方法和组合物的制作方法
专利名称：方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病的多重筛查。具体而言，本发明涉及利用质谱的遗传性疾病的多 重筛查。
背景技术：
质谱(MS)是一种强大的定性和定量分析技术，在过去的5年中已被引入到了许多 临床和研究实验室中。MS分析者的费用已经降到了大多数实验室可承受的范围。在临床实 验室中，质谱仪器被用于测定大量临床相关分析物。当用于生物样品时，MS的功效依赖于 其对化合物鉴定和定量的选择性。串联MS(MSMS)是一种提供优异分析能力的MS技术。许多国家目前都进行强制筛查，例如筛查新生儿遗传性代谢疾病、先天性甲状腺 功能减退、血红蛋白病、囊性纤维化和当地要求的多种其他疾病。将MSMS引入到代谢物筛查中引起了分析方法和潜在的能够被筛查到的疾病数量 的变革。典型地，该体系包含丁基化。然而，利用代谢物的直接分析的筛查是可能的。本发明的发明人之前已经证明了以适合新生儿和产前筛查的分析方式通过MSMS 检测和证实临床显著的血红蛋白病的可行性。代谢物筛查可以检测用于诊断特定遗传性疾病的所有代谢物。在美国和欧洲的一 些中心区，包括的疾病达30种。然而，问题是，对于许多疾病，容易检测的代谢物提供差的 灵敏度和特异性，例如高胱氨酸尿病的蛋氨酸。在英国，筛查被限定于测定苯丙氨酸以诊断苯丙酮尿症(PKU)和辛酰基肉碱以诊 断中链酰基CoA脱氢酶缺乏症(MCADD)。这是一种成本合算的方法。然而，期望拓宽筛查面， 由于技术局限性而可能被排除在外的应该筛查的疾病，同时包括标记物灵敏度和特异性低 的疾病。该现有技术的方法产生许多逻辑和临床问题。生物素酶缺乏症是一种目前利用代谢物没有筛查出的疾病实例。根据所筛查人群 的种族变异，在110，000例新生儿中大约发生1例生物素酶缺乏症。未诊断出的生物素酶缺 乏症可引起死亡、抗痉挛药抗性痉挛、双侧耳聋、视觉衰退，步态问题和多种其他非特异性 临床疾病。如果在新生儿期即被诊断并着手利用药理学剂量的生物素对其进行终生治疗， 可以完全抑制所述临床表型，并且生长和发育正常。如果在以后的生命里被诊断出来，某些 临床表现(例如痉挛)可以控制，但其他(例如耳聋)仍然存在。因此，尽管在人群中的发 生率相对较低，其仍是成本合算的候选筛查疾病。在英国以外的很多中心区利用单独的测 试——利用基于测定生物素对氨基苯甲酸(生物素PABA)所释放出的对氨基苯甲酸的比色 测定法直接测量酶的活性，对其进行筛查。所述测定要求专用的单独样品(血斑)，并且耗 力、费时且相对较不灵敏。还没有用于诊断生物素酶缺乏症的有用血液代谢物的描述。因 此，现有技术关于生物素酶筛查具有许多缺点和问题。1型酪氨酸血症是一种提议标记物灵敏度和特异性低的疾病实例。根据所筛查人 群的种族变异，在300，000例新生儿中大约发生1例1型酪氨酸血症(延胡索二酰乙酰乙 酸酶缺乏症)。未诊断出的1型酪氨酸血症可引起暴发性肝功能衰竭、凝血病以及死亡或佝偻病、吓啉症样危象、神经系统并发症和肝脏肿瘤。肝脏移植通常是唯一的治疗方式。如果 在新生儿期即被诊断并着手对其进行终生NTBC治疗，可以完全抑制所述临床表型，并且生 长和发育正常。因此，尽管罕见，仍然被认为是成本合算的候选筛查疾病。在一些情况下， 血液酪氨酸提高，但这并不能用于诊断，并且血液酪氨酸的非特异性提高在新生儿期普遍 存在，这使得利用血液酪氨酸水平作为疾病的唯一指标的尝试成为问题。考虑将琥珀酰基 丙酮当作用于诊断的代谢物，但问题是它的测定不易被整合到现有技术的代谢物筛查体系 中。由于琥珀酰基丙酮抑制胆色素原合酶(PBG合酶通过脱水连接两个5-氨基乙酰丙酸分 子)，所以最先被识别，而该抑制可导致卟啉症样危象。在许多中心区，胆色素原合酶活性被 用来筛查1型酪氨酸血症或作为酪氨酸提高的初期迹象的支持测试。所述检测基于将5-氨 基乙酰丙酸作为底物并测定所产生的胆色素原。该测定需要单独的血斑(blood spot)，费 力、耗时且灵敏度相对较低。对酶促过程缺乏了解也使得与酪氨酸血症相关的现有技术产 生一些问题。酶活性通常是在标准化和优化条件下测定的。这种标准化/优化要求特定的缓冲 液和PH环境。因此，个体的测定和条件几乎总是不同，并且通常明显不同。所以，每个测定 几乎都是独特的。第一个目标酶的检测条件几乎不适合第二个或另一个目标酶，并且确实 甚至能够抑制其活性或使其失活。当需要进行多重酶促分析时，这些都是严重的问题。另外，已知缓冲溶液能显著抑制重要化合物的电喷雾电离，这是现有技术中存在 的问题。现有技术通常利用色谱法除去化合物信号中的缓冲液，从而尝试解决这个问题，但 这是一个费时费力的步骤，需要特殊的设备和知识去实施。本发明旨在解决现有技术中存在的问题。发明概述目前筛查遗传性疾病的方法不适合多重化。现有技术中，利用用于进行具体测试 所优化的个体条件组来筛查个体疾病。并且，这些测试中的许多测试都需要单独的血斑。这 不仅费力、成本高，而且就所需要的血液的量方面也有严重限制。这在通常仅采集少量血的 新生儿筛查领域里是个尤其尖锐的问题。本发明的发明人开发出了能够同时筛查多种疾病的方法。换句话说，本发明的发 明人开发出了一种能够使筛查过程多重化的技术，从而仅利用诸如血斑的单个样品就能检 测多种疾病。为了取得这种突破，关于要测试的各诊断性化学物质的优化和稀释/检测方面， 本发明的发明人与本领域的思维相反。具体地，本发明的发明人开发了这样的方法，其摒弃 了常规的缓冲体系，并形成检测中的各化学物质的有意的次佳催化条件和/或次佳浓度。 然而，部分是作为这种方法的结果，以及部分是由于联合强大的质谱检测技术，令人惊奇地 证明，高特异性和宽筛查谱能够有利地被结合。除了这些优势之外，本发明的另一个优势就 是还大幅降低了所需样品的量。例如，通常，能够有利地对一组测试(其大于目前标准的一 排6个新生儿血斑上进行的测试)进行多重化，从而由比用于常规现有测试所采集的量的 六分之一小的血斑样品获得常规测试结果的超集。本发明基于这些惊人的发现之上。因此，一方面，本发明提供了帮助诊断受试者疾病(disorder)的方法，所述方法 包括
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提供所述受试者的样品；测定所述样品的至少两个特征，所述特征选自(i)所述样品包含的多肽的结构组成，(ii)所述样品包含的代谢物，和(iii)所述样品包含的催化活性，其中，所述至少两个特征均是由多重分析测定。“多重”/ “多重化”具有本领域中的通常含义，即以独立但相关联的方式同时进行 几个功能。换句话说，本发明中的多重化是指在单次读数(readout)中分析多个独立的疾 病指标。合适地，在本文中，“相关联的”方式是指在共同(common)考量或分析步骤中收集 多个数据，例如多个不同的可能疾病的数据，当然这些疾病通常是相互独立的。最合适地，所述共同步骤(common step)是指从共同或单个样品中提取数据。合 适地，所述共同步骤是指从数据采集仪的单个时期(session)例如MS分析仪的单个时期中 提取多种可能疾病的数据。最合适地，所述共同步骤是指仅在单个样品上进行多重分析，即 不将整体较大样品分成几部分或不对整体较大样品的不同部分进行亚制备，而在单个实体 样品上实施本发明，例如每个分析都是在同一血斑或再水化血液样品上进行的。因此，合适地，所述多重分析包括同一样品的多重分析。以下对其进行更详细地说 明。合适地，所述样品包括血液或血浆。更合适地，所述样品包括血液；更合适地，所述 样品基本由血液组成；更合适地，所述样品是血液。最合适地，所述样品包括干血斑，例如直 径约为3. 2mm的干血斑。合适地，所述干血斑是涂布在常规滤纸上并风干所得到的血液斑 点，这是新生儿血斑样品采集中的常规操作并是众所熟知的。合适地，所述样品仅由其天然存在的组分缓冲(buffer)。合适地，特别省去向所述 样品中加入缓冲液。本发明的一个优点是避免了外源性缓冲步骤。有利地，根据本发明，用 溶剂再水化是足够的，而不需要引入外源性缓冲体系。合适地，测定所述样品包含的多肽的结构组成的步骤包括(a)向所述样品中加入肽酶；(b)分析经肽酶处理后所述样品中的多肽；(c)根据(b)信息推断关于所述多肽的结构组成。合适地，所述肽酶是胰蛋白酶。合适地，目标所述多肽是血红蛋白、白蛋白、转铁蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、血浆铜 蓝蛋白、甲胎蛋白或肌红蛋白中的一种或多种。合适地，测定所述样品包含的代谢物的步骤包括测定以下物质存在与否或测定以 下物质的浓度苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、精氨基琥珀酸、肌酸、 肌酸酐、胍基乙酸、3-甲氧基酪氨酸、游离肉碱、以及一系列酰基肉碱物质(包括辛酰基肉 碱)、一系列甘氨酸缀合物(包括己酰基甘氨酸)、酸物质(包括乳清酸)、类固醇(包括 17-羟孕酮、7-脱氢胆固醇或胆固醇)。合适地，测定所述样品包含的催化活性作用的步骤包括(a)向所述样品中加入对所述催化活性作用敏感的底物；(b)分析所述样品中所述底物存在与否和/或分析作用于所述底物的所述催化活性作用的产物存在与否。合适地，可以加入多于一种对所述催化活性作用敏感的底物并对其进行分析。这 具有提高分析的特异性的优点。合适地，所述一种或多种底物均是水溶性的。这具有使所述测定简化并避免使用 有机溶剂的优点。合适地，各所述底物均仅在水中的形式加入。这具有省去缓冲试剂和/或有机溶 剂的优点。合适地，所述特征通过MS分析确定。更合适地，所述MS是电喷雾质谱-质谱 (MSMS) ο合适地，所述至少两个特征包括(i)所述样品包含的多肽的结构组成；和选自(ii)和(iii)的至少一个另外的特征。合适地，三个特征(i)、( )和(iii)均被测定。合适地，所述样品是体外样品。合适地，所述方法是体外方法。另一方面，本发明涉及组合物，其包含基本不含生物素的生物胞素。另一方面，本发明涉及组合物，其包含生物胞素，所述生物胞素包含同位素标记的 赖氨酸残基。另一方面，本发明涉及组合物，其包含基本不含生物素的生物素PABA(biotinyl PABA)。另一方面，本发明涉及组合物，其包含基本不含PABA的生物素PABA。另一方面，本发明涉及组合物，其包含基本不含生物素和PABA的生物素PABA。另一方面，本发明涉及上述组合物，其中，所述同位素标记是碳13、氘、氮15或氧 18，合适地是碳13。另一方面，本发明涉及组合物，其包含以下物质中的两种或更多种(i) 5-氨基乙酰丙酸；(ii)生物胞素；(iii)生物素对氨基苯甲酸。合适地，所述组合物还包含H2O (水)。合适地，所述组合物没有缓冲。合适地，所述组合物基本不含生物素。发明详述现有技术中，酶活性通常在标准化和优化条件下测量的。这些需要特定的缓冲液 和PH条件。即便尝试使这些分析多重化，使用不同的缓冲或pH体系也不可能完成这些尝 试，因为在实践中，每一个测定都几乎是独特的。另外，认识到缓冲液能显著抑制重要化合 物的电喷雾电离。因此，通常使用色谱法除去化合物信号中的缓冲液。本发明的发明人的 深刻理解使得可以根据本发明克服现有技术中存在的这些问题。本发明的发明人认识到， 在进行遗传性代谢疾病筛查中，测定实际的酶活性并不总是必需的，而测定酶活性存在与 否实际上提供了足够的信息。这与基于优化酶活性从而使底物转化速率最大化的现有技术 的观念相反。在某些情况下，可能必须半定量地区分高活性和低活性。根据本发明，这依然
7被容易地完成，例如，使用稳定的同位素标记标准物或底物产物比值或本文解释的其他校 准。本发明主要教导的是，对于筛查应用(例如新生儿筛查)，酶条件不需最佳。如本文所 证明的那样，即便在次佳的条件下，本发明的发明人也能够得到可靠的诊断用信息和读数。本发明的益处在于，可以有利地利用单个3. 2mm血斑测定生物素酶和胆色素原合 酶的活性，从而通过周期为1-2分钟内的MSMS将用于PKU和MCADD的临床血红蛋白诊断 (基于胰蛋白酶肽)和代谢物诊断同时加入。因此，在优选的实施方案中，本发明涉及这样 的诊断组合。分析模式本发明涉及通过合适的技术，例如质谱，最合适的为电喷雾质谱-质谱(MSMS)例 如在单个血斑上进行的临床诊断性代谢物和/或酶活性和/或蛋白质的多重分析。应用该系统用于评估受试者可能的疾病或病症，特别是遗传性疾病。本发明特别应用 于新生儿遗传性疾病的筛查。本发明的优势在于在临床症状可能没有表现出来时进行筛 查，获得可靠的读数。测定本发明的特点是在单个起始样品上进行多种类型的测定。通常这些测定作为单个 分析的一部分来进行。这可意味着所述测定平行、依次或同时进行。本发明优选方面的特 点是所述测定在单个操作中进行。这可意味着样品制备的最初步骤是依次进行的，例如，使 血斑再水化后加入底物，然后加入肽酶。然而，同时进行多重测定的基本原则是可以进行单 个分析从而从同一单个样品的考量中收集信息。在一个步骤中使样品再水化，然后在单独 的顺次步骤中将所进行的特定测定的各种基本元素加入样品中，仅这一事实不足以将所述 测定认定为单独或不同的。根据本发明，关键是对同一样品进行多种测定，从而有利地减少 样品数量(和/或所需样品物质的体积)，并简化在单个操作中有利地收集的数据的多个不 同测定的操作。因此，合适地，当在“单个样品”或在“同一样品”上实施本发明时，这表示最终用于 分析至少两个特征的样品对于导致所述两个或更多个特征分析的初始制备步骤(例如加 入底物、加入肽酶)不分开或分离，而是所述制备步骤(如果有)物理上在同一单样品(例 如同一单个物质或等份试样)上进行，然后利用同一单个样品产生所需要的读数。当然，这 并不排除将所述物质最初分成两部分以提供参比样品或校准样品，但是本发明的关键之处 在于，如上文说明的，在同一样品上进行分析步骤或过程。合适地，如果测定都在单个样品上进行，那么认为其是同时进行的。因此，为了测 定不同类型的化合物，可能需要进行第二次或再一次MS进样(injection)，例如，有机酸 (例如乳清酸)、糖和/或糖磷酸类(包括半乳糖-1-磷酸)和/或类固醇(例如17-羟孕 酮)的负电离。然而，应该注意的是，即使在多重进样MS实施方案(例如二次进样实施方 案)中，分析仍在同一单个终样品上进行。合适地，利用一次或两次进样，更合适地，利用单 次进样。更合适地，如果从单个分析收集读数，则认为所述测定是同时进行的。在优选的实 施方案中，读数由单个分析收集，合适地，所述分析是单个质谱数据收集时期。根据本发明，存在大量有利地合并在单个操作中的不同类别的分析。这些包括代 谢物筛查、酶活性筛查和特定多肽或其变体存在与否的筛查(例如胰蛋白酶MSMS)。
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代谢物代谢物筛查是指测定样品中特定化合物存在与否。将其称为代谢物筛查的原因 是，作为样品特点，该代谢物通常存在或不存在于所述样品中。换句话说，将所测定化合物 的产生(或不产生)作为所检测个体受试者一般代谢的特征。因此，分析特定代谢物的存 在与否通常不包括向样品中加入特定底物化合物或任何同源的酶活性。当然，根据所进行 的代谢物测定的具体方式，代谢物的存在可以是某种疾病的指示，或代谢物的不存在可以 是某种疾病的指示。特定化合物存在与否的代谢物筛查具有在检测或没有检测到所述化合 物时通常都提供非常清晰读数的优点。然而，在其他实施方案中，可能期望筛查特定代谢物 的水平。显然，为了准确评估所测定的代谢物的水平或浓度，这种实施方案可以要求仪器更 细致的校准，或可以要求在样品中使用内标，(或甚至是加入已知浓度该物质的外标样品或 示踪样品)。显然，除了所述代谢物的存在与否之外，这种实施方案还具有提供额外信息的 优点，即提供样品中所述代谢物的水平或浓度的信息。本发明可以测定的代谢物包括(以观察结果_指示病症的方式表示)高浓度苯丙氨酸_苯丙酮尿症高浓度酪氨酸_1、2、3型酪氨酸血症高浓度亮氨酸和缬氨酸_枫糖尿症高浓度瓜氨酸_精氨基琥珀酸合酶缺乏症高浓度鸟氨酸-回旋萎缩，高鸟氨酸血症高浓度精氨基琥珀酸_精氨基琥珀酸酶缺乏症低浓度肌酸和肌酸肝-AGAT、GAMT或肌酸转运蛋白缺乏症高浓度胍基乙酸-GAMT缺乏症低浓度胍基乙酸-AGAT缺乏症高浓度3-甲氧基酪氨酸_芳香族氨基酸脱羧酶缺乏症和磷酸吡哆醛合成缺乏症高浓度游离肉碱_棕榈酰肉碱转移酶1缺乏症低浓度游离肉碱_棕榈酰肉碱转移酶2缺乏症高浓度辛酰基肉碱-中链酰基CoA脱氢酶缺乏症(MCADD)高浓度的多种酰基肉碱物质_多种脂肪氧化作用和有机酸病高浓度己酰基甘氨酸-中链酰基CoA脱氢酶缺乏症(MCADD)高浓度乳清酸_鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症高浓度17-羟孕酮_先天性肾上腺增生高浓度皮质醇_先天性肾上腺增生低浓度皮质醇_先天性肾上腺增生高浓度7-脱氢胆固醇-Smith-Lemli-Opitz综合征高浓度胆固醇_家族性高胆固醇血症本领域技术人员熟知的其他相关物也可以等同地应用于本发明。在本文中，术语“高”和“低”应在其使用语境中进行解释。例如，“高浓度苯丙氨 酸”表示与正常受试者相比，即与没有患苯丙酮尿症的受试者相比，苯丙氨酸浓度高。相似 地，物质的“低”浓度同样表示就所研究或筛查的疾病来说，与正常个体相比，此物质浓度 低。同样的原则适用于以相对术语表示的酶活性或本文描述的其他实体，即，将数量理解为相对于未受影响的参考样品。至少出于这些原因，相对术语“高”和“低，，对于本领域读者 理解本发明及其操作是清楚且恰当的。最合适地，代谢物如实施例部分所列出的那些。应该注意到，本文公开了乳清酸作为用于检测鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症的 目标代谢物。用于此目的，之前没有使用或提示使用全血乳清酸。在某些现有背景中，将尿 乳清酸作为一种诊断用代谢物来研究。然而，本发明教导了血中乳清酸水平作为OTC缺乏 症的诊断用指示物的新用途。催化活性酶活性筛查是指筛查样品的特定催化活性的情况。合适地，其通过向样品中加入 催化活性能作用的底物来进行。为了评估可能存在或可能不存在的活性，读数通常是预期 产物的存在与否，该预期产物是在所测定的催化活性(例如酶活性)存在下由底物转变成 的。所述催化活性通常是酶活性。此活性可包括(酶-底物；所指示的疾病的方式)生物素酶-底物为生物素PABA或生物胞素或其稳定的同位素变体；缺乏(低活 性)表示生物素酶缺乏症；胆色素原合酶缺乏_底物为δ -氨基乙酰丙酸；缺乏(低活性)表示存在琥珀酰 基丙酮，(延胡索二酰乙酰乙酸酶缺乏)或胆色素原合酶缺乏症；半乳糖苷酶A-底物为4-甲基伞形酮-a-D-吡喃半乳糖苷；缺乏(低活性)表示 Fabry氏疾病；戊二酰CoA脱氢酶-底物为戊二酰CoA ；缺乏(低活性)表示1型戊二酸尿症；硫代嘌呤甲基转移酶_底物为6-巯基嘌呤或其稳定的同位素变体；缺乏(低活 性)表示硫唑嘌呤敏感；肌酸激酶_底物为磷酸肌酸；存在(高活性)表示肌营养不良/肌肉萎缩症。最合适地，所述活性选自实施例部分所述的那些活性。多肽分析适合在本发明的样品上进行的再一种类型的分析是多肽分析。其可简单地用于特 定多肽的存在与否的鉴定。或者，其可用于表征或检测限定多肽的特定变体的存在与否。其 可通过本领域技术人员所熟知的任何合适的模式来实施。合适地，多肽分析是指多肽结构组成的分析。这通常不是多肽的构象或三维结构， 不过如果需要的话，本领域技术人员可选择该特征进行分析。合适地，所述结构组成是指多 肽的分子结构。合适地，所述分子结构是指多肽的氨基酸组成。显然，测定多肽的整个氨基 酸组成可能是不现实的。合适地，考量所述氨基酸组成的关键特征部分。最合适地，这通过 多肽的肽酶消化(片段化)和所产生肽(片段)的质量分析来进行。这提供诸如特定片段 的质量的信息，该信息本身能够揭示所述多肽组成的信息，或者更通常地，片段的质量揭示 母多肽中肽酶识别序列的数量和间距的信息，由此提供所述多肽的分子结构或氨基酸组成 (即氨基酸序列)的直接(识别位点)和间接(间距)信息。所述肽酶(肽链内切酶)优选为能够断裂肽键的任何催化实体，例如酶或其片段。 目前定义了六组蛋白酶丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金属蛋白和谷氨酸。优选地， 所述肽链内切酶是单个肽链内切酶。所述肽酶可以是现有技术中已知的任何合适的肽酶，例如胰蛋白酶、V8肽链内
10切酶、胰凝乳蛋白酶、Asp-N和Lys-C。合适地，所述肽链内切酶具有XXK或XXR的识别序 列。合适地，所述分析通过胰蛋白酶消化并分析所产生的裂解产物来进行。在分离中使用 的该技术是本领域熟知的。例如，在评估临床显著的血红蛋白病时，Daniel et al已经对 这种技术进行了详尽的描述(2005Br. J. Haematol, vol. 130 pp 635-43)。除了分析作为用 于诊断血红蛋白病的目标多肽的血红蛋白外，还可以通过这种方法对肌红蛋白(用于诊断 Ducherme/Becker肌肉萎缩)、白蛋白(用于诊断甲状腺激素结合缺乏症)、转铁蛋白(用 于诊断糖基化病症)、α-1-抗胰蛋白酶(用于诊断α-1-抗胰蛋白酶缺乏症)、甲胎蛋白 (用于诊断爆发性肝功能衰竭)、铜蓝蛋白(用于诊断Wilson氏病)，或任何其他目标多肽 进行分析。读数原则上，可以通过本领域已知的适合检测所检验样品中单个化学实体的存在的任 何方式，例如通过测定其质量来收集读数。合适地，所述分析可通过具有两个不同质量选择 器且在二者之间具有碰撞步骤的装置来进行。最合适地，利用质谱(MS)来收集读数。可以 使用能够分析离子的任何MS分析器。例如，可使用MALDI/T0F/线性捕捉或任何其他类型 的MS分析器。最合适地，通过电喷雾质谱-质谱(MSMS)进行分析。生物素酶缺乏症生物素酶缺乏症的主要关注点和临床结果是双侧耳聋。英国卫生部 (UKDepartment of Health)在听力缺陷筛查方面投入了大量的资源。因此，尽管生物素酶 缺乏症是种罕见的遗传缺陷，但是此疾病的主要表型为需要终生花费高额费用的双侧耳聋 的事实意味着在新生儿期间筛查此种疾病的经济情况是非常强的。现有技术利用比色测定 法筛查生物素酶缺乏症。例如，新西兰、美国和其他国家都使用比色法筛查。由于现有技术 的比色检测法不灵敏，所产生的颜色弱，因此就该方面而言该现有技术是差的检测方法。这 导致缺乏可靠性，即便根据目前的指导进行检测也是如此。另外，在血斑上实施此项检测在 技术上也很困难。由于现有技术的方法的局限性，本领域主要集中于测定法的优化。通过 比较，发明人发现，事实上根据本发明不需要优化即可获得满意的测定结果。本发明的方法 包括监测生物胞素及其产物，而不是集中于任何酶的比色测定上。并且，本发明的简化测定 法的关键特点是不使用缓冲。首先，这具有避免对其他能在同一样品上多重化的可能酶测 定造成抑制的优点。其次，通过提供于在水中而非缓冲液中的底物有利地减少或避免离子 抑制的问题。缓冲可降低灵敏度，因此，通过避免使用，本发明有利地提高了灵敏度。再者， 如果如现有技术一样使用了缓冲液，那么为除去缓冲液可能需要费力耗时的色谱。本发明 的方法有利地除去了这一步骤。底物生物胞素是生物素酶的天然底物。生物胞素由连接赖氨酸的生物素组成。本发明 的发明人注意到商购的生物胞素往往含有显著量的生物素。因此，根据本发明，有利地，从 生物胞素底物中清除生物素。换句话说，将生物胞素底物进行纯化以除去污染性生物素。这 是个简单的纯化步骤，此步骤能够通过现有技术中任意合适的方法来完成。合适地，通过色 谱法除去生物素。用纯化的生物胞素的优势在于可以由此除去一种裂解产物(生物素)。由于生物 素是生物素酶的裂解产物，污染性生物素可产生假阳性结果。因此，如果在测定中检测到了污染性生物素，可能会给出检测到生物素酶活性的错误结论。根据本文教导的方法，即通过 除去所提供的商购的生物胞素中所有残留的污染性生物素，产生具有更大特异性的优点的 “干净”底物，消除分析中的假阳性。因此，本发明一方面涉及“干净的生物胞素”，即基本不 含生物素的生物胞素。合适地，本发明涉及根本不含生物素的生物胞素。最合适地，本发明 涉及完全不含生物素的生物胞素。生物素-PABA是生物素酶的良好底物。本发明的发明人注意到，商购的生物 素-PABA往往在溶解性方面面临挑战。采用增强溶解性(甚至3mM)的剧烈(aggressive) 处理，例如超声、加热、涡旋或类似的方法可促进自发水解，从而在溶液中产生游离的PABA 和游离的生物素。这些物质，特别是游离的生物素可能混淆所述测定。因此，根据本发明， 有利地，清除生物素-PABA底物中的生物素。换句话说，纯化生物素-PABA底物以除去污染 性生物素(和/或游离的PABA)。这是一个简单的纯化步骤，可以通过现有技术中已知的任 何合适的方法完成。合适地，通过色谱除去生物素(和/或PABA)。合适地，这种纯化在生 物素-PABA溶解之后进行。使用纯化的生物素-PABA的优势在于至少由此除去了一种裂解产物(例如生物 素)。污染性产物，例如生物素能够导致假阳性结果。因此，如果在测定中检测到了污染性生 物素，可能会给出检测到活性的错误结论。根据本文教导的方法，即通过除去所提供的商购 的生物素-PABA中所有残留的污染性生物素/PABA，产生具有更大特异性的优点的“干净” 底物，消除了分析中的假阳性。因此，本发明一方面涉及“干净的生物素-PABA”，即基本不含 生物素和/或PABA的生物素-PABA。合适地，本发明涉及根本不含生物素的生物素-PABA。 最合适地，本发明涉及完全不含生物素的生物素-PABA。合适地，所述“干净”(纯化)的生 物素-PABA以在溶液中的形式提供，这具有当试图重新溶解所述干净物质时除去可能进行 的进一步水解的优点。针对污染性生物素问题的可选办法是使用带标记的赖氨酸的生物胞素。所述标记 可以是，例如，稳定的同位素标记。因此，通过仅寻找所产生的样品中由生物素酶作用释放 的带标记的赖氨酸来进行分析。这样，通过基本忽略催化的生物素产物，生物胞素底物中存 在的任何污染性生物素被有效地忽略或排除在分析之外。生物胞素是水溶性的。仅生物素PABA是水溶性差的。关键在于，本发明的发明人通常并不关注定量而是关注某物是否存在，即定性，并 且这可减少所加入的底物水平，从而将成本降至最低，并净化了读数，使所使用的比值(例 如底物产物)准确性更高。如果需要，底物产物的比值当然也可用于定量，例如定量酶 活性。在本发明的用于测定生物素酶和/或PBG合酶的多重系统中，以不同浓度和组合 对生物胞素、生物素PABA和δ-氨基乙酰丙酸(在本文中，所使用的术语“ δ-氨基乙酰 丙酸”可以与术语“5-氨基乙酰丙酸”互换，合适地，提及“ δ-氨基乙酰丙酸”理解为是指 “5-氨基乙酰丙酸”)都进行了广泛试验。在20μ M至ImM范围内，这些底物中的每一种都 是有效的，甚至在更高浓度下也可以有效。小于20 μ M的浓度可能较少使用，并且可能会产 生酶动力学和分析灵敏度的问题。本文中，每种底物的最佳浓度为50 μ m。广泛测试了酶作用的温育时间。从仅仅几分钟到2. 5小时的温育都是有效的。合 适地，温育持续30-120分钟。最佳温育时间为约1小时。合适地，温育时间为，或者大约为
