用于生物传感器的磁清洗的制作方法
专利名称：用于生物传感器的磁清洗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流 体中的磁化或可磁化靶成分的感测设备，涉及对应的检测方法，涉及用于控制这种设备的 软件，以及涉及制造这种设备的对应方法。
背景技术：
已知使用诸如蛋白质微阵列或其他方法的生物化学和医学诊断测定确定微生物 实体之间的相互作用，所述微生物实体例如为病毒、原生动物、细菌、其细胞器、脂质体以及 诸如蛋白质或DNA的生物活性分子。US 2005/0048599A1公开了一种用于研究标记有粒子使得(例如，磁性)力可以被 施加于其上的微生物的方法。在该方法的一个实施例中，将光束通过透明材料引导到其被 全内反射的表面。作为倏逝波离开透明材料的该束光在表面处被微生物和/或其他成分散 射，之后被光电检测器检测或用于照射微生物以进行可视观察。US 2006205093描述了生物感测的挑战为检测具有高浓度背景材料(例如，mmol/ 1的白蛋白)的复杂混合物(例如，血液)中的小浓度特异性靶分子(例如，在pmol/Ι的范 围以及更低范围内的肿瘤标记物)。一种常用的生物感测方法为用捕获分子(例如，抗体、 核酸等)来涂布表面。这些分子捕获随后被检测的靶。可以使用或不使用标记来执行对靶 分子的检测。标记步骤可以发生在表面上捕获之前或之后。标记可以直接耦合到靶，或者 间接地，例如经由另一生物活性分子，将标记耦合到靶。最经常地，例如，荧光分子的光学标 记被用于检测。生物感测中的重要问题为检测标记或靶分子到生物传感器的表面或捕获分子的 非特异性结合。这产生背景信号，所述背景信号降低了生物传感器的分析灵敏度和特异性。 在诊断测定中，通过使用严格性(stringency)程序可以降低非特异性结合。严格性程序旨 在免除不希望的非特异性吸附结合，并且仅保持捕获分子和(标记的)靶分子之间的特异 性相互作用。最常用的严格化方法为清洗步骤。小心地调制清洗液的组分和温度以降低给 定测定的背景。人们越来越关注多分析物检测，其中在被称为生物芯片或(微)阵列的单个表面 上同时测量许多不同的分子。生物芯片表面包括许多点(“捕获点”)，每个点含有一个或多 个不同的捕获分子。很难改进多分析物传感器的整个芯片严格化清洗步骤，这是由于需要 抑制大量可能的背景信号，与此同时，要保持不同的特异性相互作用的范围没有受到干扰， 并且要保持不同靶和捕获分子的自然状态。结果得到较低的分析灵敏度和较低的分析特异 性。多分析物严格性问题对于蛋白质检测非常重要，这是由于蛋白质和蛋白质-蛋白质相 互作用非常不均勻，并且特定清洗步骤对蛋白质变性的影响和对蛋白质-蛋白质相互作用 的影响非常显著。Science 第 289 期的 Macbeatch 和 Schreiber (2000 年)第 I76O-I763 页描述了在 显微镜载玻片上使用天然蛋白质的文献中已经认识到蛋白质阵列或微阵列的这一主要缺陷。在与靶分子结合之前，通过在捕获分子上增加BSA来降低非特异性蛋白质_蛋白质结 合。2002年十二月关于蛋白质微阵列技术的综述文献(Macbeath (2002)Nature Genetics 32，S526-532)提到将特异性评定为蛋白质微阵列技术的关键特征的问题，但并没有给出建 议的可能溶液。目前为止，免疫学领域实现了蛋白质阵列技术的最成功应用。抗原和抗体 之间的高结合强度允许严格化清洗条件以克服抗原和抗体的非特异性相互作用。解决严格性问题的化学方式为通过设计出能与靶更强烈且更特异性相互作用的 捕获分子。示例为携带光反应基团的光适体(Photo-aptamer)、合成捕获分子，所述光反应 基团能够在靶分子的特异性位点处交联(如在Brody & Gold (2000) J.Biotechnol.第7期 第5-13页所综述的)。当包括光适体的捕获表面暴露于样品并且应用光致激发步骤时，与 适体结合位点相匹配的分子变为与其共价联接。随后，可以应用严谨的清洗步骤以移除没 有光致反应的分子。光适体方法的缺点在于其需要为每个靶设计新的光适体、需要光致激 发步骤、光交联步骤自身并不能区分特异性结合分子和非特异性结合分子，以及其为终点 检测方法。US 2006205093描述了至少使用例如珠的第一粒子或微载体以及例如第二珠的也 可以为微载体的第二粒子来确定生物活性分子之间的相互作用。至少第一微载体是磁性 的。当使用两种珠且两种珠均有磁性时，珠优选地在其磁矩大小上不同。提供磁场以放置 生物活性分子之间的受力结合，从而区分不同力的结合。一方面，第二珠(具有较大磁矩) 用于磁性地移除以较小磁矩联接到珠的靶分子，所述靶分子较弱地结合到捕获分子(其自 身通常耦合到可移动表面或固定表面)。
发明内容
本发明的目的为提供用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化 成分的流体中的磁化或可磁化靶成分的改进的感测设备、对应的检测方法、用于控制这种 设备的软件以及制造这种设备的对应方法。根据第一方面，本发明提供了 一种用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流体中的 所述磁化或可磁化靶成分的感测设备，所述设备包括-磁场发生器，其被布置成提供磁场以向适于选择性地结合所述靶成分的结合表 面吸引所述磁化或可磁化成分；-磁场控制器，其被布置成控制磁场发生器以便施加磁场来在结合表面上将所述 磁化或可磁化成分聚集成列，随后降低所述磁场以使得所述列瓦解，从而允许来自所述列 的所述磁化或可磁化靶成分中的多个结合到所述结合表面，并且重新施加所述磁场以便使 其他磁化或可磁化成分被拉离所述结合表面从而基于结合的靶成分重新形成列，以及_表面灵敏传感器，其用于检测结合到所述结合表面的磁化或可磁化靶成分。这样的重新施加磁场(其最初用于向检测表面吸引磁化或可磁化靶成分)带来的 意外效果是充当磁清洗步骤以免除不希望的弱或非特异性吸附结合，并且仅仅维持受体和 靶成分之间的特异性结合。先前认为这样的清洗步骤需要抽吸步骤或者在结合表面的相对 侧上的第二磁场发生器，以在相反方向吸引不希望的磁化或可磁化成分。因而，意外发现这 可以通过最初用于向传感器表面吸引珠的同一磁场发生器来实现，从而使得能够简化硬件并能够降低成本和大小。另外，重新施加磁场能够使检测读数比其他方式更快地达到稳定水平，从而比仅 依赖于检测随时间的梯度更快操作，或者浓度检测更加灵敏。另一方面提供了一种检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分 的流体中的所述磁化或可磁化靶成分的方法，所述方法包括如下步骤-施加磁场以向结合表面吸引所述磁化或可磁化成分，在结合表面上将所述磁化 或可磁化成分聚集成列，降低磁场以使得所述列瓦解，从而允许来自所述列的所述磁化或 可磁化靶成分中的多个结合到所述结合表面，并且重新施加磁场以便使其他磁化或可磁化 成分被拉离所述结合表面以基于结合的靶成分重新形成列，以及-检测结合到结合表面的磁化或可磁化靶成分，例如，经由表面灵敏检测方法。所述装置或方法的实施例可以具有任意附加的特征，所述特征中的一些记载于权 利要求中，并在后面进行更详细的描述。一个这样的附加特征为包括永磁体的磁场发生器 以及与用于移动永磁体的机械布置一起工作或包括其的控制器。另一个这样的附加特征为 包括电磁体的磁场发生器，以及包括用于控制通过电磁体的电流的电路的控制器。另一个这样的特征为包括用于保持流体的室的设备，所述室具有结合表面。室可 以为设备的集成部分或者可移除部分。另一个这样的特征为具有多个结合表面的设备，每 个结合表面适于结合不同的靶成分。另一个这样的特征为被布置成检测不同靶成分的设 备。这可以包括相对于传感器移动所述结合表面或者具有多个传感器。另一个这样的特征为包括光学检测器的一个或多个传感器。一个替代为用于检测 由结合表面处磁化或可磁化靶成分引起的磁场的量的磁场检测器，例如GNR型检测器。光 学检测器可以包括被布置成检测从结合表面背侧反射的光的量。这可以被布置成在背侧进 行全内反射。所述光学检测器被布置成检测由结合表面处靶成分发出的荧光。所述光学检 测器可以包括被布置成检测透射通过结合表面的光的量的透射检测器。另一个这样的特征 为被布置成在不同时间获取若干读数并具有用于从所述读数得出结果的处理器的检测器。 另一个这样的特征为重新施加强到足以区分对特异性结合与非特异性结合的磁场。另一个 这样的特征为用于移动并控制所述流体的微流体元件。任意这样的附加特征可以结合在一起并且与任意的方面进行结合。对于本领域技 术人员而言其他优势将是明显的，尤其优于现有技术。在不脱离本发明的权利要求的情况 下，可以进行若干改动和修改。因此，应当清楚地理解本发明的形式仅是说明性的，并不旨 在限制本发明的范围。
