霉菌类聚酮化合物合成基因在酵母中的异源表达的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  3

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专利名称:霉菌类聚酮化合物合成基因在酵母中的异源表达的制作方法
技术领域
本发明涉及表达载体的制作方法,所述方法从真核生物具有的包含内含子的基因中除去该基因所包含的内含子,仅将外显子序列连接,从而制作包含该连接成的序列的表达载体。详细而言,涉及以下方法:利用PCR从包含内含子的霉菌的巨大基因中将外显子序列作为多个片段扩增,利用缺口修复克隆法将该片段及限制性酶处理的载体连接,从而制作包含连接成的外显子序列的表达载体的方法;合成巨大基因的cDNA片段并连接,制作包含全长cDNA序列的表达载体的方法;导入有利用该方法制作的表达载体的转化体;由该转化体产生的蛋白质;以及得到使用该表达载体由该蛋白质产生的化合物的方法。
背景技术
由霉菌的基因组序列的分析结果明确了在霉菌基因组上存在推定为二次代谢产物的生物合成基因的多个基因,但没有确认这些基因编码的蛋白质(二次代谢产物的生物合成酶)的生产。通常,为了获得基因组序列编码的蛋白质,需要首先制备mRNA,通过逆转录酶合成cDNA后,将该cDNA导入至表·达载体。通常而言,基因的阅读框巨大时,很可能不能合成完全长度的cDNA,因此,有时存在cDNA文库中不能覆盖的阅读框,另外,难以将基因导入与取得的生物不同的宿主中使其表达(异源表达)。目前为止,二次代谢产物用作许多药品先导化合物,作为如上所述使用的二次代谢产物,例如可以举出聚酮化合物类天然产物及肽类天然产物。已知这些天然产物分别通过聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)及非核糖体妝合成酶(nonribosomal peptidesynthetase, NRPS)被生物合成(非专利文献1-3)。对于由霉菌基因组序列明确的、推定为二次代谢产物的生物合成基因的基因,也期待通过该基因编码的蛋白质合成的二次代谢产物的有用性。但是,由于霉菌为真核生物,所以基因中包含内含子,并且基因巨大,因此,利用如上所述的现有的方法难以合成完全长度的cDNA,不能合成推定为二次代谢产物的生物合成基因的基因编码的蛋白质。由于上述情况,迫切需要开发出从霉菌的巨大生物合成基因中除去内含子,使该基因编码的蛋白质表达的方法。非专利文献I:Leadlay, P.,et al.,Nature 1990非专利文献2:Katz, L.,et al.,Science 1991非专利文献3:SamsonS.,et al.,Nature 1985非专利文献4:Hisao Moriya, et al., PLos ONE 2010

发明内容
本发明的目的在于:从不能利用逆转录酶合成全长cDNA的霉菌的巨大基因中仅取出外显子序列并连接,制作包含该连接成的序列的表达载体;或者合成上述巨大基因的cDNA片段并连接,制作包含全长cDNA序列的表达载体;以及使用该表达载体使该基因编码的蛋白质表达。为了达成上述目的,发明人等利用PCR将作为霉菌的一种的球毛壳霉(Chaetomium globosum)基因组中存在的预测为推定的生物合成基因中的外显子序列的序列扩增,使这些外显子序列和限制性酶处理过的载体通过芽殖酵母中的同源重组而连接,制作表达载体,使用以酵母作为宿主的体系使该表达载体表达。即,本发明人等为了除去基因中的内含子序列,首次利用缺口修复克隆法,从而完成了本发明。即,本发明提供一种制作表达载体的方法,所述方法将真核生物具有的包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的外显子序列连接,制作包含该连接成的序列的表达载体,所述方法包括以下工序:工序(a):利用PCR,从提取自真核生物的基因组,将外显子序列作为多个片段扩
>曰,这里,PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列,反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列,通过使用这些引物,在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或与载体的限制性酶处理末端部分同源的序列,及工序(b):将通过工序(a)得到的片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母,由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。