1260分钟。温育时间为从加入底物至样品终止(例如加入终止缓冲液或运行缓冲液/溶剂) 或样品读数的时间。更合适地，由于蛋白酶通常会使酶降解，温育时间为从加入底物到加入 蛋白酶的时间。在某些实施方案中，可能同时加入底物和蛋白酶，不过预期会发生较少的底 物降解，这需要进行进一步的补偿性调整，例如较高的底物浓度。当然，本领域技术人员可以根据其需要，对底物浓度和/或温育时间进行优化。例 如，较高的底物浓度可允许较短的温育时间，反之亦然。本文给出了温育温度的指导，特别是在实施例部分。可以将室温(例如18-25°C ) 用作起始温度，如果需要，本领域技术人员可以进行优化。标准化本发明的优点在于不要求对催化分析条件进行标准化。而且，不必提供过量底物。 通过除去对过量底物的需要，本发明的优势在于可自由选择底物浓度，从而在检测的整个 时间范围内产生好的结果。另外，通过省去提供过量底物的需要，可进行半定量分析。例 如，通过提供已知浓度的底物，并通过在温育步骤后分析底物和产物的量，可以得到底物 产物比值，从而很好地估测出特定样品中活性的量。这在此实施方案中有利地消除了对用 于定量的稳定同位素标记的底物或产物的需要。1型酪氨酸血症在现有技术中，通过血液中提高的酪氨酸水平来检测1型酪氨酸血症。然而，这是 二级甚至三级结果。1型酪氨酸血症中的酶缺陷事实上并不与酪氨酸直接相关联。确实， 许多新生儿的血流中都具有提高的酪氨酸水平，特别是在早产儿当中。这就使现有技术的 分析复杂化。例如，如果操作者针对酪氨酸水平设置了高截断值，则可能会漏掉许多阳性结 果。相反，如果操作者针对酪氨酸水平设置了过低的截断值，则可能会出现过多的阴性结 果，从而在后续的检测或再检测中浪费资源。可选的办法是测量琥珀酰基丙酮的水平。然 而，这需要酸和其它化学处理，并且是一个对技术有过分要求的测定。1型酪氨酸缺乏症中 的真正酶缺陷是延胡索二酰乙酰乙酸酶的缺乏，从而导致琥珀酰基丙酮的积聚。琥珀酰基 丙酮抑制胆色素原合酶(PBS)的活性。PBS测定一直被用作琥珀酰基丙酮浓度的代表。检 测基础的胆色素原合酶的现有技术可能困难重重。首先，如果底物以测定所需的浓度使用， 则其可能会抑制酶。或者，如果建立测定方法以尝试测量胆色素原本身，由于胆色素原通常 很快被代谢掉，因此这可能有问题。这两种因素导致了进一步的困难，即现有技术的长测定 似乎一致地产生降低的结果。本发明的发明人提出了将5-氨基乙酰丙酸作为底物并测量 产生的胆色素原的方法。另外，在平行处理中，所述测定可以在琥珀酰基丙酮存在下进行重 复。琥珀酰基丙酮抑制胆色素原合酶。因此，通过比较有和没有琥珀酰基丙酮的结果，可能 清楚地说明通过直接测定胆色素原合酶活性来检测1型酪氨酸血症的能力。因此，现有技术中，PBS是在用5-氨基乙酰丙酸做底物并用比色法测量产生的胆 色素原的“优化的”测定法中测量的。现有技术显示酶的活性降低与加入的琥珀酰基丙酮 的量成正比。更重要的是，琥珀酰基丙酮为在未治疗的1型酪氨酸血症病人中观察到的浓 度时，PBS的活性(几乎)被完全破坏。然而，比色测定法不灵敏，并且在现有技术中使用 长的温育时间(16-24小时)作为提高产生的胆色素原的量的合理方法。本发明的发明人 已经认识到，当在其高浓度底物5-氨基乙酰丙酸存在下进行温育时，PBS活性可能会显著 降低。这降低了所合成的胆色素原的预期量。另外，胆色素原的产生速度可能开始被通过胆色素原脱氨酶除去胆色素原的速度所超越。因此，温育时间短代表本发明的显著优势，此 外，用MSMS检测胆色素原比用比色测定法显著更灵敏。作为一种简单的操作，MS分析通常包括空白，该空白可方便地用做参考或对照样 品。而且，当在本文中参考指“基本上无信号”时，应当记住，简单参考空白或对照样品将澄 清信号是否确实存在。本发明的优势在于特异性和灵敏度两者均高于现有技术中的比色测定法。确实， 结果通常是如此清楚以致接近二进制读数。显然，在高通量诊断情况下，这是本发明的显著 优点。合适地，本文描述的不同分析是在同一样品上进行的。“同一样品”强调的是，其是 指在同一单个物理样品上进行不同的处理和分析。其不是指，例如将样品分成多个不同处 理，和随后将各个所述不同处理组合。“同一样品”意味着使用一个物理样品，例如血斑或血 液样品，并且各不同分析均在该同一单个样品上进行。这并没有被现有技术所教导。确实， 现有技术教导了与之相反，因为现有技术强调优化条件对所进行的各个分析的重要性。目 前全球实行的筛查对进行的各个测定使用不同的血斑。现有技术一致教导每一种酶应该用 一个斑点来分析。因此，本发明的显著不同之处在于本发明的方法涉及在同一单个血斑上 分析几种酶。这一点很重要，原因在于直到本发明才意识到，事实上可以从本文教导的次佳 (或确实完全没有优化)或非缓冲体系中得到不同酶的有用信息。这是本发明整体多重化 的一个重要实施方案。关于所用的稀释，产生了类似观点。用于分析血红蛋白病的通常样品稀释比用于 代谢物分析的样品稀释高6-8倍。而且，在现有技术中，代谢物通常用甲醇或甲醇水混合 物固定从血斑中提取(使变性蛋白质和盐不能被提取)，由此减少了电喷雾源中的离子抑 制。根据本发明，所使用的唯一溶剂是水。然而，本发明的优点在于，即使在稀释6-8倍的 血红蛋白病分析用样品中，本发明也的确能够可靠且可重复地检测出诊断性代谢物。考虑 到稀释的样品中这些代谢物的显著较低的浓度，这本身就是令人惊奇的。此外，令人惊奇的 另一方面在于，根据本发明能够令人惊奇地省略被认为是代谢物分析标准方法的一部分的 甲醇或甲醇水提取体系。合适地，在本发明方法的制备步骤中不使用有机溶剂。显然，如 果为了读数需要使用MSMS运行缓冲液或类似添加剂，那么应该像常规操作一样在读数前 加入。但是，合适地，样品制备中省去有机溶剂步骤。合适地，从所述方法中省去常规的代 谢物提取步骤。样品样品可以是来自待测试的受试者的任意合适的物质。合适地，所述样品包括血液。 在某些实施方案中，所述血可以是脐血(脐带血)，其可能有利于早期诊断。更合适地，所述 样品是毛细血管血。合适地，所述样品是来自足跟采血所获得的毛细血管血。更合适地，所 述样品包含从出生后第0天至第10天的新生儿足跟采血获得的毛细血管血。合适地，所述 血在产后第1-8天采集，合适地，在产后第3-8天采集，更合适地，在产后第5-8天采集。收集足跟采血样品的血斑卡上的标准斑点通常相对较大(例如直径大于6mm)。目 前，从单个针刺采样期收集大约四个大血斑。然而，本发明的优点是需要显著较少的样品物 质。具体而言，本发明中所用到的血斑样品直径可有利地为6mm或小于6mm，并且合适地， 可以为仅3. 2mm的血斑，最合适地，仅使用一个3. 2mm血斑(或相等的样品尺寸)。作为比较，从单个标准的现有技术血斑(大血斑)所需的相同物质可以获得大约六个3. 2mm斑点。应该注意，各个国家的健康服务机构都保留这些血斑样品。例如，在丹麦，血斑被 冷冻储存。在英国，血斑通常以其干燥状态保存。每年采集和储存的血斑数量是很可观的。 例如，英国每年大约采集600，000个样品，美国每年大约3，000, 000个样品，整个欧洲(除 英国外)每年大约4，000，000个样品。因此，本发明的再一个优点在于，需要采集的血斑较 少，从而需要储存的血斑也较少。或者，可以采集与现有采样技术数量相同的血斑，本发明 的优势在于留下更多的残留血液用于后期的新检测或后续检测。另一问题就是，出生不久后的婴儿可能是痛苦的或有喂养问题。这些因素可能导 致代谢物“缺失”或确实在意想不到的时间点上出现。然而，酶活性一直存在，而不管来自 于痛苦的受试者的样品中出现的或消失的代谢物的明显的反复无常。因此，本发明的优点 在于，在测定样品的催化活性或酶活性时，所检测的受试者的产后压力从分析中大幅消除。 确实，通过直接检测酶活性而不是代谢物，灵敏度可以得到提高。此外，通过在酶活性分析 中使用标记底物，可以消除样品中的任何背景影响或预先存在的产物，提高分析的特异性。根据现有技术的观点，本文教导的多重化能够完全起作用是令人惊奇的。原因在 于，样品中多肽的蛋白水解消化，例如胰蛋白酶消化，将释放包括苯丙氨酸在内的氨基酸。 如果将苯丙氨酸作为诊断性代谢物(例如，当将其存在评为指示苯丙酮尿症时)，则预期这 种处理会使所述结果混乱。然而，正如本文所证明的，多重化分析确实起作用。确实，利用血 斑使这种影响标准化并将其(即可能观察多于实际释放的苯丙氨酸)考虑在内是可能的， 因此如果将蛋白酶处理与其他分析多重化在一起，实际上令人惊奇地，这是没有影响。换句 话说，通过使用苯丙氨酸浓度已知的血斑校准物，由于胰蛋白酶活性从样品释放的苯丙氨 酸量被从血斑标准物的等量释放补偿。对于其他氨基酸也是如此。无论如何，对于酰肉碱 分析来说，这并不是个问题。在一些实施方案中，样品龄(sample age)可能比较重要。其是指自样品采集之后 所经历的时间，而不是指采集样品的受试者的年龄。因此，样品可以为一天或数天至数周、 数月或者甚至数年，例如两年。通常，血斑越老，所提取的蛋白就越少。因此，当在分析中使 用胰蛋白酶处理时，较老样品中释放的“背景”游离氨基酸(其产生不同的“基线”读数，根 据基线读数评价用于诊断的物质，例如用于PKU的Phe的存在)的量往往较少，其中所述老 样品为数周或数月之久的样品。出于此原因，在比较样品时，优选使用大约相同样品龄的对 照或参考样品。这表示优选彼此均为2-3个月以内，合适地，彼此均为2个月以内，合适地， 彼此均为1个月以内，合适地，彼此均为2周以内，最合适地，彼此均为1周以内的样品。对于较老样品，使用甲醇作为运行溶剂可能有利于优化所洗脱的绝对量较低的物 质的电离。蛋白酶处理合适地，蛋白酶消化步骤作为分析样品前最后一个步骤(即读数前的最后一个步 骤)来进行。通常，样品先被再水化，然后加入一些底物(合适地，仅以在水中的形式加 入_避免加入任何缓冲体系)，然后温育样品以允许催化所述底物，随后仅加入蛋白酶，之 后进行适当的温育使蛋白酶发挥作用。显然，优选在酶有机会作用于外源性加入的底物 (如果有)之后向样品中加入蛋白酶。如果蛋白酶与底物同时加入，则酶自身可能被蛋白酶 作用降解，从而可能使从所述酶活性产生假阴性结果。因此，合适地，蛋白酶的加入和蛋白
15酶的温育步骤在最后，或刚好在样品分析(读数)之前进行。合适地，所述样品没有被丁基化。合适地，没有进行样品的衍生。合适地，没有对样品中的蛋白进行特异变性。合适地，添加仅以在水中的形式进行。合适地，水是样品制备中唯一使用的溶剂。 合适地，在样品制备中没有使用有机溶剂。显然，并不将在接近读数时加入的“运行缓冲液”或“运行溶剂”(其可能包括如 乙睛的有机溶剂)作为样品制备的一部分，样品制备不涉及有机溶剂是本发明的优点，但 这并不应该解释为将作为读数的一部分的最终运行缓冲液的添加排除在外。合适地，最后 加入运行溶剂(合适地，在提取/底物加入、酶活性温育、蛋白酶加入和蛋白酶温育之后加 入)。这有利于促进肽、酶底物/产物和常规代谢物的有效电离。另外这可能有利于溶解某 些代谢物，例如长链酰基肉碱。因此，合适地，最后加入运行溶剂(其可以包括有机溶剂) 的是接近读数时的目前操作的一部分。运行缓冲液可以包含现有技术中已知的任何合适的组分。合适地，如本文所述，尤 其如实施例部分所述，运行缓冲液包含乙睛。合适地，使用任何适合MSMS的运行缓冲液。在 一些实施方案中，通过加入运行缓冲液终止酶反应(无论是诊断物本身还是用来产生诊断 性多肽的蛋白酶例如胰蛋白酶)。在一些实施方案中，这种终止的运行缓冲液可以包含甲 醇，或可以由甲醇组成。这具有改善电离的优势。当然，从实际意义上讲，使用甲醇作为终 止的运行缓冲液/溶剂并不排除常规运行溶剂(例如以乙睛为基础的溶剂)的使用。从某 个角度来看，仍然可以使用这种常规溶剂，因为通常上样至MSMS仪器中用于读数的样品实 际为小体积，所述体积可以包含2ul终止样品(即包含运行缓冲液(终止运行溶剂)的样 品)，当然，所述样品通常被引入到毛细管(或“管道”)上样系统中，并由此可能被基于乙睛 的常规运行缓冲液边缘化至任一侧。因此，从实际角度来看，可以理解，使用甲醇作为终止 运行缓冲液并不排除在读数阶段使用乙睛或其它常规缓冲液，但使用甲醇作为运行缓冲液 (终止运行溶剂)具有某些优势。因此，合适地，本发明的方法包括用常规的乙睛-H2O-甲 酸运行溶剂(例如Iml)终止反应的步骤，更合适地，本发明的方法包括甲醇(例如Iml)终 止反应的步骤。合适地，没有向所述样品中加入外源性缓冲液。合适地，本发明的方法中省略了缓 冲步骤。合适地，没有向所述样品中加入外源性缓冲液。合适地，没有进行介入提取步骤，更合适地，在制备后直接对样品进行分析，没有 任何介入步骤。变性在蛋白质分析的现有技术中，在蛋白酶消化之前进行蛋白质变性被认为是必要 的。在现有技术中，例如，与血红蛋白病有关的现有技术中，利用单独加入的乙睛和甲酸对 样品进行常规变性，然后放置。根据现有技术的方法，在加入胰蛋白酶之前，用碳酸铵中和 样品中的甲酸使PH接近胰蛋白酶的最佳PH。基于干血斑中的蛋白质至少已经部分变性的 认识而省略这些步骤是本发明方法的极大简化。因此，合适地，本发明的方法特别省略了基 于有机溶剂或有机酸的样品制备步骤。合适地，本发明的方法特别省略了基于化学变性的 样品制备步骤。合适地，本发明的方法包括没有有机溶剂/变性的介入步骤的样品制备步骤。从更广的方面来说，本发明涉及省略这些步骤的蛋白质分析方法，例如血红蛋白病的诊 断方法，即使是当这些方法没有按照本文的教导进行多重化。定量-内标/产物底物比值可以利用稳定的同位素标记底物来实现定量。合适地，所述底物用至少一种稳定 的同位素标记，合适地，至少两种稳定的同位素标记。合适地，所述同位素选自由氘、碳13、 氮15和氧18组成的组。合适地，所述同位素是碳13。当使用两种同位素时，合适地，它们 为碳13和氮15。合适地，当所述底物是多肽时，所述稳定同位素被引入到目标内肽酶切割 位点(如果有)的N末端，这样由于肽随后的内肽酶切割(如果有)而将标记保留。随最 初酶底物的加入或胰蛋白酶的加入，将利用标准的同位素_稀释法测量代谢物/肽的稳定 同位素内标(例如肽稳定同位素)一起加入。合适地，可以在酶温育后加入酶产物的稳定 同位素，这具有不抑制酶活性的优点。当加入的稳定同位素标记的底物用于特异性时，最初 加入是合适的，即这样可以使酶有机会作用于任何底物。本发明的优势在于，通常不需要定 量就能测定酶活性或相关酶活性的存在与否。通常其能够利用产生的产物或底物产物比 值来测量。进一步以定量为特征的实施方案的关键优点是当使用次佳的底物浓度时。可选地，可以通过导出底物/产物比值进行定量。进一步应用本发明的系统和方法可以基于通过MSMS进行的多重的全血代谢物、酶活性和胰 蛋白酶肽测量，在单个3. 2mm血斑上同时进行遗传性代谢物疾病和血红蛋白病的诊断，而 没有样品转移。本发明可用于检测蛋白质/多肽的突变，和/或定量测量蛋白质/多肽，诸如胰蛋 白酶的蛋白酶所释放的肽。有利地，本发明省去了用于血红蛋白(或任何蛋白)常规变性的任何添加，从而显 著简化了整个过程。所述系统能容易地扩大到包括另外的代谢物、酶活性或胰蛋白酶的肽和代表可应 用于一系列临床诊断的通用多重分析方法。本发明的主要优势在于，使用血斑作为用于测量多种酶活性，例如生物素酶(最 佳PH值为6.0)和胆色素原合酶(最佳PH值为6. 4)的唯一缓冲要求。合适地，底物以在 水中的形式加入(即合适地，水是唯一使用的溶剂/载体)。然后，通过测量酶解产物来测 定活性。本发明涉及“斑点上的诊断”。使用于水中的酶底物的主要技术效果是所述样品有利地与之前用于胰蛋白酶消 化和血红蛋白病诊断的样品相同。将代谢物包含在同一分析中出乎意料地有效。用于血红蛋白病分析的样品稀释通 常比常规用于代谢物分析的稀释高6-8倍。通常利用甲醇或甲醇水混合物从血斑中提取 代谢物，这样使蛋白质和盐的洗脱最小从而使电喷雾源中的离子抑制最小。此外，底物/产 物和酶处理可以提高/降低目标代谢物。特别地，现有的代谢物分析技术通常包括丁基化， 而合适地，本发明的方法特别地将其省略。针对特定酶可以使用多于一种的底物。这有利于提高特异性。可以使用稳定的同位素标记底物，这有利于提高特异性。合适地，制备底物以特别地不含待测的酶产物。这有利于减少产物污染底物时可
17能发生的“假阳性”。合适地，使用水溶性底物。这有利于维持水作为唯一的溶剂/载体，并由此除去样 品制备中的有机溶剂和/或提取步骤(不过如上所指出的，在读数阶段加入“运行溶剂”仍 可能涉及有机溶剂，例如乙腈)。本发明的一个优点为除去了用于除去缓冲液等的色谱步骤。因此，在优选的实施方案中，所述样品包括一个血斑，样品制备不涉及转移，并且 代谢物、酶活性和蛋白均在单个多重分析中测定。本发明证明了，例如使用没有进行色谱的样品直接上样和电喷雾质谱-质谱 (MSMS)检测法，在单个3. 2mm的血斑(血斑尺寸可以更大或更小，并且可以使用液体的全血 或血浆；最合适地，使用血；合适地，血斑尺寸标称为3. 2mm ；最合适地，血斑尺寸为3. 2mm) 上，同时进行分析物的测定(例如用于MCADD的辛酰基肉碱)、蛋白的检测(镰刀β-血红 蛋白)和酶活性的测量。本文参考新生儿筛查对所述系统进行了描述，但该系统可以用于 多种临床诊断和监测情况，例如癌症、糖尿病(1型和II型)、肾病和肝病。本发明还可以应用于其他分析物，例如不对称的二甲基精氨酸(ADMA)、乳清酸和 3-0-甲基-二羟基苯丙氨酸(30MD0PA)，从而能够有利地筛查其他遗传性和先天性疾病。利 用这些代谢物的疾病筛查之前并没有阐述。可以将这些分析物(代谢物)引入到目前描述 的多重筛查系统。特别地，本发明描述了所实施的分析，即利用150μ1甲醇(包含用于氨 基酸、酰基肉碱、肌酸酐、甲基丙二酸、乳清酸、ADMA和对称性二甲基精氨酸(SDMA)定量的 所有范围的稳定同位素)洗脱血斑30分钟，然后2次进样，每次为5μ 1洗脱液，用于快速 色谱、正离子和负离子模式的电喷雾和MRM分析(在SCIEX ΑΡΙ5000 (Applied biosystems, Warrington, UK)上进行)。应该注意到，已经提出将SDMA作为肾小球过滤速率的量度，并 且本文提供的数据证明，可以在血斑中足够准确和精确地测量SDMA，从而可以在与肾功能 下降和随后的心脑血管风险的增加相关的多种临床疾病(例如糖尿病和心脏病)中准确诊 断肾衰竭并检测肾功能。
图1至8为扫描图。图9为示意图。图10、11和12为色谱图；橙色线为上线，而在图12中橙色线为下线而蓝色线为上线。图13为曲线图。图14为色谱图，上图蓝色线为上线。图15为色谱图，上图蓝色线为上线。图16为色谱图，上图蓝色线为上线。图17和18为标准曲线图。以下通过实施例对本发明进行阐述。这些实施例仅为说明性的，并且不限制权利 要求书。
实施例实施例1
一般方法向含血斑的深孔板中加入100 μ 1包含用于苯丙氨酸、酪氨酸和辛酰基肉碱的稳 定同位素的底物，并在37°C温育30分钟。加入5 μ 1胰蛋白酶(5mg/ml)，并继续在37°C温育30分钟。加入Iml包含稳定同位素PABA的运行溶剂。准备上样。MSMS时间为1分钟。详细方法2μ1上样量。75 μ 1/分钟。流动相为含有0. 025 %甲酸的1 1的乙腈水。1 分钟总MSMS MRM采集用于临床诊断的血红蛋白病、5-氨基乙酰丙酸、胆色素原、生物胞素、 生物素、赖氨酸、d5-赖氨酸、生物素PABA、PABA、d4_PABA、苯丙氨酸、酪氨酸、辛酰基肉碱、 d5-苯丙氨酸、d4-酪氨酸和d3-辛酰基肉碱。进行以下分析1)发明人用胆色素原合成酶的天然底物5-氨基乙酰丙酸温育由点在 Schleicher&Schuell滤纸(用于新生儿筛查)上的全血制备的3. 2mm全血斑，37°C温育1 小时30分钟，并通过MSMS测定胆色素原。2)同1，但包括100 μ mol/1琥珀酰基丙酮，以证明对测定的抑制_(基本上)没有 检测到胆色素原_并由此证明检测1型酪氨酸血症的能力。3)发明人用生物素酶的天然底物生物胞素温育由点在Schleicher&Schuell滤纸 (用于新生儿筛查)上的全血制备的3. 2mm全血斑，37°C温育1小时30分钟，并通过MSMS 测定生物素和赖氨酸。4)同3，但使用盐水洗涤的红细胞，并加入来自生物素酶缺乏症患者的血浆，以证 明生物素酶活性降低。底物中存在的显著量的生物素使该试验和3复杂化。但仍可能区分， 从而可以检测生物素酶缺乏症，但不含生物素的底物或稳定同位素标记的赖氨酸(所检测 的信号并且在标准条件下不存在)的优势更突出。5)发明人用生物素酶的人工底物生物素PABA温育由点在Schleicher&Schuell 滤纸(用于新生儿筛查)上的全血制备的3. 2mm全血斑，37°C温育1小时30分钟，并通过 MSMS测定生物素和PABA。6)同5，但使用盐水洗涤的红细胞，并加入来自生物素酶缺乏症患者的血浆，以证 明生物素酶活性降低。底物中存在的显著量的生物素使该试验和5复杂化。但仍可能区分 (尤其是利用PABA)，从而仍可以检测生物素酶缺乏症，但不含生物素/PABA的底物的优势 更突出。7)同5和6，但加入用于定量所释放的PABA的稳定同位素PABA。8)同上，但加入5-氨基乙酰丙酸和生物胞素或5-氨基乙酰丙酸和生物素PABA或 5-氨基乙酰丙酸、生物胞素和生物素PABA，以证明同时测定两种酶并在同一血斑上诊断生 物素酶和/或1型酪氨酸血症的能力。9)同上，但加入胰蛋白酶并在37°C进一步温育30分钟，以证明正常的酶活性、血 红蛋白谱、苯丙氨酸和辛酰基肉碱。10)同9，但样品来自镰状细胞病患者，以证明正常酶活性、苯丙氨酸、辛酰基肉碱 和镰状细胞病血红蛋白谱。
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11)同9，但样品来自PKU患者，以证明正常酶活性、血红蛋白谱、辛酰基肉碱和提 高的PKU苯丙氨酸诊断。12)同9，但样品来自MCADD患者，以证明正常酶活性、血红蛋白谱、苯丙氨酸和提 高的MCADD辛酰基肉碱诊断。实施例2:多重分析本实施例提供包括蛋白酶处理和样品中的游离氨基酸测定的多重分析，而这对于 现有技术则不可能实现。此外，发明人证明，尽管事实上仅制备单个样品用于代谢物、酶活 性、蛋白酶分析，并且该样品的制备没有外源缓冲、没有基于溶剂的变性步骤且在短时间内 制备，但本发明的各个分析和处理均可以以多重方式进行，且分析的各个读数均真实可信， 而这对于现有技术则不可能实现。因此，该部分使用的包括优化时间在内的方法为向含3. 2mm血斑的深孔板内加入100 μ 1底物(50 μ Μ，考虑浓度后，5-氨基乙酰丙 酸+生物胞素或生物素-ΡΑΒΑ)，并在37°C温育60分钟。加入100 μ 1胰蛋白酶(0. 5mg/ml)，并继续在37°C温育30分钟。加入Iml包含用于苯丙氨酸、酪氨酸和辛酰基肉碱的稳定同位素的运行溶剂。准备上样。MSMS时间为1分钟。发明人在下表中证明，对胰蛋白酶温育响应苯丙氨酸信号提高(注意许多行均为 两次重复的样品对，从而有助于消除试验误差)。注意稳定的同位素IS不受影响。这是由 于稳定的同位素当然不存在于正在用胰蛋白酶消化且使消化后的苯丙氨酸信号提高的样 品的蛋白中。这还证明甲醇中提高的信号，苯丙氨酸和稳定的同位素内标(电离提高)。利用适 当的标准计算结果。尽管有样品老化问题，但标准曲线的线性、对照值和鉴别PKU患者的易行性证明 该系统有效。苯丙氨酸提高可指示苯丙酮尿症。G的峰面积高于F，即测量来自胰蛋白酶释放的Phe以及样品中实际存在的Phe。 发明人证明这是由于胰蛋白酶释放，因为0列和P列的D5(同位素)相同。如果这是信号 效应，那么同位素标准也将“上扬”(即显示更高的信号)。甲醇作为终止/运行溶剂产生较好的电离/较高的灵敏度。通过比较F列和H列 以及0列和Q列可以证明。这是有利的但也是可选的，原因是常规的运行/终止溶剂的作 用也非常有效。该实施例证明的关键点是，其中以何种方式测定Phe与本发明的性能无关。例如， 注意S/T/U/V，尤其是第23/24行。显然，利用胰蛋白酶观察到较多的Phe。如以上所解释 的，这是由于胰蛋白酶释放Phe。类似地，利用甲醇观察到较多的Phe，如以上所解释的，这 是由于较好的电离。从现有技术的观点来看，预期这不可能起作用，因为预测胰蛋白酶释 放的Phe将产生背景水平的Phe从而使存在于PKU患者中的Phe信号丢失。然而，发明人 吃惊地证明，在本发明的多重分析中，仍然可以具有极好的区分。原因之一在于与适当对 照的比较。通过向对照中引入胰蛋白酶处理，在胰蛋白酶处理的非PKU对照组中能观察到 提高的Phe。然而，即使有胰蛋白酶产生的信号，仍然与PKU患者的更高水平有极好的区分。主要观点之一为，由于较老样品中洗脱的蛋白较少和由此可以被胰蛋白酶作用的蛋白 较少，所以在较老样品中，与胰蛋白酶相关的释放较少。此外，更主要的是，在样品龄匹配 (age-matched)的样品中，蛋白质洗脱并由此由胰蛋白酶产生的Phe信号在对照和PKU患者 之间相当，因此两者之间蛋白酶释放的Phe信号“背景”相当，但是关于现有技术，重要且出 乎预料的是，根据本发明，由于用于诊断的游离Phe存在于PKU样品中而不存在于对照中， 因此在PKU样品的信号中存在强的可检测到的差异。因此，尽管现有技术的方法被多重方 法所混扰，发明人证明本方法甚至在多重条件下也非常强大。尽管具有大的背景组分(通 过蛋白酶释放的Phe产生的)，但PKU样品[加上背景]的信号明显区别于适当对照[仅有 背景]的信号。换而言之，本发明可以允许信号在蛋白酶多重测定中“抬升”，而仍然能够区 分实际的诊断信号。当蛋白酶分析是多重测定的一部分时，这是本发明使用样品龄匹配的对照样品是 本发明的可选优点，因为这样具有更好的背景匹配，并因此具有更好/更强的区分。
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发明人证明，对胰蛋白酶温育响应酪氨酸信号提高。注意稳定的同位素工S不受影响。
多重分析辛酰基肉碱(Oct Cam)发明人证明对胰蛋白酶温育响应辛酰基肉碱信号略微提高。注意，稳定的同位素IS也受到影响。提示蛋白消化后提高的电离。这还证明甲醇中提高的信号、辛酰基肉碱和稳定的同位素内标(增加的电离)。尽管有样品老化问题，但标准曲线的线性、对照值和鉴别MCADD患者的易行性证 明该系统有效。计算的浓度计算的浓度计算的浓度 计算的浓度(ymol/l)(ymol/l)(ymol/l)(ymol/l)冠顯白酶-运亍翻月顯白酶-运亍翻冠顯白酶_ W月顯白酶-W空白斑0. 140< 00. 122< 0
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标准20. 4610. 3890. 4460. 250
标准30. 1710. 1910. 1750. 230
MCADD CDC12. 40011. 50011. 3008. 980
MCADD CDC11. 90010. 20011. 0009. 740
下表显示详细数据。
多重分析Leu发明人证明对胰蛋白酶温育响应亮氨酸信号提高。如上所讨论的，来自MSUD患者 的老血斑较不显著。注意，稳定的同位素IS不受影响。这还证明甲醇中提高的信号、亮氨酸和稳定的同位素内标(增加的电离)。然而，标准曲线的线性和对照值证明该系统在同期样品中的有效性。下表显示数 据。
