一种蜡状芽孢杆菌及其应用的制作方法
一种蜡状芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体公开了一种蜡状芽孢杆菌。本发明所述蜡状芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.7979。本发明所述蜡状芽孢杆菌可以稳定定殖在土壤中，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍，并对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用，而且可促进香草兰的生长，可应用于防治尖孢镰刀菌和促进香草兰生长中以及相关产品的制备中。
【专利说明】一种蜡状芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种蜡状芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002]香草兰(Vanilla planifolia Andrews)是兰科热带藤本香料植物,有“天然食品香料之王”的美誉。其鲜豆荚经过生香加工后含有250多种芳香成分，香气独特，被广泛用于调制各种高级香烟、名酒、茶叶，是各类高档食品和饮料的配香原料，在国际市场上供不应求。
[0003]香草兰为多年生作物，随着种植年限的增加，土壤微生物区系失调，土传病原菌根茎腐病致病菌-尖孢镰刀菌的数量明显增加，土壤微生物多样性趋于简单，香草兰长势弱，出现连作生物障碍问题，严重制约了香草兰种植业的可持续发展。为降低病原菌数量，生产中大量使用农药，导致生产成本增加、农民负担加重，豆荚品质下降，生态环境严重污染。目前，投产期香草兰种植园土传致病菌增加，有益细菌减少，土壤微生物区系失衡已经成为制约香草兰规模化种植的主要因素，也是亟待解决的关键问题。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蜡状芽孢杆菌，使得该菌株对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用，且能够在土壤中稳定定殖。
[0005]此外，本发明的另一个发明目的是所述蜡状芽孢杆菌微生物肥料能够促进香草兰的生长。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种从20年园龄香草兰种植园中长势较好的根际土壤中分离得到的菌株，命名为菌株F-6，筛选分离方法如下:
[0007]选择20年园龄香草兰种植园中长势较好的根际土壤，样品带回实验室稀释涂布、培养。挑选在血琼脂培养基上有明显溶血圈的菌株(表明其可产生抗真菌脂肽类活性物质)，再通过平板对峙试验复筛出对香草兰根茎腐病致病菌-尖孢镰刀菌有显著抑制作用的菌株F-6。通过16S rDNA方法(其16S rDNA如SEQ ID NO:1所示)鉴定菌种为蜡状芽孢杆菌。菌株F-6可产生抗真菌脂肽类物质，在以麦芽糖、蛋白胨为唯一碳、氮源的条件下生长良好。
[0008]本发明所述蜡状芽孢杆菌已于2013年8月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.7979。
[0009]本发明所述蜡状芽孢杆菌能够显著抑制尖孢镰刀菌，同时，以107cfu/g数量施用本发明所述蜡状芽孢杆菌4个月后，其在土壤中的数量仍保持在105cfu/g以上，充分表明本发明所述蜡状芽孢杆菌可以稳定定殖在土壤中，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍。
[0010]因此，本发明还提供所述蜡状芽孢杆菌在防治尖孢镰刀菌中的应用以及在制备防治尖孢镰刀菌的产品中的应用，其中，所述产品优选为生防制剂或微生物肥料。
[0011]此外，本发明还提供了一种生防制剂及其制备方法，以及一种微生物肥料及其制备方法。
[0012]当本发明所述蜡状芽孢杆菌应用到生防制剂的制备中时，所述生防制剂包括保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌以及生防制剂上可接受的助剂。所述生防制剂上可接受的助剂可以为本领域常用的物质，如载体油、增活剂以及紫外保护剂等。
[0013]所述生防制剂的制备方法为，将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于PH值为6-8的NA液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后添加生防制剂可接受的助剂即得。其中，作为优选，所述培养条件为28 V _35°C，振荡速度为160-220转/min，培养时间为24h_48h，最优选为36h。作为优选，所述NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。所述生防制剂上可接受的助剂可以为本领域常用的物质，如载体油、增活剂以及紫外保护剂等。