现在将通过参照附图进行的举例来描述如何实现本发明，在附图中图1示出了根据本发明实施例的设备；图2示出了根据实施例的另一设备；图3示出了根据实施例的方法步骤；以及图4示出了针对各浓度的靶成分的随时间的检测值的图，以及示出了结合表面附 近的磁化或可磁化成分在操作过程中的四个阶段的示意图的插图a)到d)。
具体实施例方式本发明将针对具体实施例并参照特定附图进行描述，但是本发明并不局限于此， 而仅由权利要求书进行限定。所描述的附图仅为示例性的，而非进行限制。在附图中，为了 说明的目的，一些元件的大小可能被放大而非按比例绘制。在本说明书和权利要求书中使 用术语“包括”时，其并不排除其他元件或步骤。当提到单数名词时使用例如，“一”、“一个”、 “该”的不定冠词或定冠词时，这包括多个那样的名词，除非特别指出。在权利要求书中使用的术语“包括”不应当被理解为限制其后列出的手段，其不排 除其他元件或步骤。因此，表述“包括器件A和B的设备”的范围不应当被限制为仅包括部 件A和B的设备。其意味着，就本发明而言，设备的相关部件仅为A和B。另外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分类似元件，而并 不一定用于描述顺序或时序。应当理解，如此使用的术语在特定条件下可互换，并且本文所 描述的本发明的实施例能够以不同于本文所描述或例示的其他顺序进行操作。另外，在说明书和权利要求书中的术语顶部、底部、上、下等用于描述的目的，而不 一定用于描述相对位置。应当理解，如此使用的术语在适当条件下可替换，并且本文所描述 的本发明的实施例能够以不同于本文所描述或例示的其他取向进行操作。所描述的实施例示出了用于确定诸如微生物实体，例如生物活性分子，的实体之 间的相互作用或结合的方法、装置和工具。这些实施例示出了这样的方法，其中可以区分出 不同强度的结合，例如区分出特异性结合和非特异性结合。根据本发明，对特异性结合和非 特异性结合进行区分尤其与多分析物传感器一起使用，其中，多分析物传感器可以同时检 测宽范围的诸如靶分子的靶成分。可以将设备和方法例如用于蛋白质多分析物传感器，这 是由于改变缓冲液条件以改进多分析物传感器的严格性仅仅可以在非常窄的限度内进行。 另外，其在使用了微合成流体和集成电路设备的微阵列和微流体设置中可以有实用价值， 这是由于可以在不丧失灵敏度的情况下缩减所述方法的规模。根据本发明的微电子感测设备的实施例可以用于对包括附着到靶分子的标记粒 子的靶成分进行定性或定量检测。靶成分可以例如为像生物分子、复合物、细胞分数或细 胞这样的生物物质。示例为蛋白质、诸如DNA或RNA的核酸、基因或基因片段、cDNA、酶、碳 水化合物、抗体或抗体片段、受体、细胞或诸如细胞膜或细胞器的细胞成分、细胞裂解液、病 毒、细菌、原生动物等。术语“标记粒子”应当表示具有一些可被检测的性质(例如，光学密 度、磁化率、电荷、荧光、放射性等)，由此间接表示相关靶分子的存在的粒子(原子、分子、 复合物、纳米粒子、微粒子等)。在一些情况下，“靶分子”自身可以充当“标记粒子”。感测设备可以与具有靶成分在此可以进行集中的结合表面的诸如管或室的可移 除载体合作，或者载体及其结合表面可以为与感测设备形成一体中的一部分。本文首先将 术语“结合表面”选择为流体载体表面中特定部分的唯一指代，并且尽管在许多应用中靶成 分实际上结合到所述表面，但是这并不一定如此。全部要求为靶成分可以到达结合表面以 在此进行集中(通常以由与靶成分相关、与靶成分同结合表面的相互作用相关、与靶成分 的移动性相关等的参数确定的浓度)。当传感器使用光学检测时，载体在一些情况下可以具 有针对给定光谱范围的光的高透明性，特别是具有针对由下文将要限定的光源发出的光的 高透明性。载体可以例如由玻璃或一些透明塑料制成。为了实现对生物材料成分的有效评估，生物材料必须要与生物传感器的表面紧密接触。当使用磁性标记时，这可以由磁吸引实现。磁吸引通常用于在短时间内达到期望水 平的灵敏度。由于其加速了结合表面处的聚集，因此，加速了传感器表面处磁性粒子的结合 过程。其次，磁清洗可以取代常规的湿清洗步骤，所述磁清洗更准确并减少了操作动作的次 数。这一用于清除其他成分的第二磁步骤通常通过使用结合表面之上(另外的/单独的) 磁体(永磁体或线圈)来执行。在这一步骤中，从在其中执行生物测量的液体或介质中完 全移除所有剩余“自由”磁性粒子。这种方式的问题在于为了实现磁吸引和磁清洗，需要两个单独的磁系统，或者将 线圈设计成使得可以利用机械或电机手段在吸引和排斥之间进行切换。这种设置会相对复
ο 图1、图2根据本发明实施例的感测设备根据实施例，用于具有表面灵敏检测器的生物传感器的解决方案为可替代的磁清 洗步骤。图1示出了感测设备的示例，该感测设备具有从左到右受阀Vl(I)和v2(2)、泵 Pl (3)以及室(8)底部的结合表面(4)(或结合表面阵列)控制的流体路径。传感器Sl (5) 或这样的传感器阵列被设置在结合表面附近，通常被设置在结合表面之下，但不一定是这 样。传感器例如可以为光学传感器、机械传感器、放射性传感器或磁场传感器。磁体Ml (6) 被布置成使磁场向结合表面吸引流体中的磁化或可磁化成分。磁体由控制器Cl (7)控制， 以遵循下文参照图3和图4描述的步骤。控制器(7)可以实现为常规的处理电路或常规硬 件上运行的软件，并且同永磁体一起使用时，可以包括用于使得或允许永磁体相对于结合 表面运动的手段。或者，在使用一个或多个电磁体时，控制器可以控制到一个或多个电磁体 的电流从而控制磁场的强度、其方向和/或其位置。磁场控制的时间选择可以与感测的时 间选择、控制流体元件或其他部件的时间选择相一致。图2示出了诸如聚合物的具有孔(well)形式的可移除载体的另一实施例，例如， 在底部具有结合表面的聚苯乙烯孔22。感测设备具有承载可移动永磁体28的基底21，并 且具有以光源26形式的传感器或与所述传感器相关联，并且具有光电检测器29或与所述 光电检测器29相关联。为了在结合表面的背面能够进行全内反射，存在玻璃的透明半球 24，所述透明半球24被布置成其平面靠着结合表面的背面，并且其曲面朝下使得来自光源 的光垂直于其表面进入并离开半球以使反射最小化并能够获得更好的检测精度。该传感器使用例如基于受抑全内反射(F-TIR)的光学读出方法以及磁吸引，现在 将对其进行描述。图3、图4根据实施例的方法步骤图3示出了一些主要的方法步骤。在步骤31，施加磁场以向结合表面吸引流体中 的磁化或可磁化成分。如所公知的，这具有建立成列的磁化或可磁化成分的效果，但是这通 常被看作阻碍了生物学结合，并且优选检测顺磁性成分。使用所施加的磁场，可磁化(例 如，顺磁性)成分将沿磁场线被磁化，这使得这些成分堆积成列。独立于诸如永磁体的场被 磁化的成分将同样以沿场线的优选方向排列成列。这样的成分由于其在液体内部聚集而是 次优选的，并且在关闭场时可能不会很容易地“瓦解”。在步骤33，场被降低到足以使得列 瓦解。适于实现这种结果的场强和降低的持续时间可以容易地得到确定，并且它们将取决 于成分的磁化和其他特征、流体的粘性、磁体的定位等。随后，在步骤35，以足以将其他磁化或可磁化成分拉离结合表面而剩下结合到结合表面的靶成分的强度重新施加场。这使得基 于结合到结合表面的靶成分重新建立成列的成分。此外，适于实现这种结果的重新施加的 场强和持续时间实践中能够容易地得到确定，并且它们将取决于结合的强度、成分的磁化 强度和其他特性、流体的粘性、磁体的定位等。在步骤37，传感器用于检测结合到结合表面 的靶成分。由于在结合表面上具有较少的其他磁化或可磁化成分，因此增加了检测的灵敏 度。可以在预定时间段内执行检测，并且可以使用在重新施加磁场之前的读数，以及在重新 施加过程中和在重新施加之后的读数。可以对所述读数进行处理以对其进行校准、取平均 值、使其与降低和重新施加的时间相关等。这可以通过板载集成电路完成，或者通过诸如个 人计算机或微控制器的外部计算机完成。经处理的检测输出可以以正/负二进制结果的形 式输出，或者例如以聚集度的形式输出。