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本发明甚至可以用于老样品(例如数月至2年的老样品或者甚至更老的样品)。 扫描图和/或比值(例如Leu-Phe比值)可用于获得极好的诊断结果。例如，所计算的亮 氨酸和缬氨酸的结果可信性较低，这似乎与样品的样品龄有关。观察扫描图，很清楚应该作 出诊断。在这种情况下，亮氨酸/苯丙氨酸比值和/或缬氨酸/苯丙氨酸比值可用于区分 来自MSUD患者的样品。此外，观察扫描图，表明亮氨酸/丙氨酸和缬氨酸/丙氨酸比值明 显较好。为了对此进行说明，参见图1，酰基肉碱扫描(上)和中性丢失扫描(下，丢失甲酸 酯离子)。比较图1和图2可知Phe提高，由此诊断PKU患者。与图3比较，可知MSUD样品中亮氨酸/异亮氨酸(132.3)提高。Leu Phe 比值(132. 3 166. 4)是 MSUD 的较显著标志。由于作为次级作用Ala在MSUD中通常较低，因此Leu Ala(132. 3 90. 1)比值 也是MSUD的较显著标志，由此，将该Leu Ala比值作为诊断，其在MSUD中更加显著。图4显示在MCADD患者中检测的辛酰基肉碱(288. 2)，并且这种检测和诊断不受本 发明多重分析的影响。重复这些试验，这次将蛋白酶作为多重方法的一部分。图5显示包括蛋白酶(胰 蛋白酶)在内的整个过程的对照样品。注意，由于胰蛋白酶释放氨基酸，信号比图1高约10 倍。然而，尽管具有该数量级的较高信号，本发明仍然可以有利地提供极好的区分。将图6 中的Phe (166. 3)与图5中的比较，显然图6中的Phe较高，尽管具有高出10倍的整体信号/ 背景水平，但这仍可以诊断PKU。此外，比较图7 (132. 2)与图5 (大约1. 6X IO5比1. IX IO5)， 可以容易且明显地区分和诊断MSUD患者。如上所述，如果比较比值，例如Leu Ala的比 值，可以获得更显著的区分。对于辛酰基肉碱，比较图8(288. 4)与图5，甚至在作为多重方 法的一部分的胰蛋白酶存在的情况下，也可以显著区分和诊断MCADD。合适地，在临床实践中，检测的样品斑均是在大约一周内制备的。然而，为了说明 本发明的可信性，MSUD斑为一年多前制备的，并且根据“非胰蛋白酶”与“胰蛋白酶”处理 的比较，显然，在利用胰蛋白酶的该斑点上，发明人没有获得亮氨酸或缬氨酸的任何显著提 尚ο关于5-氨基乙酰丙酸/异亮氨酸/亮氨酸的评注注意，这些物质(以及羟基脯氨酸)导致132. 3峰。这就是为何底物浓度(例如 5-氨基乙酰丙酸浓度)被有利地最小化的原因。因此，在多重样品中使用的5-氨基乙酰丙 酸越少，5-氨基乙酰丙酸的存在对132. 3峰的“抬升”越小。现有技术通常使用的底物约为 本发明教导的20倍，因此在现有技术的方法中没有也不能观察到所述影响。合适地，使用 50 μ M 5-氨基乙酰丙酸底物。扫描结果证明，其可能用于进行MSUD诊断。如上所述，所述信号还包括来自5-氨 基乙酰丙酸的一些贡献，但这通过使用高碰撞能量亮氨酸转变作为读出(readout)而被有 利地最小化。无论如何，发明人证明扫描方法甚至在该多重情况下也起作用。在全世界的多数新生儿筛查实验室中，针对氨基酸进行中性丢失扫描(多数使用 丁基化样品，但如本发明在这些样品中所显示的那样，也可以使用未衍生化样品和中性丢 失m/z 46)，针对酰基肉碱使用子离子m/z 85的母离子扫描(同于对丁基化的注解，但对于
33丁基化和未衍生样品，m/z 85子离子相同)。优选使用MRM。然而，以上例证了如何能够以多重方式，甚至是具有多种可由操作 者选择的可选读数下应用本发明。多重分析Val这证明对胰蛋白酶温育响应缬氨酸信号提高(不是来自MSUD患者的老斑)。注 意，稳定的同位素IS不受影响。这还证明甲醇中提高的信号、缬氨酸和稳定的同位素内标(增加的电离)。样品老化问题使MSUD患者的鉴别变得困难。然而，标准曲线的线性和对照值表明 所述系统在同期样品中的有效性。
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注意，使用亮氨酸/苯丙氨酸信号比值容易地鉴定MSUD患者
样品名称
空白斑 标准1
分析物峰面积(计算)分析物峰面积(计算)Leu/Phe比值 胰蛋白酶-运行溶剂 胰蛋白酶-运行溶剂
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53300 559000
1. 02 0. 26
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洗涤对照11700004780002. 45
MCADD CDC21000007480002. 81
MCADD CDC21500007460002. 88
PKU新155000011400001. 36
PKU新165000011900001. 39
MSUD17700003290005. 38
MSUD18300003390005. 40
AS8270003010002. 75
AC7940004060001. 96
AA8710003150002. 77
由于低苯丙氨酉髮浓度的精确度问I1，所述浓度比值可略微变动。
理论上，实践中以及根据扫描结果，缬氨酸,/丙氨酸比值提供另--种强有力的区分标准。
如上所指，必须牢记在这些特定实施例中，MSUD样品比其他老很多，并且由此具有
较少的与蛋白酶相关的释放。如所充分证明的，本发明为强有力的诊断工具，即使在由于蛋 白酶作用而发生高释放的情况下也具有优异的区分力。确实，以上实施例中的数据对此进 行了证明。实施例3 生物素酶与生物素/PABA多重用生物素PABA(约50 μ mol/1)和5_氨基乙酰丙酸(50 μ mol/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。发明人提出问题测量生物素或PABA区分对照和生物素酶缺乏症么？发明人还解决这些问题产物/底物比值可以用于区分么？成人对照的活性如何与最近的新生儿样品比较？老样品和EDTA中收集的样品中的活性可以测量么？样品名称样品ID 样丨？口类型分析物峰名称分析物峰面积(计算)
对照生物素PABA未知生物素75600
对照生物素PABA未知生物素70900
对照+SA生物素PABA未知生物素69300
对照+SA生物素PABA未知生物素69200
洗涤对照生物素PABA未知生物素23400
洗涤对照生物素PABA未知生物素20300
对照生物素PABA未知PABA45100
对照生物素PABA未知PABA45100
对照+SA生物素PABA未知PABA47900
对照+SA生物素PABA未知 38PABA44700
洗涤对照 生物素PABA 未知PABA1950洗涤对照 生物素PABA 未知PABA1210结论 成人对照样品中的生物素信号仅为生物素酶缺乏症样品中的信号的3. 5倍——见 第1、2行和5、6行(粗体和下划线标出)成人对照样品中的PABA信号是生物素酶缺乏症样品中的信号的30倍——见第7、 8行和11、12行(粗体和斜体字标出)。MCADD样品中最低的生物素信号与生物素酶缺乏症样品中的生物素信号没有显著 差别。MCADD样品中最低的PABA信号仍为生物素酶缺乏症样品中的PABA信号的5倍。因 此，PABA是优选的分析物。注意，在用底物温育的空白斑中具有非常显著的生物素信号，这暗示信噪比差。注 意，用底物温育的空白斑中基本上没有可测量的PABA信号，这暗示信噪比非常高。因此，再 一次说明PABA为优选分析物。PABA/生物素PABA比值提供了更大的区分——35倍。老样品和EDTA样品中的生物素酶活性是可测量的(虽然在老样品中具有一定程 度的样品破坏)。优选底物为生物胞素，因为其是天然底物，且其通常比其他底物更少被生物素污
^fe ο实施例4 =PBG合酶多重用水、生物胞素(50μπιΟ1/1)和5_氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)以及生物素 PABA(50ymol/l)和5-氨基乙酰丙酸(50μπιο1/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。利用两个MRM测量胆色素原首个问题测量胆色素原区分对照和1型酪氨酸血症么(琥珀酰基丙酮抑制胆色 素原合酶活性)？第二个问题哪种胆色素原MRM更好？产物/底物比值可以用于区分么？成人对照活性如何与最近的新生儿样品比较？老样品和EDTA中收集的样品中的活性可以测量么？利用生物胞素或生物素PABA同时测量生物素酶活性时PBG合酶活性有区别么？样品名称样品ID 样；话类型分析物峰名称分析物峰面积(计算)
对照生物胞素未知胆色素原58800
对照生物胞素未知胆色素原62500
对照+SA生物胞素未知胆色素原3970
对照+SA生物胞素未知胆色素原3810
对照生物素PABA未知胆色素原61600
对照生物素PABA未知胆色素原56900
对照+SA生物素PABA未知胆色素原4680
对照+SA生物素PABA未知胆色素原4220
对照生物胞素未知胆色素原232900
对照生物胞素未知胆色素原236400
对照+SA生物胞素未知胆色素原21910
对照+SA生物胞素未知胆色素原22400
对照生物素PABA未知胆色素原236500
对照生物素PABA未知胆色素原233200
对照+SA生物素PABA未知胆色素原21540
对照+SA生物素PABA未知胆色素原21940
结论成人对照样品中的胆色素原信号为1型酪氨酸血症样品中信号(高于空白血斑) 的15倍——见显示的粗体。其他任何非-EDTA样品中最低的胆色素原信号仍为1型酪氨酸血症样品中的信号 的2倍。注意，用底物温育的空白斑中基本上没有可测量的胆色素原信号，这暗示在制备 的1型酪氨酸血症样品中具有一些残留的活性。227. 3/122. IMRM较敏感，但信噪比没有227. 3/94. 0好。这暗示两者皆有可能，但 由于具有较高的信噪比而优选227. 3/122. 1。产物/底物比值提供了稍大的区分——15-20倍。最近的新生儿样品来自PKU患者，并且活性是成人活性的约60-70%，但仍然可以 高度进行区分。虽然几乎可以肯定在老样品中具有一定程度的样品降解，但老样品中的PBG合酶 活性是可以测量的(但在EDTA样品中不能测量)。生物素酶底物之间没有差别。实施例5 :Hbs多重用水、生物胞素(50μπιΟ1/1)和5_氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)以及生物素 PABA(50ymol/l)和5-氨基乙酰丙酸(50μπιο1/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。首个问题通过包括酶底物和温育的多重化是否影响检测镰刀肽的能力？第二个问题底物之间具有差别么，尤其对于离子抑制？样品名称 样品ID 样品类型 分析物峰名称分析物峰面积(计算)分 析物质量范围(amu)面积比AS水 未知 镰刀 91800461.9/472 4am 1.050AS水 未知 镰刀 92600461.9/472 4am 1.MDAS 生物β 未知 镰刀103000461.9/472 4am 1.060AS 生物β 未知 镰刀I(HXX)461.9/472 4am 1.030AS 生β P·未知 镰刀107000461.9/472 4am 1.050AS 生牧康 PA^V 未知 镰刀I(MXX)461.9/472 4am 1.110结论成人HbAS样品中的镰刀信号为水中或底物中其他样品的信号的约100倍——见显示的粗体(AS =杂合)。镰刀或野生型肽的生物素酶底物之间没有差别。因此，多重分析也惊人地适合血红蛋白病的诊断。当存在底物并且与所考量的酶 活性进行温育时，对同时发生的多重血红蛋白病诊断没有损害，即对信号或区分没有影响。针对Hbc、HbDPunjab, HbOarab, HbE、δ -Lepore 和 HbF 进行同样的操作，其均作 用良好，并且没有背景影响。(NB HbF MCADD为婴儿，这也是该样品中观察到许多HbF的原 因。) 45倍一
信噪比<
实施例6 生物素酶与生物胞素/生物素多重
用水和生物胞素(50μπιΟ1/1)两者以及5-氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)温育血斑。 酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。 首个问题测量生物素能够鉴别对照和生物素酶缺乏症么？ 第二个问题产物/底物比值可以用于区分么？ 成人对照活性如何与最近的新生儿样品比较？ 老样品和EDTA中收集的样品中的活性可以测量么？
椒口名称mbD椒铭称分_繊(雜)分_麗范围W画只比
0.203 0.221 0.265 0.223 0.003 0.003 结论
成人对照样品中的生物素信号为生物素酶缺乏症样品中信号(同于空白血斑)的 -见显示的粗体。
其他任何样品中的最低生物素信号仍为生物素酶缺乏症样品中信号的8倍。 注意，用底物温育的空白斑中基本上没有可测量的生物素信号，这表明非常高的
如所预期的，产物/底物比值提供了较大的区分——73倍。对照生物胞素未知生物素86500244.6/227. Oamu
对照生物胞素未知生物素105000244.6/227. Oamu
对照+SA生物胞素未知生物素103000244.6/227. Oamu
对照+SA生物胞素未知生物素102000244.6/227. Oamu
洗涤对照生物胞素未知生物素1950244.6/227. Oamu
洗涤对照生物胞素未知生物素1800244.6/227. Oamu
最近的新生儿样品来自PKU患者，并且活性没有明显较低(早产儿的活性可能较 低，但仍然可以进行很好的区分)。虽然几乎可以肯定在老样品中具有一定程度的样品降解，但老样品和EDTA样品 中的生物素酶活性仍然是可以测量的。洗涤表示洗涤的红细胞(生物素酶在血浆中)——为了等效，将生物素酶缺乏症 患者的血浆加回去，由此其不含生物素酶。实施例7 PKU多重用水、生物胞素(50μπιΟ1/1)和5_氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)以及生物素 PABA(50ymol/l)和5-氨基乙酰丙酸(50μπιο1/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。首个问题能够非常好地测量苯丙氨酸从而检测苯酮尿症么？
所述方法确实是定量的么？任一个酶底物混合物的加入影响苯丙氨酸信号么？注意，由生物胞素混合物中的标准物计算结果。PKU多重数据显于下表 结论可以非常容易地鉴定来自患者的样品。数值高，但区分(信号、比值或浓度)良好。 所述方法似乎高度定量——线性、精确度和QC结果良好。来自胰蛋白酶的背景意 味着标准曲线没有通过零。患者的苯丙氨酸浓度如之前所测。然而，标准和QC是在同时进行的。对照的高数值和较老样品的低水平(测量值 < 0)可能表明轻微的提取问题。实践中，优选所有的分析样品都在1周内采集。底物对信号没有影响。实施例8 =MCADD多重用水、生物胞素(50μπιΟ1/1)和5_氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)以及生物素 PABA(50ymol/l)和5-氨基乙酰丙酸(50μπιο1/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。首个问题可以非常好地测量辛酰基肉碱从而检测MCADD么？所述方法确实是定量的么？任一个酶底物混合物的加入影响苯丙氨酸信号么？注意，由生物胞素混合物中的标准物计算结果。MCADD多重数据显于下表
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割 ng EDTA样品看起来良好。所述方法似乎高度定量——线性、精确度和QC结果良好。患者的辛酰基肉碱浓度如之前所测。没有检测到提取影响。底物对信号没有影响。因此，发明人全面证明了以多重方式进行多种检测的能力。无论所述检测为代谢 物、酶活性或多肽的考量(通过蛋白酶消化)，所有条件或处理中没有一个对用于样品分析 的其他任何读数产生不利影响。因此，本发明提供了强大的多重诊断方法。实施例9 乳清酸乳清酸是嘧啶合成中的重要代谢物。因此，在遗传性嘧啶重新合成疾病，尤其是 UMP合酶缺乏症中，尿乳清酸浓度提高。乳清酸是由氨甲酰磷酸和天冬氨酸合成的，并由此 在尿素循环的遗传性疾病即鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、精氨基琥珀酸合酶缺乏症和 精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症中，尿乳清酸提高(参见图9)。基于临床基础和UMP合酶缺乏症中乳清酸的大量分泌，遗传性乳清酸尿症和尿素 循环病症的区分诊断相对容易。尿素循环缺陷的区分诊断通常基于血浆或尿氨基酸在 精氨基琥珀酸合酶缺乏症中瓜氨酸提高，在精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症中精氨基琥珀酸提 高。在鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症中，血浆瓜氨酸通常降低，而最初的诊断基于在用于 诊断的尿素循环中的氨基酸没有提高的情况下，尿乳清酸分泌提高。由于乳清酸由肾脏主 动分泌，并且与尿中观察到的浓度相比血浆浓度相对较低，所以很少测量全血/血浆乳清 酸。然而，在没有治疗的情况下，乳清酸的血/血浆浓度在上述所有疾病中都将提高。关于 尿素循环疾病中的血浆乳清酸，仅有一篇重要文献(Sass et al (1999)PedNeph 13,912) 0 该作者利用气相色谱-质谱测量了来自精氨基琥珀酸合酶缺乏症患者的样品中的血浆乳 清酸，并得出血浆分析并不比尿素分析有优势的结论。本发明公开了利用电喷雾MSMS定量血斑乳清酸用于筛查新生儿和急性患者的 OTC。以下信息是来自 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)数据库的关于该 病症的摘录鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症是尿素循环代谢的先天性X-连锁缺陷，可引起高氨血 症。利用饮食补充的精氨酸和低蛋白饮食可以治疗该疾病。尿素循环病症的特征在于高氨血症、脑病和呼吸性碱中毒的三联征。已经阐述了 五种涉及尿素循环中酶的生物合成的不同缺陷的疾病0TC缺乏症、氨甲酰磷酸合酶缺乏 症(237300)、精氨基琥珀酸合酶缺乏症或瓜氨酸血症(215700)、精氨基琥珀酸裂解酶缺乏 症(207900)和精氨酸酶缺乏症(207800)。临床特征Russell et al. (1962)描述了患有慢性氨中毒和精神衰退的2个堂兄妹。通过肝 活组织检查，显示肝脏OTC的活性非常低。推断在尿素合成中在鸟氨酸向瓜氨酸转化的水 平上存在缺陷。Levin et al. (1969)报道了一例受影响的女婴，其母亲排斥蛋白质并且血浆氨水 平提高，而其父亲IH常。在另一例男婴中，Levin et al. (1969)发现了他们认为的由OTC缺乏症引起的普通高氨血症的变体，推测原因是不同的酶变化。酶活性为正常的25%，而非在 其他病例中的为正常的5% _7%，并且所述酶的其他特征也不同于正常。临床图片比通常 的病例轻微。Holmes et al. (1987)也描沭了 OTC缺乏症的轻微变体。Campbell et al. (1971,1973)报道了由完全的鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏导致的致 死性新生儿高氨血症。他们认为所述酶的编码基因的突变可在杂合的女性中导致部分缺 乏，在半合子的男性中导致完全缺乏。Thaler et al. (1974)描沭了在患有具有内脏脂肪变件的脑病(提示为Reye综 合征)的儿童中的OTC缺乏的“新型蛋白耐受变体”。KrieRer et al. (1979)报道了一例患 有OTC缺乏症的男婴，其相对没有症状达4个月，但由于大脑萎缩逐步发展为严重的痉挛， 并在13个月龄时死亡。肝脏OTC活性是正常的1.5%。该作者提出，在肝脏中微管脂肪积 聚的急性恶化过程中的OTC缺乏的临床图片可提示为Reye综合征。Bruton et al. (1970)描沭了星形细胞转化为Alzheimer II型神经胶质，这是任 何形式的高氨血症的特征。Kornfeld et al. (1985)报道了在2例OTC缺乏症中的神经病 理学的发现。一个3天龄的男孩显示主要位于脑干的神经胶质增生，一个2岁的女孩显示 广泛分布的神经胶质增生和大脑皮质的瘢痕性脑回，以及在小脑内颗粒层中的萎缩。Drogari和Leonard(1988)描述了 6例临床症状发作相对晚的受影响男孩。其中 之一为在孩童时期被认为是一个“非常难相处的孩子，内向且脾气暴躁”。在12岁时，他精 神错乱发作并因此住院，但没有发现原因。在14岁时，他前夜吃了高蛋白食物后深度昏迷 住进医院。尿乳清酸分泌增加，并且发现其母亲是携带者。此后，用低蛋白饮食、精氨酸补 充剂和苯甲酸钠对其进行治疗。然而，他进一步出现特别是由能量限制导致的高氨血症发 作。18岁时，他在考试中表现良好并被医学院录取。Finkelstein et al. (1989,1990)描 述了 21例男性患者，他们在28天龄以后出现作者所定义的晚发性OTC缺乏症。患者在出 生时表现正常，但易激惹、呕吐且嗜睡，其通常是短暂的且以后逐步显现。表现的年龄从2 个月至44岁。Matsuda et al. (1971)和 Oizumi et al. (1984)报道了在男性中的推测为等位 基因型的部分缺乏。Oizumi et al. (1984)报道了 一例患有间歇性昏迷和由感染引起的 高氨血症的6岁男孩。肝脏活组织检查表明OTC活性为正常的16%。其母亲在蛋白负荷 (protein load)后尿中分泌的乳清酸提高。补充饮食精氨酸消除了该男孩的高氨血症发 作。Matsuda et al. (1991)描述了患有OTC缺乏症的32例日本患者的临床和实验室特征。 他们根据临床表现和发作年龄将患者分为3组第1组(0-28天)、第2组(29-5岁)、第3 组(大于5岁)。最低的死亡率和精神发育迟缓发生率出现在第2组患者中。第1组和第 3组患者的死亡比率和酶活性相似。这些患者的瓜氨酸水平最高，且在其首次发作高氨血症 前没有症状。作者强调晚发性OTC缺乏症的发病率比之前公认的高。Anadiotis et al. (2001)报道了一例患有OTC缺乏症的15岁男性患者，其在进食 低蛋白饮食、瓜氨酸和苯基丁酸钠时发展为胰腺炎。Lee et al. (2002)注意到数个在与精氨基琥珀酸合酶缺乏症相关的瓜氨酸血症 中(Goldblum et al. , 1986)和氨甲酰磷酸酯合成酶缺乏症中(Kline et al. ,1981)的尿素 循环先天性缺陷有关的肠病性肢端皮炎样皮肤病(acrodermatitis enteropathica-like dermatosis)的报道。Lee et al. (2002)推测，由于精氨酸占表皮角蛋白氨基酸组成的如
53此大比例，与尿循环缺陷相关的精氨酸缺乏症可能在受影响婴儿中引起损害的表皮屏障功 能和皮肤损伤。Lien et al. (2007)报道了一例52岁男性，其在常规的喉息肉摘除手术后突然死 于高氨血症。手术后8天，他发展为精神错乱、运动失调和偏执狂，并进一步发展为癫痫发 作、脑水肿、昏迷，并在3天内死亡。之前的医史是平常的。对该患者20岁的无症状女儿进 行产前评估，发现她的孪生儿子均为OTC基因突变的携带者。母亲为该突变的杂合体，但对 她父亲的尸检样品的DNA分析并不成功。两个小男孩通过低蛋白饮食身体健康。Lien et al. (2007)强调该老人的OTC缺乏症的晚发性和不正常表现。杂合女性Rowe et al. (1986)综沭了 13例有症状的女性杂合子。她们的表现时间早至1周 龄，晚至第6年。诊断前的症状是非特异的短暂的极端易激惹(100%)、短暂呕吐和嗜睡 (100% )、蛋白回避(92% )、运动失调(77% )、II期昏迷(46% )、生长延迟(38% )、发育 延迟(38%)、癫痫发作(23%)。经常在断母乳时发作。包括先证者在内，13个家族中的女 性42%具有症状。Gilchrist和Coleman (1987)报道了 2例杂合子女性，其晚发性严重症状。其中1 例在36岁开始脑病和局灶性的神经功能缺陷，另一个在38岁开始。第二个在蛋白饮食后 尿乳清酸提高，并且终生回避肉类，其经常导致头痛。Arn et al. (1989)讨论了 OTC基因座突变的杂合件的表型影响。另外，Arnet at. (1990)报道了突变OTC等位基因携带者的正常女性尤其在产后期患高氨血症性昏迷的 风险增加。他们建议每个具有进行性嗜睡(progressive lethargy)和木僵(stupor)(急 性皮质功能障碍的迹象)或昏迷发作的女性，尤其是在妊娠期间，都要通过家谱分析(探寻 之前的发作史)和血浆铵的测量以及(如果能够立即获得的)血浆谷氨酰胺水平的测量来 检查OTC缺乏症。高氨血症的早期鉴定提供了通过苯甲酸钠、苯乙酸钠和盐酸精氨酸的静 脉治疗纠正血浆氨水平的机会。Lee et al. (2002)报道了患有类似肠病性肢端皮炎的皮肤损伤的女婴，随后发现 其患有OTC缺乏症。排除了感染因素和锌缺乏症，并且补充精氨酸和瓜氨酸后皮疹开始消 退。遗传Scott et al. (1972)介绍了支持OTC缺乏症的X-连锁隐性遗传的2个家族。Short et al. (1973)研究了 4个家庭，所有都符合X-连锁遗传。在杂合性OTC缺乏症的女性肝脏 内，Ricciuti et al. (1976)证明有2类细胞，一类细胞酶活性不足，另一类细胞酶活性正 常。细胞嵌合性的发现证明，OTC的基因为X-连锁的。因此，X-连锁显性遗传的证据基于 (1)该病在男性中的严重性，在多数病例中都几乎完全缺乏酶；(2)临床严重性和酶水平在 杂合女性中的很大变化；(3)杂合女性的肝脏中Lyon现象的证实；和(4)小鼠中X-连锁的 证实(参见 DeMars et al.，1976)。谱图分析Burdakin禾口 Norum (1981)观察到对于X染色体上OTC缺乏和G6PD (305900)的连 锁，至少有三分之一的可能重组体。随后在X染色体的相对末端发现了该基因座。诊断