[0014]当本发明所述蜡状芽孢杆菌应用到微生物肥料的制备中时，所述微生物肥料，由保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌以及牲畜家禽粪便经固体发酵获得。作为优选，所述牲畜家禽粪便为牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪、鸭粪、鹅粪或它们的任意种混合物，更优选的，所述牲畜家禽粪便为腐熟后的牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪、鸭粪、鹅粪或它们的任意种混合物。最优选的，所述腐熟的各牲畜家禽粪便中，有机质质量比含量>35%，有机氮质量比含量为
1.0%-2.0%，含水量质量比为25%-30%。
[0015]所述微生物肥料制备方法包括以下步骤:
[0016]步骤1、将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于pH值为6_8的NA液
体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后获得菌悬液；
[0017]步骤2、将菌悬液接种到牲畜家禽粪便中进行固体发酵至所述蜡状芽孢杆菌数量达到108cfu/g以上，期间固体发酵温度不高于50°C，获得微生物菌肥。
[0018]其中，作为优选，所述培养条件为28°C -35°C，振荡速度为160-220转/min，培养时间为24h-48h，最优选为36h。作为优选，所述NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。
[0019]作为优选，所述牲畜家禽粪便为牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪、鸭粪、鹅粪或它们的任意种混合物，更优选的，所述牲畜家禽粪便为腐熟后的牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪、鸭粪、鹅粪或它们的任意种混合物。最优选的，所述腐熟的各牲畜家禽粪便中，有机质质量比含量>35%，有机氮质量比含量为1.0%-2.0%，含水量质量比为25%-30%。
[0020]作为优选，所述菌悬液和牲畜家禽粪便的体积质量比为lmL-2mL:1Ogo
[0021]作为所述微生物肥料制备的优选方案，还包括步骤3:
[0022]将所述微生物菌肥进行后熟3-5天，最后在温度45°C _6(TC将其含水量蒸发至30%以下。
[0023]本发明所述微生物肥料除了能够明显抑制尖孢镰刀菌外，还能够促进香草兰的生长，如提高香草兰根系干重、茎干重、叶片干重、根系直径、根系总体积等。同时施用含有107cfu/g数量蜡状芽孢杆菌的微生物肥料4个月后，其在土壤中的数量仍保持在107cfu/g以上，充分表明本发明所述微生物肥料可以稳定定殖在土壤中，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍。
[0024]由以上技术方案可知，本发明所述蜡状芽孢杆菌可以稳定定殖在土壤中，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍，并对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用，而且可促进香草兰的生长，可应用于防治尖孢镰刀菌以及相关产品的制备中。
[0025]生物保藏说明
[0026]分类命名:腊状芽孢杆菌,Bacillus cereus.于2013年8月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号 为CGMCC N0.7979。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1所示为不同处理对香草兰植株地上部及根系干重的影响的柱形图，每个柱形图所代表的含义参见图1图例，柱形图上a、b、C、ab、be、Cd字母表示差异显著程度；
[0028]图2所示为不同处理对香草兰根系直径和根系总体积的影响的柱形图，每个柱形图所代表的含义参见图2横纵坐标标示，柱形图上a、b、ab字母表示差异显著程度；
[0029]图3所示为不同处理对香草兰根际土壤尖孢镰刀菌数量的影响的柱形图，每个柱形图所代表的含义参见图3横纵坐标标示，柱形图上a、b、c字母表示差异显著程度；
[0030]图4所示为菌株F-6在香草兰根际土壤定殖情况的柱形图，每个柱形图所代表的含义参见图4横纵坐标标示，柱形图上a、b、c字母表示差异显著程度。
【具体实施方式】
[0031]本发明公开了一种蜡状芽孢杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述蜡状芽孢杆菌及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0032]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0033]实施例1:本发明所述蜡状芽孢杆菌的分离和鉴定
[0034]选择20年园龄香草兰种植园中长势较好的根际土壤，样品带回实验室稀释涂布、培养。挑选在血琼脂培养基上有明显溶血圈的菌株(表明其可产生抗真菌脂肽类活性物质)，再通过平板对峙试验复筛出对香草兰根茎腐病致病菌-尖孢镰刀菌有显著抑制作用的菌株F-6。通过16S rDNA方法鉴定菌种，该菌株F-6属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),可产生抗真菌脂肽类物质，在以麦芽糖、蛋白胨为唯一碳、氮源的条件下生长良好。菌种于30%甘油中-80°C保存。