当磁体为永磁体时，磁场的施加、降低以及重新施加将包括相对于结合表面移动 磁体。在一些实施例中，移动载体比移动磁体更加容易。当磁体为电磁体时，场可由电路、 例如在控制器中的电路进行控制，以改变磁体中的电流。图4示出了来自于传感器的针对许多不同浓度的读数的图。其基于针对利用光学 检测和磁致动进行测定实验的实验设置，如图2所示。一旦致动，永磁体通过机械运动被置 于孔下。孔的底部与磁体之间的距离大约为2mm。更小的距离，例如大约Imm或更小也是优 选的。这些能够通过使用不完整半球来实现。清楚地，针对该实施例描述的任意参数都不 是限制性的，可以使用其他参数和变动。图4示出了关于涂布10pg/ml BSA-吗啡的聚苯乙烯孔的剂量响应曲线。将 以利用预混合有溶于PBS+10mg/ml BSA+0. 65 % Tween-20的限定量自由吗啡的抗吗啡 (anti-morpine)抗体功能化的磁性粒子(MP)形式的磁化或可磁化成分加入到孔中(MP 1 20稀释，溶液总量为40 μ 1，吗啡终浓度为1至lOOOng/ml之间)。使用孔下的永磁体 致动MP15秒，以将MP提高聚集于表面附近。接下来，移除磁体，并使得MP结合到表面60 秒。数据显示，20秒之后的磁性粒子到表面的结合率是对溶液中自由吗啡的浓度的直接测 量(如图4所示)。出乎意料地，在下一磁吸引步骤时，信号在第二致动步骤期间增加，并且 达到对孔中吗啡浓度有很好测量的稳定水平。可以如下理解该结果第一珠被注入并均勻分布在溶液中(见图4的插图a)。一 旦磁致动，MP聚集于表面，而并未示出到表面的结合有大的增加(没有信号降低，见图4中 的插图b，对应于图3的步骤31)。磁珠将垂直于表面排列成列或柱，并且表面上珠的数量 较低，因而被系统检测到的珠的数量也很低。一旦移除磁场，表示MP结合到表面信号下降 (图4中的插图c，对应于图3的步骤33)。在60秒的自由结合之后，磁体被再次置于孔下。 一旦施加该磁吸引，首先MP将高聚集于表面附近。接下来，所有的磁化或可磁化MP将从结 合到表面的MP开始，排列成列。非特异性结合到表面的MP中的至少大部分以及溶液中自由 的MP中的至少适量部分将被集中到这些柱中(见图4中的插图d，对应于图3的步骤35)。 这样，非特异性结合的MP被从表面移除，并且仅对表面上的结合MP执行终点测量，而不需 要额外的顶部磁体(注意使用倏逝场的光学探查方法为真正表面灵敏方法，因此，仅检测 到实际上结合到表面的珠)。因此，在第二磁致动步骤的几秒之后，所有未结合的MP被从表 面移除，且信号稳定，现在仅表示结合的MP，这是由于在所使用的光学检测方案中仅检测到 这些MP。
尽管已经描述了对于基于作为读出方法的受抑全内反射(F-TIR)的生物传感器 所使用的磁清洗步骤，但是可以使用其他种类的表面灵敏读出方法(如其他表面声波测 量、光学表面扫描或成像方法和GMR)。在W02006059270A2中描述了基于GMR的生物传感
ο光学表面传感器这可以具有光源和光检测器，现在将对其示例进行更详细的描述。提供光源用于 发射下文称之为“入射光束”的光束进入上述载体，使得所述光束在载体的结合表面的研究 区域中发生完内反射。光源可以例如为激光器或发光二极管(LED)，其任选地具有一些用于 形成并引导入射光束的光学器件。所述“研究区域”可以为结合表面的子区域或者包括整 个结合表面；其将典型地具有由入射光束照射的大致为圆点的形状。另外，应当注意到，全 内反射的发生需要载体的折射率大于与结合表面相邻的材料的折射率。这例如是在载体由 玻璃(η = 2)或塑料(η = 1. 6)制成而相邻材料为水(η = 1. 3)时的情况。应当进一步注 意到，术语“全内反射”应当包括称之为“受抑全内反射”的情况，其中，在反射过程中，一些 入射光被丢失(吸收、散射等)。光检测器用于确定反射光束中的光的量，其中，术语“反射光束”既是对被检测器 捕获的光的唯一指代，同时也暗指该射束的所有光都来自入射光束的上述全内反射。然而， “反射光束”并不一定包括所有全内反射的光(尽管优选地为这种情况)，这是由于该光中 的一些例如可以用于其他目的或者仅仅被丢失。检测器可以包括借助于其检测给定谱的光的任意合适的一个或多个传感器，例 如，光电二极管、CCD传感器、CMOS图像传感器、光电阻、光电池、光电倍增管或显微镜。微电子传感器设备的一些实施例可以允许对结合表面的研究区域中的靶成分的 灵敏且精确的定量或定性检测。这是由于如下事实全内反射入射光束生成从载体表面延 伸短距离进入相邻材料的倏逝波。如果该倏逝波的光被存在于结合表面的靶成分或标记粒 子散射或者吸收，其将在反射光束中丢失。因此，反射光束中的光的量(更精确地当与入射 光束相比较时反射光束中丢失的光的量)为结合表面的靶成分/标记的存以及其量的指 示。所描述的光检测过程的一个优势包括其准确性，这是由于倏逝波仅检查与结合表面相 邻的通常10到300nm厚度的小体积，从而避免了来自该体积后面的散装材料的干扰。另外， 大多数生物样品具有接近于水(η = 1.3)的折射率，并且仅当具有较高折射率的标记进入 倏逝场的范围内时反射受到抑制。当测量反射光时实现高灵敏度，这是由于检测到降低全 内反射光的量的所有效应。另外，可以任选地离开一定距离执行光学检测，即载体与光源 或光检测器之间没有机械接触地执行光学检测。透射进入载体11中的入射光束以大于全内反射(TIR)的临界角θ。的角度到达 结合表面，因此被全内反射为“反射光束”。反射光束通过另一表面离开载体并由例如光电 二极管的光电检测器29检测。这样检测反射光束的光的量(例如，由在整个光谱中或光谱 的特定部分中这一光束的光强所表示的)。通过耦合到检测器的评估和记录模块在观察期 间对测量结果进行评估并任选地进行监测。任选地，可以替代地或另外地使用另一光检测器以检测由被入射光束的倏逝波激 励的荧光粒子所发射的荧光。由于这一荧光通常被各向同性地发射到所有侧，因此该另一 检测器理论上可以被置于任意位置，例如，也可以在结合表面之上。另外，当然也可以使用检测器用于荧光的采样，其中，后者(荧光)可以例如在光谱上与反射光相区分。尽管下 文集中于反射光的测量，但是本文所讨论的原理也可以加以必要的变更以应用到荧光的检 测。为了消除或者至少最小化(例如，诸如唾液、血液等的样品流体的)背景的影响， 检测技术应当为表面特异性的。这可以通过使用在下文所解释的受抑全内反射的原理来实 现。根据Snell折射定律，关于两个介质A和B之间界面的法线的角度9,和ΘΒ应当 满足以下等式nA sin θ A = nB sin θ B其中，nA、nB分别为介质A和B中的折射率。具有高折射率的介质A(例如，玻璃nA =2)中的光线例如将在与具有较低折射率的介质B，例如空气(nB = 1)或水(nB ^ 1. 3)相 接触的界面上以角度θB折射离开法线。入射光的一部分将在所述界面以与入射角9,相 同的角度进行反射。当入射角θ 4逐渐增加时，折射角度θ Β将增加直到其到达90°。相 应的入射角被称为临界角Θ。，并由sine。= nB/nA给出。以较大的入射角，所有的光将被 反射回介质A(玻璃)内，因此，被称为“全内反射”。然而，非常接近于介质A (玻璃)和介 质B (空气或水)之间的界面的地方，在介质B中形成倏逝波，所述倏逝波离开表面以指数 形式衰减。作为到表面的距离ζ的函数的场幅度可以被表示为exp(-k^nA2 sin2(θΑ)-ηΒ2 ■ ζ)其中，k = 2 π / λ，θ Α为全反射束的入射角，并且ηΑ和ηΒ为各自相关介质的折射率。对于波长λ的典型值，例如λ = 650nm,以及nA = 1. 53和nB = 1. 33，在约为 228nm的距离ζ之后，场幅度下降到其初始值的exp(-l) 0. 37。当该倏逝波与像在图1 和图2的设置中的磁性粒子MP这样的另一介质相互作用时，入射光的一部分将耦合到样品 流体中(这被称为“受抑全内反射”)，并且反射强度将降低(与此同时，对于干净界面且没 有相互作用的情况，反射强度将为100%)。取决于干扰的量，即在结合表面(而不是在样 品室的其他部分)上或者非常靠近(大约220nm之内)结合表面的磁珠的量，反射强度将 相应地下降。这一强度下降为对于结合磁性靶成分的量的直接测量，因此是对与靶分子的 浓度的直接测量。当将所提到的大约200nm的倏逝波相互作用距离与抗体、靶分子和磁珠 的典型尺寸相比较时，清楚的是，背景的影响将为最小。较大的波长λ将增加相互作用距 离，但是，背景液体的影响将仍非常小。所描述的程序不依赖于所施加的磁场。这允许对制备步骤、测量步骤和清洗步骤 的实时光学监测。所监测的信号还可以用于控制测量步骤或个别处理步骤。对于典型应用的材料，载体的介质A可以为玻璃和/或一些具有1. 52的典型折射 率的透明塑料。样品室中的介质B可以为基于水的，并且具有接近1.3的折射率。这对应 于60°的临界角θ。。因此，实际上选择70°的入射角以允许流体介质具有较大折射率(假 定ηΑ = 1. 52, ηΒ允许为高达1. 43的最大值)。较高的ηΒ值将需要较大的ηΑ和/或较大的 入射角。所描述的光学读出以及用于致动的磁性标记的优势包括以下内容-便宜的盒载体盒可以包括相对简单的、聚合物材料的注模件，其还可以包含流体通道，