Rowe et al. (1986)认为根据家族Φ、饮食Φ、短晳的非特异症状、停丨h蛋白的反 应以及其他特点可以早诊断。在所检查的5个患者中，诊断时IQ低于70。OTC在肝脏和小肠的粘膜中表达。Hamano et al. (1988)描沭了通过对十二指肠 粘膜的活组织检查样品进行免疫细胞化学检测的方式鉴定OTC缺乏携带者。OTC-阴性细 胞分布于一些绒毛的一侧，而OTC-阳性细胞位于另一侧。肠上皮细胞起源于隐窝细胞的分 裂，然后沿绒毛的侧面上升。认为单个隐窝的上皮由单个亲本类型的细胞构成。大约15%的杂合女性具有威胁生命的高氨血症性昏迷。有症状携带者和无症状携 带者的乳清酸分泌均提高，尤其在蛋白负荷检测的情况下。Pelet et al. (1990)发现，在肯 定携带者中，该测试很少为阴性，可能通常不超过8%的携带者。Hauser et al. (1990)描沭了可以替代氮负荷的用于鉴定杂合女件的测试。在氮 负荷测试中，氨甲酰磷酸在线粒体内积聚。过量的氨甲酰磷酸扩散至胞液中，在此其作为底 物增强嘧啶的生物合成，从而导致乳清酸的积聚和分泌。在Hauser et al. (1990)提出的 测试中，用单次口服剂量的别嘌呤醇取代氮负荷。该方法的有效性取决于氧化嘌呤醇核糖 核苷酸(oxypurinol ribonucleotide)(别嘌呤醇的代谢物)对乳清酸核苷单磷酸脱羧酶 的抑制作用，该抑制作用引起乳清酸核苷单磷酸和其前体乳清酸的积聚，并最终引起乳清 酸尿症禾口 orotidinuria。Grompe et al. (1991)提出了 OTC缺乏症的诊断算法。虽然由于对所述基因的克 隆，通过连锁分析已经极大地提高了 OTC缺乏症的产前以及携带者检测的准确度，但对于 许多病例都代表新突变的该疾病，基于RFLP的诊断具有局限性。Yudkoff et al. (1996)开发了监测OTC缺乏症的女性杂合体的代谢能力的新技 术。他们推断该检测有效地检测体内氮代谢，并可以不必进行用于测量OTC缺乏症中的酶 活性的肝脏活组织检查。无症状的OTC缺乏携带者以正常速度形成尿，这表明即使酶活性 低于正常也能够进行尿素生成。虽然表面上看无症状OTC缺乏携带者以正常速度形成尿， 但如其5-(15)N-谷氨酰胺生成提高所反映的，其氮代谢仍然异常。这种新的测试可能对于 监测OTC缺乏症的新型疗法，例如肝脏移植和基因治疗的效果至关重要。所述方法利用质 谱测量在口服(15)NH(4)C1后(15)NH(4)C1向(15)N-尿素和5-(15)N-谷氨酰胺的转化。BowlinR et al. (1999)报道了具有2个连续患有由OTC基因突变引起的OTC缺乏 症的男性家庭。该母亲的生化研究结果正常。利用外周血白细胞和皮肤成纤维细胞对其母 亲进行基因型分析，显示没有突变，这强烈地提示性腺嵌合性。作者指出，当咨询夫妻(其 中母亲之前已有受OTC缺乏症影响的孩子但看来并不是携带者)时，需要考虑性腺嵌合性。总之，根据OMIM描述需要注意的要点是虽然OTC为X-连锁病，但其可以以非常易变的严重性影响女性携带者。男性和女性可以在新生儿期即表现几乎普遍致死的非常严重的疾病。根据残留的酶活性和低蛋白饮食的自我选择，男性和女性也可以在从儿童至成年 的生命的任何阶段呈现从反社会行为至死亡的不同程度的严重性。由于没有适当的检测，因此还没有考虑新生儿筛查。本发明可以有利地用于鉴定晚发的患者群，具有相对简单的饮食管理和“可选择 方式”的药物学的所述患者群将正常的生长和发育，并且在任何失代偿期的过程中都将具 有要遵循的指定紧急方案。这类似于中链酰基CoA缺乏症(MCADD)的筛查，中链酰基CoA缺乏症是遗传性脂肪氧化障碍，最近在英国被批准用于新生儿筛查。OTC和MCADD代表“Reye 综合征”的主要原因。本发明的发明人没有发现在现有技术中在新生儿期利用全血/血浆或干血斑筛 查OTC的任何技术尝试一这是本发明的另一个新应用。当然，本领域技术人员应知道，这 种具体检测并不是特异的，将检测UMP合酶缺乏症和其他尿素信号疾病(见以上)的病例， 但可以根据临床背景或领域内熟知的其他生物标记物进行容易地区分。因此，合适地，本发 明的方法可以包括再一个步骤，该步骤包括根据临床或生物标记物背景进行区分，以证明 所检测的疾病。在该实施例中，给出的OTC数据证明了利用需时约5分钟的色谱操作对干血斑中 的乳清酸进行准确定量的能力。如果想要减少该过程的时间，通过减少柱尺寸和/或提高 流速从而在2分钟的周期内实现适当的色谱，来对该体系进行优化是可能的。因此，考虑所 给出的数据，很清楚，干血斑乳清酸可用于新生儿血斑筛查OTC缺乏症。基于以下问题发明人提供了试验支持发明人能够检测到干血斑上的乳清酸的正常值么？发明人能够在预期生理范围内检测到干血乳清酸的变化么？试验一位成人志愿者提供了 5ml锂肝素化血样品，存储在-80°C。随后将该样品融化、 混合，并如下加入乳清酸标准物90 μ 1全血+10 μ 1去离子水(终浓度，基础)100μ 1 全血+1 μ 1 100μπιο1/1 乳清酸(终浓度，基础+1 μ mo 1 /1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 500 μ mol/1 乳清酸(终浓度，基础+5 μ mo 1 /1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 2. 5mmol/l 乳清酸(终浓度，基础+邪μmol/1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 10mmol/l 乳清酸(终浓度，基础+100 μ mol/1)利用移液管将50 μ 1各样品移至标准Schleicher & Schuell滤纸上，并在室温下 干燥，并进行所述测定。包含对照DBS样品(老ND)和来自甲基丙二酸血症患者的DBS样
P
ΡΠ O制备3. 2mm的血斑(大约相当于2. 5μ 1样品)。制备甲醇提取溶剂(包含用于 氨基酸、酰基肉碱、肌酸酐、甲基丙二酸、乳清酸、ADMA和SDMA定量的所有范围的稳定同位 素)。向各DBS中加入150 μ 1提取溶剂，并在离心前在37°C混合30分钟。将上清液转移 到聚丙烯96孔深孔板中，并盖上顶盖。然后根据色谱和以多反应监测(MRM)模式进行的稳 定同位素稀释负离子电喷雾质谱-质谱(MSMS)(在SCIEX API5000 (Applied Biosystems, Warrington, UK)上进行)，计算乳清酸、甲基丙二酸(见以下色谱图)、甲基柠檬酸(未显 示数据)和3-羟基戊二酸(未显示数据)。利用HTS PAL 自动取样器(CTC Analytics AG, Switzerland)将 5μ 1 上清液自
56动注射到250 μ 1/分钟的乙腈水(37. 5 62. 5ν/ν)流动相流中。在具有2cmx4. Omm保 护柱的 Chirobiotic T 100x2. Imm 柱(Advanced Separation Technologies, Congleton, UK)上进行色谱，并且以负离子MRM模式获得用于乳清酸(m/zl54. 9/111. 1,156. 9/113. 1) 和甲基丙二酸、甲基柠檬酸和3-羟基戊二酸的前体/产物离子对。利用Analyst version 1.4. 3计算结果。结果见DBS ND对照、DBS对照+25 μ mol/1乳清酸和DBS MMA的色谱图(图10、11和 12)在每种情况下，上部都为乳清酸(蓝色)，稳定同位素乳清酸内标(红色)，下部都 为甲基丙二酸(蓝色)和稳定的同位素甲基丙二酸标准(红色)。ND对照和DBS MMA的色谱图检查证明，对于乳清酸存在干扰背景信号(约 1-3 μ mol/1)，其限制了 DBS乳清酸的任何测定的灵敏度。然而，当加入的乳清酸为 25μπι01/1的水平时，信噪比为约8 1。25 μ mol/1的数值是显著的，因为发明人已经测量 了来自患OTC缺乏症的新生儿(之前诊断的病例的亲属)的样品中的血浆/全血乳清酸， 浓度为约25 μ mol/1。因此，证明了 OTC缺乏症的新生儿筛查。对于甲基丙二酸。DBS ND和DBS对照+25 μ mol/1乳清酸的色谱图显示了 MMA的 明显信号，事实上，这是乳清酸并且它是该体系中略晚于MMA的色谱分析。然而，在阳性病 例中，MMA的提高是可用于诊断的。这证明利用快速色谱和负离子模式的MSMS同时测量可 用于诊断的乳清酸和MMA的血斑浓度的能力。进一步加入可用于诊断的有机酸(例如3-羟 基戊二酸)并提高该检测系统的诊断功效的潜能是明显的。注意，在该实施例中色谱耗时5分钟。然而，利用50mm柱和400 μ 1/分钟流速，耗 时可降低至<2分钟。可以容易准确且精确地计算向全血中加入的诊断范围(1-100 μ mol/1)内的乳清 酸标准物。这通过图13 (DBS乳清酸标准曲线(1-ΙΟΟμπιοΙ/Ι))中的标准曲线证明。R2值 是在分析范围内分析精确度的粗略计算，为0. 9997。这是利用干血斑的优异的相关性。乳清酸的主要数据峰名称乳清酸15W3C作为内标Q1/Q3 质量156. 93/113峰名称乳清酸内标乳清酸15W3CQ1/Q3 质量154. 93/111拟合线性截距0. 0333斜率0. 0152相关系数 0. 9997使用面积样品名称 样品ID (μmol/1)
57
05amu
05amu
权重
样品类型分析物峰名称分析物浓度计算的浓度
ND旧未知乳清酸N/A2. 4
乳清藤？ IuM标准乳清酸10. 9
乳清藤？ 5uM标准乳清酸55. 3
乳清藤？ 25uM标准乳清酸2525. 9
乳清藤？IOOuM标准乳清酸10098. 9
MMA未知乳清酸N/A< 0实施例9的总结由于干扰，利用目前的色谱体系检测干血斑上乳清酸的正常值是有问题的。本发明能够在预期的诊断范围内检测并准确测量干血斑乳清酸的变化。也可以同时测量其他诊断性有机酸，例如甲基丙二酸，即该标记物能够根据本发 明进行多重化。认为尿乳清酸测量值的提高对OTC缺乏症的诊断至关重要。发明人证明了通过负 离子MSMS以适合新生儿筛查和多重化应用的模式在所要求的浓度范围内测量DBS乳清酸 的能力。实施例10 3-0-甲基-二羟基苯丙氨酸芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)是参与由苯丙氨酸和酪氨酸合成神经递质(尤其是 多巴胺和5羟色胺)的代谢通路中的酶。遗传性AADC缺乏症引起CSF多巴胺和5羟色胺 减少以及底物代谢物L-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)和5-羟色氨酸(5-HT)增加。30MD0PA 通过L-DOPA的3-0-甲基化产生，并且也增加。AADC的诊断主要集中于CSF神经递质的降低，但在一些情况下，已经证明高香草 酸的降低和尿L-D0PA、5-HT和30MD0PA的提高是有用的。关于神经递质或L_D0PA、5_HT和 30MD0PA的血浆浓度的公开非常少。在临床上，AADC是重要的疾病(见下)，但相对简单的 治疗即可有效。磷酸吡哆醛是AADC活性的重要辅助因子。因此，磷酸吡哆醛供给和合成中的问题 可产生与AADC缺乏症类似的症状。最近已经识别出两种新的遗传性疾病。第一种为磷酸 吡哆醛合成的问题，具体为编码5'-磷酸吡哆醇(胺)氧化酶(PNPO)的基因突变。这种 疾病伴随严重的痉挛和早死亡，可通过施予磷酸吡哆醛进行非常简单且有效地治疗。因此， 它是新生儿筛查的主要候选疾病。第二种遗传性疾病为α -氨基己二酸半醛脱氢酶(AASD) 缺乏症。在这种疾病中，由于缺乏所述酶，α -氨基己二酸半醛积聚并形成哌啶-6-羧酸酯， 其不可逆地与磷酸吡哆醛反应形成Knoevenagel缩合物。这导致磷酸吡哆醛缺乏和随后的 严重痉挛。这种疾病伴随严重的痉挛，可通过施予吡哆醇进行非常简单且有效的治疗。因 此，它是新生儿筛查的主要候选疾病。营养性吡哆醇缺乏症被认为有类似的临床状况。预期上述所有3种疾病都引起30MD0PA在血浆/全血中积聚。在本发明中首次公 开了利用30MD0PA进行新生儿筛查的可能性。发明人公开了利用电喷雾MSMS的干血斑3-0-甲基-二羟基苯丙氨酸定量在遗传 性AADC、PNP0和AASD缺乏症以及全身性吡哆醇缺乏症的新生儿和急性患者筛查中的应用。以下信息是来自 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)数据库的关于该 病症的摘录AADC缺乏症是神经递质代谢的先天错误，它导致5羟色胺和儿茶酚胺两者都缺乏
58(Abeling et al. ,2000)。临床特征Hyland和 Clayton (1990)以及 Hyland et al. (1992)报道了 由第一代堂兄妹父母 所生的男性单卵双胞胎，其在2个月龄时出现严重的张力减退和由哭泣、随后胳膊和腿的 伸展、眼动危象和紫绀组成的突发行为。他们的四肢也出现偶然的舞蹈手足徐动症。随后观 察到体温调节的缺陷和姿势性低血压。实验室分析表明，CSF中高香草酸(HVA)和5-羟吲 哚乙酸(5-HIAA)浓度大幅降低，同时全血5羟色胺和血浆儿茶酚胺也降低。L-D0PA、5-羟 色氨酸(5HTP)和3-甲氧酪氨酸的尿分泌明显升高，所有这些在生化途径中的AADC步骤之 前。这些发现证明，5羟色胺和多巴胺的合成在中枢和外周神经系统中均受影响，这与AADC 的缺乏相符。血浆和肝脏组织中AADC酶活性大幅降低(对照的1%)。利用单胺氧化酶 抑制剂、多巴胺激动剂和吡哆醇进行治疗可以使张力(tone)和运动显著改善。其父母无症 状，但具有与其AADC缺乏症杂合相符的生化谱。Mailer et al. (1997)报道了父母为沂亲的伊朗患者,其在婴儿期出现张力减退、 发作性过度哭泣并眼睛上翻、伸展四肢并且体温不稳定。5岁时，其发育严重延迟，深度张力 减退，并且四肢肌张力增强，腱反射和脚底伸张反应活跃。自发运动为舞蹈病手足徐动症样 的，并且出汗增加。CSF、血和尿分析以及低AADC酶活性与AADC缺乏症相符。Korenke et al. (1997)报道了父母没有亲缘关系的德国AADC患者。临床表型和实验室发现与之前报道 的病例类似。Korenke et al. (1997)和 Mailer et al. (1997)提到了 AADC 缺乏症和二氢 化喋呤还原酶缺乏症(261630)之间的临床相似性。Abeling et al. (1998)报道了一例患有AADC缺乏症的荷兰女孩，虽然她仍然呈 现精神运动阻滞以及特有的张力亢进发作和眼动危象，但临床表型较轻。CSF显示5-HIAA 和HVA降低，尿中显示5-HIAA、香草基苦杏仁酸(VMA)和去甲肾上腺素降低，L-DOPA提高， 但同时多巴胺和HVA也升高，而多巴胺和HVA由于酶缺陷而应该降低。不能检测血浆AADC 活性。Abeling et al. (1998)认为AADC缺乏症被限制在脑室。在检查几个AADC患者(包 括Abeling et al. (1998)报道的患者)时，Abeling et al. (2000)发现所有患者都具有 高多巴胺尿症(hyperdopaminuria)，在施予L-DOPA后升高。HVA也升高。作者注意到，多 巴胺是在肾中由肾形式的AADC产生的，肾形式的AADC存在于近端肾小管中，并参与钠的肾 处理。在AADC缺乏症患者中，这些肾细胞获取的累积底物L-DOPA的量提高，其迅速被转化 为多巴胺和HVA。Swoboda et al. (2003)评论了包括4例之前报道的患者在内的11例AADC缺乏症 患者。新生儿症状包括进食状况差、嗜睡、上睑下垂、低体温和低血压。所有患者都具有间 歇性眼动异常、躯体张力减退、肢体张力亢进和主动行为削弱。多数患者还情绪不稳定且易 激惹。其他特征包括肌阵挛、张力障碍、突发性出汗和胃肠问题，例如反流病、便秘和腹泻。 功能性临床结果差。生化特征Verbeek et al. (2007)描述了利用AADC酶的两个底物5_羟色氨酸(5-HTP)和 3，4-二羟苯丙氨酸(L-多巴)用于血浆AADC酶活性的测定。他们发现以L-多巴为底物时 对照血浆中AADC酶的平均活性比用5-HTP时的倍数高8-12。AADC的两种底物竞争该酶的 同一个活性位点，从而导致AADC缺乏症患者中残留酶活性的降低相同。在AADC缺乏症患者中，对应于这两种底物的酶活性的降低相同，其为HVA、5-HIAA和MHPG的CSF浓度，而杂 合子具有中等的AADC活性水平。这些酶和测定可以在血上进行。临床管理Pons et al. (2004)注意到AADC缺乏症的临床管理通常涉及维生素B6、多巴胺激 动剂和MAO抑制剂以增强单胺传送。在评价一组AADC患者中的治疗反应时，作者检测了 2 个主要组一组为对治疗作出反应并在发育上具有进步的5位男性，第二组为对治疗作出 的反应差且通常发展为药物导致的运动障碍的5位女性和1位男性。该发现提示了单胺能 体系的性别差异，女性更依赖于多巴胺体系。总之，根据OMIM的描述，需要注意的要点是30MD0PA(注意，3-甲氧酪氨酸只是30MD0PA的另一个名称)的唯一提及与尿有关。诊断依然在其早期，且主要依赖于减少的CSF神经递质的测量。尽管3种疾病都符合新生儿筛查的国际标准，但现有技术甚至都没有考虑任意三 种疾病的新生儿筛查的可能性。发明人的目的在于利用本发明的多重筛查，尤其是用于新生儿的筛查，鉴别无论 出于什么原因而AADC活性降低的病例。因此，所述测试并不特异于一种疾病，但根据临床 背景(对磷酸吡哆醇或吡哆醛的应答)或其他生物标记物，包括AADC活性，可以容易的区 分可能的疾病。因此，合适地，本发明的方法可以包括通过所阐述的或本领域已知的次级测 试来确认诊断的另一个步骤。在该实施例中，所给出的数据证明了可以利用需时约6分钟的色谱操作对干血斑 中的30MD0PA进行准确定量的能力。通过减少柱尺寸和/或提高流速，可以在2分钟的周 期内实现适当的色谱。因此，当考虑所给出的数据时，很清楚，干血斑30MD酸可以用于诸如 遗传性AADC、PNPO和AASD缺乏症和全身性吡哆醇缺乏症的新生儿筛查的应用。在以下试验部分，发明人解决了以下问题发明人能够检测到干血斑上30MD0PA的正常值么？发明人能够在预期生理范围内检测到干血30MD0PA的变化么？试验一位成人志愿者提供了 5ml锂肝素化血样品，存储在-80°C。随后将该样品融化、 混合，并如下加入30MD0PA标准物90 μ 1全血+10 μ 1去离子水(终浓度，基础)100 μ 1 +1 μ 1 100 μ mol/1 30MD0PA(终浓度，基础+1 μ mo 1 /1)100 μ 1 +1 μ 1 500 μ mol/1 30MD0PA(终浓度，基础+δ μ mol/1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 2. 5mmol/l 30MD0PA(终浓度，基础+邪μmol/1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 10mmol/l 30MD0PA(终浓度，基础+100μ mol/1)
60
利用移液管将50 μ 1各样品移至标准Schleicher & Schuell滤纸上，在室温下干 燥，并进行所述测定。包含对照DBS样品(老ND)、来自AADC缺乏症患者的DBS样品、来自 戊二酰CoA脱氢酶缺乏症患者的DBS样品和来自非常长的长链酰基CoA脱氢酶缺乏症患者 的DBS。注意，还测量ADMA和SDMA (参见实施例9)。制备3. 2mm的血斑(大约相当于2. 5μ 1样品)。制备甲醇提取溶剂(包含用于 氨基酸、酰基肉碱、肌酸酐、甲基丙二酸、乳清酸、ADMA和SDMA定量的所有范围的稳定同位 素)。向各个DBS中加入150 μ 1提取溶剂，并在离心前在37°C混合30分钟。将上清液转 移到聚丙烯96孔深孔板中，并盖上顶盖。然后根据色谱和以多反应监测(MRM)模式进行的 正离子电喷雾质谱-质谱(MSMS)(在 SCIEX API5000 (Applied Biosystems，Warrington， UK)上进行)，计算30MD0PA(注意，在这个具体试验时没有内标可以使用，但现在有)、戊二 酰肉碱(见图14-16的色谱图)、四癸烯酰基肉碱(见图14-16的色谱图)、ADMA和SDMA。利用HTS PAL 自动取样器(CTC Analytics AG，Switzerland)将 5 μ 1 上清液自 动注射到250 μ 1/分钟的含0. 025%甲酸的乙腈水(50 50ν/ν)流动相流中。在具有 2cmx4. Omm保护柱的 Chirobiotic T 100x2. Imm 柱(Advanced Separation Technologies, Congleton,UK)上进行色谱，并且以正离子MRM模式获得用于乳清酸(m/z 212. 2/166. 2用 于定量，212. 2/149. 2用于验证)和戊二酰肉碱、四癸烯酰基肉碱、ADMA和SDMA的前体/产 物离子对。利用Analyst version 1. 4. 3计算结果。结果见以下DBS AADC患者、DBS戊二酰CoA脱氢酶缺乏症患者和DBSVLCAD缺乏症患 者的质谱在每种情况下，上部都为30MD0PA (约2. 7min)定量离子(蓝色)和30MD0PA验证 离子(红色)，中部都为戊二酰肉碱(约3. Omin)(蓝色)和稳定的同位素戊二酰肉碱内标 (红色)，下部都为四癸烯酰基肉碱(蓝色)和稳定的同位素四癸烯酰基肉碱内标(红色)。DBS戊二酰CoA脱氢酶缺乏症患者和DBS VLCAD缺乏症患者的色谱图检查证明，通 常没有30MD0PA的可检测信号。然而，在AADC缺乏症患者中，在浓度为约lOymol/l时，有 用于30MD0PA定量和验证离子的显著的等效信号(参见下表中的计算值)。因此，根据本发 明，AADC缺乏症筛查，例如新生儿筛查是可能的。本发明还可以用于筛查由AADC活性降低 导致的任何疾病。对于戊二酰肉碱，与其他两个色谱图相比，DBS戊二酰肉碱脱氢酶缺乏症患者的色 谱图证明了用于戊二酰CoA脱氢酶缺乏症的诊断信号。与其他两个色谱图相比，DBS VLCAD 缺乏症患者的色谱图证明了用于VLCAD缺乏症的诊断信号。这证明了利用快速色谱和阳离 子模式的MSMS同时(即以多重方式)测量30MD0PA、戊二酰肉碱和四癸烯酰基肉碱的诊断 性血斑浓度的能力。显然，存在进一步加入可用于诊断性化合物(例如ADMA)并提高该测 试体系诊断功效的可能性。注意，在该样品中色谱耗时6分钟。然而，利用50mm柱和400 μ 1/分钟流速，耗时 可降低至约2分钟。即使没有稳定的同位素内标，也容易准确且精确地计算向全血中加入的诊断范 围(l-lOOymol/l)内的30MD0PA标准物。这通过图17和18中的标准曲线可以证明。R2 值是在分析范围内分析精确度的粗略计算，利用定量离子其为0. 9991，利用验证离子其为0.9987。这是利用干血斑的优异的相关性。
峰名称30MD0PA Q
无内标
Q1/Q3 质量212. 20/166. 20amu
拟合 线性 权重
截距 -2.04E+04
斜率 2.08E+04
相关系数 0. 9991
使用面积
峰名称30MD0PA C
No内标
Q1/Q3 质量212. 20/149. 20amu
拟合 线性 权重
截距 -1.42E+03
斜率 1.68E+04
相关系数 0. 9987
使用面积
样品名称样品ID 样品类型分析物峰名称分析物浓度计算的浓度(μπο / )
ND旧 未知30MD0PAQN/A无峰
30MD IuM 标准30MD0PAQ1无峰
30MD 5uM 标准30MD0PAQ55. 4
30MD 25uM 标准30MD0PAQ2523. 1
30MD IOOuM 标准30MD0PAQ100102. 0
ADMA IuM 未知30MD0PAQN/A无峰
GA 1 未知30MD0PAQN/A无峰
AADC 未知30MD0PAQN/A10. 5
VLCADD 未知30MD0PAQN/A无峰
MCAD 未知30MD0PAQN/A无峰
ND旧 未知30MD0PACN/A无峰
30MD IuM 标准30MD0PAC11. 1
30MD 5uM 标准30MD0PAC54. 9
30MD 25uM 标准30MD0PAC2522. 6
30MD IOOuM 标准30MD0PAC100102. 0
ADMA IuM 未知30MD0PACN/A无峰
GA 1 未知30MD0PACN/A无峰
AADC 未知30MD0PACN/A10. 0
VLCADD 未知30MD0PACN/A无峰
实施例10的总结
由于浓度太低，利用目前的系统检测干血斑上30MD0PA酸丨的正常值是有问题的。
62不同的仪器可以解决这个问题。发明人能够在预期的诊断范围内检测并准确测量干血斑30MD0PA的变化(由真实 的患者样品决定)。也能够同时(即以本发明的多重方式)测量其他诊断性化合物，例如戊二酰肉碱、 四癸烯酰基肉碱和ADMA。首次公开了测量提高的DBS 30MD0PA用于筛查新生儿AADC活性缺乏症。发明人 证明了在新诊断的AADC缺乏症患者中，DSS 30MD0PA提高。发明人证明，通过正离子MSMS 以适合多重筛查(例如新生儿筛查)的模式在所要求的浓度范围内测量DBS 30MD0PA的能 力。以上说明书中提及的所有出版物都通过引用并入本文。本发明所述方面和实施方 式的各种修饰和变体对于本领域技术人员来说都是明显的，而不脱离本发明的范围。虽然 已经结合具体的优选实施方案对本发明进行了描述，但应该理解，将所主张的发明限定到 这些具体的实施方式上是不恰当的。确实，所描述的实施本发明的方式的各种对于本领域 技术人员来说明显的修饰也在权利要求数的范围内。
权利要求
一种帮助诊断受试者疾病的方法，所述方法包括提供来自所述受试者的样品，其中所述样品包括血液；测定所述样品的至少两个特征，所述特征选自(i)所述样品包含的多肽的结构组成；(ii)所述样品包含的代谢物；和(iii)所述样品包含的催化活性；其中，所述至少两个特征均由同一样品的多重分析测定。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括干血斑。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述样品仅由其天然存在的组分缓冲。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，测定所述样品包含的多肽的结构组成包括(a)向所述样品中加入肽酶；(b)分析经肽酶处理后的所述样品中的多肽；(c)根据(b)信息推断所述多肽的结构组成。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述肽酶是胰蛋白酶。
6.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述样品包含的所述多肽是一种或多种 血红蛋白或肌红蛋白。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，测定所述样品包含的代谢物包括测定苯 丙氨酸、辛酰基肉碱或者酰基肉碱的存在与否。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，测定所述样品包含的催化活性包括(a)向所述样品中加入对所述催化活性的作用敏感的底物；和(b)分析所述样品中所述底物的存在与否和/或作用于所述底物的所述催化活性作用 的产物的存在与否。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，加入并分析对所述催化活性作用敏感的 多于一种的底物。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述一种或多种底物是水溶性的。
11.如权利要求10所述的方法，其中，各所述底物均仅以在水中的形式加入。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述特征由MS分析确定。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述MS是电喷雾质谱-质谱(MSMS)。
14.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述至少两个特征包括 (i)所述样品包含的多肽的结构组成，和选自(ii)或(iii)的至少另一个特征。
15.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述三个特征(i)、(ii)和(iii)均被测定。
16.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述样品是体外样品。
17.—种组合物，其包含基本不含生物素的生物胞素。
18.—种组合物，其包含生物胞素，所述生物胞素包含同位素标记的赖氨酸残基。
19.如权利要求18所述的组合物，其中，所述同位素标记是碳13、氘、氮15或氧18。
20.一种组合物，其包含基本不含生物素的生物素-PABA0
21.一种组合物，其包含基本不含PABA的生物素-PABA。
22.—种组合物，其包含以下物质中的两种或更多种 (i)5-氨基乙酰丙酸；( )生物胞素；(iii)生物素对氨基苯甲酸。
23.如权利要求22所述的组合物，其还包含H20。
全文摘要
本发明涉及一种帮助诊断受试者疾病的方法，所述方法包括提供来自所述受试者的样品，其中所述样品包括血液；测定所述样品的至少两个特征，所述特征选自所述样品包含的多肽的结构组成；所述样品包含的代谢物；和所述样品包含的催化活性，其中所述至少两个特征均是由同一个样品的多重分析确定。本发明还涉及某些组合物。
文档编号G01N33/68GK101932722SQ200880126114
公开日2010年12月29日 申请日期2008年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者查尔斯·特纳, 雷蒙德·尼尔·多尔顿 申请人:伦敦王室学院;盖伊St托马斯基金信托