[0035]所述蜡状芽孢杆菌已于2013年8月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC N0.7979。
[0036]实施例2:本发明所述生防制剂的制备
[0037]将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于pH值为6_8的NA液体培养基中，在28°C -35°C、160-220转/min转速下振荡培养36h，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后添加载体油、增活剂和紫外保护剂即得。
[0038]其中，NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。
[0039]实施例3:本发明所述微生物肥料的制备
[0040]将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于pH值为6_8的NA液体培养基中，在28°C -35°C、160-220转/min转速下振荡培养36h，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后获得菌悬液；其中，NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。
[0041]将菌悬液接种到腐熟后的牛粪中(菌悬液和腐熟牛粪的体积质量比为2mL:1Og)进行固体发酵至所述蜡状芽孢杆菌数量达到108cfu/g以上，期间固体发酵温度不高于50°C，每天翻动I次，获得微生物菌肥。其中，腐熟的牛粪中有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1.0%-2.0%，含水量质量比为25%-30%。
[0042]将所得到的微生物菌肥进行后熟4天，最后在温度45°C -60°C将其含水量蒸发至30%以下。
[0043]经过后熟的微生物肥料含有108cfu/g以上的蜡状芽孢杆菌，总氮磷钾养分质量比含量为5%-11%，有机质质量比含量为30%-40%。
[0044]实施例4:盆栽试验
[0045]采集20年园龄、有明显连作生物障碍的香草兰种植园土壤做为供试土壤，试验盆钵采用周转箱(内尺寸600 X 420 X 165_)，选取长势一致的健康香草兰做为供试苗。
[0046]将绿色荧光蛋白分子标记后的菌株F-6接种至2000ml含0.3mg/ml卡那霉素的NA液体培养基中，摇床培养36h,离心菌体,用无菌水重悬,再离心，用等体积的无菌水悬浮后获的菌悬液；其中，NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。
[0047]将菌悬液接种到腐熟后的牛粪中(菌悬液和腐熟牛粪的体积质量比为2mL:1Og)进行固体发酵至所述蜡状芽孢杆菌数量达到108cfu/g，期间固体发酵温度不高于50°C，每天翻动I次，获得微生物菌肥。其中，腐熟的牛粪中有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1.0%-2.0%，含水量质量比为25%-30%。
[0048]试验设4个处理:1)对照(CK，施用等量化肥)；2)施用牛粪堆肥(0M，施肥量3%)；3)施用标记菌株F-6菌悬液(F-6，接种浓度为107cfu/g 土);4)施用微生物肥料(B10，施肥量3%，F-6接种浓度为107cfu/g 土)。该盆栽试验每盆栽种I株香草兰,每处理重复4次，三次独立试验，共48盆。
[0049]测定指标:在香草兰移栽4个月后毁灭性采样，采用根系扫描仪测定根系形态；植株地上部及根系干重；根际土壤标记菌株F-6及尖孢镰刀菌数量。结果分别见图1-图4。
[0050]由图1可知，施用微生物肥料的处理香草兰根系干重、叶片干重和茎干重除茎干重和施用牛粪堆肥处理不显著外，其余均显著高于其他处理。
[0051]由图2可知，施用微生物肥料的处理根系直径和根系总体积均高于其他处理，这说明施用微生物肥料可促进香草兰根系生长。另外，施用牛粪的处理根系直径和总体积与对照相比无明显差异，表明施用牛粪有机肥对改善香草兰根系生长状况无显著效果。
[0052]由图3可知，施用微生物肥料及菌液F-6的处理香草兰根际土壤尖孢镰刀菌数量显著低于对照及施用牛粪的处理，施用微生物肥料的处理尖孢镰刀菌数量显著低于施用F-6的处理，另外，对照与施用牛粪的处理之间差异不显著。表明施用微生物肥料或F-6菌液均可显著抑制香草兰根际土壤有害真菌尖孢镰刀菌的生长，降低其在根际土壤数量。
[0053]由图4可知，施用F-6菌液或其微生物肥料4个月后，F_6在土壤中的浓度分别在105cfu/g及107cfu/g以上，而在对照及施用牛粪堆肥的处理中并未检测到该菌株，这说明F-6可在土壤中稳定定殖，利于香草兰生长，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍。并且，施用微生物肥料的处理F-6在根际土壤的数量显著高于单独施用菌液的处理，这表明微生物有机肥可为F-6提供丰富的碳、氮源，更利于其在土壤中存活。