另外,本发明提供一种 制作表达载体的方法,所述表达载体包含真核生物具有的、包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的全长cDNA序列,所述方法包括以下工序:工序(a):从提取自真核生物的mRNA合成cDNA片段,利用PCR扩增该cDNA片段,这里,PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列,反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列,通过使用这些引物,在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或与载体的限制性酶处理末端部分同源的序列,及工序(b):将通过工序(a)得到的cDNA片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母,由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。上述方法可以应用于作为真核生物的霉菌的基因,霉菌可以为青霉属(Penicilium 属)、毛壳属(Chaetomium 属)、或曲霉属(Aspergillus 属)。另外,在上述方法中,基因或推定为基因的基因组序列可以为4 20kb。进而,在上述方法中,基因或推定为基因的基因组序列可以为编码聚酮合酶或非核糖体肽合成酶的序列。在上述方法中,可以使连接成的序列为包含序列号15 21、29及47中的任一个所表示的碱基序列的多核苷酸。另外,本发明还提供一种导入有通过上述方法制作的表达载体的转化体。进而,本发明还提供一种由上述转化体产生的蛋白质。另外,本发明还提供一种得到化合物的方法,所述方法使用通过上述方法制作的表达载体,得到由包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列编码的蛋白质产生的化合物。上述方法可以包括下述工序:培养导入了表达载体的转化体,从培养液或转化体中提取化合物。使用本发明时,能够从基因序列中除去内含子,仅使外显子连接,因此,根据本发明,可以说能够人为地进行剪接。另外,使用本发明时,能够使由于使用现有方法不能合成cDNA因而不能使其表达的、巨大基因编码的蛋白质表达。进而,通过培养导入该表达载体的宿主,也能得到由表达的蛋白质产生的化合物。对由基因组序列的信息推定为基因、但没有分离及确认其产物的序列应用本发明的方法时,能够合成该推定基因编码的未知蛋白质,确定该蛋白质的功能。另外,对霉菌类的基因应用本发明制作表达载体,使用以酵母作为宿主的体系使其表达时,即使为异源表达,也能在不使霉菌的蛋白质变性的情况下进行合成。


图1为表示推定PKS基因(CHGG_10128)的外显子序列的模式图、及表示用于扩增各外显子的引物。图2表示利用PCR扩增推定PKS基因(CHGG_10128)的外显子序列的结果。图3为表示推定PKS基因(CHGG_10128)的外显子序列在芽殖酵母中发生的同源重组的模式图。图4为确认了推定PKS基因(CHGG_10128)的表达载体的基因表达的蛋白质免疫印迹法(western blot)。图5为确认了 6-MSA合成酶(MSAS)的表达的SDS-PAGE及蛋白质免疫印迹法。图6A为检测标准品6-MSA的254nm的吸收波长的色谱图(a)及紫外吸收光谱(b)。图6B为标准品6-MSA的质量分析的谱图(a)及质谱图(b)。图7为标准品6-MSA的HPLC数据。图8A为检测酵母提取液样品的254nm的吸收波长的色谱图(a)及紫外吸收光谱(b)。图SB为酵母提取液样品的质量分析的谱图(a)及质谱图(b)。图9为酵母提取液样品的HPLC数据。图1OA为用HPLC从酵母提取液样品中分离得到的馏分的H-NMR谱。图1OB为将图1OA所示的H-NMR谱的一部分放大所得的谱图。图11为表示推定的PKS基因(CHGG_00542)的外显子序列的模式图、 及用于扩增各外显子的引物。
图12表示利用PCR扩增推定的PKS基因(CHGG_00542)的外显子序列的结果。图13为表示推定的PKS基因(CHGG_00542)的外显子序列在芽殖酵母中发生的同源重组的模式图。图14为确认了推定的PKS基因(CHGG_00542)的表达载体的基因表达的蛋白质免疫印迹法。图15为从导入了推定的PKS基因(CHGG_00542)的表达载体的酵母中提取的固体的LC/MS谱图。图16为从导入了推定的PKS基因(CHGG_00542)的表达载体的酵母的培养液中分离的、化合物 I (CHGG_00542-1)及化合物 2 (CHGG_00542_2)的 H-NMR 谱。
具体实施例方式本发明涉及一种制作表达载体的方法,所述方法利用缺口修复克隆法,从真核生物具有的包含内含子的基因中除去该基因所含的内含子,仅使外显子序列连接,从而制作包含该连接成的序列的表达载体。本发明中,制作表达载体时,将想要表达的推定的基因序列、以及合成该基因序列编码的蛋白质的推定底物的酶的基因序列等多个基因导入一个载体,另外将在转化时得到的多个表达载体导入一个细胞,进而将多个基因也导入染色体上。通过上述手法,与现有的缺口修复克隆法(参见Hisao Moriya, et al.,PLos ONE 2010)相比,能有效地表达基因,成功地增加目标蛋白质及由该蛋白质合成的化合物的产量。