技术领域：
本发明涉及疾病的多重筛查。具体而言，本发明涉及利用质谱的遗传性疾病的多 重筛查。
背景技术：
质谱(MS)是一种强大的定性和定量分析技术，在过去的5年中已被引入到了许多 临床和研究实验室中。MS分析者的费用已经降到了大多数实验室可承受的范围。在临床实 验室中，质谱仪器被用于测定大量临床相关分析物。当用于生物样品时，MS的功效依赖于 其对化合物鉴定和定量的选择性。串联MS(MSMS)是一种提供优异分析能力的MS技术。许多国家目前都进行强制筛查，例如筛查新生儿遗传性代谢疾病、先天性甲状腺 功能减退、血红蛋白病、囊性纤维化和当地要求的多种其他疾病。将MSMS引入到代谢物筛查中引起了分析方法和潜在的能够被筛查到的疾病数量 的变革。典型地，该体系包含丁基化。然而，利用代谢物的直接分析的筛查是可能的。本发明的发明人之前已经证明了以适合新生儿和产前筛查的分析方式通过MSMS 检测和证实临床显著的血红蛋白病的可行性。代谢物筛查可以检测用于诊断特定遗传性疾病的所有代谢物。在美国和欧洲的一 些中心区，包括的疾病达30种。然而，问题是，对于许多疾病，容易检测的代谢物提供差的 灵敏度和特异性，例如高胱氨酸尿病的蛋氨酸。在英国，筛查被限定于测定苯丙氨酸以诊断苯丙酮尿症(PKU)和辛酰基肉碱以诊 断中链酰基CoA脱氢酶缺乏症(MCADD)。这是一种成本合算的方法。然而，期望拓宽筛查面， 由于技术局限性而可能被排除在外的应该筛查的疾病，同时包括标记物灵敏度和特异性低 的疾病。该现有技术的方法产生许多逻辑和临床问题。生物素酶缺乏症是一种目前利用代谢物没有筛查出的疾病实例。根据所筛查人群 的种族变异，在110，000例新生儿中大约发生1例生物素酶缺乏症。未诊断出的生物素酶缺 乏症可引起死亡、抗痉挛药抗性痉挛、双侧耳聋、视觉衰退，步态问题和多种其他非特异性 临床疾病。如果在新生儿期即被诊断并着手利用药理学剂量的生物素对其进行终生治疗， 可以完全抑制所述临床表型，并且生长和发育正常。如果在以后的生命里被诊断出来，某些 临床表现(例如痉挛)可以控制，但其他(例如耳聋)仍然存在。因此，尽管在人群中的发 生率相对较低，其仍是成本合算的候选筛查疾病。在英国以外的很多中心区利用单独的测 试——利用基于测定生物素对氨基苯甲酸(生物素PABA)所释放出的对氨基苯甲酸的比色 测定法直接测量酶的活性，对其进行筛查。所述测定要求专用的单独样品(血斑)，并且耗 力、费时且相对较不灵敏。还没有用于诊断生物素酶缺乏症的有用血液代谢物的描述。因 此，现有技术关于生物素酶筛查具有许多缺点和问题。1型酪氨酸血症是一种提议标记物灵敏度和特异性低的疾病实例。根据所筛查人 群的种族变异，在300，000例新生儿中大约发生1例1型酪氨酸血症(延胡索二酰乙酰乙 酸酶缺乏症)。未诊断出的1型酪氨酸血症可引起暴发性肝功能衰竭、凝血病以及死亡或佝偻病、吓啉症样危象、神经系统并发症和肝脏肿瘤。肝脏移植通常是唯一的治疗方式。如果 在新生儿期即被诊断并着手对其进行终生NTBC治疗，可以完全抑制所述临床表型，并且生 长和发育正常。因此，尽管罕见，仍然被认为是成本合算的候选筛查疾病。在一些情况下， 血液酪氨酸提高，但这并不能用于诊断，并且血液酪氨酸的非特异性提高在新生儿期普遍 存在，这使得利用血液酪氨酸水平作为疾病的唯一指标的尝试成为问题。考虑将琥珀酰基 丙酮当作用于诊断的代谢物，但问题是它的测定不易被整合到现有技术的代谢物筛查体系 中。由于琥珀酰基丙酮抑制胆色素原合酶(PBG合酶通过脱水连接两个5-氨基乙酰丙酸分 子)，所以最先被识别，而该抑制可导致卟啉症样危象。在许多中心区，胆色素原合酶活性被 用来筛查1型酪氨酸血症或作为酪氨酸提高的初期迹象的支持测试。所述检测基于将5-氨 基乙酰丙酸作为底物并测定所产生的胆色素原。该测定需要单独的血斑(blood spot)，费 力、耗时且灵敏度相对较低。对酶促过程缺乏了解也使得与酪氨酸血症相关的现有技术产 生一些问题。酶活性通常是在标准化和优化条件下测定的。这种标准化/优化要求特定的缓冲 液和PH环境。因此，个体的测定和条件几乎总是不同，并且通常明显不同。所以，每个测定 几乎都是独特的。第一个目标酶的检测条件几乎不适合第二个或另一个目标酶，并且确实 甚至能够抑制其活性或使其失活。当需要进行多重酶促分析时，这些都是严重的问题。另外，已知缓冲溶液能显著抑制重要化合物的电喷雾电离，这是现有技术中存在 的问题。现有技术通常利用色谱法除去化合物信号中的缓冲液，从而尝试解决这个问题，但 这是一个费时费力的步骤，需要特殊的设备和知识去实施。本发明旨在解决现有技术中存在的问题。发明概述目前筛查遗传性疾病的方法不适合多重化。现有技术中，利用用于进行具体测试 所优化的个体条件组来筛查个体疾病。并且，这些测试中的许多测试都需要单独的血斑。这 不仅费力、成本高，而且就所需要的血液的量方面也有严重限制。这在通常仅采集少量血的 新生儿筛查领域里是个尤其尖锐的问题。本发明的发明人开发出了能够同时筛查多种疾病的方法。换句话说，本发明的发 明人开发出了一种能够使筛查过程多重化的技术，从而仅利用诸如血斑的单个样品就能检 测多种疾病。为了取得这种突破，关于要测试的各诊断性化学物质的优化和稀释/检测方面， 本发明的发明人与本领域的思维相反。具体地，本发明的发明人开发了这样的方法，其摒弃 了常规的缓冲体系，并形成检测中的各化学物质的有意的次佳催化条件和/或次佳浓度。 然而，部分是作为这种方法的结果，以及部分是由于联合强大的质谱检测技术，令人惊奇地 证明，高特异性和宽筛查谱能够有利地被结合。除了这些优势之外，本发明的另一个优势就 是还大幅降低了所需样品的量。例如，通常，能够有利地对一组测试(其大于目前标准的一 排6个新生儿血斑上进行的测试)进行多重化，从而由比用于常规现有测试所采集的量的 六分之一小的血斑样品获得常规测试结果的超集。本发明基于这些惊人的发现之上。因此，一方面，本发明提供了帮助诊断受试者疾病(disorder)的方法，所述方法 包括
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提供所述受试者的样品；测定所述样品的至少两个特征，所述特征选自(i)所述样品包含的多肽的结构组成，(ii)所述样品包含的代谢物，和(iii)所述样品包含的催化活性，其中，所述至少两个特征均是由多重分析测定。“多重”/ “多重化”具有本领域中的通常含义，即以独立但相关联的方式同时进行 几个功能。换句话说，本发明中的多重化是指在单次读数(readout)中分析多个独立的疾 病指标。合适地，在本文中，“相关联的”方式是指在共同(common)考量或分析步骤中收集 多个数据，例如多个不同的可能疾病的数据，当然这些疾病通常是相互独立的。最合适地，所述共同步骤(common step)是指从共同或单个样品中提取数据。合 适地，所述共同步骤是指从数据采集仪的单个时期(session)例如MS分析仪的单个时期中 提取多种可能疾病的数据。最合适地，所述共同步骤是指仅在单个样品上进行多重分析，即 不将整体较大样品分成几部分或不对整体较大样品的不同部分进行亚制备，而在单个实体 样品上实施本发明，例如每个分析都是在同一血斑或再水化血液样品上进行的。因此，合适地，所述多重分析包括同一样品的多重分析。以下对其进行更详细地说 明。合适地，所述样品包括血液或血浆。更合适地，所述样品包括血液；更合适地，所述 样品基本由血液组成；更合适地，所述样品是血液。最合适地，所述样品包括干血斑，例如直 径约为3. 2mm的干血斑。合适地，所述干血斑是涂布在常规滤纸上并风干所得到的血液斑 点，这是新生儿血斑样品采集中的常规操作并是众所熟知的。合适地，所述样品仅由其天然存在的组分缓冲(buffer)。合适地，特别省去向所述 样品中加入缓冲液。本发明的一个优点是避免了外源性缓冲步骤。有利地，根据本发明，用 溶剂再水化是足够的，而不需要引入外源性缓冲体系。合适地，测定所述样品包含的多肽的结构组成的步骤包括(a)向所述样品中加入肽酶；(b)分析经肽酶处理后所述样品中的多肽；(c)根据(b)信息推断关于所述多肽的结构组成。合适地，所述肽酶是胰蛋白酶。合适地，目标所述多肽是血红蛋白、白蛋白、转铁蛋白、α-l-抗胰蛋白酶、血浆铜 蓝蛋白、甲胎蛋白或肌红蛋白中的一种或多种。合适地，测定所述样品包含的代谢物的步骤包括测定以下物质存在与否或测定以 下物质的浓度苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、缬氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸、精氨基琥珀酸、肌酸、 肌酸酐、胍基乙酸、3-甲氧基酪氨酸、游离肉碱、以及一系列酰基肉碱物质(包括辛酰基肉 碱)、一系列甘氨酸缀合物(包括己酰基甘氨酸)、酸物质(包括乳清酸)、类固醇(包括 17-羟孕酮、7-脱氢胆固醇或胆固醇)。合适地，测定所述样品包含的催化活性作用的步骤包括(a)向所述样品中加入对所述催化活性作用敏感的底物；(b)分析所述样品中所述底物存在与否和/或分析作用于所述底物的所述催化活性作用的产物存在与否。合适地，可以加入多于一种对所述催化活性作用敏感的底物并对其进行分析。这 具有提高分析的特异性的优点。合适地，所述一种或多种底物均是水溶性的。这具有使所述测定简化并避免使用 有机溶剂的优点。合适地，各所述底物均仅在水中的形式加入。这具有省去缓冲试剂和/或有机溶 剂的优点。合适地，所述特征通过MS分析确定。更合适地，所述MS是电喷雾质谱-质谱 (MSMS) ο合适地，所述至少两个特征包括(i)所述样品包含的多肽的结构组成；和选自(ii)和(iii)的至少一个另外的特征。合适地，三个特征(i)、( )和(iii)均被测定。合适地，所述样品是体外样品。合适地，所述方法是体外方法。另一方面，本发明涉及组合物，其包含基本不含生物素的生物胞素。另一方面，本发明涉及组合物，其包含生物胞素，所述生物胞素包含同位素标记的 赖氨酸残基。另一方面，本发明涉及组合物，其包含基本不含生物素的生物素PABA(biotinyl PABA)。另一方面，本发明涉及组合物，其包含基本不含PABA的生物素PABA。另一方面，本发明涉及组合物，其包含基本不含生物素和PABA的生物素PABA。另一方面，本发明涉及上述组合物，其中，所述同位素标记是碳13、氘、氮15或氧 18，合适地是碳13。另一方面，本发明涉及组合物，其包含以下物质中的两种或更多种(i) 5-氨基乙酰丙酸；(ii)生物胞素；(iii)生物素对氨基苯甲酸。合适地，所述组合物还包含H2O (水)。合适地，所述组合物没有缓冲。合适地，所述组合物基本不含生物素。发明详述现有技术中，酶活性通常在标准化和优化条件下测量的。这些需要特定的缓冲液 和PH条件。即便尝试使这些分析多重化，使用不同的缓冲或pH体系也不可能完成这些尝 试，因为在实践中，每一个测定都几乎是独特的。另外，认识到缓冲液能显著抑制重要化合 物的电喷雾电离。因此，通常使用色谱法除去化合物信号中的缓冲液。本发明的发明人的 深刻理解使得可以根据本发明克服现有技术中存在的这些问题。本发明的发明人认识到， 在进行遗传性代谢疾病筛查中，测定实际的酶活性并不总是必需的，而测定酶活性存在与 否实际上提供了足够的信息。这与基于优化酶活性从而使底物转化速率最大化的现有技术 的观念相反。在某些情况下，可能必须半定量地区分高活性和低活性。根据本发明，这依然
7被容易地完成，例如，使用稳定的同位素标记标准物或底物产物比值或本文解释的其他校 准。本发明主要教导的是，对于筛查应用(例如新生儿筛查)，酶条件不需最佳。如本文所 证明的那样，即便在次佳的条件下，本发明的发明人也能够得到可靠的诊断用信息和读数。本发明的益处在于，可以有利地利用单个3. 2mm血斑测定生物素酶和胆色素原合 酶的活性，从而通过周期为1-2分钟内的MSMS将用于PKU和MCADD的临床血红蛋白诊断 (基于胰蛋白酶肽)和代谢物诊断同时加入。因此，在优选的实施方案中，本发明涉及这样 的诊断组合。分析模式本发明涉及通过合适的技术，例如质谱，最合适的为电喷雾质谱-质谱(MSMS)例 如在单个血斑上进行的临床诊断性代谢物和/或酶活性和/或蛋白质的多重分析。应用该系统用于评估受试者可能的疾病或病症，特别是遗传性疾病。本发明特别应用 于新生儿遗传性疾病的筛查。本发明的优势在于在临床症状可能没有表现出来时进行筛 查，获得可靠的读数。测定本发明的特点是在单个起始样品上进行多种类型的测定。通常这些测定作为单个 分析的一部分来进行。这可意味着所述测定平行、依次或同时进行。本发明优选方面的特 点是所述测定在单个操作中进行。这可意味着样品制备的最初步骤是依次进行的，例如，使 血斑再水化后加入底物，然后加入肽酶。然而，同时进行多重测定的基本原则是可以进行单 个分析从而从同一单个样品的考量中收集信息。在一个步骤中使样品再水化，然后在单独 的顺次步骤中将所进行的特定测定的各种基本元素加入样品中，仅这一事实不足以将所述 测定认定为单独或不同的。根据本发明，关键是对同一样品进行多种测定，从而有利地减少 样品数量(和/或所需样品物质的体积)，并简化在单个操作中有利地收集的数据的多个不 同测定的操作。因此，合适地，当在“单个样品”或在“同一样品”上实施本发明时，这表示最终用于 分析至少两个特征的样品对于导致所述两个或更多个特征分析的初始制备步骤(例如加 入底物、加入肽酶)不分开或分离，而是所述制备步骤(如果有)物理上在同一单样品(例 如同一单个物质或等份试样)上进行，然后利用同一单个样品产生所需要的读数。当然，这 并不排除将所述物质最初分成两部分以提供参比样品或校准样品，但是本发明的关键之处 在于，如上文说明的，在同一样品上进行分析步骤或过程。合适地，如果测定都在单个样品上进行，那么认为其是同时进行的。因此，为了测 定不同类型的化合物，可能需要进行第二次或再一次MS进样(injection)，例如，有机酸 (例如乳清酸)、糖和/或糖磷酸类(包括半乳糖-1-磷酸)和/或类固醇(例如17-羟孕 酮)的负电离。然而，应该注意的是，即使在多重进样MS实施方案(例如二次进样实施方 案)中，分析仍在同一单个终样品上进行。合适地，利用一次或两次进样，更合适地，利用单 次进样。更合适地，如果从单个分析收集读数，则认为所述测定是同时进行的。在优选的实 施方案中，读数由单个分析收集，合适地，所述分析是单个质谱数据收集时期。根据本发明，存在大量有利地合并在单个操作中的不同类别的分析。这些包括代 谢物筛查、酶活性筛查和特定多肽或其变体存在与否的筛查(例如胰蛋白酶MSMS)。
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代谢物代谢物筛查是指测定样品中特定化合物存在与否。将其称为代谢物筛查的原因 是，作为样品特点，该代谢物通常存在或不存在于所述样品中。换句话说，将所测定化合物 的产生(或不产生)作为所检测个体受试者一般代谢的特征。因此，分析特定代谢物的存 在与否通常不包括向样品中加入特定底物化合物或任何同源的酶活性。当然，根据所进行 的代谢物测定的具体方式，代谢物的存在可以是某种疾病的指示，或代谢物的不存在可以 是某种疾病的指示。特定化合物存在与否的代谢物筛查具有在检测或没有检测到所述化合 物时通常都提供非常清晰读数的优点。然而，在其他实施方案中，可能期望筛查特定代谢物 的水平。显然，为了准确评估所测定的代谢物的水平或浓度，这种实施方案可以要求仪器更 细致的校准，或可以要求在样品中使用内标，(或甚至是加入已知浓度该物质的外标样品或 示踪样品)。显然，除了所述代谢物的存在与否之外，这种实施方案还具有提供额外信息的 优点，即提供样品中所述代谢物的水平或浓度的信息。本发明可以测定的代谢物包括(以观察结果_指示病症的方式表示)高浓度苯丙氨酸_苯丙酮尿症高浓度酪氨酸_1、2、3型酪氨酸血症高浓度亮氨酸和缬氨酸_枫糖尿症高浓度瓜氨酸_精氨基琥珀酸合酶缺乏症高浓度鸟氨酸-回旋萎缩，高鸟氨酸血症高浓度精氨基琥珀酸_精氨基琥珀酸酶缺乏症低浓度肌酸和肌酸肝-AGAT、GAMT或肌酸转运蛋白缺乏症高浓度胍基乙酸-GAMT缺乏症低浓度胍基乙酸-AGAT缺乏症高浓度3-甲氧基酪氨酸_芳香族氨基酸脱羧酶缺乏症和磷酸吡哆醛合成缺乏症高浓度游离肉碱_棕榈酰肉碱转移酶1缺乏症低浓度游离肉碱_棕榈酰肉碱转移酶2缺乏症高浓度辛酰基肉碱-中链酰基CoA脱氢酶缺乏症(MCADD)高浓度的多种酰基肉碱物质_多种脂肪氧化作用和有机酸病高浓度己酰基甘氨酸-中链酰基CoA脱氢酶缺乏症(MCADD)高浓度乳清酸_鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症高浓度17-羟孕酮_先天性肾上腺增生高浓度皮质醇_先天性肾上腺增生低浓度皮质醇_先天性肾上腺增生高浓度7-脱氢胆固醇-Smith-Lemli-Opitz综合征高浓度胆固醇_家族性高胆固醇血症本领域技术人员熟知的其他相关物也可以等同地应用于本发明。在本文中，术语“高”和“低”应在其使用语境中进行解释。例如，“高浓度苯丙氨 酸”表示与正常受试者相比，即与没有患苯丙酮尿症的受试者相比，苯丙氨酸浓度高。相似 地，物质的“低”浓度同样表示就所研究或筛查的疾病来说，与正常个体相比，此物质浓度 低。同样的原则适用于以相对术语表示的酶活性或本文描述的其他实体，即，将数量理解为相对于未受影响的参考样品。至少出于这些原因，相对术语“高”和“低，，对于本领域读者 理解本发明及其操作是清楚且恰当的。最合适地，代谢物如实施例部分所列出的那些。应该注意到，本文公开了乳清酸作为用于检测鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症的 目标代谢物。用于此目的，之前没有使用或提示使用全血乳清酸。在某些现有背景中，将尿 乳清酸作为一种诊断用代谢物来研究。然而，本发明教导了血中乳清酸水平作为OTC缺乏 症的诊断用指示物的新用途。催化活性酶活性筛查是指筛查样品的特定催化活性的情况。合适地，其通过向样品中加入 催化活性能作用的底物来进行。为了评估可能存在或可能不存在的活性，读数通常是预期 产物的存在与否，该预期产物是在所测定的催化活性(例如酶活性)存在下由底物转变成 的。所述催化活性通常是酶活性。此活性可包括(酶-底物；所指示的疾病的方式)生物素酶-底物为生物素PABA或生物胞素或其稳定的同位素变体；缺乏(低活 性)表示生物素酶缺乏症；胆色素原合酶缺乏_底物为δ -氨基乙酰丙酸；缺乏(低活性)表示存在琥珀酰 基丙酮，(延胡索二酰乙酰乙酸酶缺乏)或胆色素原合酶缺乏症；半乳糖苷酶A-底物为4-甲基伞形酮-a-D-吡喃半乳糖苷；缺乏(低活性)表示 Fabry氏疾病；戊二酰CoA脱氢酶-底物为戊二酰CoA ；缺乏(低活性)表示1型戊二酸尿症；硫代嘌呤甲基转移酶_底物为6-巯基嘌呤或其稳定的同位素变体；缺乏(低活 性)表示硫唑嘌呤敏感；肌酸激酶_底物为磷酸肌酸；存在(高活性)表示肌营养不良/肌肉萎缩症。最合适地，所述活性选自实施例部分所述的那些活性。多肽分析适合在本发明的样品上进行的再一种类型的分析是多肽分析。其可简单地用于特 定多肽的存在与否的鉴定。或者，其可用于表征或检测限定多肽的特定变体的存在与否。其 可通过本领域技术人员所熟知的任何合适的模式来实施。合适地，多肽分析是指多肽结构组成的分析。这通常不是多肽的构象或三维结构， 不过如果需要的话，本领域技术人员可选择该特征进行分析。合适地，所述结构组成是指多 肽的分子结构。合适地，所述分子结构是指多肽的氨基酸组成。显然，测定多肽的整个氨基 酸组成可能是不现实的。合适地，考量所述氨基酸组成的关键特征部分。最合适地，这通过 多肽的肽酶消化(片段化)和所产生肽(片段)的质量分析来进行。这提供诸如特定片段 的质量的信息，该信息本身能够揭示所述多肽组成的信息，或者更通常地，片段的质量揭示 母多肽中肽酶识别序列的数量和间距的信息，由此提供所述多肽的分子结构或氨基酸组成 (即氨基酸序列)的直接(识别位点)和间接(间距)信息。所述肽酶(肽链内切酶)优选为能够断裂肽键的任何催化实体，例如酶或其片段。 目前定义了六组蛋白酶丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、金属蛋白和谷氨酸。优选地， 所述肽链内切酶是单个肽链内切酶。所述肽酶可以是现有技术中已知的任何合适的肽酶，例如胰蛋白酶、V8肽链内
10切酶、胰凝乳蛋白酶、Asp-N和Lys-C。合适地，所述肽链内切酶具有XXK或XXR的识别序 列。合适地，所述分析通过胰蛋白酶消化并分析所产生的裂解产物来进行。在分离中使用 的该技术是本领域熟知的。例如，在评估临床显著的血红蛋白病时，Daniel et al已经对 这种技术进行了详尽的描述(2005Br. J. Haematol, vol. 130 pp 635-43)。除了分析作为用 于诊断血红蛋白病的目标多肽的血红蛋白外，还可以通过这种方法对肌红蛋白(用于诊断 Ducherme/Becker肌肉萎缩)、白蛋白(用于诊断甲状腺激素结合缺乏症)、转铁蛋白(用 于诊断糖基化病症)、α-1-抗胰蛋白酶(用于诊断α-1-抗胰蛋白酶缺乏症)、甲胎蛋白 (用于诊断爆发性肝功能衰竭)、铜蓝蛋白(用于诊断Wilson氏病)，或任何其他目标多肽 进行分析。读数原则上，可以通过本领域已知的适合检测所检验样品中单个化学实体的存在的任 何方式，例如通过测定其质量来收集读数。合适地，所述分析可通过具有两个不同质量选择 器且在二者之间具有碰撞步骤的装置来进行。最合适地，利用质谱(MS)来收集读数。可以 使用能够分析离子的任何MS分析器。例如，可使用MALDI/T0F/线性捕捉或任何其他类型 的MS分析器。最合适地，通过电喷雾质谱-质谱(MSMS)进行分析。生物素酶缺乏症生物素酶缺乏症的主要关注点和临床结果是双侧耳聋。英国卫生部 (UKDepartment of Health)在听力缺陷筛查方面投入了大量的资源。因此，尽管生物素酶 缺乏症是种罕见的遗传缺陷，但是此疾病的主要表型为需要终生花费高额费用的双侧耳聋 的事实意味着在新生儿期间筛查此种疾病的经济情况是非常强的。现有技术利用比色测定 法筛查生物素酶缺乏症。例如，新西兰、美国和其他国家都使用比色法筛查。由于现有技术 的比色检测法不灵敏，所产生的颜色弱，因此就该方面而言该现有技术是差的检测方法。这 导致缺乏可靠性，即便根据目前的指导进行检测也是如此。另外，在血斑上实施此项检测在 技术上也很困难。由于现有技术的方法的局限性，本领域主要集中于测定法的优化。通过 比较，发明人发现，事实上根据本发明不需要优化即可获得满意的测定结果。本发明的方法 包括监测生物胞素及其产物，而不是集中于任何酶的比色测定上。并且，本发明的简化测定 法的关键特点是不使用缓冲。首先，这具有避免对其他能在同一样品上多重化的可能酶测 定造成抑制的优点。其次，通过提供于在水中而非缓冲液中的底物有利地减少或避免离子 抑制的问题。缓冲可降低灵敏度，因此，通过避免使用，本发明有利地提高了灵敏度。再者， 如果如现有技术一样使用了缓冲液，那么为除去缓冲液可能需要费力耗时的色谱。本发明 的方法有利地除去了这一步骤。底物生物胞素是生物素酶的天然底物。生物胞素由连接赖氨酸的生物素组成。本发明 的发明人注意到商购的生物胞素往往含有显著量的生物素。因此，根据本发明，有利地，从 生物胞素底物中清除生物素。换句话说，将生物胞素底物进行纯化以除去污染性生物素。这 是个简单的纯化步骤，此步骤能够通过现有技术中任意合适的方法来完成。合适地，通过色 谱法除去生物素。用纯化的生物胞素的优势在于可以由此除去一种裂解产物(生物素)。由于生物 素是生物素酶的裂解产物，污染性生物素可产生假阳性结果。因此，如果在测定中检测到了污染性生物素，可能会给出检测到生物素酶活性的错误结论。根据本文教导的方法，即通过 除去所提供的商购的生物胞素中所有残留的污染性生物素，产生具有更大特异性的优点的 “干净”底物，消除分析中的假阳性。因此，本发明一方面涉及“干净的生物胞素”，即基本不 含生物素的生物胞素。合适地，本发明涉及根本不含生物素的生物胞素。最合适地，本发明 涉及完全不含生物素的生物胞素。生物素-PABA是生物素酶的良好底物。本发明的发明人注意到，商购的生物 素-PABA往往在溶解性方面面临挑战。采用增强溶解性(甚至3mM)的剧烈(aggressive) 处理，例如超声、加热、涡旋或类似的方法可促进自发水解，从而在溶液中产生游离的PABA 和游离的生物素。这些物质，特别是游离的生物素可能混淆所述测定。因此，根据本发明， 有利地，清除生物素-PABA底物中的生物素。换句话说，纯化生物素-PABA底物以除去污染 性生物素(和/或游离的PABA)。这是一个简单的纯化步骤，可以通过现有技术中已知的任 何合适的方法完成。合适地，通过色谱除去生物素(和/或PABA)。合适地，这种纯化在生 物素-PABA溶解之后进行。使用纯化的生物素-PABA的优势在于至少由此除去了一种裂解产物(例如生物 素)。污染性产物，例如生物素能够导致假阳性结果。因此，如果在测定中检测到了污染性生 物素，可能会给出检测到活性的错误结论。根据本文教导的方法，即通过除去所提供的商购 的生物素-PABA中所有残留的污染性生物素/PABA，产生具有更大特异性的优点的“干净” 底物，消除了分析中的假阳性。因此，本发明一方面涉及“干净的生物素-PABA”，即基本不含 生物素和/或PABA的生物素-PABA。合适地，本发明涉及根本不含生物素的生物素-PABA。 最合适地，本发明涉及完全不含生物素的生物素-PABA。合适地，所述“干净”(纯化)的生 物素-PABA以在溶液中的形式提供，这具有当试图重新溶解所述干净物质时除去可能进行 的进一步水解的优点。针对污染性生物素问题的可选办法是使用带标记的赖氨酸的生物胞素。所述标记 可以是，例如，稳定的同位素标记。因此，通过仅寻找所产生的样品中由生物素酶作用释放 的带标记的赖氨酸来进行分析。这样，通过基本忽略催化的生物素产物，生物胞素底物中存 在的任何污染性生物素被有效地忽略或排除在分析之外。生物胞素是水溶性的。仅生物素PABA是水溶性差的。关键在于，本发明的发明人通常并不关注定量而是关注某物是否存在，即定性，并 且这可减少所加入的底物水平，从而将成本降至最低，并净化了读数，使所使用的比值(例 如底物产物)准确性更高。如果需要，底物产物的比值当然也可用于定量，例如定量酶 活性。在本发明的用于测定生物素酶和/或PBG合酶的多重系统中，以不同浓度和组合 对生物胞素、生物素PABA和δ-氨基乙酰丙酸(在本文中，所使用的术语“ δ-氨基乙酰 丙酸”可以与术语“5-氨基乙酰丙酸”互换，合适地，提及“ δ-氨基乙酰丙酸”理解为是指 “5-氨基乙酰丙酸”)都进行了广泛试验。在20μ M至ImM范围内，这些底物中的每一种都 是有效的，甚至在更高浓度下也可以有效。小于20 μ M的浓度可能较少使用，并且可能会产 生酶动力学和分析灵敏度的问题。本文中，每种底物的最佳浓度为50 μ m。广泛测试了酶作用的温育时间。从仅仅几分钟到2. 5小时的温育都是有效的。合 适地，温育持续30-120分钟。最佳温育时间为约1小时。合适地，温育时间为，或者大约为