[0054] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种蜡状芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC N0.7979。
2.根据权利要求1所述蜡状芽孢杆菌，其特征在于，16SrDNA如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述蜡状芽孢杆菌在防治尖孢镰刀菌中的应用。
4.权利要求1所述蜡状芽孢杆菌在制备防治尖孢镰刀菌的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述产品为生防制剂或微生物肥料。
6.一种生防制剂，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌以及生防制剂上可接受的助剂。
7.一种生防制剂的制备方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于PH值为6-8的NA液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后添加生防制剂可接受的助剂即得。
8.—种微生物肥料，其特征在于，由保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌以及牲畜家禽粪便经固体发酵获得。
9.一种微生物肥料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于pH值为6_8的NA液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后获得菌悬液； 步骤2、将菌悬液接种到牲畜家禽粪便中进行固体发酵至所述蜡状芽孢杆菌数量达到108cfu/g以上，期间固体发酵温度不高于50°C，获得微生物菌肥。`
10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，还包括步骤3: 将所述微生物菌肥进行后熟3-5天，最后在温度45°C -60°C将其含水量蒸发至30%以下。
【文档编号】A01P3/00GK103667158SQ201310737546
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】王辉, 赵青云, 赵秋芳, 王 华, 庄辉发, 宋应辉, 朱自慧 申请人:中国热带农业科学院香料饮料研究所
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体公开了一种蜡状芽孢杆菌。本发明所述蜡状芽孢杆菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.7979。本发明所述蜡状芽孢杆菌可以稳定定殖在土壤中，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍，并对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用，而且可促进香草兰的生长，可应用于防治尖孢镰刀菌和促进香草兰生长中以及相关产品的制备中。
【专利说明】一种蜡状芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种蜡状芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002]香草兰(Vanilla planifolia Andrews)是兰科热带藤本香料植物,有“天然食品香料之王”的美誉。其鲜豆荚经过生香加工后含有250多种芳香成分，香气独特，被广泛用于调制各种高级香烟、名酒、茶叶，是各类高档食品和饮料的配香原料，在国际市场上供不应求。
[0003]香草兰为多年生作物，随着种植年限的增加，土壤微生物区系失调，土传病原菌根茎腐病致病菌-尖孢镰刀菌的数量明显增加，土壤微生物多样性趋于简单，香草兰长势弱，出现连作生物障碍问题，严重制约了香草兰种植业的可持续发展。为降低病原菌数量，生产中大量使用农药，导致生产成本增加、农民负担加重，豆荚品质下降，生态环境严重污染。目前，投产期香草兰种植园土传致病菌增加，有益细菌减少，土壤微生物区系失衡已经成为制约香草兰规模化种植的主要因素，也是亟待解决的关键问题。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种蜡状芽孢杆菌，使得该菌株对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用，且能够在土壤中稳定定殖。
[0005]此外，本发明的另一个发明目的是所述蜡状芽孢杆菌微生物肥料能够促进香草兰的生长。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种从20年园龄香草兰种植园中长势较好的根际土壤中分离得到的菌株，命名为菌株F-6，筛选分离方法如下:
[0007]选择20年园龄香草兰种植园中长势较好的根际土壤，样品带回实验室稀释涂布、培养。挑选在血琼脂培养基上有明显溶血圈的菌株(表明其可产生抗真菌脂肽类活性物质)，再通过平板对峙试验复筛出对香草兰根茎腐病致病菌-尖孢镰刀菌有显著抑制作用的菌株F-6。通过16S rDNA方法(其16S rDNA如SEQ ID NO:1所示)鉴定菌种为蜡状芽孢杆菌。菌株F-6可产生抗真菌脂肽类物质，在以麦芽糖、蛋白胨为唯一碳、氮源的条件下生长良好。
[0008]本发明所述蜡状芽孢杆菌已于2013年8月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.7979。
[0009]本发明所述蜡状芽孢杆菌能够显著抑制尖孢镰刀菌，同时，以107cfu/g数量施用本发明所述蜡状芽孢杆菌4个月后，其在土壤中的数量仍保持在105cfu/g以上，充分表明本发明所述蜡状芽孢杆菌可以稳定定殖在土壤中，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍。
[0010]因此，本发明还提供所述蜡状芽孢杆菌在防治尖孢镰刀菌中的应用以及在制备防治尖孢镰刀菌的产品中的应用，其中，所述产品优选为生防制剂或微生物肥料。
[0011]此外，本发明还提供了一种生防制剂及其制备方法，以及一种微生物肥料及其制备方法。
[0012]当本发明所述蜡状芽孢杆菌应用到生防制剂的制备中时，所述生防制剂包括保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌以及生防制剂上可接受的助剂。所述生防制剂上可接受的助剂可以为本领域常用的物质，如载体油、增活剂以及紫外保护剂等。
[0013]所述生防制剂的制备方法为，将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于PH值为6-8的NA液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后添加生防制剂可接受的助剂即得。其中，作为优选，所述培养条件为28 V _35°C，振荡速度为160-220转/min，培养时间为24h_48h，最优选为36h。作为优选，所述NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。所述生防制剂上可接受的助剂可以为本领域常用的物质，如载体油、增活剂以及紫外保护剂等。
[0014]当本发明所述蜡状芽孢杆菌应用到微生物肥料的制备中时，所述微生物肥料，由保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌以及牲畜家禽粪便经固体发酵获得。作为优选，所述牲畜家禽粪便为牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪、鸭粪、鹅粪或它们的任意种混合物，更优选的，所述牲畜家禽粪便为腐熟后的牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪、鸭粪、鹅粪或它们的任意种混合物。最优选的，所述腐熟的各牲畜家禽粪便中，有机质质量比含量>35%，有机氮质量比含量为
1.0%-2.0%，含水量质量比为25%-30%。
[0015]所述微生物肥料制备方法包括以下步骤:
[0016]步骤1、将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于pH值为6_8的NA液
体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后获得菌悬液；
[0017]步骤2、将菌悬液接种到牲畜家禽粪便中进行固体发酵至所述蜡状芽孢杆菌数量达到108cfu/g以上，期间固体发酵温度不高于50°C，获得微生物菌肥。
[0018]其中，作为优选，所述培养条件为28°C -35°C，振荡速度为160-220转/min，培养时间为24h-48h，最优选为36h。作为优选，所述NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。
[0019]作为优选，所述牲畜家禽粪便为牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪、鸭粪、鹅粪或它们的任意种混合物，更优选的，所述牲畜家禽粪便为腐熟后的牛粪、猪粪、羊粪、鸡粪、鸭粪、鹅粪或它们的任意种混合物。最优选的，所述腐熟的各牲畜家禽粪便中，有机质质量比含量>35%，有机氮质量比含量为1.0%-2.0%，含水量质量比为25%-30%。
[0020]作为优选，所述菌悬液和牲畜家禽粪便的体积质量比为lmL-2mL:1Ogo
[0021]作为所述微生物肥料制备的优选方案，还包括步骤3:
[0022]将所述微生物菌肥进行后熟3-5天，最后在温度45°C _6(TC将其含水量蒸发至30%以下。
[0023]本发明所述微生物肥料除了能够明显抑制尖孢镰刀菌外，还能够促进香草兰的生长，如提高香草兰根系干重、茎干重、叶片干重、根系直径、根系总体积等。同时施用含有107cfu/g数量蜡状芽孢杆菌的微生物肥料4个月后，其在土壤中的数量仍保持在107cfu/g以上，充分表明本发明所述微生物肥料可以稳定定殖在土壤中，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍。