一直以来,本技术领域中利用周知的方法,⑴难以使巨大的基因组基因剪接并异源表达,及(ii)即使使基因表达得到蛋白质,利用目前为止的技术也很难鉴定该蛋白质的功能,因此,使功能未知、为巨大的基因、且包含许多内含子序列的基因表达,明确被翻译的蛋白质的功能极为困难。对于这一问题,本发明人等使用利用缺口修复克隆法的本发明的方法,即使为功能未知且巨大的基因组基因,也成功地获得推定为该基因的cDNA的序列,使该序列编码的蛋白质表达。进而,通过使合成该蛋白质的推定底物的酶的基因也表达,成功地获得由该蛋白质合成的化合物。另外,本发明的一个方案中,对于不能利用逆转录酶合成全长cDNA的巨大基因,合成cDNA的片段,使用缺口修复克隆法将这些片段连接,由此能够得到巨大基因的内含子被除去的阅读框。由目前为止的知识,虽然推定基因中的某序列是外显子序列还是内含子序列,但这只不过是推定,在包含多个内含子序列的巨大基因的情况,该推定错误的可能性变高。因此,与将外显子的推定序列连接相比,将cDNA的片段连接能够更确实地得到巨大基因的阅读框。1.定义所谓“基因”是指编码蛋白质的信息的DNA区域。所谓“推定为基因的基因组序列”,是指基于目前为止的知 识,预测为编码蛋白质的信息的DNA区域。所述预测可以使用市售的软件容易地进行,例如公开了利用NCBI的程序进行的预测结果(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。所谓“外显子”或“外显子序列”,是指基因中所包含的被转录为mRNA的DNA区域、及由该DNA区域转录的mRNA区域。所谓“内含子”或“内含子序列”,是指基因中所包含的不编码蛋白质的信息、即使作为一次转录产物被转录也通过RNA剪接被除去、在mRNA中不包含的DNA区域。真核生物中,基因作为一次转录产物被转录后,通过RNA剪接除去内含子,将外显子彼此连接,从而形成mRNA。真核生物的基因中,通常外显子被内含子截断。另夕卜,由目前为止的知识,能够推定基因中的某序列是外显子序列还是内含子序列,例如公开了利用NCBI的程序进行的结果(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)。本说明书中,用于“外显子”及“内含子”分别以包括推定为外显子的序列及推定为内含子的序列的意思使用。本发明中,所谓“片段”是指包含基因的一部分序列的DNA片段。本发明中,所谓“5’末端部分”及“3’末端部分”分别是指包含从片段的5’末端或3’末端开始连续的多个碱基序列的多核苷酸,所谓“多个”,只要是本发明中引物能有效地发挥功能、并且可发生同源重组的长度即可。本发明中,所谓“限制性酶处理末端部分”是指包含通过限制性酶处理产生的载体的末端开始连续的多个碱基序列的多核苷酸,所谓“多个”只要是本发明中可发生同源重组的长度即可。本说明书中,所谓“正向引物”,是指具有与想要利用PCR扩增的DNA序列的有义链的5’末端互补的序列的引物,所谓“反向引物”,是指具有与想要利用PCR扩增的DNA序列的反义链的5’末端互补的序列的引物。本发明中,所谓“互补的序列”,是指在严格的条件下,能够与模板序列杂交的序列,不需要为完全互补。具体而言,优选引物序列的80%以上互补,较优选90%以上,特别优选100%。本发明中,所谓“同源的序列”是指具有能在连接的片段之间发生同源重组程度的同源性的序列。同源性优选为足够高,优选99%以上、较优选99.9%以上同源,进一步优选两序列相同。

本发明中,所谓 “霉菌”是指分类为真菌的微生物,指丝状菌。没有限定,作为本发明中的“霉菌”,例如可以举出青霉菌属(Penicilium属)、毛壳属(Chaetomium属)、及曲霉属(Aspergillus 属)。所谓“聚酮合酶(polyketide synthase、PKS) ”,是参与聚酮化合物化合物的生物合成的酶,所谓“聚酮化合物”为由放线菌、丝状菌、植物等产生的二次代谢产物的总称。这里,所谓“二次代谢产物”,不是所有的生物中都含有,是指通过生物合成不直接参与生物的共同的生命现象的物质的代谢(即二次代谢)产生的天然产物。没有限定,作为聚酮化合物,例如可以举出四环素或红霉素等抗生素、道诺霉素等抗癌剂。所谓“非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS) ”,不参与通常的以mRNA作为模板合成肽的肽翻译,而是参与在有规则地排列的酶之间传递底物、来将肽聚合从而合成蛋白质的反应的酶。2.表达载体的制作方法本发明提供一种制作表达载体的方法,所述方法利用PCR将包含内含子的巨大基因中所含的外显子序列作为多个片段扩增,利用缺口修复克隆法连接该片段及限制性酶处理过的载体,得到表达载体。使用本发明时,能够从基因序列中除去内含子,仅使外显子连接,因此,通过本发明,可以说能够人为地进行剪接。所谓缺口修复克隆法,是利用芽殖酵母具有的重组修复机制、在芽殖酵母内或分裂酵母内构筑质粒的构造的方法,是如果DNA片段具有同源区域则能够发生同源重组而将DNA片段连接的方法(例如,参见Hisao Moriya, et al.,PLos ONE 2010)。因此,使用缺口修复法时,若制备具有同源且特异性序列的DNA片段,则能够精度良好地连接该DNA片段。