1260分钟。温育时间为从加入底物至样品终止(例如加入终止缓冲液或运行缓冲液/溶剂) 或样品读数的时间。更合适地，由于蛋白酶通常会使酶降解，温育时间为从加入底物到加入 蛋白酶的时间。在某些实施方案中，可能同时加入底物和蛋白酶，不过预期会发生较少的底 物降解，这需要进行进一步的补偿性调整，例如较高的底物浓度。当然，本领域技术人员可以根据其需要，对底物浓度和/或温育时间进行优化。例 如，较高的底物浓度可允许较短的温育时间，反之亦然。本文给出了温育温度的指导，特别是在实施例部分。可以将室温(例如18-25°C ) 用作起始温度，如果需要，本领域技术人员可以进行优化。标准化本发明的优点在于不要求对催化分析条件进行标准化。而且，不必提供过量底物。 通过除去对过量底物的需要，本发明的优势在于可自由选择底物浓度，从而在检测的整个 时间范围内产生好的结果。另外，通过省去提供过量底物的需要，可进行半定量分析。例 如，通过提供已知浓度的底物，并通过在温育步骤后分析底物和产物的量，可以得到底物 产物比值，从而很好地估测出特定样品中活性的量。这在此实施方案中有利地消除了对用 于定量的稳定同位素标记的底物或产物的需要。1型酪氨酸血症在现有技术中，通过血液中提高的酪氨酸水平来检测1型酪氨酸血症。然而，这是 二级甚至三级结果。1型酪氨酸血症中的酶缺陷事实上并不与酪氨酸直接相关联。确实， 许多新生儿的血流中都具有提高的酪氨酸水平，特别是在早产儿当中。这就使现有技术的 分析复杂化。例如，如果操作者针对酪氨酸水平设置了高截断值，则可能会漏掉许多阳性结 果。相反，如果操作者针对酪氨酸水平设置了过低的截断值，则可能会出现过多的阴性结 果，从而在后续的检测或再检测中浪费资源。可选的办法是测量琥珀酰基丙酮的水平。然 而，这需要酸和其它化学处理，并且是一个对技术有过分要求的测定。1型酪氨酸缺乏症中 的真正酶缺陷是延胡索二酰乙酰乙酸酶的缺乏，从而导致琥珀酰基丙酮的积聚。琥珀酰基 丙酮抑制胆色素原合酶(PBS)的活性。PBS测定一直被用作琥珀酰基丙酮浓度的代表。检 测基础的胆色素原合酶的现有技术可能困难重重。首先，如果底物以测定所需的浓度使用， 则其可能会抑制酶。或者，如果建立测定方法以尝试测量胆色素原本身，由于胆色素原通常 很快被代谢掉，因此这可能有问题。这两种因素导致了进一步的困难，即现有技术的长测定 似乎一致地产生降低的结果。本发明的发明人提出了将5-氨基乙酰丙酸作为底物并测量 产生的胆色素原的方法。另外，在平行处理中，所述测定可以在琥珀酰基丙酮存在下进行重 复。琥珀酰基丙酮抑制胆色素原合酶。因此，通过比较有和没有琥珀酰基丙酮的结果，可能 清楚地说明通过直接测定胆色素原合酶活性来检测1型酪氨酸血症的能力。因此，现有技术中，PBS是在用5-氨基乙酰丙酸做底物并用比色法测量产生的胆 色素原的“优化的”测定法中测量的。现有技术显示酶的活性降低与加入的琥珀酰基丙酮 的量成正比。更重要的是，琥珀酰基丙酮为在未治疗的1型酪氨酸血症病人中观察到的浓 度时，PBS的活性(几乎)被完全破坏。然而，比色测定法不灵敏，并且在现有技术中使用 长的温育时间(16-24小时)作为提高产生的胆色素原的量的合理方法。本发明的发明人 已经认识到，当在其高浓度底物5-氨基乙酰丙酸存在下进行温育时，PBS活性可能会显著 降低。这降低了所合成的胆色素原的预期量。另外，胆色素原的产生速度可能开始被通过胆色素原脱氨酶除去胆色素原的速度所超越。因此，温育时间短代表本发明的显著优势，此 外，用MSMS检测胆色素原比用比色测定法显著更灵敏。作为一种简单的操作，MS分析通常包括空白，该空白可方便地用做参考或对照样 品。而且，当在本文中参考指“基本上无信号”时，应当记住，简单参考空白或对照样品将澄 清信号是否确实存在。本发明的优势在于特异性和灵敏度两者均高于现有技术中的比色测定法。确实， 结果通常是如此清楚以致接近二进制读数。显然，在高通量诊断情况下，这是本发明的显著 优点。合适地，本文描述的不同分析是在同一样品上进行的。“同一样品”强调的是，其是 指在同一单个物理样品上进行不同的处理和分析。其不是指，例如将样品分成多个不同处 理，和随后将各个所述不同处理组合。“同一样品”意味着使用一个物理样品，例如血斑或血 液样品，并且各不同分析均在该同一单个样品上进行。这并没有被现有技术所教导。确实， 现有技术教导了与之相反，因为现有技术强调优化条件对所进行的各个分析的重要性。目 前全球实行的筛查对进行的各个测定使用不同的血斑。现有技术一致教导每一种酶应该用 一个斑点来分析。因此，本发明的显著不同之处在于本发明的方法涉及在同一单个血斑上 分析几种酶。这一点很重要，原因在于直到本发明才意识到，事实上可以从本文教导的次佳 (或确实完全没有优化)或非缓冲体系中得到不同酶的有用信息。这是本发明整体多重化 的一个重要实施方案。关于所用的稀释，产生了类似观点。用于分析血红蛋白病的通常样品稀释比用于 代谢物分析的样品稀释高6-8倍。而且，在现有技术中，代谢物通常用甲醇或甲醇水混合 物固定从血斑中提取(使变性蛋白质和盐不能被提取)，由此减少了电喷雾源中的离子抑 制。根据本发明，所使用的唯一溶剂是水。然而，本发明的优点在于，即使在稀释6-8倍的 血红蛋白病分析用样品中，本发明也的确能够可靠且可重复地检测出诊断性代谢物。考虑 到稀释的样品中这些代谢物的显著较低的浓度，这本身就是令人惊奇的。此外，令人惊奇的 另一方面在于，根据本发明能够令人惊奇地省略被认为是代谢物分析标准方法的一部分的 甲醇或甲醇水提取体系。合适地，在本发明方法的制备步骤中不使用有机溶剂。显然，如 果为了读数需要使用MSMS运行缓冲液或类似添加剂，那么应该像常规操作一样在读数前 加入。但是，合适地，样品制备中省去有机溶剂步骤。合适地，从所述方法中省去常规的代 谢物提取步骤。样品样品可以是来自待测试的受试者的任意合适的物质。合适地，所述样品包括血液。 在某些实施方案中，所述血可以是脐血(脐带血)，其可能有利于早期诊断。更合适地，所述 样品是毛细血管血。合适地，所述样品是来自足跟采血所获得的毛细血管血。更合适地，所 述样品包含从出生后第0天至第10天的新生儿足跟采血获得的毛细血管血。合适地，所述 血在产后第1-8天采集，合适地，在产后第3-8天采集，更合适地，在产后第5-8天采集。收集足跟采血样品的血斑卡上的标准斑点通常相对较大(例如直径大于6mm)。目 前，从单个针刺采样期收集大约四个大血斑。然而，本发明的优点是需要显著较少的样品物 质。具体而言，本发明中所用到的血斑样品直径可有利地为6mm或小于6mm，并且合适地， 可以为仅3. 2mm的血斑，最合适地，仅使用一个3. 2mm血斑(或相等的样品尺寸)。作为比较，从单个标准的现有技术血斑(大血斑)所需的相同物质可以获得大约六个3. 2mm斑点。应该注意，各个国家的健康服务机构都保留这些血斑样品。例如，在丹麦，血斑被 冷冻储存。在英国，血斑通常以其干燥状态保存。每年采集和储存的血斑数量是很可观的。 例如，英国每年大约采集600，000个样品，美国每年大约3，000, 000个样品，整个欧洲(除 英国外)每年大约4，000，000个样品。因此，本发明的再一个优点在于，需要采集的血斑较 少，从而需要储存的血斑也较少。或者，可以采集与现有采样技术数量相同的血斑，本发明 的优势在于留下更多的残留血液用于后期的新检测或后续检测。另一问题就是，出生不久后的婴儿可能是痛苦的或有喂养问题。这些因素可能导 致代谢物“缺失”或确实在意想不到的时间点上出现。然而，酶活性一直存在，而不管来自 于痛苦的受试者的样品中出现的或消失的代谢物的明显的反复无常。因此，本发明的优点 在于，在测定样品的催化活性或酶活性时，所检测的受试者的产后压力从分析中大幅消除。 确实，通过直接检测酶活性而不是代谢物，灵敏度可以得到提高。此外，通过在酶活性分析 中使用标记底物，可以消除样品中的任何背景影响或预先存在的产物，提高分析的特异性。根据现有技术的观点，本文教导的多重化能够完全起作用是令人惊奇的。原因在 于，样品中多肽的蛋白水解消化，例如胰蛋白酶消化，将释放包括苯丙氨酸在内的氨基酸。 如果将苯丙氨酸作为诊断性代谢物(例如，当将其存在评为指示苯丙酮尿症时)，则预期这 种处理会使所述结果混乱。然而，正如本文所证明的，多重化分析确实起作用。确实，利用血 斑使这种影响标准化并将其(即可能观察多于实际释放的苯丙氨酸)考虑在内是可能的， 因此如果将蛋白酶处理与其他分析多重化在一起，实际上令人惊奇地，这是没有影响。换句 话说，通过使用苯丙氨酸浓度已知的血斑校准物，由于胰蛋白酶活性从样品释放的苯丙氨 酸量被从血斑标准物的等量释放补偿。对于其他氨基酸也是如此。无论如何，对于酰肉碱 分析来说，这并不是个问题。在一些实施方案中，样品龄(sample age)可能比较重要。其是指自样品采集之后 所经历的时间，而不是指采集样品的受试者的年龄。因此，样品可以为一天或数天至数周、 数月或者甚至数年，例如两年。通常，血斑越老，所提取的蛋白就越少。因此，当在分析中使 用胰蛋白酶处理时，较老样品中释放的“背景”游离氨基酸(其产生不同的“基线”读数，根 据基线读数评价用于诊断的物质，例如用于PKU的Phe的存在)的量往往较少，其中所述老 样品为数周或数月之久的样品。出于此原因，在比较样品时，优选使用大约相同样品龄的对 照或参考样品。这表示优选彼此均为2-3个月以内，合适地，彼此均为2个月以内，合适地， 彼此均为1个月以内，合适地，彼此均为2周以内，最合适地，彼此均为1周以内的样品。对于较老样品，使用甲醇作为运行溶剂可能有利于优化所洗脱的绝对量较低的物 质的电离。蛋白酶处理合适地，蛋白酶消化步骤作为分析样品前最后一个步骤(即读数前的最后一个步 骤)来进行。通常，样品先被再水化，然后加入一些底物(合适地，仅以在水中的形式加 入_避免加入任何缓冲体系)，然后温育样品以允许催化所述底物，随后仅加入蛋白酶，之 后进行适当的温育使蛋白酶发挥作用。显然，优选在酶有机会作用于外源性加入的底物 (如果有)之后向样品中加入蛋白酶。如果蛋白酶与底物同时加入，则酶自身可能被蛋白酶 作用降解，从而可能使从所述酶活性产生假阴性结果。因此，合适地，蛋白酶的加入和蛋白
15酶的温育步骤在最后，或刚好在样品分析(读数)之前进行。合适地，所述样品没有被丁基化。合适地，没有进行样品的衍生。合适地，没有对样品中的蛋白进行特异变性。合适地，添加仅以在水中的形式进行。合适地，水是样品制备中唯一使用的溶剂。 合适地，在样品制备中没有使用有机溶剂。显然，并不将在接近读数时加入的“运行缓冲液”或“运行溶剂”(其可能包括如 乙睛的有机溶剂)作为样品制备的一部分，样品制备不涉及有机溶剂是本发明的优点，但 这并不应该解释为将作为读数的一部分的最终运行缓冲液的添加排除在外。合适地，最后 加入运行溶剂(合适地，在提取/底物加入、酶活性温育、蛋白酶加入和蛋白酶温育之后加 入)。这有利于促进肽、酶底物/产物和常规代谢物的有效电离。另外这可能有利于溶解某 些代谢物，例如长链酰基肉碱。因此，合适地，最后加入运行溶剂(其可以包括有机溶剂) 的是接近读数时的目前操作的一部分。运行缓冲液可以包含现有技术中已知的任何合适的组分。合适地，如本文所述，尤 其如实施例部分所述，运行缓冲液包含乙睛。合适地，使用任何适合MSMS的运行缓冲液。在 一些实施方案中，通过加入运行缓冲液终止酶反应(无论是诊断物本身还是用来产生诊断 性多肽的蛋白酶例如胰蛋白酶)。在一些实施方案中，这种终止的运行缓冲液可以包含甲 醇，或可以由甲醇组成。这具有改善电离的优势。当然，从实际意义上讲，使用甲醇作为终 止的运行缓冲液/溶剂并不排除常规运行溶剂(例如以乙睛为基础的溶剂)的使用。从某 个角度来看，仍然可以使用这种常规溶剂，因为通常上样至MSMS仪器中用于读数的样品实 际为小体积，所述体积可以包含2ul终止样品(即包含运行缓冲液(终止运行溶剂)的样 品)，当然，所述样品通常被引入到毛细管(或“管道”)上样系统中，并由此可能被基于乙睛 的常规运行缓冲液边缘化至任一侧。因此，从实际角度来看，可以理解，使用甲醇作为终止 运行缓冲液并不排除在读数阶段使用乙睛或其它常规缓冲液，但使用甲醇作为运行缓冲液 (终止运行溶剂)具有某些优势。因此，合适地，本发明的方法包括用常规的乙睛-H2O-甲 酸运行溶剂(例如Iml)终止反应的步骤，更合适地，本发明的方法包括甲醇(例如Iml)终 止反应的步骤。合适地，没有向所述样品中加入外源性缓冲液。合适地，本发明的方法中省略了缓 冲步骤。合适地，没有向所述样品中加入外源性缓冲液。合适地，没有进行介入提取步骤，更合适地，在制备后直接对样品进行分析，没有 任何介入步骤。变性在蛋白质分析的现有技术中，在蛋白酶消化之前进行蛋白质变性被认为是必要 的。在现有技术中，例如，与血红蛋白病有关的现有技术中，利用单独加入的乙睛和甲酸对 样品进行常规变性，然后放置。根据现有技术的方法，在加入胰蛋白酶之前，用碳酸铵中和 样品中的甲酸使PH接近胰蛋白酶的最佳PH。基于干血斑中的蛋白质至少已经部分变性的 认识而省略这些步骤是本发明方法的极大简化。因此，合适地，本发明的方法特别省略了基 于有机溶剂或有机酸的样品制备步骤。合适地，本发明的方法特别省略了基于化学变性的 样品制备步骤。合适地，本发明的方法包括没有有机溶剂/变性的介入步骤的样品制备步骤。从更广的方面来说，本发明涉及省略这些步骤的蛋白质分析方法，例如血红蛋白病的诊 断方法，即使是当这些方法没有按照本文的教导进行多重化。定量-内标/产物底物比值可以利用稳定的同位素标记底物来实现定量。合适地，所述底物用至少一种稳定 的同位素标记，合适地，至少两种稳定的同位素标记。合适地，所述同位素选自由氘、碳13、 氮15和氧18组成的组。合适地，所述同位素是碳13。当使用两种同位素时，合适地，它们 为碳13和氮15。合适地，当所述底物是多肽时，所述稳定同位素被引入到目标内肽酶切割 位点(如果有)的N末端，这样由于肽随后的内肽酶切割(如果有)而将标记保留。随最 初酶底物的加入或胰蛋白酶的加入，将利用标准的同位素_稀释法测量代谢物/肽的稳定 同位素内标(例如肽稳定同位素)一起加入。合适地，可以在酶温育后加入酶产物的稳定 同位素，这具有不抑制酶活性的优点。当加入的稳定同位素标记的底物用于特异性时，最初 加入是合适的，即这样可以使酶有机会作用于任何底物。本发明的优势在于，通常不需要定 量就能测定酶活性或相关酶活性的存在与否。通常其能够利用产生的产物或底物产物比 值来测量。进一步以定量为特征的实施方案的关键优点是当使用次佳的底物浓度时。可选地，可以通过导出底物/产物比值进行定量。进一步应用本发明的系统和方法可以基于通过MSMS进行的多重的全血代谢物、酶活性和胰 蛋白酶肽测量，在单个3. 2mm血斑上同时进行遗传性代谢物疾病和血红蛋白病的诊断，而 没有样品转移。本发明可用于检测蛋白质/多肽的突变，和/或定量测量蛋白质/多肽，诸如胰蛋 白酶的蛋白酶所释放的肽。有利地，本发明省去了用于血红蛋白(或任何蛋白)常规变性的任何添加，从而显 著简化了整个过程。所述系统能容易地扩大到包括另外的代谢物、酶活性或胰蛋白酶的肽和代表可应 用于一系列临床诊断的通用多重分析方法。本发明的主要优势在于，使用血斑作为用于测量多种酶活性，例如生物素酶(最 佳PH值为6.0)和胆色素原合酶(最佳PH值为6. 4)的唯一缓冲要求。合适地，底物以在 水中的形式加入(即合适地，水是唯一使用的溶剂/载体)。然后，通过测量酶解产物来测 定活性。本发明涉及“斑点上的诊断”。使用于水中的酶底物的主要技术效果是所述样品有利地与之前用于胰蛋白酶消 化和血红蛋白病诊断的样品相同。将代谢物包含在同一分析中出乎意料地有效。用于血红蛋白病分析的样品稀释通 常比常规用于代谢物分析的稀释高6-8倍。通常利用甲醇或甲醇水混合物从血斑中提取 代谢物，这样使蛋白质和盐的洗脱最小从而使电喷雾源中的离子抑制最小。此外，底物/产 物和酶处理可以提高/降低目标代谢物。特别地，现有的代谢物分析技术通常包括丁基化， 而合适地，本发明的方法特别地将其省略。针对特定酶可以使用多于一种的底物。这有利于提高特异性。可以使用稳定的同位素标记底物，这有利于提高特异性。合适地，制备底物以特别地不含待测的酶产物。这有利于减少产物污染底物时可
17能发生的“假阳性”。合适地，使用水溶性底物。这有利于维持水作为唯一的溶剂/载体，并由此除去样 品制备中的有机溶剂和/或提取步骤(不过如上所指出的，在读数阶段加入“运行溶剂”仍 可能涉及有机溶剂，例如乙腈)。本发明的一个优点为除去了用于除去缓冲液等的色谱步骤。因此，在优选的实施方案中，所述样品包括一个血斑，样品制备不涉及转移，并且 代谢物、酶活性和蛋白均在单个多重分析中测定。本发明证明了，例如使用没有进行色谱的样品直接上样和电喷雾质谱-质谱 (MSMS)检测法，在单个3. 2mm的血斑(血斑尺寸可以更大或更小，并且可以使用液体的全血 或血浆；最合适地，使用血；合适地，血斑尺寸标称为3. 2mm ；最合适地，血斑尺寸为3. 2mm) 上，同时进行分析物的测定(例如用于MCADD的辛酰基肉碱)、蛋白的检测(镰刀β-血红 蛋白)和酶活性的测量。本文参考新生儿筛查对所述系统进行了描述，但该系统可以用于 多种临床诊断和监测情况，例如癌症、糖尿病(1型和II型)、肾病和肝病。本发明还可以应用于其他分析物，例如不对称的二甲基精氨酸(ADMA)、乳清酸和 3-0-甲基-二羟基苯丙氨酸(30MD0PA)，从而能够有利地筛查其他遗传性和先天性疾病。利 用这些代谢物的疾病筛查之前并没有阐述。可以将这些分析物(代谢物)引入到目前描述 的多重筛查系统。特别地，本发明描述了所实施的分析，即利用150μ1甲醇(包含用于氨 基酸、酰基肉碱、肌酸酐、甲基丙二酸、乳清酸、ADMA和对称性二甲基精氨酸(SDMA)定量的 所有范围的稳定同位素)洗脱血斑30分钟，然后2次进样，每次为5μ 1洗脱液，用于快速 色谱、正离子和负离子模式的电喷雾和MRM分析(在SCIEX ΑΡΙ5000 (Applied biosystems, Warrington, UK)上进行)。应该注意到，已经提出将SDMA作为肾小球过滤速率的量度，并 且本文提供的数据证明，可以在血斑中足够准确和精确地测量SDMA，从而可以在与肾功能 下降和随后的心脑血管风险的增加相关的多种临床疾病(例如糖尿病和心脏病)中准确诊 断肾衰竭并检测肾功能。
图1至8为扫描图。图9为示意图。图10、11和12为色谱图；橙色线为上线，而在图12中橙色线为下线而蓝色线为上线。图13为曲线图。图14为色谱图，上图蓝色线为上线。图15为色谱图，上图蓝色线为上线。图16为色谱图，上图蓝色线为上线。图17和18为标准曲线图。以下通过实施例对本发明进行阐述。这些实施例仅为说明性的，并且不限制权利 要求书。
实施例实施例1
一般方法向含血斑的深孔板中加入100 μ 1包含用于苯丙氨酸、酪氨酸和辛酰基肉碱的稳 定同位素的底物，并在37°C温育30分钟。加入5 μ 1胰蛋白酶(5mg/ml)，并继续在37°C温育30分钟。加入Iml包含稳定同位素PABA的运行溶剂。准备上样。MSMS时间为1分钟。详细方法2μ1上样量。75 μ 1/分钟。流动相为含有0. 025 %甲酸的1 1的乙腈水。1 分钟总MSMS MRM采集用于临床诊断的血红蛋白病、5-氨基乙酰丙酸、胆色素原、生物胞素、 生物素、赖氨酸、d5-赖氨酸、生物素PABA、PABA、d4_PABA、苯丙氨酸、酪氨酸、辛酰基肉碱、 d5-苯丙氨酸、d4-酪氨酸和d3-辛酰基肉碱。进行以下分析1)发明人用胆色素原合成酶的天然底物5-氨基乙酰丙酸温育由点在 Schleicher&Schuell滤纸(用于新生儿筛查)上的全血制备的3. 2mm全血斑，37°C温育1 小时30分钟，并通过MSMS测定胆色素原。2)同1，但包括100 μ mol/1琥珀酰基丙酮，以证明对测定的抑制_(基本上)没有 检测到胆色素原_并由此证明检测1型酪氨酸血症的能力。3)发明人用生物素酶的天然底物生物胞素温育由点在Schleicher&Schuell滤纸 (用于新生儿筛查)上的全血制备的3. 2mm全血斑，37°C温育1小时30分钟，并通过MSMS 测定生物素和赖氨酸。4)同3，但使用盐水洗涤的红细胞，并加入来自生物素酶缺乏症患者的血浆，以证 明生物素酶活性降低。底物中存在的显著量的生物素使该试验和3复杂化。但仍可能区分， 从而可以检测生物素酶缺乏症，但不含生物素的底物或稳定同位素标记的赖氨酸(所检测 的信号并且在标准条件下不存在)的优势更突出。5)发明人用生物素酶的人工底物生物素PABA温育由点在Schleicher&Schuell 滤纸(用于新生儿筛查)上的全血制备的3. 2mm全血斑，37°C温育1小时30分钟，并通过 MSMS测定生物素和PABA。6)同5，但使用盐水洗涤的红细胞，并加入来自生物素酶缺乏症患者的血浆，以证 明生物素酶活性降低。底物中存在的显著量的生物素使该试验和5复杂化。但仍可能区分 (尤其是利用PABA)，从而仍可以检测生物素酶缺乏症，但不含生物素/PABA的底物的优势 更突出。7)同5和6，但加入用于定量所释放的PABA的稳定同位素PABA。8)同上，但加入5-氨基乙酰丙酸和生物胞素或5-氨基乙酰丙酸和生物素PABA或 5-氨基乙酰丙酸、生物胞素和生物素PABA，以证明同时测定两种酶并在同一血斑上诊断生 物素酶和/或1型酪氨酸血症的能力。9)同上，但加入胰蛋白酶并在37°C进一步温育30分钟，以证明正常的酶活性、血 红蛋白谱、苯丙氨酸和辛酰基肉碱。10)同9，但样品来自镰状细胞病患者，以证明正常酶活性、苯丙氨酸、辛酰基肉碱 和镰状细胞病血红蛋白谱。
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11)同9，但样品来自PKU患者，以证明正常酶活性、血红蛋白谱、辛酰基肉碱和提 高的PKU苯丙氨酸诊断。12)同9，但样品来自MCADD患者，以证明正常酶活性、血红蛋白谱、苯丙氨酸和提 高的MCADD辛酰基肉碱诊断。实施例2:多重分析本实施例提供包括蛋白酶处理和样品中的游离氨基酸测定的多重分析，而这对于 现有技术则不可能实现。此外，发明人证明，尽管事实上仅制备单个样品用于代谢物、酶活 性、蛋白酶分析，并且该样品的制备没有外源缓冲、没有基于溶剂的变性步骤且在短时间内 制备，但本发明的各个分析和处理均可以以多重方式进行，且分析的各个读数均真实可信， 而这对于现有技术则不可能实现。因此，该部分使用的包括优化时间在内的方法为向含3. 2mm血斑的深孔板内加入100 μ 1底物(50 μ Μ，考虑浓度后，5-氨基乙酰丙 酸+生物胞素或生物素-ΡΑΒΑ)，并在37°C温育60分钟。加入100 μ 1胰蛋白酶(0. 5mg/ml)，并继续在37°C温育30分钟。加入Iml包含用于苯丙氨酸、酪氨酸和辛酰基肉碱的稳定同位素的运行溶剂。准备上样。MSMS时间为1分钟。发明人在下表中证明，对胰蛋白酶温育响应苯丙氨酸信号提高(注意许多行均为 两次重复的样品对，从而有助于消除试验误差)。注意稳定的同位素IS不受影响。这是由 于稳定的同位素当然不存在于正在用胰蛋白酶消化且使消化后的苯丙氨酸信号提高的样 品的蛋白中。这还证明甲醇中提高的信号，苯丙氨酸和稳定的同位素内标(电离提高)。利用适 当的标准计算结果。尽管有样品老化问题，但标准曲线的线性、对照值和鉴别PKU患者的易行性证明 该系统有效。苯丙氨酸提高可指示苯丙酮尿症。G的峰面积高于F，即测量来自胰蛋白酶释放的Phe以及样品中实际存在的Phe。 发明人证明这是由于胰蛋白酶释放，因为0列和P列的D5(同位素)相同。如果这是信号 效应，那么同位素标准也将“上扬”(即显示更高的信号)。甲醇作为终止/运行溶剂产生较好的电离/较高的灵敏度。通过比较F列和H列 以及0列和Q列可以证明。这是有利的但也是可选的，原因是常规的运行/终止溶剂的作 用也非常有效。该实施例证明的关键点是，其中以何种方式测定Phe与本发明的性能无关。例如， 注意S/T/U/V，尤其是第23/24行。显然，利用胰蛋白酶观察到较多的Phe。如以上所解释 的，这是由于胰蛋白酶释放Phe。类似地，利用甲醇观察到较多的Phe，如以上所解释的，这 是由于较好的电离。从现有技术的观点来看，预期这不可能起作用，因为预测胰蛋白酶释 放的Phe将产生背景水平的Phe从而使存在于PKU患者中的Phe信号丢失。然而，发明人 吃惊地证明，在本发明的多重分析中，仍然可以具有极好的区分。原因之一在于与适当对 照的比较。通过向对照中引入胰蛋白酶处理，在胰蛋白酶处理的非PKU对照组中能观察到 提高的Phe。然而，即使有胰蛋白酶产生的信号，仍然与PKU患者的更高水平有极好的区分。主要观点之一为，由于较老样品中洗脱的蛋白较少和由此可以被胰蛋白酶作用的蛋白 较少，所以在较老样品中，与胰蛋白酶相关的释放较少。此外，更主要的是，在样品龄匹配 (age-matched)的样品中，蛋白质洗脱并由此由胰蛋白酶产生的Phe信号在对照和PKU患者 之间相当，因此两者之间蛋白酶释放的Phe信号“背景”相当，但是关于现有技术，重要且出 乎预料的是，根据本发明，由于用于诊断的游离Phe存在于PKU样品中而不存在于对照中， 因此在PKU样品的信号中存在强的可检测到的差异。因此，尽管现有技术的方法被多重方 法所混扰，发明人证明本方法甚至在多重条件下也非常强大。尽管具有大的背景组分(通 过蛋白酶释放的Phe产生的)，但PKU样品[加上背景]的信号明显区别于适当对照[仅有 背景]的信号。换而言之，本发明可以允许信号在蛋白酶多重测定中“抬升”，而仍然能够区 分实际的诊断信号。当蛋白酶分析是多重测定的一部分时，这是本发明使用样品龄匹配的对照样品是 本发明的可选优点，因为这样具有更好的背景匹配，并因此具有更好/更强的区分。
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发明人证明，对胰蛋白酶温育响应酪氨酸信号提高。注意稳定的同位素工S不受影响。
多重分析辛酰基肉碱(Oct Cam)发明人证明对胰蛋白酶温育响应辛酰基肉碱信号略微提高。注意，稳定的同位素IS也受到影响。提示蛋白消化后提高的电离。这还证明甲醇中提高的信号、辛酰基肉碱和稳定的同位素内标(增加的电离)。尽管有样品老化问题，但标准曲线的线性、对照值和鉴别MCADD患者的易行性证 明该系统有效。计算的浓度计算的浓度计算的浓度 计算的浓度(ymol/l)(ymol/l)(ymol/l)(ymol/l)冠顯白酶-运亍翻月顯白酶-运亍翻冠顯白酶_ W月顯白酶-W空白斑0. 140< 00. 122< 0
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标准20. 4610. 3890. 4460. 250
标准30. 1710. 1910. 1750. 230
MCADD CDC12. 40011. 50011. 3008. 980
MCADD CDC11. 90010. 20011. 0009. 740
下表显示详细数据。
多重分析Leu发明人证明对胰蛋白酶温育响应亮氨酸信号提高。如上所讨论的，来自MSUD患者 的老血斑较不显著。注意，稳定的同位素IS不受影响。这还证明甲醇中提高的信号、亮氨酸和稳定的同位素内标(增加的电离)。然而，标准曲线的线性和对照值证明该系统在同期样品中的有效性。下表显示数 据。
