸/ Y -亚麻酸/全顺式_4，7，10, 13，16，19- 二十二碳六烯酸/全顺式_5，8，11，14，17- 二十碳五烯酸中的一种或多种的混合物；所述培养液为浓度在lmL/L-3ml/L的所述多不饱和脂肪酸与水的乳浊液。
[0008]任意一种市售的多不饱和脂肪酸均能够实现本发明的效果，经发明人验证，当多不饱和脂肪酸为碳链长18-22、含有2-6个不饱和键的多不饱和脂肪酸时，其对摩西球囊霉侵染效率、生根苗生长效率的促进效果最优。在这个范围的多不饱和脂肪酸中，花生四烯酸、亚油酸、共轭亚油酸、a-亚麻酸、Y-亚麻酸、全顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸、全顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸，均是在现有工业体系中较易获得、成本低廉的品种。尤其是其中的亚油酸，其对摩西球囊霉的侵染效率、生根苗生长笑了的促进作用特别明显，远超等价的其他多不饱和脂肪酸。因此特别有利于在大规模的栽培中使用。所述营养液可以是多不饱和脂肪酸与水混合成的温度乳浊液。
[0009]进一步的，所述共生培养基中白蘑科真菌的浓度为0.01mg-0.5mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为70-120g/100株移栽苗。
[0010]白蘑科真菌的起始浓度过低，则其要经历一较长时间的适应期方能进入对数生长期，不易于侵染生根苗成为生根苗内的优势菌种，从而导致本发明所追求的技术效果无法实现；而白蘑科真菌的浓度过高，则一方面容易导致成本的升高，也会较大程度上地阻碍后续摩西球囊霉的接种。摩西球囊霉的接种量过低会受白蘑科真菌的抑制而无法成功与生根苗共生，而其接种量过高将同样会升高生产成本，不利于推广使用。因此在本发明中，每植有100株的移栽苗接种70-120g摩西球囊霉。
[0011]优选的，所述白蘑科真菌为蜜环菌属或小蜜环菌属中的一种或多种真菌。
[0012]蜜环菌属本身是兰科植物中的天麻内常见的共生菌，但由于现有的技术通常只接种蜜环菌这一单一菌种，无法有效提升兰科植物幼苗的抗逆能力，因此培育时还需要较长时间的炼苗，其幼苗存活率较低。而在本发明中，蜜环菌与摩西球囊霉在多不饱和脂肪酸的作用下同时与兰科植物的生根苗共生，则能有效地提升兰科植物幼苗的抗逆特性，不但可缩短或减免炼苗时间，其幼苗的成活率、生长速率也有较大的提升。小蜜环菌属，主要包含了假蜜环菌这一物种。在本发明中，采用假蜜环菌与兰科植物生根苗共生，在多不饱和脂肪酸及摩西球囊霉的作用下，能使生根苗表现出优秀的抗逆特性及生命力，其生长速率远超采用现有技术处理的空白对照组。特别要指出的是，发明人发现，在亚油酸的作用下，将假蜜环菌与摩西球囊霉接种至金线莲生根苗中，其促进生根苗生长的效果尤其明显，经处理有，金线莲生根苗的生物量涨幅可比未经处理时高出30%以上。这一效果尚未有相关现有技术记载。
[0013]所述向所述生根苗和/或移栽基质喷洒喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液是指向生根苗和/或移栽基质喷洒3-4mL/10株生根苗的亚油酸水溶液。
[0014]亚油酸浓度过低，其效果并不能充分发挥。有鉴于亚油酸成本较高，施用亚油酸含量过高也不利于控制成本。根据小蜜环菌和蜜环菌属的生长规律，本发明特别限定了亚油酸的使用量，可在保证作用效果的前提下，最大程度地降低生产成本。
[0015]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0016]本发明可以`在培养基被菌索覆盖时——即白蘑科真菌成功与生根苗共生时将生根苗移栽。但考虑到共生初期，尚未在生根苗内形成数量足够的菌群，生根苗活力较弱，本发明在生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm时，方将生根苗植入移栽基质。
[0017]所述步骤b中光照强度为30001ux，培养温度为23_27°C。
[0018]更进一步，所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚或密闭林地下培育，追肥，并以2-3天对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。
[0019]本发明的追肥可选用任一种适用于兰科植物的追肥方法，特别优选的，可选用市售的氨基酸肥或Hogland营养液进行追肥。所述灌溉可选用喷灌或滴灌的方式进行，以保持移栽基质湿润而不造成积水为标准。除大棚和密闭林地外，任意一种湿润、阴凉而适于培育兰科植物的环境均可适用于本发明。对兰科植物的培育过程中的其他操作，均可采用现有做法实现。
[0020]所述兰科植物包括石斛、天麻或金线莲。
[0021]所述兰科植物为金线莲；所述白蘑科真菌为假蜜环菌；所述将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养是指将所述生根苗与假蜜环菌共同接种至共生培养基中，直至蓝色菌索覆盖培养基。
[0022]本发明先后对兰科植物接种白蘑科真菌和摩西球囊霉，并选用多不饱和脂肪酸促进二者与兰科植物共生，使组培时兰科植物的生根苗获得优异的抗旱、抗高温、抗湿等抗逆特性，无需经历炼苗便可直接移栽，不但有效缩短了生产周期，提高生产效率，更能有效地促进植物的生长；同时本发明更对两种共生微生物的接种量、接种时机及多不饱和脂肪酸的施加量进行了设计，确保其作用最大化的同时有效控制了生产成本，使本发明的产业化成为可能。
【具体实施方式】
[0023]为了便于本领域技术人员理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详细描述: 实施例1
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。[0024]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为小蜜环菌属的假蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3ml浓度为2ml/L的亚油酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0025]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为0.05mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重100g摩西球囊霉菌剂。
[0026]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为6cm。
[0027]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为25°C。光照时间为24小时每天。