(1-1)利用PCR的外显子序列的扩增工序(a)基因组的提取本发明的方法中,首先从含有目标基因的真核生物中提取基因组。基因组的提取可以利用本领域技术人员周知的方法进行。另外,也可以利用市售的试剂盒。(b)引物的设计本发明的方法中,利用PCR,使外显子序列作为多个片段扩增。具体而言,外显子被内含子外显子截断的情况,使各个外显子作为片段扩增。另外,一个外显子大到难以利用PCR扩增的程度时,使一个外显子作为能够利用PCR扩增的长度的多个片段扩增。对于缺口修复克隆法,具有同源区域的片段之间发生同源重组,两个片段被连接(参见图3),因此,本发明中,片段必须在连接部位具有与连接片段的末端部分或连接载体的限制性酶处理末端部分同源的序列。因此,本发明的方法中使用的引物如下设计:在利用PCR扩增片段的同时,在该片段的末端部分添加与连接的片段的末端部分或连接的载体的限制性酶处理末端部分同源的序列。即,本发明中可使用的引物由下述序列构成:与模板链结合、发挥作为引物的功能的序列;和用于在末端添加与连接的序列同源的序列的序列。对于引物的设计,以下根据图1,以下述情况为例,具体说明将4个外显子(从5’末端侧依次为外显子I 4)分别扩增并连接,并入限制性酶处理过的载体中的情况。扩增外显子I时,针对有义链的引物(外显子I正向引物)设计成从5’末端向3’末端的方向依次地、包含与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分互补的序列(图1中用大写粗体表示)和与外显子I的有义链的5’末端部分的序列互补的序列(图1中用大写表示)。针对反义链的引物(外显子I反向引物)设计成从5’末端侧开始依次地、包含与外显子2的反义链的3’末端部分互补的序列(图1中用小写斜体表示)和与外显子I的反义链的5’末端部分的序列互补的序列(图1中用大写带下划线表示)。使用这些引物进行PCR反应时,可以作为扩增的片段得到下述序列:在外显子I的5’末端添加有与载体的限制性酶处理末端部分的3’末端部分的序列同源的序列,在3’末端添加有与外显子2的5’末端部分同源的序列。扩增外显子2时,针对有义链的引物(外显子2正向引物)设计成从5’末端向3’末端的方向依次地、包含与外显子I的有义链的3’末端部分互补的序列(图1中用大写带下划线表示)和与外显子2的有义链的5’末端部分的序列互补的序列(图1中用小写斜体表示)。针对反义链的引物(外显子2反向引物)设计成从5’末端侧依次地、包含与外显子3的反义链的3’末端部分互补的序列(图1中用小写表示)和与外显子2的反义链的5’末端部分的序列互补的序列(图1中用大写斜体带下划线表示)。使用这些引物进行PCR反应时,可以作为扩增的片段得到下述序列:在外显子2的5’末端添加有与外显子I的3’末端部分同源的序列,在3’末端添加有与外显子3的5’末端部分同源的序列。扩增外显子3时,针对有义链的引物(外显子3正向引物)设计成从5’末端向3’末端的方向依次地、包含与外显子2的有义链的3’末端部分互补的序列(图1中用大写斜体带下划线表示)和与外显子3的有义链的5’末端部分的序列互补的序列(图1中用小写表示)。针对反义链的引物(外显子3反向引物)设计成从5’末端侧依次地、包含与外显子4的反义链的3’末端部分互补的序列(图1中用大写带虚线表示)和与外显子3的反义链的5’末端部分的序列互补的序列(图1中用大写带双线表示)。使用这些引物进行PCR反应时,可以作为扩增的片段得到下述序列:在外显子3的5’末端添加有与外显子2的3’末端部分同源的序列,在3’末端添加有与外显子4的5’末端部分同源的序列。扩增外显子4时,针对有义链的引物(外显子4正向引物)设计成从5’末端向3’末端的方向依次地、包含与外显子3的有义链的3’末端部分互补的序列(图1中用大写带双线表示)和与外显子4的有义链的5’末端部分的序列互补的序列(图1中用大写带虚线表示)。针对反义链的引物(外显子4反向引物)设计成从5’末端侧依次地、包含与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分互补的序列(图1中用大写粗体带下划线表示)和与外显子4的反义链的5’末端部分互补的序列(图1中用小写粗体表示)。使用这些引物进行PCR反应时,可以作为扩增的片段得到下述序列:在外显子4的5’末端添加有与外显子3的3’末端部分同源的序列,在3’末端添加有与载体的限制性酶处理末端部分同源的序列。外显子I反向引物和外显子2正向引物、外显子2反向引物和外显子3正向引物、外显子3反向引物和外显子4正向引物分别包含互补的序列(图1中用相同的字体表示互补的序列)。弓丨物序列中,与模板链结合发挥作为弓丨物的功能的序列部分的长度、即本发明中正向引物及反向引物的3’末端侧的序列部分的长度,只要为在PCR中引物有效地发挥功能的长度即可。对于在PCR中能有效地发挥功能的引物的长度,只要为本领域技术人员就能够适当设定,没有限定,例如为5 50bp,优选为10 40bp,较优选为15 30bp。另外,引物整体的长度只要为在缺口修复克隆法中能够发生同源重组的长度即可,这样的同源序列的长度为约25bp,优选为约50bp,较优选约75bp。