-很大的多路复用可能性以进行多分析物测试一次性盒中的结合表面可以光学 扫描大区域。或者，在大检测阵列的情况下可以进行大区域成像。这样的阵列(定位于光 学透明表面上的)可以由例如在光学表面上喷墨印刷不同的结合分子来制成。方法还允许通过使用多波束和多检测器以及多致动磁体(机械运动或电磁致动 的)进行孔板中的高通量测试。-致动和感测为正交的磁性粒子的磁致动(由大磁场和磁场梯度执行的)并不 影响感测过程。因此，光学方法允许持续监测致动期间的信号。这为测定过程提供许多启 示，其并允许基于信号斜率的简单的动力学检测方法。-由于指数降低的倏逝场，系统确实为表面灵敏。-简单界面如果必要的话，其可以在盒和读取器之间没有电连接的情况下实现。 光学窗口是探测盒的唯一需求。因此可以执行无接触读出。-可以进行低噪声读出。在实验室环境下，通常使用包括许多样品室(“孔”)阵列的孔板，在这些样品室中 可以并行进行不同测试。由于单个注模步骤就足够了，因此这些(可能一次性)孔的生产
非常简单。光源可以被布置成产生以大于临界角θ。的角度入射到孔底部表面上的平行光 束。为了防止这一入射光束在从空气到载体(例如，玻璃或塑料材料)的第一界面处过度 反射，孔的底部包括半径为R的半球形24，所述半球形的中心与结合表面的背面的检测表 面重合。入射光线指向这一相同中心。在反射侧，定位诸如光电二极管29的光电检测器以 检测反射光束的强度。孔的典型直径D的范围为1到8mm。光源的替代包括一些像透镜(未示出)这样的光学元件以产生基本上聚焦于半球 24中心的入射光束。在检测侧，可以使用诸如透镜的类似光学元件以集中并检测所反射且 现在发散的光束的光强。在测量过程的进一步发展中，可以使用多入射光束和反射光束以同时检测在相同 孔或孔阵列中的不同位置处是否存在靶分子。可以在孔的底部上或孔阵列的底部上提供多 个半球，所述半球可以用于将来自多入射光束的光耦合到孔底部上的相应研究区域。在该 情况下可以使用多个光电检测器(未示出)以测量多反射光束。另一替代实施例具有棱镜或去顶棱锥结构来取代半球以耦合入射光束和反射光 束的光。棱锥的斜边应当基本上垂直于这些光线。该设计的优势在于，其容易制作且并不 阻碍来自相邻区域的波束。可以使用具有大直径的单个平行入射光束以覆盖孔底部的所有 检测区域。作为检测器，可以使用与每个个别检测区域对准的多个光电二极管。或者，可以 使用诸如在数字相机中使用的CXD或CMOS芯片(未示出)以对包括所有检测区域的整个 孔底部的反射强度响应进行成像。使用适当的信号处理，所有信号可以用独立的检测器来 导出，而不需要预先对准。在另一实施例中，孔底部可以包括开放的空腔，所述空腔的中心在(一条或多条) 入射光束以及(一条或多条)反射光束的光路径之外。这允许以下有利特征-可以将磁线圈的(T形)铁氧体磁芯用于改进的场强度和浓度，并且可以被置于 靠近结合表面，以允许紧凑的低功率设计。
-实现自对准结构如果光学器件和磁场发生器为固定的，可以发生铁氧体磁芯 上的孔的自动对准。磁化或可磁化成分可以为磁珠形式，例如填充有小的磁性颗粒(例如，氧化铁颗 粒)的聚苯乙烯球面。这使得所述珠为超顺磁性的。聚苯乙烯的折射率与典型基底材料的 孔板的折射率很好地匹配。这样，增强了光的光学输出耦合。上面描述了一种使用表面灵敏读出方法的生物传感器，所述方法包括一种新的致 动方法，其中，在第二磁吸引步骤期间在传感器表面上形成磁性粒子的堆积。第一磁致动步 骤(捕捉步骤)用于传感器表面附近的MP的高聚集。检测的真实表面灵敏度使得信号在 该第二磁吸引步骤期间降低，这是由于没有检测到堆积的顶部部分。仅仅对每个堆积的底 部MP进行探查。仅需要从底面进行致动的事实使得系统更简单，因此更鲁棒。本领域技术 人员可以想到在权利要求书的范围内有其他变化和添加。
权利要求
一种用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流体中的所述磁化或可磁化靶成分的感测设备，所述设备包括-磁场发生器，其被布置成提供磁场以向适于选择性地结合所述靶成分的结合表面吸引所述磁化或可磁化成分；-磁场控制器，其被布置成控制所述磁场发生器以便施加所述磁场来在所述结合表面上将所述磁化或可磁化成分聚集成列，随后降低所述磁场以使得所述列瓦解，从而允许来自所述列的所述磁化或可磁化靶成分中的多个结合到所述结合表面，并且重新施加所述磁场以便使其他磁化或可磁化成分被拉离所述结合表面从而基于结合的靶成分重新形成列，以及-表面灵敏传感器，其用于检测结合到所述结合表面的所述磁化或可磁化靶成分。
2.根据权利要求1所述的设备，所述控制器被布置成以足以区分对所述结合表面的特 异性结合和非特异性结合的强度来重新施加所述磁场。
3.根据权利要求1或2所述的设备，所述传感器包括光学传感器。
4.根据任一项前述权利要求所述的设备，所述磁场发生器包括永磁体并且所述控制器 包括用于移动所述永磁体的机械布置。
5.根据任一项前述权利要求所述的设备，所述磁场发生器包括电磁体，并且所述控制 器包括用于控制通过所述电磁体的电流的电路。
6.根据任一项前述权利要求所述的设备，包括用于保持所述流体的室，所述室具有所 述结合表面。
7.根据任一项前述权利要求所述的设备，其具有多个结合表面，每个结合表面均适于 结合不同的靶成分。
8.根据任一项前述权利要求所述的设备，所述传感器被布置成检测由所述结合表面处 的所述靶成分发出的荧光。
9.根据任一项前述权利要求所述的设备，所述检测器被布置成在不同时间获取若干读 数，并且具有用于从所述读数中得出结果的处理器。
10.一种用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流体中的所 述磁化或可磁化靶成分的方法，所述方法包括如下步骤-施加磁场以向结合表面吸引所述磁化或可磁化成分，以在所述结合表面上将所述磁 化或可磁化成分聚集成列，降低所述磁场以使得所述列瓦解，从而允许来自所述列的所述 磁化或可磁化靶成分中的多个结合到所述结合表面，并且重新施加所述磁场以便使其他磁 化或可磁化成分被拉离所述结合表面从而基于所述结合靶成分重新形成列，以及_检测结合到所述结合表面的所述磁化或可磁化靶成分。
11.根据权利要求10所述的方法，所述重新施加的步骤包括以足以区分对所述结合表 面的特异性结合和非特异性结合的强度来重新施加所述磁场。
全文摘要
检测在含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流体中的所述磁化或可磁化靶成分，使用磁场发生器(M1，28)以向着结合吸引表面磁化或可磁化成分。磁场控制器(C1)施加磁场以在结合表面上将磁化或可磁化成分聚集成列，随后降低所述磁场以使得所述列瓦解，从而允许更多的成分到达结合表面，并且重新施加磁场，以便使其他成分被拉离所述结合表面以基于所结合的靶成分重新形成列。表面灵敏传感器(S1，26，29)检测所结合的磁化或可磁化靶成分。磁场的重新施加充当磁清洗步骤以释放不希望的非特异性吸附结合，留下靶，从而以简化的硬件改进灵敏度并降低成本和大小。
文档编号G01N33/543GK101889208SQ200880119443
公开日2010年11月17日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月7日
发明者A·H·J·伊明克, C·A·费许雷恩, D·M·布鲁斯, F·K·德泰耶, T·范德维克 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司
技术领域：