[0028]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚或密闭林地下培育，追肥，并以2-3天对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。
[0029]实施例2
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0030]本实施例中，所述生根苗是通过诱导兰科植物腋芽生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为小蜜环菌属的假蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用4ml浓度为lml/L的亚油酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0031]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为0.5mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重70g摩西球囊霉菌剂。
[0032]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为7cm。
[0033]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为23°C。光照时间为24小时每天。
[0034]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的密闭林地下培育，采用氨基酸肥追肥，并以2-3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0035]实施例3
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0036]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中， 所述白蘑科真菌为小蜜环菌属的假蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3ml浓度为3ml/L的亚油酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0037]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为0.01mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重120g摩西球囊霉菌剂。
[0038]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3cm。
[0039]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为27°C。光照时间为24小时每天。
[0040]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚或密闭林地下培育，采用氨基酸肥追肥，并以2-3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0041]实施例4
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0042]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为小蜜环菌属的假蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3.5ml浓度为2.5ml/L的亚油酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。[0043]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为0.lmg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重90g摩西球囊霉菌剂。
[0044]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0045]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为26°C。光照时间为24小时每天。
[0046]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚培育，采用Hogland营养液追肥，并以2-3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0047]实施例5
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生 根苗和移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0048]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3ml浓度为3ml/L的a -亚麻酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0049]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中蜜环菌的浓度为菌体干重0.09mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重70-120g摩西球囊霉菌剂。
[0050]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0051]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为27°C。光照时间为24小时每天。
[0052]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的密闭林地下培育，采用Hogland营养液追肥，并以2_3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0053]实施例6
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0054]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述白蘑科真菌为蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为每10株生根苗用3-4ml浓度为2ml/L的a-亚麻酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0055]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中蜜环菌的浓度为菌体干重0.2mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重70-120g摩西球囊霉菌剂。