[0024]由以上技术方案可知，本发明所述蜡状芽孢杆菌可以稳定定殖在土壤中，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍，并对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用，而且可促进香草兰的生长，可应用于防治尖孢镰刀菌以及相关产品的制备中。
[0025]生物保藏说明
[0026]分类命名:腊状芽孢杆菌,Bacillus cereus.于2013年8月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号 为CGMCC N0.7979。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1所示为不同处理对香草兰植株地上部及根系干重的影响的柱形图，每个柱形图所代表的含义参见图1图例，柱形图上a、b、C、ab、be、Cd字母表示差异显著程度；
[0028]图2所示为不同处理对香草兰根系直径和根系总体积的影响的柱形图，每个柱形图所代表的含义参见图2横纵坐标标示，柱形图上a、b、ab字母表示差异显著程度；
[0029]图3所示为不同处理对香草兰根际土壤尖孢镰刀菌数量的影响的柱形图，每个柱形图所代表的含义参见图3横纵坐标标示，柱形图上a、b、c字母表示差异显著程度；
[0030]图4所示为菌株F-6在香草兰根际土壤定殖情况的柱形图，每个柱形图所代表的含义参见图4横纵坐标标示，柱形图上a、b、c字母表示差异显著程度。
【具体实施方式】
[0031]本发明公开了一种蜡状芽孢杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述蜡状芽孢杆菌及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0032]下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0033]实施例1:本发明所述蜡状芽孢杆菌的分离和鉴定
[0034]选择20年园龄香草兰种植园中长势较好的根际土壤，样品带回实验室稀释涂布、培养。挑选在血琼脂培养基上有明显溶血圈的菌株(表明其可产生抗真菌脂肽类活性物质)，再通过平板对峙试验复筛出对香草兰根茎腐病致病菌-尖孢镰刀菌有显著抑制作用的菌株F-6。通过16S rDNA方法鉴定菌种，该菌株F-6属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),可产生抗真菌脂肽类物质，在以麦芽糖、蛋白胨为唯一碳、氮源的条件下生长良好。菌种于30%甘油中-80°C保存。
[0035]所述蜡状芽孢杆菌已于2013年8月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC N0.7979。
[0036]实施例2:本发明所述生防制剂的制备
[0037]将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于pH值为6_8的NA液体培养基中，在28°C -35°C、160-220转/min转速下振荡培养36h，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后添加载体油、增活剂和紫外保护剂即得。
[0038]其中，NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。
[0039]实施例3:本发明所述微生物肥料的制备
[0040]将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于pH值为6_8的NA液体培养基中，在28°C -35°C、160-220转/min转速下振荡培养36h，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后获得菌悬液；其中，NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。
[0041]将菌悬液接种到腐熟后的牛粪中(菌悬液和腐熟牛粪的体积质量比为2mL:1Og)进行固体发酵至所述蜡状芽孢杆菌数量达到108cfu/g以上，期间固体发酵温度不高于50°C，每天翻动I次，获得微生物菌肥。其中，腐熟的牛粪中有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1.0%-2.0%，含水量质量比为25%-30%。
[0042]将所得到的微生物菌肥进行后熟4天，最后在温度45°C -60°C将其含水量蒸发至30%以下。
[0043]经过后熟的微生物肥料含有108cfu/g以上的蜡状芽孢杆菌，总氮磷钾养分质量比含量为5%-11%，有机质质量比含量为30%-40%。
[0044]实施例4:盆栽试验
[0045]采集20年园龄、有明显连作生物障碍的香草兰种植园土壤做为供试土壤，试验盆钵采用周转箱(内尺寸600 X 420 X 165_)，选取长势一致的健康香草兰做为供试苗。