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本发明甚至可以用于老样品(例如数月至2年的老样品或者甚至更老的样品)。 扫描图和/或比值(例如Leu-Phe比值)可用于获得极好的诊断结果。例如，所计算的亮 氨酸和缬氨酸的结果可信性较低，这似乎与样品的样品龄有关。观察扫描图，很清楚应该作 出诊断。在这种情况下，亮氨酸/苯丙氨酸比值和/或缬氨酸/苯丙氨酸比值可用于区分 来自MSUD患者的样品。此外，观察扫描图，表明亮氨酸/丙氨酸和缬氨酸/丙氨酸比值明 显较好。为了对此进行说明，参见图1，酰基肉碱扫描(上)和中性丢失扫描(下，丢失甲酸 酯离子)。比较图1和图2可知Phe提高，由此诊断PKU患者。与图3比较，可知MSUD样品中亮氨酸/异亮氨酸(132.3)提高。Leu Phe 比值(132. 3 166. 4)是 MSUD 的较显著标志。由于作为次级作用Ala在MSUD中通常较低，因此Leu Ala(132. 3 90. 1)比值 也是MSUD的较显著标志，由此，将该Leu Ala比值作为诊断，其在MSUD中更加显著。图4显示在MCADD患者中检测的辛酰基肉碱(288. 2)，并且这种检测和诊断不受本 发明多重分析的影响。重复这些试验，这次将蛋白酶作为多重方法的一部分。图5显示包括蛋白酶(胰 蛋白酶)在内的整个过程的对照样品。注意，由于胰蛋白酶释放氨基酸，信号比图1高约10 倍。然而，尽管具有该数量级的较高信号，本发明仍然可以有利地提供极好的区分。将图6 中的Phe (166. 3)与图5中的比较，显然图6中的Phe较高，尽管具有高出10倍的整体信号/ 背景水平，但这仍可以诊断PKU。此外，比较图7 (132. 2)与图5 (大约1. 6X IO5比1. IX IO5)， 可以容易且明显地区分和诊断MSUD患者。如上所述，如果比较比值，例如Leu Ala的比 值，可以获得更显著的区分。对于辛酰基肉碱，比较图8(288. 4)与图5，甚至在作为多重方 法的一部分的胰蛋白酶存在的情况下，也可以显著区分和诊断MCADD。合适地，在临床实践中，检测的样品斑均是在大约一周内制备的。然而，为了说明 本发明的可信性，MSUD斑为一年多前制备的，并且根据“非胰蛋白酶”与“胰蛋白酶”处理 的比较，显然，在利用胰蛋白酶的该斑点上，发明人没有获得亮氨酸或缬氨酸的任何显著提 尚ο关于5-氨基乙酰丙酸/异亮氨酸/亮氨酸的评注注意，这些物质(以及羟基脯氨酸)导致132. 3峰。这就是为何底物浓度(例如 5-氨基乙酰丙酸浓度)被有利地最小化的原因。因此，在多重样品中使用的5-氨基乙酰丙 酸越少，5-氨基乙酰丙酸的存在对132. 3峰的“抬升”越小。现有技术通常使用的底物约为 本发明教导的20倍，因此在现有技术的方法中没有也不能观察到所述影响。合适地，使用 50 μ M 5-氨基乙酰丙酸底物。扫描结果证明，其可能用于进行MSUD诊断。如上所述，所述信号还包括来自5-氨 基乙酰丙酸的一些贡献，但这通过使用高碰撞能量亮氨酸转变作为读出(readout)而被有 利地最小化。无论如何，发明人证明扫描方法甚至在该多重情况下也起作用。在全世界的多数新生儿筛查实验室中，针对氨基酸进行中性丢失扫描(多数使用 丁基化样品，但如本发明在这些样品中所显示的那样，也可以使用未衍生化样品和中性丢 失m/z 46)，针对酰基肉碱使用子离子m/z 85的母离子扫描(同于对丁基化的注解，但对于
33丁基化和未衍生样品，m/z 85子离子相同)。优选使用MRM。然而，以上例证了如何能够以多重方式，甚至是具有多种可由操作 者选择的可选读数下应用本发明。多重分析Val这证明对胰蛋白酶温育响应缬氨酸信号提高(不是来自MSUD患者的老斑)。注 意，稳定的同位素IS不受影响。这还证明甲醇中提高的信号、缬氨酸和稳定的同位素内标(增加的电离)。样品老化问题使MSUD患者的鉴别变得困难。然而，标准曲线的线性和对照值表明 所述系统在同期样品中的有效性。
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注意，使用亮氨酸/苯丙氨酸信号比值容易地鉴定MSUD患者
样品名称
空白斑 标准1
分析物峰面积(计算)分析物峰面积(计算)Leu/Phe比值 胰蛋白酶-运行溶剂 胰蛋白酶-运行溶剂
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53300 559000
1. 02 0. 26
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洗涤对照11700004780002. 45
MCADD CDC21000007480002. 81
MCADD CDC21500007460002. 88
PKU新155000011400001. 36
PKU新165000011900001. 39
MSUD17700003290005. 38
MSUD18300003390005. 40
AS8270003010002. 75
AC7940004060001. 96
AA8710003150002. 77
由于低苯丙氨酉髮浓度的精确度问I1，所述浓度比值可略微变动。
理论上，实践中以及根据扫描结果，缬氨酸,/丙氨酸比值提供另--种强有力的区分标准。
如上所指，必须牢记在这些特定实施例中，MSUD样品比其他老很多，并且由此具有
较少的与蛋白酶相关的释放。如所充分证明的，本发明为强有力的诊断工具，即使在由于蛋 白酶作用而发生高释放的情况下也具有优异的区分力。确实，以上实施例中的数据对此进 行了证明。实施例3 生物素酶与生物素/PABA多重用生物素PABA(约50 μ mol/1)和5_氨基乙酰丙酸(50 μ mol/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。发明人提出问题测量生物素或PABA区分对照和生物素酶缺乏症么？发明人还解决这些问题产物/底物比值可以用于区分么？成人对照的活性如何与最近的新生儿样品比较？老样品和EDTA中收集的样品中的活性可以测量么？样品名称样品ID 样丨？口类型分析物峰名称分析物峰面积(计算)
对照生物素PABA未知生物素75600
对照生物素PABA未知生物素70900
对照+SA生物素PABA未知生物素69300
对照+SA生物素PABA未知生物素69200
洗涤对照生物素PABA未知生物素23400
洗涤对照生物素PABA未知生物素20300
对照生物素PABA未知PABA45100
对照生物素PABA未知PABA45100
对照+SA生物素PABA未知PABA47900
对照+SA生物素PABA未知 38PABA44700
洗涤对照 生物素PABA 未知PABA1950洗涤对照 生物素PABA 未知PABA1210结论 成人对照样品中的生物素信号仅为生物素酶缺乏症样品中的信号的3. 5倍——见 第1、2行和5、6行(粗体和下划线标出)成人对照样品中的PABA信号是生物素酶缺乏症样品中的信号的30倍——见第7、 8行和11、12行(粗体和斜体字标出)。MCADD样品中最低的生物素信号与生物素酶缺乏症样品中的生物素信号没有显著 差别。MCADD样品中最低的PABA信号仍为生物素酶缺乏症样品中的PABA信号的5倍。因 此，PABA是优选的分析物。注意，在用底物温育的空白斑中具有非常显著的生物素信号，这暗示信噪比差。注 意，用底物温育的空白斑中基本上没有可测量的PABA信号，这暗示信噪比非常高。因此，再 一次说明PABA为优选分析物。PABA/生物素PABA比值提供了更大的区分——35倍。老样品和EDTA样品中的生物素酶活性是可测量的(虽然在老样品中具有一定程 度的样品破坏)。优选底物为生物胞素，因为其是天然底物，且其通常比其他底物更少被生物素污
^fe ο实施例4 =PBG合酶多重用水、生物胞素(50μπιΟ1/1)和5_氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)以及生物素 PABA(50ymol/l)和5-氨基乙酰丙酸(50μπιο1/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。利用两个MRM测量胆色素原首个问题测量胆色素原区分对照和1型酪氨酸血症么(琥珀酰基丙酮抑制胆色 素原合酶活性)？第二个问题哪种胆色素原MRM更好？产物/底物比值可以用于区分么？成人对照活性如何与最近的新生儿样品比较？老样品和EDTA中收集的样品中的活性可以测量么？利用生物胞素或生物素PABA同时测量生物素酶活性时PBG合酶活性有区别么？样品名称样品ID 样；话类型分析物峰名称分析物峰面积(计算)
对照生物胞素未知胆色素原58800
对照生物胞素未知胆色素原62500
对照+SA生物胞素未知胆色素原3970
对照+SA生物胞素未知胆色素原3810
对照生物素PABA未知胆色素原61600
对照生物素PABA未知胆色素原56900
对照+SA生物素PABA未知胆色素原4680
对照+SA生物素PABA未知胆色素原4220
对照生物胞素未知胆色素原232900
对照生物胞素未知胆色素原236400
对照+SA生物胞素未知胆色素原21910
对照+SA生物胞素未知胆色素原22400
对照生物素PABA未知胆色素原236500
对照生物素PABA未知胆色素原233200
对照+SA生物素PABA未知胆色素原21540
对照+SA生物素PABA未知胆色素原21940
结论成人对照样品中的胆色素原信号为1型酪氨酸血症样品中信号(高于空白血斑) 的15倍——见显示的粗体。其他任何非-EDTA样品中最低的胆色素原信号仍为1型酪氨酸血症样品中的信号 的2倍。注意，用底物温育的空白斑中基本上没有可测量的胆色素原信号，这暗示在制备 的1型酪氨酸血症样品中具有一些残留的活性。227. 3/122. IMRM较敏感，但信噪比没有227. 3/94. 0好。这暗示两者皆有可能，但 由于具有较高的信噪比而优选227. 3/122. 1。产物/底物比值提供了稍大的区分——15-20倍。最近的新生儿样品来自PKU患者，并且活性是成人活性的约60-70%，但仍然可以 高度进行区分。虽然几乎可以肯定在老样品中具有一定程度的样品降解，但老样品中的PBG合酶 活性是可以测量的(但在EDTA样品中不能测量)。生物素酶底物之间没有差别。实施例5 :Hbs多重用水、生物胞素(50μπιΟ1/1)和5_氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)以及生物素 PABA(50ymol/l)和5-氨基乙酰丙酸(50μπιο1/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。首个问题通过包括酶底物和温育的多重化是否影响检测镰刀肽的能力？第二个问题底物之间具有差别么，尤其对于离子抑制？样品名称 样品ID 样品类型 分析物峰名称分析物峰面积(计算)分 析物质量范围(amu)面积比AS水 未知 镰刀 91800461.9/472 4am 1.050AS水 未知 镰刀 92600461.9/472 4am 1.MDAS 生物β 未知 镰刀103000461.9/472 4am 1.060AS 生物β 未知 镰刀I(HXX)461.9/472 4am 1.030AS 生β P·未知 镰刀107000461.9/472 4am 1.050AS 生牧康 PA^V 未知 镰刀I(MXX)461.9/472 4am 1.110结论成人HbAS样品中的镰刀信号为水中或底物中其他样品的信号的约100倍——见显示的粗体(AS =杂合)。镰刀或野生型肽的生物素酶底物之间没有差别。因此，多重分析也惊人地适合血红蛋白病的诊断。当存在底物并且与所考量的酶 活性进行温育时，对同时发生的多重血红蛋白病诊断没有损害，即对信号或区分没有影响。针对Hbc、HbDPunjab, HbOarab, HbE、δ -Lepore 和 HbF 进行同样的操作，其均作 用良好，并且没有背景影响。(NB HbF MCADD为婴儿，这也是该样品中观察到许多HbF的原 因。) 45倍一
信噪比<
实施例6 生物素酶与生物胞素/生物素多重
用水和生物胞素(50μπιΟ1/1)两者以及5-氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)温育血斑。 酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。 首个问题测量生物素能够鉴别对照和生物素酶缺乏症么？ 第二个问题产物/底物比值可以用于区分么？ 成人对照活性如何与最近的新生儿样品比较？ 老样品和EDTA中收集的样品中的活性可以测量么？
椒口名称mbD椒铭称分_繊(雜)分_麗范围W画只比
0.203 0.221 0.265 0.223 0.003 0.003 结论
成人对照样品中的生物素信号为生物素酶缺乏症样品中信号(同于空白血斑)的 -见显示的粗体。
其他任何样品中的最低生物素信号仍为生物素酶缺乏症样品中信号的8倍。 注意，用底物温育的空白斑中基本上没有可测量的生物素信号，这表明非常高的
如所预期的，产物/底物比值提供了较大的区分——73倍。对照生物胞素未知生物素86500244.6/227. Oamu
对照生物胞素未知生物素105000244.6/227. Oamu
对照+SA生物胞素未知生物素103000244.6/227. Oamu
对照+SA生物胞素未知生物素102000244.6/227. Oamu
洗涤对照生物胞素未知生物素1950244.6/227. Oamu
洗涤对照生物胞素未知生物素1800244.6/227. Oamu
最近的新生儿样品来自PKU患者，并且活性没有明显较低(早产儿的活性可能较 低，但仍然可以进行很好的区分)。虽然几乎可以肯定在老样品中具有一定程度的样品降解，但老样品和EDTA样品 中的生物素酶活性仍然是可以测量的。洗涤表示洗涤的红细胞(生物素酶在血浆中)——为了等效，将生物素酶缺乏症 患者的血浆加回去，由此其不含生物素酶。实施例7 PKU多重用水、生物胞素(50μπιΟ1/1)和5_氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)以及生物素 PABA(50ymol/l)和5-氨基乙酰丙酸(50μπιο1/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。首个问题能够非常好地测量苯丙氨酸从而检测苯酮尿症么？
所述方法确实是定量的么？任一个酶底物混合物的加入影响苯丙氨酸信号么？注意，由生物胞素混合物中的标准物计算结果。PKU多重数据显于下表 结论可以非常容易地鉴定来自患者的样品。数值高，但区分(信号、比值或浓度)良好。 所述方法似乎高度定量——线性、精确度和QC结果良好。来自胰蛋白酶的背景意 味着标准曲线没有通过零。患者的苯丙氨酸浓度如之前所测。然而，标准和QC是在同时进行的。对照的高数值和较老样品的低水平(测量值 < 0)可能表明轻微的提取问题。实践中，优选所有的分析样品都在1周内采集。底物对信号没有影响。实施例8 =MCADD多重用水、生物胞素(50μπιΟ1/1)和5_氨基乙酰丙酸(50μπιΟ1/1)以及生物素 PABA(50ymol/l)和5-氨基乙酰丙酸(50μπιο1/1)温育血斑。酶活性、胰蛋白酶消化后用于诊断的血红蛋白病肽和代谢物的完整分析过程。首个问题可以非常好地测量辛酰基肉碱从而检测MCADD么？所述方法确实是定量的么？任一个酶底物混合物的加入影响苯丙氨酸信号么？注意，由生物胞素混合物中的标准物计算结果。MCADD多重数据显于下表
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割 ng EDTA样品看起来良好。所述方法似乎高度定量——线性、精确度和QC结果良好。患者的辛酰基肉碱浓度如之前所测。没有检测到提取影响。底物对信号没有影响。因此，发明人全面证明了以多重方式进行多种检测的能力。无论所述检测为代谢 物、酶活性或多肽的考量(通过蛋白酶消化)，所有条件或处理中没有一个对用于样品分析 的其他任何读数产生不利影响。因此，本发明提供了强大的多重诊断方法。实施例9 乳清酸乳清酸是嘧啶合成中的重要代谢物。因此，在遗传性嘧啶重新合成疾病，尤其是 UMP合酶缺乏症中，尿乳清酸浓度提高。乳清酸是由氨甲酰磷酸和天冬氨酸合成的，并由此 在尿素循环的遗传性疾病即鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、精氨基琥珀酸合酶缺乏症和 精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症中，尿乳清酸提高(参见图9)。基于临床基础和UMP合酶缺乏症中乳清酸的大量分泌，遗传性乳清酸尿症和尿素 循环病症的区分诊断相对容易。尿素循环缺陷的区分诊断通常基于血浆或尿氨基酸在 精氨基琥珀酸合酶缺乏症中瓜氨酸提高，在精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症中精氨基琥珀酸提 高。在鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症中，血浆瓜氨酸通常降低，而最初的诊断基于在用于 诊断的尿素循环中的氨基酸没有提高的情况下，尿乳清酸分泌提高。由于乳清酸由肾脏主 动分泌，并且与尿中观察到的浓度相比血浆浓度相对较低，所以很少测量全血/血浆乳清 酸。然而，在没有治疗的情况下，乳清酸的血/血浆浓度在上述所有疾病中都将提高。关于 尿素循环疾病中的血浆乳清酸，仅有一篇重要文献(Sass et al (1999)PedNeph 13,912) 0 该作者利用气相色谱-质谱测量了来自精氨基琥珀酸合酶缺乏症患者的样品中的血浆乳 清酸，并得出血浆分析并不比尿素分析有优势的结论。本发明公开了利用电喷雾MSMS定量血斑乳清酸用于筛查新生儿和急性患者的 OTC。以下信息是来自 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)数据库的关于该 病症的摘录鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症是尿素循环代谢的先天性X-连锁缺陷，可引起高氨血 症。利用饮食补充的精氨酸和低蛋白饮食可以治疗该疾病。尿素循环病症的特征在于高氨血症、脑病和呼吸性碱中毒的三联征。已经阐述了 五种涉及尿素循环中酶的生物合成的不同缺陷的疾病0TC缺乏症、氨甲酰磷酸合酶缺乏 症(237300)、精氨基琥珀酸合酶缺乏症或瓜氨酸血症(215700)、精氨基琥珀酸裂解酶缺乏 症(207900)和精氨酸酶缺乏症(207800)。临床特征Russell et al. (1962)描述了患有慢性氨中毒和精神衰退的2个堂兄妹。通过肝 活组织检查，显示肝脏OTC的活性非常低。推断在尿素合成中在鸟氨酸向瓜氨酸转化的水 平上存在缺陷。Levin et al. (1969)报道了一例受影响的女婴，其母亲排斥蛋白质并且血浆氨水 平提高，而其父亲IH常。在另一例男婴中，Levin et al. (1969)发现了他们认为的由OTC缺乏症引起的普通高氨血症的变体，推测原因是不同的酶变化。酶活性为正常的25%，而非在 其他病例中的为正常的5% _7%，并且所述酶的其他特征也不同于正常。临床图片比通常 的病例轻微。Holmes et al. (1987)也描沭了 OTC缺乏症的轻微变体。Campbell et al. (1971,1973)报道了由完全的鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏导致的致 死性新生儿高氨血症。他们认为所述酶的编码基因的突变可在杂合的女性中导致部分缺 乏，在半合子的男性中导致完全缺乏。Thaler et al. (1974)描沭了在患有具有内脏脂肪变件的脑病(提示为Reye综 合征)的儿童中的OTC缺乏的“新型蛋白耐受变体”。KrieRer et al. (1979)报道了一例患 有OTC缺乏症的男婴，其相对没有症状达4个月，但由于大脑萎缩逐步发展为严重的痉挛， 并在13个月龄时死亡。肝脏OTC活性是正常的1.5%。该作者提出，在肝脏中微管脂肪积 聚的急性恶化过程中的OTC缺乏的临床图片可提示为Reye综合征。Bruton et al. (1970)描沭了星形细胞转化为Alzheimer II型神经胶质，这是任 何形式的高氨血症的特征。Kornfeld et al. (1985)报道了在2例OTC缺乏症中的神经病 理学的发现。一个3天龄的男孩显示主要位于脑干的神经胶质增生，一个2岁的女孩显示 广泛分布的神经胶质增生和大脑皮质的瘢痕性脑回，以及在小脑内颗粒层中的萎缩。Drogari和Leonard(1988)描述了 6例临床症状发作相对晚的受影响男孩。其中 之一为在孩童时期被认为是一个“非常难相处的孩子，内向且脾气暴躁”。在12岁时，他精 神错乱发作并因此住院，但没有发现原因。在14岁时，他前夜吃了高蛋白食物后深度昏迷 住进医院。尿乳清酸分泌增加，并且发现其母亲是携带者。此后，用低蛋白饮食、精氨酸补 充剂和苯甲酸钠对其进行治疗。然而，他进一步出现特别是由能量限制导致的高氨血症发 作。18岁时，他在考试中表现良好并被医学院录取。Finkelstein et al. (1989,1990)描 述了 21例男性患者，他们在28天龄以后出现作者所定义的晚发性OTC缺乏症。患者在出 生时表现正常，但易激惹、呕吐且嗜睡，其通常是短暂的且以后逐步显现。表现的年龄从2 个月至44岁。Matsuda et al. (1971)和 Oizumi et al. (1984)报道了在男性中的推测为等位 基因型的部分缺乏。Oizumi et al. (1984)报道了 一例患有间歇性昏迷和由感染引起的 高氨血症的6岁男孩。肝脏活组织检查表明OTC活性为正常的16%。其母亲在蛋白负荷 (protein load)后尿中分泌的乳清酸提高。补充饮食精氨酸消除了该男孩的高氨血症发 作。Matsuda et al. (1991)描述了患有OTC缺乏症的32例日本患者的临床和实验室特征。 他们根据临床表现和发作年龄将患者分为3组第1组(0-28天)、第2组(29-5岁)、第3 组(大于5岁)。最低的死亡率和精神发育迟缓发生率出现在第2组患者中。第1组和第 3组患者的死亡比率和酶活性相似。这些患者的瓜氨酸水平最高，且在其首次发作高氨血症 前没有症状。作者强调晚发性OTC缺乏症的发病率比之前公认的高。Anadiotis et al. (2001)报道了一例患有OTC缺乏症的15岁男性患者，其在进食 低蛋白饮食、瓜氨酸和苯基丁酸钠时发展为胰腺炎。Lee et al. (2002)注意到数个在与精氨基琥珀酸合酶缺乏症相关的瓜氨酸血症 中(Goldblum et al. , 1986)和氨甲酰磷酸酯合成酶缺乏症中(Kline et al. ,1981)的尿素 循环先天性缺陷有关的肠病性肢端皮炎样皮肤病(acrodermatitis enteropathica-like dermatosis)的报道。Lee et al. (2002)推测，由于精氨酸占表皮角蛋白氨基酸组成的如
53此大比例，与尿循环缺陷相关的精氨酸缺乏症可能在受影响婴儿中引起损害的表皮屏障功 能和皮肤损伤。Lien et al. (2007)报道了一例52岁男性，其在常规的喉息肉摘除手术后突然死 于高氨血症。手术后8天，他发展为精神错乱、运动失调和偏执狂，并进一步发展为癫痫发 作、脑水肿、昏迷，并在3天内死亡。之前的医史是平常的。对该患者20岁的无症状女儿进 行产前评估，发现她的孪生儿子均为OTC基因突变的携带者。母亲为该突变的杂合体，但对 她父亲的尸检样品的DNA分析并不成功。两个小男孩通过低蛋白饮食身体健康。Lien et al. (2007)强调该老人的OTC缺乏症的晚发性和不正常表现。杂合女性Rowe et al. (1986)综沭了 13例有症状的女性杂合子。她们的表现时间早至1周 龄，晚至第6年。诊断前的症状是非特异的短暂的极端易激惹(100%)、短暂呕吐和嗜睡 (100% )、蛋白回避(92% )、运动失调(77% )、II期昏迷(46% )、生长延迟(38% )、发育 延迟(38%)、癫痫发作(23%)。经常在断母乳时发作。包括先证者在内，13个家族中的女 性42%具有症状。Gilchrist和Coleman (1987)报道了 2例杂合子女性，其晚发性严重症状。其中1 例在36岁开始脑病和局灶性的神经功能缺陷，另一个在38岁开始。第二个在蛋白饮食后 尿乳清酸提高，并且终生回避肉类，其经常导致头痛。Arn et al. (1989)讨论了 OTC基因座突变的杂合件的表型影响。另外，Arnet at. (1990)报道了突变OTC等位基因携带者的正常女性尤其在产后期患高氨血症性昏迷的 风险增加。他们建议每个具有进行性嗜睡(progressive lethargy)和木僵(stupor)(急 性皮质功能障碍的迹象)或昏迷发作的女性，尤其是在妊娠期间，都要通过家谱分析(探寻 之前的发作史)和血浆铵的测量以及(如果能够立即获得的)血浆谷氨酰胺水平的测量来 检查OTC缺乏症。高氨血症的早期鉴定提供了通过苯甲酸钠、苯乙酸钠和盐酸精氨酸的静 脉治疗纠正血浆氨水平的机会。Lee et al. (2002)报道了患有类似肠病性肢端皮炎的皮肤损伤的女婴，随后发现 其患有OTC缺乏症。排除了感染因素和锌缺乏症，并且补充精氨酸和瓜氨酸后皮疹开始消 退。遗传Scott et al. (1972)介绍了支持OTC缺乏症的X-连锁隐性遗传的2个家族。Short et al. (1973)研究了 4个家庭，所有都符合X-连锁遗传。在杂合性OTC缺乏症的女性肝脏 内，Ricciuti et al. (1976)证明有2类细胞，一类细胞酶活性不足，另一类细胞酶活性正 常。细胞嵌合性的发现证明，OTC的基因为X-连锁的。因此，X-连锁显性遗传的证据基于 (1)该病在男性中的严重性，在多数病例中都几乎完全缺乏酶；(2)临床严重性和酶水平在 杂合女性中的很大变化；(3)杂合女性的肝脏中Lyon现象的证实；和(4)小鼠中X-连锁的 证实(参见 DeMars et al.，1976)。谱图分析Burdakin禾口 Norum (1981)观察到对于X染色体上OTC缺乏和G6PD (305900)的连 锁，至少有三分之一的可能重组体。随后在X染色体的相对末端发现了该基因座。诊断