[0056]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0057]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为23_27°C。光照时间为24小时每天。
[0058]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的密闭林地下培育，采用Hogland营养液追肥，并以2_3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0059]实施例7
本实施例提供一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤:
a.制备兰科植物的生根苗；
b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗；
c.菌化生根苗移栽；
所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
[0060]本实施例中，所述生根苗是通过制备兰科植物去毒愈伤组织，再诱导愈伤组织生根而获得的。本实施例中，所述`白蘑科真菌为蜜环菌。本实施例中，所述摩西球囊霉为市售的摩西球囊霉菌剂。所述多不饱和脂肪酸为4ml浓度为3ml/L的花生四烯酸水溶液。所述移栽基质为置于苗盘中的腐殖土。
[0061]所述共生培养基可根据不同种类兰科植物的特性，选择其使用的市售组培营养液，所述共生培养基中假蜜环菌的浓度为菌体干重0.03mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为每植有100株移栽苗的腐殖土施加干重100g摩西球囊霉菌剂。
[0062]所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
[0063]所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为25°C。光照时间为24小时每天。
[0064]所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的密闭林地下培育，采用Hogland营养液追肥，并以2_3天频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。其余栽培方式均与现有技术一致。
[0065]分别采用实施例1-7的方法培育金线莲每组20株，。60日后测试一次平均幼苗的生物量，其结果如表1所示。
[0066]分别采用实施例1-7的方法培育天麻，每组20株，60日后检测其平均幼苗生物量增长情况，其结果如表2所示。
[0067]对照例I
本对照例提供一种兰科植物组培方法，其未使用多不饱和脂肪酸，其余步骤与实施例1一致。
[0068]对照例2
本对照例提供一种兰科植物组培方法，其未对生根苗接种白蘑科真菌，其余步骤与实施例I 一致。
[0069]对照例3
本对照例提供一种兰科植物组培方法，其未对生根苗接种摩西球囊霉，其余步骤与实施例I 一致。
[0070]对照例4
本对照例提供一种兰科植物组培方法，其未对生根苗接种摩西球囊霉、白蘑科真菌，亦未施用多不饱和脂肪酸。其余步骤与实施例1 一致。
[0071 ] 采用对照例1-4的组培方法培育金线莲，每组20株，60日后检测其平均生物量，其结果如表1所示。
[0072]采用对照例1-4的组培方法培育天麻，每组20株，60日后检测其平均生物量，其结果如表2所示。
[0073]表1培养60日金线莲生物量及多糖含量_
【权利要求】
1.一种兰科植物组织培养方法，包括以下步骤: a.制备兰科植物的生根苗； b.将所述生根苗与白蘑科真菌共同接种至共生培养基中培养直至菌索完全覆盖共生培养基，获得菌化生根苗； c.菌化生根苗移栽； 所述菌化生根苗移栽包括将所述菌化生根苗植入移栽基质中，同时向移栽基质接种摩西球囊霉，再向所述菌化生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液。
2.根据权利要求1所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述多不饱和脂肪酸为花生四烯酸、亚油酸、共轭亚油酸、a -亚麻酸、Y -亚麻酸、全顺式-4，7，10, 13，16，19-二十二碳六烯酸、全顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸中的一种或多种的混合物；所述培养液为浓度在lmL/L-3ml/L的所述多不饱和脂肪酸与水的乳浊液。
3.根据权利要求2所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述共生培养基中白蘑科真菌的浓度为0.01mg-0.5mg/ml ;所述摩西球囊霉的接种量为70_120g/100株移栽苗。
4.根据权利要求1-3任一项所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述白蘑科真菌为蜜环菌属或小蜜环菌属中的一种或多种真菌。
5.根据权利要求4所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述向所述生根苗和/或移栽基质喷洒含有多不饱和脂肪酸的培养液是指生根苗和/或移栽基质喷洒3-4mL/10株生根苗培养液。
6.根据权利要求5所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述步骤c中植入移栽基质的生根苗其根部至植物学顶端长度为3-7cm。
7.根据权利要求5-6任一项所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述步骤b中光照强度为30001UX，培养温度为23-27°C。
8.根据权利要求5-6任一项所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述生根苗移栽还包括植入移栽基质后将移栽苗置于空气湿度大于60%的大棚或密闭林地下培育，追肥，并以2-3天的频率对其灌溉一次，保持移栽基质的湿润。
9.根据权利要求1-3、5-6任一项所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述兰科植物包括石斛、天麻或金线莲。
10.根据权利要求 9所述的兰科植物组织培养方法，其特征在于:所述兰科植物为金线连。
【文档编号】A01H4/00GK103704138SQ201310728135
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】魏晓辰 申请人:魏晓辰
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