[0046]将绿色荧光蛋白分子标记后的菌株F-6接种至2000ml含0.3mg/ml卡那霉素的NA液体培养基中，摇床培养36h,离心菌体,用无菌水重悬,再离心，用等体积的无菌水悬浮后获的菌悬液；其中，NA液体培养基配方为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，余量为水。
[0047]将菌悬液接种到腐熟后的牛粪中(菌悬液和腐熟牛粪的体积质量比为2mL:1Og)进行固体发酵至所述蜡状芽孢杆菌数量达到108cfu/g，期间固体发酵温度不高于50°C，每天翻动I次，获得微生物菌肥。其中，腐熟的牛粪中有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1.0%-2.0%，含水量质量比为25%-30%。
[0048]试验设4个处理:1)对照(CK，施用等量化肥)；2)施用牛粪堆肥(0M，施肥量3%)；3)施用标记菌株F-6菌悬液(F-6，接种浓度为107cfu/g 土);4)施用微生物肥料(B10，施肥量3%，F-6接种浓度为107cfu/g 土)。该盆栽试验每盆栽种I株香草兰,每处理重复4次，三次独立试验，共48盆。
[0049]测定指标:在香草兰移栽4个月后毁灭性采样，采用根系扫描仪测定根系形态；植株地上部及根系干重；根际土壤标记菌株F-6及尖孢镰刀菌数量。结果分别见图1-图4。
[0050]由图1可知，施用微生物肥料的处理香草兰根系干重、叶片干重和茎干重除茎干重和施用牛粪堆肥处理不显著外，其余均显著高于其他处理。
[0051]由图2可知，施用微生物肥料的处理根系直径和根系总体积均高于其他处理，这说明施用微生物肥料可促进香草兰根系生长。另外，施用牛粪的处理根系直径和总体积与对照相比无明显差异，表明施用牛粪有机肥对改善香草兰根系生长状况无显著效果。
[0052]由图3可知，施用微生物肥料及菌液F-6的处理香草兰根际土壤尖孢镰刀菌数量显著低于对照及施用牛粪的处理，施用微生物肥料的处理尖孢镰刀菌数量显著低于施用F-6的处理，另外，对照与施用牛粪的处理之间差异不显著。表明施用微生物肥料或F-6菌液均可显著抑制香草兰根际土壤有害真菌尖孢镰刀菌的生长，降低其在根际土壤数量。
[0053]由图4可知，施用F-6菌液或其微生物肥料4个月后，F_6在土壤中的浓度分别在105cfu/g及107cfu/g以上，而在对照及施用牛粪堆肥的处理中并未检测到该菌株，这说明F-6可在土壤中稳定定殖，利于香草兰生长，改善土壤微生物环境，消除连作生物障碍。并且，施用微生物肥料的处理F-6在根际土壤的数量显著高于单独施用菌液的处理，这表明微生物有机肥可为F-6提供丰富的碳、氮源，更利于其在土壤中存活。
[0054] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种蜡状芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC N0.7979。
2.根据权利要求1所述蜡状芽孢杆菌，其特征在于，16SrDNA如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述蜡状芽孢杆菌在防治尖孢镰刀菌中的应用。
4.权利要求1所述蜡状芽孢杆菌在制备防治尖孢镰刀菌的产品中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述产品为生防制剂或微生物肥料。
6.一种生防制剂，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌以及生防制剂上可接受的助剂。
7.一种生防制剂的制备方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于PH值为6-8的NA液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后添加生防制剂可接受的助剂即得。
8.—种微生物肥料，其特征在于，由保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌以及牲畜家禽粪便经固体发酵获得。
9.一种微生物肥料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1、将保藏编号为CGMCC N0.7979的蜡状芽孢杆菌接种于pH值为6_8的NA液体培养基中振荡培养，离心菌体，用无菌水重悬，再离心，用等体积的无菌水悬浮后获得菌悬液； 步骤2、将菌悬液接种到牲畜家禽粪便中进行固体发酵至所述蜡状芽孢杆菌数量达到108cfu/g以上，期间固体发酵温度不高于50°C，获得微生物菌肥。`
10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，还包括步骤3: 将所述微生物菌肥进行后熟3-5天，最后在温度45°C -60°C将其含水量蒸发至30%以下。
【文档编号】A01P3/00GK103667158SQ201310737546
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】王辉, 赵青云, 赵秋芳, 王 华, 庄辉发, 宋应辉, 朱自慧 申请人:中国热带农业科学院香料饮料研究所
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