因此,本发明中使用的引物整体的长度没有限定,例如可以为约25bp,优选为约50bp,较优选为约75bp。(c)片段的扩增将从真核生物提取的基因组作为模板,使用如上述(b)所记载而设计的引物,利用PCR,将外显子序列作为多个片段扩增。对于PCR的反应条件,可由本领域技术人员适当设定。另外,PCR反应可以使用市售的试剂盒进行。使用如上述(b)所记载而设计的引物时,可以得到在外显子的两末端分别添加有连接的外显子或载体的末端部分的序列的片段。(1-2) cDNA片段的合成及扩增工序(a)mRNA的提取及使用逆转录酶的cDNA片段的合成本发明的一个方案中,首先,从包含目标基因的真核生物中提取mRNA。mRNA的提取可以利用本领域技术人员所周知的方法进行。另外,也可以利用市售的试剂盒。例如,提取总RNA后,可以使用寡dT柱精制mRNA。接下来,使用逆转录酶合成所得的mRNA的单链互补的DNA(cDNA)片段。逆转录反应可以利用本领域技术人员所周知的方法进行。例如,可以使用寡dT引物或寡dT接头引物得到单链cDNA片段。或者可以对提取的总RNA应用寡dT引物或寡dT接头引物和逆转录酶,仅使mRNA逆转录,得到单链cDNA片段。(b)引物的设计与上述(1-1) (b)所记载的同样地,通过具有同源区域的片段间的同源重组连接片段,因此,本发明中,片段必须在连接部位具有与连接的片段的末端部分或连接的载体的限制性酶处理末端部分同源的序列。因此,本发明的方法中使用的引物如下设计:在利用PCR扩增片段的同时,在该片段的末端部分添加与连接的片段的末端部分或连接的载体的限制性酶处理末端部分同源的序列。即,本发明中可使用的引物包含下述序列:与模板链结合并发挥作为引物的功能的序列、和用于在末端添加与连接的序列同源的序列的序列。因此,对于用于使cDNA片段扩增的引物,与上述(1-1) (b)记载的方法同样地、基于外显子及内含子的预测序列以及导入的载体的限制性酶处理末端的序列进行设计。(C)片段的扩增将通过上述(a)得到的单链cDNA片段作为模板,使用如上述(b)所述而设计的引物,利用PCR扩增cDNA片段。对于PCR的反应条件,可由本领域技术人员适当设定。另外,PCR反应可以使用市售的试剂盒进行。(2)载体的限制性酶处理本发明中,载体用限制性酶消化、切断后使用。作为限制性酶,可以使用本领域技术人员周知的限制性酶,利用本领域技术人员周知的方法进行限制性酶处理。使用限制性酶,载体可以在I处被切断,也可以在2处以上被切断。使用具有芽殖酵母或分裂酵母的复制起点及选择标记的载体。作为以酵母作为宿主的载体,可以举出YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YcP型载体等,例如可以使用PGPD-2等。作为选择标记,例如可以包括营养缺陷型报告基因或编码可追踪的标记蛋白质的基因,例如编码绿色荧光蛋白质(GFP)、黄色荧光蛋白质(YFP)、及蓝绿色荧光蛋白质(CFP)的基因;以及其他报告基因,例如LacZ基因及耐药性基因。另外,载体可以包含启动子区域及转录终止区域等。将启动子区域及转录终止区域配置在载体内,以使启动子区域及转录终止区域控制目标基因及选择标记的表达。(3)表达载体的制作工序将利用PCR扩增的片段和限制性酶处理过的载体同时导入芽殖酵母或分裂酵母中来进行转化。由此,在芽殖酵母或分裂酵母内、于具有同源序列的片段间及片段和载体的限制性酶处理末端部分之间发生同源重组,形成连接有片段的表达载体。本发明的方法中,对于想要表达的推定基因序列、以及合成该基因序列编码的蛋白质的推定底物的酶的基因、该蛋白质的修饰酶的基因等多个基因制作片段,导入一个载体。如上述(1-1) (b)所述,根据图1,以分别扩增外显子1 4、连接并并入至限制性酶处理过的载体中的情况(图3)为例,在下面进行说明。

在利用PCR的扩增工序中,形成在外显子1 4的两端分别添加有与连接的外显子或载体同源的序列的片段。因此,在载体的限制性酶处理3’末端部分的序列和在外显子I的5’末端添加的与载体的限制性酶处理3’末端部分同源的序列之间发生同源重组。对于外显子I及外显子2,外显子I在3’末端部分、外显子2在5’末端部分分别具有由外显子I的3’末端部分的序列和外显子2的5’末端部分的序列构成的序列,因此,在该序列间发生同源重组,结果在外显子I的3’末端连接外显子2的5’末端。对于外显子2和外显子3、及外显子3和外显子4也同样地,在外显子2的3’末端连接外显子3的5’末端,在外显子3的3’末端连接外显子4的5’末端。由于在外显子4的3’末端添加有与载体的限制性酶处理5’末端部分的序列同源的序列,所以在所述序列和载体的限制性酶处理5’末端部分的序列之间发生同源重组。通过上述同源重组,可以制作包含下述序列的表达载体,所述序列为基因中所含的外显子I 4按照 被基因编码的顺序所连接成的序列,即推定为基因的cDNA序列的序列。另外,本发明的一个方案中,利用同源重组,可以制作包含cDNA片段所连接成的序列、即全长cDNA序列的表达载体。作为将片段等导入芽殖酵母或分裂酵母的方法,例如可以使用电穿孔法等周知的方法。由于同源重组可在多个片段的末端部分同时发生,所以使用本发明的方法时,可以同时并入多个片段。