本发明涉及用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流 体中的磁化或可磁化靶成分的感测设备，涉及对应的检测方法，涉及用于控制这种设备的 软件，以及涉及制造这种设备的对应方法。
背景技术：
已知使用诸如蛋白质微阵列或其他方法的生物化学和医学诊断测定确定微生物 实体之间的相互作用，所述微生物实体例如为病毒、原生动物、细菌、其细胞器、脂质体以及 诸如蛋白质或DNA的生物活性分子。US 2005/0048599A1公开了一种用于研究标记有粒子使得(例如，磁性)力可以被 施加于其上的微生物的方法。在该方法的一个实施例中，将光束通过透明材料引导到其被 全内反射的表面。作为倏逝波离开透明材料的该束光在表面处被微生物和/或其他成分散 射，之后被光电检测器检测或用于照射微生物以进行可视观察。US 2006205093描述了生物感测的挑战为检测具有高浓度背景材料(例如，mmol/ 1的白蛋白)的复杂混合物(例如，血液)中的小浓度特异性靶分子(例如，在pmol/Ι的范 围以及更低范围内的肿瘤标记物)。一种常用的生物感测方法为用捕获分子(例如，抗体、 核酸等)来涂布表面。这些分子捕获随后被检测的靶。可以使用或不使用标记来执行对靶 分子的检测。标记步骤可以发生在表面上捕获之前或之后。标记可以直接耦合到靶，或者 间接地，例如经由另一生物活性分子，将标记耦合到靶。最经常地，例如，荧光分子的光学标 记被用于检测。生物感测中的重要问题为检测标记或靶分子到生物传感器的表面或捕获分子的 非特异性结合。这产生背景信号，所述背景信号降低了生物传感器的分析灵敏度和特异性。 在诊断测定中，通过使用严格性(stringency)程序可以降低非特异性结合。严格性程序旨 在免除不希望的非特异性吸附结合，并且仅保持捕获分子和(标记的)靶分子之间的特异 性相互作用。最常用的严格化方法为清洗步骤。小心地调制清洗液的组分和温度以降低给 定测定的背景。人们越来越关注多分析物检测，其中在被称为生物芯片或(微)阵列的单个表面 上同时测量许多不同的分子。生物芯片表面包括许多点(“捕获点”)，每个点含有一个或多 个不同的捕获分子。很难改进多分析物传感器的整个芯片严格化清洗步骤，这是由于需要 抑制大量可能的背景信号，与此同时，要保持不同的特异性相互作用的范围没有受到干扰， 并且要保持不同靶和捕获分子的自然状态。结果得到较低的分析灵敏度和较低的分析特异 性。多分析物严格性问题对于蛋白质检测非常重要，这是由于蛋白质和蛋白质-蛋白质相 互作用非常不均勻，并且特定清洗步骤对蛋白质变性的影响和对蛋白质-蛋白质相互作用 的影响非常显著。Science 第 289 期的 Macbeatch 和 Schreiber (2000 年)第 I76O-I763 页描述了在 显微镜载玻片上使用天然蛋白质的文献中已经认识到蛋白质阵列或微阵列的这一主要缺陷。在与靶分子结合之前，通过在捕获分子上增加BSA来降低非特异性蛋白质_蛋白质结 合。2002年十二月关于蛋白质微阵列技术的综述文献(Macbeath (2002)Nature Genetics 32，S526-532)提到将特异性评定为蛋白质微阵列技术的关键特征的问题，但并没有给出建 议的可能溶液。目前为止，免疫学领域实现了蛋白质阵列技术的最成功应用。抗原和抗体 之间的高结合强度允许严格化清洗条件以克服抗原和抗体的非特异性相互作用。解决严格性问题的化学方式为通过设计出能与靶更强烈且更特异性相互作用的 捕获分子。示例为携带光反应基团的光适体(Photo-aptamer)、合成捕获分子，所述光反应 基团能够在靶分子的特异性位点处交联(如在Brody & Gold (2000) J.Biotechnol.第7期 第5-13页所综述的)。当包括光适体的捕获表面暴露于样品并且应用光致激发步骤时，与 适体结合位点相匹配的分子变为与其共价联接。随后，可以应用严谨的清洗步骤以移除没 有光致反应的分子。光适体方法的缺点在于其需要为每个靶设计新的光适体、需要光致激 发步骤、光交联步骤自身并不能区分特异性结合分子和非特异性结合分子，以及其为终点 检测方法。US 2006205093描述了至少使用例如珠的第一粒子或微载体以及例如第二珠的也 可以为微载体的第二粒子来确定生物活性分子之间的相互作用。至少第一微载体是磁性 的。当使用两种珠且两种珠均有磁性时，珠优选地在其磁矩大小上不同。提供磁场以放置 生物活性分子之间的受力结合，从而区分不同力的结合。一方面，第二珠(具有较大磁矩) 用于磁性地移除以较小磁矩联接到珠的靶分子，所述靶分子较弱地结合到捕获分子(其自 身通常耦合到可移动表面或固定表面)。
发明内容
本发明的目的为提供用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化 成分的流体中的磁化或可磁化靶成分的改进的感测设备、对应的检测方法、用于控制这种 设备的软件以及制造这种设备的对应方法。根据第一方面，本发明提供了 一种用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流体中的 所述磁化或可磁化靶成分的感测设备，所述设备包括-磁场发生器，其被布置成提供磁场以向适于选择性地结合所述靶成分的结合表 面吸引所述磁化或可磁化成分；-磁场控制器，其被布置成控制磁场发生器以便施加磁场来在结合表面上将所述 磁化或可磁化成分聚集成列，随后降低所述磁场以使得所述列瓦解，从而允许来自所述列 的所述磁化或可磁化靶成分中的多个结合到所述结合表面，并且重新施加所述磁场以便使 其他磁化或可磁化成分被拉离所述结合表面从而基于结合的靶成分重新形成列，以及_表面灵敏传感器，其用于检测结合到所述结合表面的磁化或可磁化靶成分。这样的重新施加磁场(其最初用于向检测表面吸引磁化或可磁化靶成分)带来的 意外效果是充当磁清洗步骤以免除不希望的弱或非特异性吸附结合，并且仅仅维持受体和 靶成分之间的特异性结合。先前认为这样的清洗步骤需要抽吸步骤或者在结合表面的相对 侧上的第二磁场发生器，以在相反方向吸引不希望的磁化或可磁化成分。因而，意外发现这 可以通过最初用于向传感器表面吸引珠的同一磁场发生器来实现，从而使得能够简化硬件并能够降低成本和大小。另外，重新施加磁场能够使检测读数比其他方式更快地达到稳定水平，从而比仅 依赖于检测随时间的梯度更快操作，或者浓度检测更加灵敏。另一方面提供了一种检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分 的流体中的所述磁化或可磁化靶成分的方法，所述方法包括如下步骤-施加磁场以向结合表面吸引所述磁化或可磁化成分，在结合表面上将所述磁化 或可磁化成分聚集成列，降低磁场以使得所述列瓦解，从而允许来自所述列的所述磁化或 可磁化靶成分中的多个结合到所述结合表面，并且重新施加磁场以便使其他磁化或可磁化 成分被拉离所述结合表面以基于结合的靶成分重新形成列，以及-检测结合到结合表面的磁化或可磁化靶成分，例如，经由表面灵敏检测方法。所述装置或方法的实施例可以具有任意附加的特征，所述特征中的一些记载于权 利要求中，并在后面进行更详细的描述。一个这样的附加特征为包括永磁体的磁场发生器 以及与用于移动永磁体的机械布置一起工作或包括其的控制器。另一个这样的附加特征为 包括电磁体的磁场发生器，以及包括用于控制通过电磁体的电流的电路的控制器。另一个这样的特征为包括用于保持流体的室的设备，所述室具有结合表面。室可 以为设备的集成部分或者可移除部分。另一个这样的特征为具有多个结合表面的设备，每 个结合表面适于结合不同的靶成分。另一个这样的特征为被布置成检测不同靶成分的设 备。这可以包括相对于传感器移动所述结合表面或者具有多个传感器。另一个这样的特征为包括光学检测器的一个或多个传感器。一个替代为用于检测 由结合表面处磁化或可磁化靶成分引起的磁场的量的磁场检测器，例如GNR型检测器。光 学检测器可以包括被布置成检测从结合表面背侧反射的光的量。这可以被布置成在背侧进 行全内反射。所述光学检测器被布置成检测由结合表面处靶成分发出的荧光。所述光学检 测器可以包括被布置成检测透射通过结合表面的光的量的透射检测器。另一个这样的特征 为被布置成在不同时间获取若干读数并具有用于从所述读数得出结果的处理器的检测器。 另一个这样的特征为重新施加强到足以区分对特异性结合与非特异性结合的磁场。另一个 这样的特征为用于移动并控制所述流体的微流体元件。任意这样的附加特征可以结合在一起并且与任意的方面进行结合。对于本领域技 术人员而言其他优势将是明显的，尤其优于现有技术。在不脱离本发明的权利要求的情况 下，可以进行若干改动和修改。因此，应当清楚地理解本发明的形式仅是说明性的，并不旨 在限制本发明的范围。