Rowe et al. (1986)认为根据家族Φ、饮食Φ、短晳的非特异症状、停丨h蛋白的反 应以及其他特点可以早诊断。在所检查的5个患者中，诊断时IQ低于70。OTC在肝脏和小肠的粘膜中表达。Hamano et al. (1988)描沭了通过对十二指肠 粘膜的活组织检查样品进行免疫细胞化学检测的方式鉴定OTC缺乏携带者。OTC-阴性细 胞分布于一些绒毛的一侧，而OTC-阳性细胞位于另一侧。肠上皮细胞起源于隐窝细胞的分 裂，然后沿绒毛的侧面上升。认为单个隐窝的上皮由单个亲本类型的细胞构成。大约15%的杂合女性具有威胁生命的高氨血症性昏迷。有症状携带者和无症状携 带者的乳清酸分泌均提高，尤其在蛋白负荷检测的情况下。Pelet et al. (1990)发现，在肯 定携带者中，该测试很少为阴性，可能通常不超过8%的携带者。Hauser et al. (1990)描沭了可以替代氮负荷的用于鉴定杂合女件的测试。在氮 负荷测试中，氨甲酰磷酸在线粒体内积聚。过量的氨甲酰磷酸扩散至胞液中，在此其作为底 物增强嘧啶的生物合成，从而导致乳清酸的积聚和分泌。在Hauser et al. (1990)提出的 测试中，用单次口服剂量的别嘌呤醇取代氮负荷。该方法的有效性取决于氧化嘌呤醇核糖 核苷酸(oxypurinol ribonucleotide)(别嘌呤醇的代谢物)对乳清酸核苷单磷酸脱羧酶 的抑制作用，该抑制作用引起乳清酸核苷单磷酸和其前体乳清酸的积聚，并最终引起乳清 酸尿症禾口 orotidinuria。Grompe et al. (1991)提出了 OTC缺乏症的诊断算法。虽然由于对所述基因的克 隆，通过连锁分析已经极大地提高了 OTC缺乏症的产前以及携带者检测的准确度，但对于 许多病例都代表新突变的该疾病，基于RFLP的诊断具有局限性。Yudkoff et al. (1996)开发了监测OTC缺乏症的女性杂合体的代谢能力的新技 术。他们推断该检测有效地检测体内氮代谢，并可以不必进行用于测量OTC缺乏症中的酶 活性的肝脏活组织检查。无症状的OTC缺乏携带者以正常速度形成尿，这表明即使酶活性 低于正常也能够进行尿素生成。虽然表面上看无症状OTC缺乏携带者以正常速度形成尿， 但如其5-(15)N-谷氨酰胺生成提高所反映的，其氮代谢仍然异常。这种新的测试可能对于 监测OTC缺乏症的新型疗法，例如肝脏移植和基因治疗的效果至关重要。所述方法利用质 谱测量在口服(15)NH(4)C1后(15)NH(4)C1向(15)N-尿素和5-(15)N-谷氨酰胺的转化。BowlinR et al. (1999)报道了具有2个连续患有由OTC基因突变引起的OTC缺乏 症的男性家庭。该母亲的生化研究结果正常。利用外周血白细胞和皮肤成纤维细胞对其母 亲进行基因型分析，显示没有突变，这强烈地提示性腺嵌合性。作者指出，当咨询夫妻(其 中母亲之前已有受OTC缺乏症影响的孩子但看来并不是携带者)时，需要考虑性腺嵌合性。总之，根据OMIM描述需要注意的要点是虽然OTC为X-连锁病，但其可以以非常易变的严重性影响女性携带者。男性和女性可以在新生儿期即表现几乎普遍致死的非常严重的疾病。根据残留的酶活性和低蛋白饮食的自我选择，男性和女性也可以在从儿童至成年 的生命的任何阶段呈现从反社会行为至死亡的不同程度的严重性。由于没有适当的检测，因此还没有考虑新生儿筛查。本发明可以有利地用于鉴定晚发的患者群，具有相对简单的饮食管理和“可选择 方式”的药物学的所述患者群将正常的生长和发育，并且在任何失代偿期的过程中都将具 有要遵循的指定紧急方案。这类似于中链酰基CoA缺乏症(MCADD)的筛查，中链酰基CoA缺乏症是遗传性脂肪氧化障碍，最近在英国被批准用于新生儿筛查。OTC和MCADD代表“Reye 综合征”的主要原因。本发明的发明人没有发现在现有技术中在新生儿期利用全血/血浆或干血斑筛 查OTC的任何技术尝试一这是本发明的另一个新应用。当然，本领域技术人员应知道，这 种具体检测并不是特异的，将检测UMP合酶缺乏症和其他尿素信号疾病(见以上)的病例， 但可以根据临床背景或领域内熟知的其他生物标记物进行容易地区分。因此，合适地，本发 明的方法可以包括再一个步骤，该步骤包括根据临床或生物标记物背景进行区分，以证明 所检测的疾病。在该实施例中，给出的OTC数据证明了利用需时约5分钟的色谱操作对干血斑中 的乳清酸进行准确定量的能力。如果想要减少该过程的时间，通过减少柱尺寸和/或提高 流速从而在2分钟的周期内实现适当的色谱，来对该体系进行优化是可能的。因此，考虑所 给出的数据，很清楚，干血斑乳清酸可用于新生儿血斑筛查OTC缺乏症。基于以下问题发明人提供了试验支持发明人能够检测到干血斑上的乳清酸的正常值么？发明人能够在预期生理范围内检测到干血乳清酸的变化么？试验一位成人志愿者提供了 5ml锂肝素化血样品，存储在-80°C。随后将该样品融化、 混合，并如下加入乳清酸标准物90 μ 1全血+10 μ 1去离子水(终浓度，基础)100μ 1 全血+1 μ 1 100μπιο1/1 乳清酸(终浓度，基础+1 μ mo 1 /1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 500 μ mol/1 乳清酸(终浓度，基础+5 μ mo 1 /1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 2. 5mmol/l 乳清酸(终浓度，基础+邪μmol/1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 10mmol/l 乳清酸(终浓度，基础+100 μ mol/1)利用移液管将50 μ 1各样品移至标准Schleicher & Schuell滤纸上，并在室温下 干燥，并进行所述测定。包含对照DBS样品(老ND)和来自甲基丙二酸血症患者的DBS样
P
ΡΠ O制备3. 2mm的血斑(大约相当于2. 5μ 1样品)。制备甲醇提取溶剂(包含用于 氨基酸、酰基肉碱、肌酸酐、甲基丙二酸、乳清酸、ADMA和SDMA定量的所有范围的稳定同位 素)。向各DBS中加入150 μ 1提取溶剂，并在离心前在37°C混合30分钟。将上清液转移 到聚丙烯96孔深孔板中，并盖上顶盖。然后根据色谱和以多反应监测(MRM)模式进行的稳 定同位素稀释负离子电喷雾质谱-质谱(MSMS)(在SCIEX API5000 (Applied Biosystems, Warrington, UK)上进行)，计算乳清酸、甲基丙二酸(见以下色谱图)、甲基柠檬酸(未显 示数据)和3-羟基戊二酸(未显示数据)。利用HTS PAL 自动取样器(CTC Analytics AG, Switzerland)将 5μ 1 上清液自
56动注射到250 μ 1/分钟的乙腈水(37. 5 62. 5ν/ν)流动相流中。在具有2cmx4. Omm保 护柱的 Chirobiotic T 100x2. Imm 柱(Advanced Separation Technologies, Congleton, UK)上进行色谱，并且以负离子MRM模式获得用于乳清酸(m/zl54. 9/111. 1,156. 9/113. 1) 和甲基丙二酸、甲基柠檬酸和3-羟基戊二酸的前体/产物离子对。利用Analyst version 1.4. 3计算结果。结果见DBS ND对照、DBS对照+25 μ mol/1乳清酸和DBS MMA的色谱图(图10、11和 12)在每种情况下，上部都为乳清酸(蓝色)，稳定同位素乳清酸内标(红色)，下部都 为甲基丙二酸(蓝色)和稳定的同位素甲基丙二酸标准(红色)。ND对照和DBS MMA的色谱图检查证明，对于乳清酸存在干扰背景信号(约 1-3 μ mol/1)，其限制了 DBS乳清酸的任何测定的灵敏度。然而，当加入的乳清酸为 25μπι01/1的水平时，信噪比为约8 1。25 μ mol/1的数值是显著的，因为发明人已经测量 了来自患OTC缺乏症的新生儿(之前诊断的病例的亲属)的样品中的血浆/全血乳清酸， 浓度为约25 μ mol/1。因此，证明了 OTC缺乏症的新生儿筛查。对于甲基丙二酸。DBS ND和DBS对照+25 μ mol/1乳清酸的色谱图显示了 MMA的 明显信号，事实上，这是乳清酸并且它是该体系中略晚于MMA的色谱分析。然而，在阳性病 例中，MMA的提高是可用于诊断的。这证明利用快速色谱和负离子模式的MSMS同时测量可 用于诊断的乳清酸和MMA的血斑浓度的能力。进一步加入可用于诊断的有机酸(例如3-羟 基戊二酸)并提高该检测系统的诊断功效的潜能是明显的。注意，在该实施例中色谱耗时5分钟。然而，利用50mm柱和400 μ 1/分钟流速，耗 时可降低至<2分钟。可以容易准确且精确地计算向全血中加入的诊断范围(1-100 μ mol/1)内的乳清 酸标准物。这通过图13 (DBS乳清酸标准曲线(1-ΙΟΟμπιοΙ/Ι))中的标准曲线证明。R2值 是在分析范围内分析精确度的粗略计算，为0. 9997。这是利用干血斑的优异的相关性。乳清酸的主要数据峰名称乳清酸15W3C作为内标Q1/Q3 质量156. 93/113峰名称乳清酸内标乳清酸15W3CQ1/Q3 质量154. 93/111拟合线性截距0. 0333斜率0. 0152相关系数 0. 9997使用面积样品名称 样品ID (μmol/1)
57
05amu
05amu
权重
样品类型分析物峰名称分析物浓度计算的浓度
ND旧未知乳清酸N/A2. 4
乳清藤？ IuM标准乳清酸10. 9
乳清藤？ 5uM标准乳清酸55. 3
乳清藤？ 25uM标准乳清酸2525. 9
乳清藤？IOOuM标准乳清酸10098. 9
MMA未知乳清酸N/A< 0实施例9的总结由于干扰，利用目前的色谱体系检测干血斑上乳清酸的正常值是有问题的。本发明能够在预期的诊断范围内检测并准确测量干血斑乳清酸的变化。也可以同时测量其他诊断性有机酸，例如甲基丙二酸，即该标记物能够根据本发 明进行多重化。认为尿乳清酸测量值的提高对OTC缺乏症的诊断至关重要。发明人证明了通过负 离子MSMS以适合新生儿筛查和多重化应用的模式在所要求的浓度范围内测量DBS乳清酸 的能力。实施例10 3-0-甲基-二羟基苯丙氨酸芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)是参与由苯丙氨酸和酪氨酸合成神经递质(尤其是 多巴胺和5羟色胺)的代谢通路中的酶。遗传性AADC缺乏症引起CSF多巴胺和5羟色胺 减少以及底物代谢物L-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)和5-羟色氨酸(5-HT)增加。30MD0PA 通过L-DOPA的3-0-甲基化产生，并且也增加。AADC的诊断主要集中于CSF神经递质的降低，但在一些情况下，已经证明高香草 酸的降低和尿L-D0PA、5-HT和30MD0PA的提高是有用的。关于神经递质或L_D0PA、5_HT和 30MD0PA的血浆浓度的公开非常少。在临床上，AADC是重要的疾病(见下)，但相对简单的 治疗即可有效。磷酸吡哆醛是AADC活性的重要辅助因子。因此，磷酸吡哆醛供给和合成中的问题 可产生与AADC缺乏症类似的症状。最近已经识别出两种新的遗传性疾病。第一种为磷酸 吡哆醛合成的问题，具体为编码5'-磷酸吡哆醇(胺)氧化酶(PNPO)的基因突变。这种 疾病伴随严重的痉挛和早死亡，可通过施予磷酸吡哆醛进行非常简单且有效地治疗。因此， 它是新生儿筛查的主要候选疾病。第二种遗传性疾病为α -氨基己二酸半醛脱氢酶(AASD) 缺乏症。在这种疾病中，由于缺乏所述酶，α -氨基己二酸半醛积聚并形成哌啶-6-羧酸酯， 其不可逆地与磷酸吡哆醛反应形成Knoevenagel缩合物。这导致磷酸吡哆醛缺乏和随后的 严重痉挛。这种疾病伴随严重的痉挛，可通过施予吡哆醇进行非常简单且有效的治疗。因 此，它是新生儿筛查的主要候选疾病。营养性吡哆醇缺乏症被认为有类似的临床状况。预期上述所有3种疾病都引起30MD0PA在血浆/全血中积聚。在本发明中首次公 开了利用30MD0PA进行新生儿筛查的可能性。发明人公开了利用电喷雾MSMS的干血斑3-0-甲基-二羟基苯丙氨酸定量在遗传 性AADC、PNP0和AASD缺乏症以及全身性吡哆醇缺乏症的新生儿和急性患者筛查中的应用。以下信息是来自 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)数据库的关于该 病症的摘录AADC缺乏症是神经递质代谢的先天错误，它导致5羟色胺和儿茶酚胺两者都缺乏
58(Abeling et al. ,2000)。临床特征Hyland和 Clayton (1990)以及 Hyland et al. (1992)报道了 由第一代堂兄妹父母 所生的男性单卵双胞胎，其在2个月龄时出现严重的张力减退和由哭泣、随后胳膊和腿的 伸展、眼动危象和紫绀组成的突发行为。他们的四肢也出现偶然的舞蹈手足徐动症。随后观 察到体温调节的缺陷和姿势性低血压。实验室分析表明，CSF中高香草酸(HVA)和5-羟吲 哚乙酸(5-HIAA)浓度大幅降低，同时全血5羟色胺和血浆儿茶酚胺也降低。L-D0PA、5-羟 色氨酸(5HTP)和3-甲氧酪氨酸的尿分泌明显升高，所有这些在生化途径中的AADC步骤之 前。这些发现证明，5羟色胺和多巴胺的合成在中枢和外周神经系统中均受影响，这与AADC 的缺乏相符。血浆和肝脏组织中AADC酶活性大幅降低(对照的1%)。利用单胺氧化酶 抑制剂、多巴胺激动剂和吡哆醇进行治疗可以使张力(tone)和运动显著改善。其父母无症 状，但具有与其AADC缺乏症杂合相符的生化谱。Mailer et al. (1997)报道了父母为沂亲的伊朗患者,其在婴儿期出现张力减退、 发作性过度哭泣并眼睛上翻、伸展四肢并且体温不稳定。5岁时，其发育严重延迟，深度张力 减退，并且四肢肌张力增强，腱反射和脚底伸张反应活跃。自发运动为舞蹈病手足徐动症样 的，并且出汗增加。CSF、血和尿分析以及低AADC酶活性与AADC缺乏症相符。Korenke et al. (1997)报道了父母没有亲缘关系的德国AADC患者。临床表型和实验室发现与之前报道 的病例类似。Korenke et al. (1997)和 Mailer et al. (1997)提到了 AADC 缺乏症和二氢 化喋呤还原酶缺乏症(261630)之间的临床相似性。Abeling et al. (1998)报道了一例患有AADC缺乏症的荷兰女孩，虽然她仍然呈 现精神运动阻滞以及特有的张力亢进发作和眼动危象，但临床表型较轻。CSF显示5-HIAA 和HVA降低，尿中显示5-HIAA、香草基苦杏仁酸(VMA)和去甲肾上腺素降低，L-DOPA提高， 但同时多巴胺和HVA也升高，而多巴胺和HVA由于酶缺陷而应该降低。不能检测血浆AADC 活性。Abeling et al. (1998)认为AADC缺乏症被限制在脑室。在检查几个AADC患者(包 括Abeling et al. (1998)报道的患者)时，Abeling et al. (2000)发现所有患者都具有 高多巴胺尿症(hyperdopaminuria)，在施予L-DOPA后升高。HVA也升高。作者注意到，多 巴胺是在肾中由肾形式的AADC产生的，肾形式的AADC存在于近端肾小管中，并参与钠的肾 处理。在AADC缺乏症患者中，这些肾细胞获取的累积底物L-DOPA的量提高，其迅速被转化 为多巴胺和HVA。Swoboda et al. (2003)评论了包括4例之前报道的患者在内的11例AADC缺乏症 患者。新生儿症状包括进食状况差、嗜睡、上睑下垂、低体温和低血压。所有患者都具有间 歇性眼动异常、躯体张力减退、肢体张力亢进和主动行为削弱。多数患者还情绪不稳定且易 激惹。其他特征包括肌阵挛、张力障碍、突发性出汗和胃肠问题，例如反流病、便秘和腹泻。 功能性临床结果差。生化特征Verbeek et al. (2007)描述了利用AADC酶的两个底物5_羟色氨酸(5-HTP)和 3，4-二羟苯丙氨酸(L-多巴)用于血浆AADC酶活性的测定。他们发现以L-多巴为底物时 对照血浆中AADC酶的平均活性比用5-HTP时的倍数高8-12。AADC的两种底物竞争该酶的 同一个活性位点，从而导致AADC缺乏症患者中残留酶活性的降低相同。在AADC缺乏症患者中，对应于这两种底物的酶活性的降低相同，其为HVA、5-HIAA和MHPG的CSF浓度，而杂 合子具有中等的AADC活性水平。这些酶和测定可以在血上进行。临床管理Pons et al. (2004)注意到AADC缺乏症的临床管理通常涉及维生素B6、多巴胺激 动剂和MAO抑制剂以增强单胺传送。在评价一组AADC患者中的治疗反应时，作者检测了 2 个主要组一组为对治疗作出反应并在发育上具有进步的5位男性，第二组为对治疗作出 的反应差且通常发展为药物导致的运动障碍的5位女性和1位男性。该发现提示了单胺能 体系的性别差异，女性更依赖于多巴胺体系。总之，根据OMIM的描述，需要注意的要点是30MD0PA(注意，3-甲氧酪氨酸只是30MD0PA的另一个名称)的唯一提及与尿有关。诊断依然在其早期，且主要依赖于减少的CSF神经递质的测量。尽管3种疾病都符合新生儿筛查的国际标准，但现有技术甚至都没有考虑任意三 种疾病的新生儿筛查的可能性。发明人的目的在于利用本发明的多重筛查，尤其是用于新生儿的筛查，鉴别无论 出于什么原因而AADC活性降低的病例。因此，所述测试并不特异于一种疾病，但根据临床 背景(对磷酸吡哆醇或吡哆醛的应答)或其他生物标记物，包括AADC活性，可以容易的区 分可能的疾病。因此，合适地，本发明的方法可以包括通过所阐述的或本领域已知的次级测 试来确认诊断的另一个步骤。在该实施例中，所给出的数据证明了可以利用需时约6分钟的色谱操作对干血斑 中的30MD0PA进行准确定量的能力。通过减少柱尺寸和/或提高流速，可以在2分钟的周 期内实现适当的色谱。因此，当考虑所给出的数据时，很清楚，干血斑30MD酸可以用于诸如 遗传性AADC、PNPO和AASD缺乏症和全身性吡哆醇缺乏症的新生儿筛查的应用。在以下试验部分，发明人解决了以下问题发明人能够检测到干血斑上30MD0PA的正常值么？发明人能够在预期生理范围内检测到干血30MD0PA的变化么？试验一位成人志愿者提供了 5ml锂肝素化血样品，存储在-80°C。随后将该样品融化、 混合，并如下加入30MD0PA标准物90 μ 1全血+10 μ 1去离子水(终浓度，基础)100 μ 1 +1 μ 1 100 μ mol/1 30MD0PA(终浓度，基础+1 μ mo 1 /1)100 μ 1 +1 μ 1 500 μ mol/1 30MD0PA(终浓度，基础+δ μ mol/1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 2. 5mmol/l 30MD0PA(终浓度，基础+邪μmol/1)100 μ 1 全血 +1 μ 1 10mmol/l 30MD0PA(终浓度，基础+100μ mol/1)
60
利用移液管将50 μ 1各样品移至标准Schleicher & Schuell滤纸上，在室温下干 燥，并进行所述测定。包含对照DBS样品(老ND)、来自AADC缺乏症患者的DBS样品、来自 戊二酰CoA脱氢酶缺乏症患者的DBS样品和来自非常长的长链酰基CoA脱氢酶缺乏症患者 的DBS。注意，还测量ADMA和SDMA (参见实施例9)。制备3. 2mm的血斑(大约相当于2. 5μ 1样品)。制备甲醇提取溶剂(包含用于 氨基酸、酰基肉碱、肌酸酐、甲基丙二酸、乳清酸、ADMA和SDMA定量的所有范围的稳定同位 素)。向各个DBS中加入150 μ 1提取溶剂，并在离心前在37°C混合30分钟。将上清液转 移到聚丙烯96孔深孔板中，并盖上顶盖。然后根据色谱和以多反应监测(MRM)模式进行的 正离子电喷雾质谱-质谱(MSMS)(在 SCIEX API5000 (Applied Biosystems，Warrington， UK)上进行)，计算30MD0PA(注意，在这个具体试验时没有内标可以使用，但现在有)、戊二 酰肉碱(见图14-16的色谱图)、四癸烯酰基肉碱(见图14-16的色谱图)、ADMA和SDMA。利用HTS PAL 自动取样器(CTC Analytics AG，Switzerland)将 5 μ 1 上清液自 动注射到250 μ 1/分钟的含0. 025%甲酸的乙腈水(50 50ν/ν)流动相流中。在具有 2cmx4. Omm保护柱的 Chirobiotic T 100x2. Imm 柱(Advanced Separation Technologies, Congleton,UK)上进行色谱，并且以正离子MRM模式获得用于乳清酸(m/z 212. 2/166. 2用 于定量，212. 2/149. 2用于验证)和戊二酰肉碱、四癸烯酰基肉碱、ADMA和SDMA的前体/产 物离子对。利用Analyst version 1. 4. 3计算结果。结果见以下DBS AADC患者、DBS戊二酰CoA脱氢酶缺乏症患者和DBSVLCAD缺乏症患 者的质谱在每种情况下，上部都为30MD0PA (约2. 7min)定量离子(蓝色)和30MD0PA验证 离子(红色)，中部都为戊二酰肉碱(约3. Omin)(蓝色)和稳定的同位素戊二酰肉碱内标 (红色)，下部都为四癸烯酰基肉碱(蓝色)和稳定的同位素四癸烯酰基肉碱内标(红色)。DBS戊二酰CoA脱氢酶缺乏症患者和DBS VLCAD缺乏症患者的色谱图检查证明，通 常没有30MD0PA的可检测信号。然而，在AADC缺乏症患者中，在浓度为约lOymol/l时，有 用于30MD0PA定量和验证离子的显著的等效信号(参见下表中的计算值)。因此，根据本发 明，AADC缺乏症筛查，例如新生儿筛查是可能的。本发明还可以用于筛查由AADC活性降低 导致的任何疾病。对于戊二酰肉碱，与其他两个色谱图相比，DBS戊二酰肉碱脱氢酶缺乏症患者的色 谱图证明了用于戊二酰CoA脱氢酶缺乏症的诊断信号。与其他两个色谱图相比，DBS VLCAD 缺乏症患者的色谱图证明了用于VLCAD缺乏症的诊断信号。这证明了利用快速色谱和阳离 子模式的MSMS同时(即以多重方式)测量30MD0PA、戊二酰肉碱和四癸烯酰基肉碱的诊断 性血斑浓度的能力。显然，存在进一步加入可用于诊断性化合物(例如ADMA)并提高该测 试体系诊断功效的可能性。注意，在该样品中色谱耗时6分钟。然而，利用50mm柱和400 μ 1/分钟流速，耗时 可降低至约2分钟。即使没有稳定的同位素内标，也容易准确且精确地计算向全血中加入的诊断范 围(l-lOOymol/l)内的30MD0PA标准物。这通过图17和18中的标准曲线可以证明。R2 值是在分析范围内分析精确度的粗略计算，利用定量离子其为0. 9991，利用验证离子其为0.9987。这是利用干血斑的优异的相关性。
峰名称30MD0PA Q
无内标
Q1/Q3 质量212. 20/166. 20amu
拟合 线性 权重
截距 -2.04E+04
斜率 2.08E+04
相关系数 0. 9991
使用面积
峰名称30MD0PA C
No内标
Q1/Q3 质量212. 20/149. 20amu
拟合 线性 权重
截距 -1.42E+03
斜率 1.68E+04
相关系数 0. 9987
使用面积
样品名称样品ID 样品类型分析物峰名称分析物浓度计算的浓度(μπο / )
ND旧 未知30MD0PAQN/A无峰
30MD IuM 标准30MD0PAQ1无峰
30MD 5uM 标准30MD0PAQ55. 4
30MD 25uM 标准30MD0PAQ2523. 1
30MD IOOuM 标准30MD0PAQ100102. 0
ADMA IuM 未知30MD0PAQN/A无峰
GA 1 未知30MD0PAQN/A无峰
AADC 未知30MD0PAQN/A10. 5
VLCADD 未知30MD0PAQN/A无峰
MCAD 未知30MD0PAQN/A无峰
ND旧 未知30MD0PACN/A无峰
30MD IuM 标准30MD0PAC11. 1
30MD 5uM 标准30MD0PAC54. 9
30MD 25uM 标准30MD0PAC2522. 6
30MD IOOuM 标准30MD0PAC100102. 0
ADMA IuM 未知30MD0PACN/A无峰
GA 1 未知30MD0PACN/A无峰
AADC 未知30MD0PACN/A10. 0
VLCADD 未知30MD0PACN/A无峰
实施例10的总结
由于浓度太低，利用目前的系统检测干血斑上30MD0PA酸丨的正常值是有问题的。
62不同的仪器可以解决这个问题。发明人能够在预期的诊断范围内检测并准确测量干血斑30MD0PA的变化(由真实 的患者样品决定)。也能够同时(即以本发明的多重方式)测量其他诊断性化合物，例如戊二酰肉碱、 四癸烯酰基肉碱和ADMA。首次公开了测量提高的DBS 30MD0PA用于筛查新生儿AADC活性缺乏症。发明人 证明了在新诊断的AADC缺乏症患者中，DSS 30MD0PA提高。发明人证明，通过正离子MSMS 以适合多重筛查(例如新生儿筛查)的模式在所要求的浓度范围内测量DBS 30MD0PA的能 力。以上说明书中提及的所有出版物都通过引用并入本文。本发明所述方面和实施方 式的各种修饰和变体对于本领域技术人员来说都是明显的，而不脱离本发明的范围。虽然 已经结合具体的优选实施方案对本发明进行了描述，但应该理解，将所主张的发明限定到 这些具体的实施方式上是不恰当的。确实，所描述的实施本发明的方式的各种对于本领域 技术人员来说明显的修饰也在权利要求数的范围内。
权利要求
一种帮助诊断受试者疾病的方法，所述方法包括提供来自所述受试者的样品，其中所述样品包括血液；测定所述样品的至少两个特征，所述特征选自(i)所述样品包含的多肽的结构组成；(ii)所述样品包含的代谢物；和(iii)所述样品包含的催化活性；其中，所述至少两个特征均由同一样品的多重分析测定。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述样品包括干血斑。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述样品仅由其天然存在的组分缓冲。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，测定所述样品包含的多肽的结构组成包括(a)向所述样品中加入肽酶；(b)分析经肽酶处理后的所述样品中的多肽；(c)根据(b)信息推断所述多肽的结构组成。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述肽酶是胰蛋白酶。
6.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述样品包含的所述多肽是一种或多种 血红蛋白或肌红蛋白。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，测定所述样品包含的代谢物包括测定苯 丙氨酸、辛酰基肉碱或者酰基肉碱的存在与否。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，测定所述样品包含的催化活性包括(a)向所述样品中加入对所述催化活性的作用敏感的底物；和(b)分析所述样品中所述底物的存在与否和/或作用于所述底物的所述催化活性作用 的产物的存在与否。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，加入并分析对所述催化活性作用敏感的 多于一种的底物。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述一种或多种底物是水溶性的。
11.如权利要求10所述的方法，其中，各所述底物均仅以在水中的形式加入。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述特征由MS分析确定。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述MS是电喷雾质谱-质谱(MSMS)。
14.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述至少两个特征包括 (i)所述样品包含的多肽的结构组成，和选自(ii)或(iii)的至少另一个特征。
15.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述三个特征(i)、(ii)和(iii)均被测定。
16.如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述样品是体外样品。
17.—种组合物，其包含基本不含生物素的生物胞素。
18.—种组合物，其包含生物胞素，所述生物胞素包含同位素标记的赖氨酸残基。
19.如权利要求18所述的组合物，其中，所述同位素标记是碳13、氘、氮15或氧18。
20.一种组合物，其包含基本不含生物素的生物素-PABA0
21.一种组合物，其包含基本不含PABA的生物素-PABA。
22.—种组合物，其包含以下物质中的两种或更多种 (i)5-氨基乙酰丙酸；( )生物胞素；(iii)生物素对氨基苯甲酸。
23.如权利要求22所述的组合物，其还包含H20。
全文摘要
本发明涉及一种帮助诊断受试者疾病的方法，所述方法包括提供来自所述受试者的样品，其中所述样品包括血液；测定所述样品的至少两个特征，所述特征选自所述样品包含的多肽的结构组成；所述样品包含的代谢物；和所述样品包含的催化活性，其中所述至少两个特征均是由同一个样品的多重分析确定。本发明还涉及某些组合物。
文档编号G01N33/68GK101932722SQ200880126114
公开日2010年12月29日 申请日期2008年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者查尔斯·特纳, 雷蒙德·尼尔·多尔顿 申请人:伦敦王室学院;盖伊St托马斯基金信托
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