另外,本发明的方法中,可以并入约20kbp以下的片段。使用本发明的方法时,可以将约20kbp以下、约15kbp以下、约IOkbp以下、或约5kbp以下的基因的cDNA序列并入至表达载体中。制作的表达载体利用选择标记选择转化体,回收该转化体中含有的表达载体。3.来自球毛壳霉(Chaetomium globosum)的PKS基因表达载体作为本发明的一个方案,可以按照上述2.的方法,制作来自球毛壳霉(Chaetomium globosum)的PKS基因表达载体。球毛壳霉中存在推定为PKS基因的基因组,但并未发现它们编码的蛋白质作为天然产物被生产,也未通过合成获得。可以从这样的基因(CHGG_10128、ANID_03386、ANID_07903、CHGG_00046、CHGG_00542、CHGG_04068、CHGG_05286、及CHGG_09586)中除去内含子,仅将外显子序列连接,制作包含该连接成的序列的表达载体。即,可以制作包含上述基因的推定cDNA序列(序列号29及序列号15 21)的表达载体(序列号14及序列号22 28)。另外,本发明的一个方案中,也可以制作包含将上述PKS基因(CHGG_10128、ANID_03386、ANID_07903、CHGG_00046、CHGG_00542、CHGG_04068、CHGG_05286、及CHGG_09586)的cDNA片段连接得到的全长cDNA序列的表达载体。来自球毛壳霉的PKS基因表达载体还可以进一步含有编码修饰PKS从而发挥功能的修饰酶的基因即npgA基因、及编码产生作为PKS的底物的丙二酰-CoA的酶的基因即matB基因的一方或两方。这些基因可以事先并入至载体中,或者与PKS基因一同作为片段制备、利用同源重组而导入。4.导入了表达载体的转化体可以将按照本发明的方法而得到的、包含外显子所连接成的序列或全长cDNA序列的表达载体导入宿主细胞中,得到转化体。作为宿主细胞,可以为大肠杆菌及酵母中的任一种,但使用以酵母作为宿主的体系使其表达时,即使为异源表达也能在不使真核生物的蛋白质变性的情况下合成,因此优选使用酵母。转化时,可以将一个或多个表达载体导入一个细胞,并且将多个基因导入染色体上。5.转化体产生的蛋白质本发明的一个方案中,可以得到导入了表达载体的转化体产生的蛋白质。可以在被导入至表达载体的外显子所连接成的序列或全长cDNA序列能够表达的条件下培养本发明的转化体,得到蛋白质。该转化体可以在本领域通用的培养基中进行培养。培养方法可以按照本领域技术人员周知的方法进行,关于温度、pH、培养时间、是否进行通气或搅拌等,可由本领域技术人员适当设定。在从培养的转化体中提取蛋白质时,可以使用下述方法:培养后,用周知的方法收集转化体,将其悬浮在适当的缓冲液中,通过超声波、溶菌酶及/或冻融等破坏转化体,然后离心分离或过滤,得到粗提取液。缓冲液中可以适当添加表面活性剂或蛋白质变性剂等。作为从得到的粗提取液中分离 纯化蛋白质的方法,可以使用硫酸铝沉淀法等盐析、凝胶过滤等本领域中周知的方法。对于转化体产生的蛋白质,也可以应用基因工程上常用的融合产生方法,使其作为具有标签的融合蛋白质而表达。作为标签,可以使用His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等周知的标签。添加标签时,作为分离 纯化方法,可以使用亲和色谱法等。6.使用表达载体,制造由包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列编码的蛋白质产生的化合物的方法本发明的一个方案中,可以制造由导入了表达载体的转化体产生的蛋白质合成的化合物。在被导入至表达载体的外显子所连接成的序列或全长cDNA序列能够表达的条件下,培养本发明的转化体,使该序列编码的蛋白质表达。本发明的转化体可以在本领域通用的培养基中进行培养。另外,培养方法可以按照本领域技术人员周知的方法进行,关于温度、pH、培养时间、是否进行通气或搅拌等,可由本领域技术人员适当设定。培养基、培养方法、培养时间等培养条件优选进行最优化,使化合物的生产量变多。通过培养,使在转化体内或培养液中蓄积由被导入至表达载体的外显子所连接成的序列或全长cDNA序列编码的蛋白质合成的化合物。从转化体或培养液中提取化合物。提取的方法可以根据化合物的物性、从本领域中周知的方法中适当选择。例如,培养液中蓄积有化合物时,通过离心分离等从培养液中除去转化体后,可以通过对培养液单独或组合进行溶剂萃取法、离子交换树脂法、吸附或分配色谱法及凝胶过滤法等来提取。在转化体内蓄积的化合物的情况,通过离心分离等从培养液中回收转化体,将其悬浮在适当的缓冲液中,通过超声波、溶菌酶及/或冻融等破坏转化体,通过离心分离或过滤得到粗提取液,然后通过单独或组合溶剂萃取法、离子交换树脂法、吸附或分配色谱法及凝胶过滤法等来提取。进而,提取的化合物可以根据其物性、使用本领域中周知的方法进行纯化。如实施例2所示,使用本发明的表达载体制造化合物时,可以从IL的培养液中得到Ig左右的化合物。实用化水平的生产效率为从IL的培养液中得到0.1g左右,因此,可以说该生产效率与实用化水平的生产效率相比足够高。本发明的一个方案中,通过制作包含霉菌的二次代谢产物的生物合成基因或推定为基因的基因组序列的表达载体,培养导入了该表达载体的转化体,从而能够得到二次代谢产物。因此,使用本发明的方法时,能够得到未知的二次代谢产物,所以有可能创制有用的生物活性物质。本说明书中明示引用的所有专利及参考文献的内容全部作为参照引入本说明书中。另外,作为本申请的要求优先权的基础的申请、即日本专利申请2010-181279号及2011-007312号的说明书及附图中记载的内容,全部作为参照引入本说明书中。以下,基于实施例进一步详细说明本发明,但这些实施例并不限制本发明。[实施例1]