现在将通过参照附图进行的举例来描述如何实现本发明，在附图中图1示出了根据本发明实施例的设备；图2示出了根据实施例的另一设备；图3示出了根据实施例的方法步骤；以及图4示出了针对各浓度的靶成分的随时间的检测值的图，以及示出了结合表面附 近的磁化或可磁化成分在操作过程中的四个阶段的示意图的插图a)到d)。
具体实施例方式本发明将针对具体实施例并参照特定附图进行描述，但是本发明并不局限于此， 而仅由权利要求书进行限定。所描述的附图仅为示例性的，而非进行限制。在附图中，为了 说明的目的，一些元件的大小可能被放大而非按比例绘制。在本说明书和权利要求书中使 用术语“包括”时，其并不排除其他元件或步骤。当提到单数名词时使用例如，“一”、“一个”、 “该”的不定冠词或定冠词时，这包括多个那样的名词，除非特别指出。在权利要求书中使用的术语“包括”不应当被理解为限制其后列出的手段，其不排 除其他元件或步骤。因此，表述“包括器件A和B的设备”的范围不应当被限制为仅包括部 件A和B的设备。其意味着，就本发明而言，设备的相关部件仅为A和B。另外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三等用于区分类似元件，而并 不一定用于描述顺序或时序。应当理解，如此使用的术语在特定条件下可互换，并且本文所 描述的本发明的实施例能够以不同于本文所描述或例示的其他顺序进行操作。另外，在说明书和权利要求书中的术语顶部、底部、上、下等用于描述的目的，而不 一定用于描述相对位置。应当理解，如此使用的术语在适当条件下可替换，并且本文所描述 的本发明的实施例能够以不同于本文所描述或例示的其他取向进行操作。所描述的实施例示出了用于确定诸如微生物实体，例如生物活性分子，的实体之 间的相互作用或结合的方法、装置和工具。这些实施例示出了这样的方法，其中可以区分出 不同强度的结合，例如区分出特异性结合和非特异性结合。根据本发明，对特异性结合和非 特异性结合进行区分尤其与多分析物传感器一起使用，其中，多分析物传感器可以同时检 测宽范围的诸如靶分子的靶成分。可以将设备和方法例如用于蛋白质多分析物传感器，这 是由于改变缓冲液条件以改进多分析物传感器的严格性仅仅可以在非常窄的限度内进行。 另外，其在使用了微合成流体和集成电路设备的微阵列和微流体设置中可以有实用价值， 这是由于可以在不丧失灵敏度的情况下缩减所述方法的规模。根据本发明的微电子感测设备的实施例可以用于对包括附着到靶分子的标记粒 子的靶成分进行定性或定量检测。靶成分可以例如为像生物分子、复合物、细胞分数或细 胞这样的生物物质。示例为蛋白质、诸如DNA或RNA的核酸、基因或基因片段、cDNA、酶、碳 水化合物、抗体或抗体片段、受体、细胞或诸如细胞膜或细胞器的细胞成分、细胞裂解液、病 毒、细菌、原生动物等。术语“标记粒子”应当表示具有一些可被检测的性质(例如，光学密 度、磁化率、电荷、荧光、放射性等)，由此间接表示相关靶分子的存在的粒子(原子、分子、 复合物、纳米粒子、微粒子等)。在一些情况下，“靶分子”自身可以充当“标记粒子”。感测设备可以与具有靶成分在此可以进行集中的结合表面的诸如管或室的可移 除载体合作，或者载体及其结合表面可以为与感测设备形成一体中的一部分。本文首先将 术语“结合表面”选择为流体载体表面中特定部分的唯一指代，并且尽管在许多应用中靶成 分实际上结合到所述表面，但是这并不一定如此。全部要求为靶成分可以到达结合表面以 在此进行集中(通常以由与靶成分相关、与靶成分同结合表面的相互作用相关、与靶成分 的移动性相关等的参数确定的浓度)。当传感器使用光学检测时，载体在一些情况下可以具 有针对给定光谱范围的光的高透明性，特别是具有针对由下文将要限定的光源发出的光的 高透明性。载体可以例如由玻璃或一些透明塑料制成。为了实现对生物材料成分的有效评估，生物材料必须要与生物传感器的表面紧密接触。当使用磁性标记时，这可以由磁吸引实现。磁吸引通常用于在短时间内达到期望水 平的灵敏度。由于其加速了结合表面处的聚集，因此，加速了传感器表面处磁性粒子的结合 过程。其次，磁清洗可以取代常规的湿清洗步骤，所述磁清洗更准确并减少了操作动作的次 数。这一用于清除其他成分的第二磁步骤通常通过使用结合表面之上(另外的/单独的) 磁体(永磁体或线圈)来执行。在这一步骤中，从在其中执行生物测量的液体或介质中完 全移除所有剩余“自由”磁性粒子。这种方式的问题在于为了实现磁吸引和磁清洗，需要两个单独的磁系统，或者将 线圈设计成使得可以利用机械或电机手段在吸引和排斥之间进行切换。这种设置会相对复
ο 图1、图2根据本发明实施例的感测设备根据实施例，用于具有表面灵敏检测器的生物传感器的解决方案为可替代的磁清 洗步骤。图1示出了感测设备的示例，该感测设备具有从左到右受阀Vl(I)和v2(2)、泵 Pl (3)以及室(8)底部的结合表面(4)(或结合表面阵列)控制的流体路径。传感器Sl (5) 或这样的传感器阵列被设置在结合表面附近，通常被设置在结合表面之下，但不一定是这 样。传感器例如可以为光学传感器、机械传感器、放射性传感器或磁场传感器。磁体Ml (6) 被布置成使磁场向结合表面吸引流体中的磁化或可磁化成分。磁体由控制器Cl (7)控制， 以遵循下文参照图3和图4描述的步骤。控制器(7)可以实现为常规的处理电路或常规硬 件上运行的软件，并且同永磁体一起使用时，可以包括用于使得或允许永磁体相对于结合 表面运动的手段。或者，在使用一个或多个电磁体时，控制器可以控制到一个或多个电磁体 的电流从而控制磁场的强度、其方向和/或其位置。磁场控制的时间选择可以与感测的时 间选择、控制流体元件或其他部件的时间选择相一致。图2示出了诸如聚合物的具有孔(well)形式的可移除载体的另一实施例，例如， 在底部具有结合表面的聚苯乙烯孔22。感测设备具有承载可移动永磁体28的基底21，并 且具有以光源26形式的传感器或与所述传感器相关联，并且具有光电检测器29或与所述 光电检测器29相关联。为了在结合表面的背面能够进行全内反射，存在玻璃的透明半球 24，所述透明半球24被布置成其平面靠着结合表面的背面，并且其曲面朝下使得来自光源 的光垂直于其表面进入并离开半球以使反射最小化并能够获得更好的检测精度。该传感器使用例如基于受抑全内反射(F-TIR)的光学读出方法以及磁吸引，现在 将对其进行描述。图3、图4根据实施例的方法步骤图3示出了一些主要的方法步骤。在步骤31，施加磁场以向结合表面吸引流体中 的磁化或可磁化成分。如所公知的，这具有建立成列的磁化或可磁化成分的效果，但是这通 常被看作阻碍了生物学结合，并且优选检测顺磁性成分。使用所施加的磁场，可磁化(例 如，顺磁性)成分将沿磁场线被磁化，这使得这些成分堆积成列。独立于诸如永磁体的场被 磁化的成分将同样以沿场线的优选方向排列成列。这样的成分由于其在液体内部聚集而是 次优选的，并且在关闭场时可能不会很容易地“瓦解”。在步骤33，场被降低到足以使得列 瓦解。适于实现这种结果的场强和降低的持续时间可以容易地得到确定，并且它们将取决 于成分的磁化和其他特征、流体的粘性、磁体的定位等。随后，在步骤35，以足以将其他磁化或可磁化成分拉离结合表面而剩下结合到结合表面的靶成分的强度重新施加场。这使得基 于结合到结合表面的靶成分重新建立成列的成分。此外，适于实现这种结果的重新施加的 场强和持续时间实践中能够容易地得到确定，并且它们将取决于结合的强度、成分的磁化 强度和其他特性、流体的粘性、磁体的定位等。在步骤37，传感器用于检测结合到结合表面 的靶成分。由于在结合表面上具有较少的其他磁化或可磁化成分，因此增加了检测的灵敏 度。可以在预定时间段内执行检测，并且可以使用在重新施加磁场之前的读数，以及在重新 施加过程中和在重新施加之后的读数。可以对所述读数进行处理以对其进行校准、取平均 值、使其与降低和重新施加的时间相关等。这可以通过板载集成电路完成，或者通过诸如个 人计算机或微控制器的外部计算机完成。经处理的检测输出可以以正/负二进制结果的形 式输出，或者例如以聚集度的形式输出。