来自球毛壳霉的PKS基因表达载体的制作及基因表达1.CHGG_10128针对作为霉菌的一种的球毛壳霉,解读了全基因组序列,利用NCBI (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)的程序预测编码聚酮合酶(PKS)的基因区域、以及该区域中的外显子序列和内含子序列。对于推定为编码聚酮合酶(PKS)的基因中的一个(CHGG_10128)(序列号I),进行以下的实验。(I)利用PCR的外显子序列的扩增从球毛壳霉中提取DNA。推定CHGG_10128具有3个内含子序列,因此,利用PCR将除去这些内含子序列的4个外显子序列扩增。合成正向引物,使其从5’末端向3’末端的方向依次具有与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3 ’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列,合成反向引物,使其从5’末端向3’末端的方向依次具有与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列(图1)。如图1所示,使外显子序列从5’端依次为外显子I 4(序列号10 13)时,将外显子I的正向引物示于序列号2,将外显子I的反向引物示于序列号3,将外显子2的正向引物不于序列号4,将外显子2的反向引物不于序列号5,将外显子3的正向引物不于序列号6,将外显子3的反向引物不于序列号7,将外显子4的正向引物不于序列号8,将外显子4的反向引物不于序列号9。PCR反应在94°C下使其变性2分钟后,进行30个循环的下述反应:外显子I在98°C下10秒、55°C下30秒、68°C下I分钟,外显子2在98°C下10秒、55°C下30秒、68°C下5分钟,外显子3在98°C下10秒、55°C下30秒、68°C下2分钟,外显子4在98°C下10秒、55。。下30秒、68°C下I分钟。聚合酶使用KOD-Plus-Neo (东洋纺)。(2)利用同源重组的表达载体的制作通过电泳确认外显子1、外显子2、外显子3、及外显子4被扩增后(图2),表示目标条带的PCR产物、限制性酶处理过的载体、以及编码作为标签的His及HA标签的序列导入芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。使用市售的pRS425作为载体,使用SalI及SacI作为限制性酶。通过酵母内的重组酶引起同源重组,制作包含外显子1、外显子2、外显子3及外显子4的表达载体(序列号14 )(图3)。利用同源重组,并入有由外显子I 4构成的序列(序列号29)的表达载体使用Leu作为标记进行选择。(3)目标蛋白质在酵母中的表达将所得的表达载体导入酵母中,使其转化。在SC/Leu (2%棉子糖)培养液中培养24小时,投入半乳糖使最终浓度为2%。培养12小时后,回收酵母,从酵母中提取蛋白质。将提取的蛋白质供给蛋白质免疫印迹,确认了基因表达。基于连接外显子I 4的序列(序列号29)的PKS的分子量为279kDa,标签肽的分子量为8kDa,因此,预测在分子量287kDa处检测出条带,结果实际上在其附近确认到条带(图4)。蛋白质免疫印迹中,使用抗His抗体(Sigma) (4000倍)作为一抗、抗小鼠抗体(Invitrogen) (I倍)作为二抗,检测中使用利用碱性磷酸酶的化学发光。
2.其他基因对于推定为编码PKS 的其他基因(ANID_03386、ANID_07903、CHGG_00046、CHGG_00542、CHGG_04068、CHGG_05286 及 CHGG_09586),也与上述 I 同样地进行实验,制作包含推定为这些基因的cDNA序列的序列(依次不于序列号15 21)的表达载体(依次不于序列号22 28)。与上述I同样地将这些表达载体导入酵母中并转化时,确认了蛋白质的表达。[实施例2]在体内的化合物(6~甲基水杨酸)的生产将6-甲基水杨酸(6-methylsalicylic acid, 6-MSA)作为代表的来自真菌的聚酮化合物进行了研究,另外,已知其合成酶¢-甲基水杨酸合成酶、6-MSA合成酶、MSAS)也能在大肠杆菌中表达。因此,为了表示导入了根据本发明的方法制作的表达载体的转化体实际上能够生产化合物,针对6-甲基水杨酸合成酶进行以下实验。1.表达载体的构筑及MSAS的表达从作为霉菌的土曲霉中提取DNA。6-MSA合成酶的基因(序列号30)具有I个内含子序列,因此利用PCR将除去该内含子序列的2个外显子序列扩增。