当磁体为永磁体时，磁场的施加、降低以及重新施加将包括相对于结合表面移动 磁体。在一些实施例中，移动载体比移动磁体更加容易。当磁体为电磁体时，场可由电路、 例如在控制器中的电路进行控制，以改变磁体中的电流。图4示出了来自于传感器的针对许多不同浓度的读数的图。其基于针对利用光学 检测和磁致动进行测定实验的实验设置，如图2所示。一旦致动，永磁体通过机械运动被置 于孔下。孔的底部与磁体之间的距离大约为2mm。更小的距离，例如大约Imm或更小也是优 选的。这些能够通过使用不完整半球来实现。清楚地，针对该实施例描述的任意参数都不 是限制性的，可以使用其他参数和变动。图4示出了关于涂布10pg/ml BSA-吗啡的聚苯乙烯孔的剂量响应曲线。将 以利用预混合有溶于PBS+10mg/ml BSA+0. 65 % Tween-20的限定量自由吗啡的抗吗啡 (anti-morpine)抗体功能化的磁性粒子(MP)形式的磁化或可磁化成分加入到孔中(MP 1 20稀释，溶液总量为40 μ 1，吗啡终浓度为1至lOOOng/ml之间)。使用孔下的永磁体 致动MP15秒，以将MP提高聚集于表面附近。接下来，移除磁体，并使得MP结合到表面60 秒。数据显示，20秒之后的磁性粒子到表面的结合率是对溶液中自由吗啡的浓度的直接测 量(如图4所示)。出乎意料地，在下一磁吸引步骤时，信号在第二致动步骤期间增加，并且 达到对孔中吗啡浓度有很好测量的稳定水平。可以如下理解该结果第一珠被注入并均勻分布在溶液中(见图4的插图a)。一 旦磁致动，MP聚集于表面，而并未示出到表面的结合有大的增加(没有信号降低，见图4中 的插图b，对应于图3的步骤31)。磁珠将垂直于表面排列成列或柱，并且表面上珠的数量 较低，因而被系统检测到的珠的数量也很低。一旦移除磁场，表示MP结合到表面信号下降 (图4中的插图c，对应于图3的步骤33)。在60秒的自由结合之后，磁体被再次置于孔下。 一旦施加该磁吸引，首先MP将高聚集于表面附近。接下来，所有的磁化或可磁化MP将从结 合到表面的MP开始，排列成列。非特异性结合到表面的MP中的至少大部分以及溶液中自由 的MP中的至少适量部分将被集中到这些柱中(见图4中的插图d，对应于图3的步骤35)。 这样，非特异性结合的MP被从表面移除，并且仅对表面上的结合MP执行终点测量，而不需 要额外的顶部磁体(注意使用倏逝场的光学探查方法为真正表面灵敏方法，因此，仅检测 到实际上结合到表面的珠)。因此，在第二磁致动步骤的几秒之后，所有未结合的MP被从表 面移除，且信号稳定，现在仅表示结合的MP，这是由于在所使用的光学检测方案中仅检测到 这些MP。
尽管已经描述了对于基于作为读出方法的受抑全内反射(F-TIR)的生物传感器 所使用的磁清洗步骤，但是可以使用其他种类的表面灵敏读出方法(如其他表面声波测 量、光学表面扫描或成像方法和GMR)。在W02006059270A2中描述了基于GMR的生物传感
ο光学表面传感器这可以具有光源和光检测器，现在将对其示例进行更详细的描述。提供光源用于 发射下文称之为“入射光束”的光束进入上述载体，使得所述光束在载体的结合表面的研究 区域中发生完内反射。光源可以例如为激光器或发光二极管(LED)，其任选地具有一些用于 形成并引导入射光束的光学器件。所述“研究区域”可以为结合表面的子区域或者包括整 个结合表面；其将典型地具有由入射光束照射的大致为圆点的形状。另外，应当注意到，全 内反射的发生需要载体的折射率大于与结合表面相邻的材料的折射率。这例如是在载体由 玻璃(η = 2)或塑料(η = 1. 6)制成而相邻材料为水(η = 1. 3)时的情况。应当进一步注 意到，术语“全内反射”应当包括称之为“受抑全内反射”的情况，其中，在反射过程中，一些 入射光被丢失(吸收、散射等)。光检测器用于确定反射光束中的光的量，其中，术语“反射光束”既是对被检测器 捕获的光的唯一指代，同时也暗指该射束的所有光都来自入射光束的上述全内反射。然而， “反射光束”并不一定包括所有全内反射的光(尽管优选地为这种情况)，这是由于该光中 的一些例如可以用于其他目的或者仅仅被丢失。检测器可以包括借助于其检测给定谱的光的任意合适的一个或多个传感器，例 如，光电二极管、CCD传感器、CMOS图像传感器、光电阻、光电池、光电倍增管或显微镜。微电子传感器设备的一些实施例可以允许对结合表面的研究区域中的靶成分的 灵敏且精确的定量或定性检测。这是由于如下事实全内反射入射光束生成从载体表面延 伸短距离进入相邻材料的倏逝波。如果该倏逝波的光被存在于结合表面的靶成分或标记粒 子散射或者吸收，其将在反射光束中丢失。因此，反射光束中的光的量(更精确地当与入射 光束相比较时反射光束中丢失的光的量)为结合表面的靶成分/标记的存以及其量的指 示。所描述的光检测过程的一个优势包括其准确性，这是由于倏逝波仅检查与结合表面相 邻的通常10到300nm厚度的小体积，从而避免了来自该体积后面的散装材料的干扰。另外， 大多数生物样品具有接近于水(η = 1.3)的折射率，并且仅当具有较高折射率的标记进入 倏逝场的范围内时反射受到抑制。当测量反射光时实现高灵敏度，这是由于检测到降低全 内反射光的量的所有效应。另外，可以任选地离开一定距离执行光学检测，即载体与光源 或光检测器之间没有机械接触地执行光学检测。透射进入载体11中的入射光束以大于全内反射(TIR)的临界角θ。的角度到达 结合表面，因此被全内反射为“反射光束”。反射光束通过另一表面离开载体并由例如光电 二极管的光电检测器29检测。这样检测反射光束的光的量(例如，由在整个光谱中或光谱 的特定部分中这一光束的光强所表示的)。通过耦合到检测器的评估和记录模块在观察期 间对测量结果进行评估并任选地进行监测。任选地，可以替代地或另外地使用另一光检测器以检测由被入射光束的倏逝波激 励的荧光粒子所发射的荧光。由于这一荧光通常被各向同性地发射到所有侧，因此该另一 检测器理论上可以被置于任意位置，例如，也可以在结合表面之上。另外，当然也可以使用检测器用于荧光的采样，其中，后者(荧光)可以例如在光谱上与反射光相区分。尽管下 文集中于反射光的测量，但是本文所讨论的原理也可以加以必要的变更以应用到荧光的检 测。为了消除或者至少最小化(例如，诸如唾液、血液等的样品流体的)背景的影响， 检测技术应当为表面特异性的。这可以通过使用在下文所解释的受抑全内反射的原理来实 现。根据Snell折射定律，关于两个介质A和B之间界面的法线的角度9,和ΘΒ应当 满足以下等式nA sin θ A = nB sin θ B其中，nA、nB分别为介质A和B中的折射率。具有高折射率的介质A(例如，玻璃nA =2)中的光线例如将在与具有较低折射率的介质B，例如空气(nB = 1)或水(nB ^ 1. 3)相 接触的界面上以角度θB折射离开法线。入射光的一部分将在所述界面以与入射角9,相 同的角度进行反射。当入射角θ 4逐渐增加时，折射角度θ Β将增加直到其到达90°。相 应的入射角被称为临界角Θ。，并由sine。= nB/nA给出。以较大的入射角，所有的光将被 反射回介质A(玻璃)内，因此，被称为“全内反射”。然而，非常接近于介质A (玻璃)和介 质B (空气或水)之间的界面的地方，在介质B中形成倏逝波，所述倏逝波离开表面以指数 形式衰减。作为到表面的距离ζ的函数的场幅度可以被表示为exp(-k^nA2 sin2(θΑ)-ηΒ2 ■ ζ)其中，k = 2 π / λ，θ Α为全反射束的入射角，并且ηΑ和ηΒ为各自相关介质的折射率。对于波长λ的典型值，例如λ = 650nm,以及nA = 1. 53和nB = 1. 33，在约为 228nm的距离ζ之后，场幅度下降到其初始值的exp(-l) 0. 37。当该倏逝波与像在图1 和图2的设置中的磁性粒子MP这样的另一介质相互作用时，入射光的一部分将耦合到样品 流体中(这被称为“受抑全内反射”)，并且反射强度将降低(与此同时，对于干净界面且没 有相互作用的情况，反射强度将为100%)。取决于干扰的量，即在结合表面(而不是在样 品室的其他部分)上或者非常靠近(大约220nm之内)结合表面的磁珠的量，反射强度将 相应地下降。这一强度下降为对于结合磁性靶成分的量的直接测量，因此是对与靶分子的 浓度的直接测量。当将所提到的大约200nm的倏逝波相互作用距离与抗体、靶分子和磁珠 的典型尺寸相比较时，清楚的是，背景的影响将为最小。较大的波长λ将增加相互作用距 离，但是，背景液体的影响将仍非常小。所描述的程序不依赖于所施加的磁场。这允许对制备步骤、测量步骤和清洗步骤 的实时光学监测。所监测的信号还可以用于控制测量步骤或个别处理步骤。对于典型应用的材料，载体的介质A可以为玻璃和/或一些具有1. 52的典型折射 率的透明塑料。样品室中的介质B可以为基于水的，并且具有接近1.3的折射率。这对应 于60°的临界角θ。。因此，实际上选择70°的入射角以允许流体介质具有较大折射率(假 定ηΑ = 1. 52, ηΒ允许为高达1. 43的最大值)。较高的ηΒ值将需要较大的ηΑ和/或较大的 入射角。所描述的光学读出以及用于致动的磁性标记的优势包括以下内容-便宜的盒载体盒可以包括相对简单的、聚合物材料的注模件，其还可以包含流体通道，
-很大的多路复用可能性以进行多分析物测试一次性盒中的结合表面可以光学 扫描大区域。或者，在大检测阵列的情况下可以进行大区域成像。这样的阵列(定位于光 学透明表面上的)可以由例如在光学表面上喷墨印刷不同的结合分子来制成。方法还允许通过使用多波束和多检测器以及多致动磁体(机械运动或电磁致动 的)进行孔板中的高通量测试。-致动和感测为正交的磁性粒子的磁致动(由大磁场和磁场梯度执行的)并不 影响感测过程。因此，光学方法允许持续监测致动期间的信号。这为测定过程提供许多启 示，其并允许基于信号斜率的简单的动力学检测方法。-由于指数降低的倏逝场，系统确实为表面灵敏。-简单界面如果必要的话，其可以在盒和读取器之间没有电连接的情况下实现。 光学窗口是探测盒的唯一需求。因此可以执行无接触读出。-可以进行低噪声读出。在实验室环境下，通常使用包括许多样品室(“孔”)阵列的孔板，在这些样品室中 可以并行进行不同测试。由于单个注模步骤就足够了，因此这些(可能一次性)孔的生产
非常简单。光源可以被布置成产生以大于临界角θ。的角度入射到孔底部表面上的平行光 束。为了防止这一入射光束在从空气到载体(例如，玻璃或塑料材料)的第一界面处过度 反射，孔的底部包括半径为R的半球形24，所述半球形的中心与结合表面的背面的检测表 面重合。入射光线指向这一相同中心。在反射侧，定位诸如光电二极管29的光电检测器以 检测反射光束的强度。孔的典型直径D的范围为1到8mm。光源的替代包括一些像透镜(未示出)这样的光学元件以产生基本上聚焦于半球 24中心的入射光束。在检测侧，可以使用诸如透镜的类似光学元件以集中并检测所反射且 现在发散的光束的光强。在测量过程的进一步发展中，可以使用多入射光束和反射光束以同时检测在相同 孔或孔阵列中的不同位置处是否存在靶分子。可以在孔的底部上或孔阵列的底部上提供多 个半球，所述半球可以用于将来自多入射光束的光耦合到孔底部上的相应研究区域。在该 情况下可以使用多个光电检测器(未示出)以测量多反射光束。另一替代实施例具有棱镜或去顶棱锥结构来取代半球以耦合入射光束和反射光 束的光。棱锥的斜边应当基本上垂直于这些光线。该设计的优势在于，其容易制作且并不 阻碍来自相邻区域的波束。可以使用具有大直径的单个平行入射光束以覆盖孔底部的所有 检测区域。作为检测器，可以使用与每个个别检测区域对准的多个光电二极管。或者，可以 使用诸如在数字相机中使用的CXD或CMOS芯片(未示出)以对包括所有检测区域的整个 孔底部的反射强度响应进行成像。使用适当的信号处理，所有信号可以用独立的检测器来 导出，而不需要预先对准。在另一实施例中，孔底部可以包括开放的空腔，所述空腔的中心在(一条或多条) 入射光束以及(一条或多条)反射光束的光路径之外。这允许以下有利特征-可以将磁线圈的(T形)铁氧体磁芯用于改进的场强度和浓度，并且可以被置于 靠近结合表面，以允许紧凑的低功率设计。
-实现自对准结构如果光学器件和磁场发生器为固定的，可以发生铁氧体磁芯 上的孔的自动对准。磁化或可磁化成分可以为磁珠形式，例如填充有小的磁性颗粒(例如，氧化铁颗 粒)的聚苯乙烯球面。这使得所述珠为超顺磁性的。聚苯乙烯的折射率与典型基底材料的 孔板的折射率很好地匹配。这样，增强了光的光学输出耦合。上面描述了一种使用表面灵敏读出方法的生物传感器，所述方法包括一种新的致 动方法，其中，在第二磁吸引步骤期间在传感器表面上形成磁性粒子的堆积。第一磁致动步 骤(捕捉步骤)用于传感器表面附近的MP的高聚集。检测的真实表面灵敏度使得信号在 该第二磁吸引步骤期间降低，这是由于没有检测到堆积的顶部部分。仅仅对每个堆积的底 部MP进行探查。仅需要从底面进行致动的事实使得系统更简单，因此更鲁棒。本领域技术 人员可以想到在权利要求书的范围内有其他变化和添加。
权利要求
一种用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流体中的所述磁化或可磁化靶成分的感测设备，所述设备包括-磁场发生器，其被布置成提供磁场以向适于选择性地结合所述靶成分的结合表面吸引所述磁化或可磁化成分；-磁场控制器，其被布置成控制所述磁场发生器以便施加所述磁场来在所述结合表面上将所述磁化或可磁化成分聚集成列，随后降低所述磁场以使得所述列瓦解，从而允许来自所述列的所述磁化或可磁化靶成分中的多个结合到所述结合表面，并且重新施加所述磁场以便使其他磁化或可磁化成分被拉离所述结合表面从而基于结合的靶成分重新形成列，以及-表面灵敏传感器，其用于检测结合到所述结合表面的所述磁化或可磁化靶成分。
2.根据权利要求1所述的设备，所述控制器被布置成以足以区分对所述结合表面的特 异性结合和非特异性结合的强度来重新施加所述磁场。
3.根据权利要求1或2所述的设备，所述传感器包括光学传感器。
4.根据任一项前述权利要求所述的设备，所述磁场发生器包括永磁体并且所述控制器 包括用于移动所述永磁体的机械布置。
5.根据任一项前述权利要求所述的设备，所述磁场发生器包括电磁体，并且所述控制 器包括用于控制通过所述电磁体的电流的电路。
6.根据任一项前述权利要求所述的设备，包括用于保持所述流体的室，所述室具有所 述结合表面。
7.根据任一项前述权利要求所述的设备，其具有多个结合表面，每个结合表面均适于 结合不同的靶成分。
8.根据任一项前述权利要求所述的设备，所述传感器被布置成检测由所述结合表面处 的所述靶成分发出的荧光。
9.根据任一项前述权利要求所述的设备，所述检测器被布置成在不同时间获取若干读 数，并且具有用于从所述读数中得出结果的处理器。
10.一种用于检测含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流体中的所 述磁化或可磁化靶成分的方法，所述方法包括如下步骤-施加磁场以向结合表面吸引所述磁化或可磁化成分，以在所述结合表面上将所述磁 化或可磁化成分聚集成列，降低所述磁场以使得所述列瓦解，从而允许来自所述列的所述 磁化或可磁化靶成分中的多个结合到所述结合表面，并且重新施加所述磁场以便使其他磁 化或可磁化成分被拉离所述结合表面从而基于所述结合靶成分重新形成列，以及_检测结合到所述结合表面的所述磁化或可磁化靶成分。
11.根据权利要求10所述的方法，所述重新施加的步骤包括以足以区分对所述结合表 面的特异性结合和非特异性结合的强度来重新施加所述磁场。
全文摘要
检测在含有磁化或可磁化靶成分以及其他磁化或可磁化成分的流体中的所述磁化或可磁化靶成分，使用磁场发生器(M1，28)以向着结合吸引表面磁化或可磁化成分。磁场控制器(C1)施加磁场以在结合表面上将磁化或可磁化成分聚集成列，随后降低所述磁场以使得所述列瓦解，从而允许更多的成分到达结合表面，并且重新施加磁场，以便使其他成分被拉离所述结合表面以基于所结合的靶成分重新形成列。表面灵敏传感器(S1，26，29)检测所结合的磁化或可磁化靶成分。磁场的重新施加充当磁清洗步骤以释放不希望的非特异性吸附结合，留下靶，从而以简化的硬件改进灵敏度并降低成本和大小。
文档编号G01N33/543GK101889208SQ200880119443
公开日2010年11月17日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月7日
发明者A·H·J·伊明克, C·A·费许雷恩, D·M·布鲁斯, F·K·德泰耶, T·范德维克 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司
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