此时,以在各片段上添加与连接的片段的末端或载体的限制性酶处理末端部分同源的序列的方式,设计正向引物(序列号31)和反向引物(序列号32)、及正向引物(序列号33)和反向引物(序列号34)来使用。与实施例1同样地,利用同源重组,将扩增的外显子序列的片段及编码作为标签的HA的序列导入pKW1250 (Leu2d)的ORF (开放阅读框)中,构筑包含6-MSA合成酶基因的cDNA的表达载体(序列号35)。另外,使用GRC法,也一并并入npgA及matB。表达载体使用Ura (尿嘧啶)作为标记 进行选择。将上述表达载体导入酵母进行转化,确认MSAS (204kDa)的表达。具体而言,将所得的表达载体导入酵母并使其转化后,在SC/Leu (2%棉子糖)培养液中培养24小时,投入半乳糖,使最终浓度为2%。培养12小时后,回收酵母。用珠破碎提取回收的酵母,使用镍柱(N1-NTA树脂,QIAGEN)精制该提取物,得到以下样品(图5);无细胞提取液(泳道I)、可溶性馏分(泳道2)、非吸附馏分(泳道3)、洗涤馏分(泳道4)、洗脱馏分(咪唑浓度IOOmM)(泳道5)、洗脱馏分(咪唑浓度200mM)(泳道6)、洗脱馏分(咪唑浓度500mM)(泳道7)。将所得的样品供给SDS-PAGE及蛋白质免疫印迹,确认了基因表达。凝胶进行CBB染色,蛋白质免疫印迹中,使用抗HA抗体(Roche) (1000倍)作为一抗,使用抗小鼠抗体(Invitrogen)(I倍)作为二抗,检测中使用利用碱性磷酸酶的化学发光。结果示于图5。作为对照,也检测出了丙二酰-CoA合成酶(MATB) (57kDa)及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP) (32kDa),仅MSAS的生产量极少。需要说明的是,酵母中的蛋白质的表达方法参考Jay D.Keasling等的Nature(2006)。2.6-MSA 的参考由于MSAS不能在体外进行酶反应,所以从美国Santa Cruz Biotechnologi公司购入6-MSA,作为由酶反应生产的化合物的标准品。用LC/MS及制备用HPLC检测该化合物,得到参考数据。对于LC/MS的测定条件,通过电子离子化法进行离子化并检测。LC/MS的结果示于图6A及图6B。图6A的a为检测254nm的吸收波长的色谱图,图6A的b为目标化合物的紫外吸收光谱,图6B的a为质量分析的谱图,图6B的b为目标化合物的质谱图。由图6A的b及图6B的b可知6-MSA难以被离子化,因而采用MS的检测困难,但采用UV检测容易。制备用HPLC的测定条件使用C18柱,检测流速lmL/min、254nm的吸收波长。将制备用HPLC的结果示于图7。由图7可知保留时间27.4分钟的峰相当于6-MSA。3.在体内的6-MSA的生产将上述1.中制作的表达载体导入酵母进行转化,如下所述培养该酵母。1:在 SC/Ura plate 中、30°C下培养 48 小时2:SC/Ura 2mL、30°C下震荡培养 24 小时3:SC/Leu 25mL、30°C下震荡培养 48 小时`4:YPD 1L、30°C下震荡培养12小时
`
5:添加半乳糖使最终浓度为2%6:震荡培养6天将培养液离心,回收上清液后,使用HCl将上清液的pH调节为1-2。用与上清液等量的乙酸乙酯提取目标化合物(6-MSA),使其干燥,结果从IL的培养液中得到约Ig的目标化合物。使得到的固体溶解于甲醇 用LC/MS分析,用HPLC分离得到。测定条件与上述
2.相同。将LC/MS的光谱示于图8,将HPLC的光谱示于图9。图8A的a为检测254nm的吸收波长所得的色谱图,图8A的b为目标化合物的紫外吸收光谱,图SB的a为质量分析的谱图,图SB的b为目标化合物的质谱图。基于上述2.中得到的参考数据,用HPLC分离得到保留时间为27分钟的馏分。使分离得到的馏分干燥后,溶解于氘代甲醇(MeOD(4D))中,进行NMR谱分析。结果示于图1OA及图10B。由上述结果能够确认,被转化的酵母产生6-MSA。即,确认了导入了按照本发明的方法制作的表达载体的转化体实际上能够生产二次代谢产物。[实施例3]来自球毛壳霍的PKS某闵(CHGG 00542)表汰载体的制作及某闵表汰1.CHGG_00542基因表达载体的构筑对于球毛壳霉具有的推定为编码聚酮合酶(PKS)的基因中的一种(CHGG_00542)的、将5个腺嘌呤(492、3925、3965、4529及6077残基)置换为鸟嘌呤的序列(序列号36)进行以下实验。(I)利用PCR的外显子序列的扩增从球毛壳霉提取DNA。推定CHGG_00542具有3个内含子序列,因此,利用PCR扩增除去这些内含子序列的4个外显子序列(从5’端依次为外显子I 4(序列号37 40))。此时,设计并使用外显子I正向引物(序列号41)和外显子I反向引物(序列号42)、外显子2正向引物(序列号43)和外显子2反向引物(序列号44)、及外显子3正向引物(序列号45)和外显子3 *4反向引物(序列号46)(图11),使在各片段上附加与连接的片段的末端或载体的限制性酶处理末端部分同源的序列。合成具有下述序列的外显子`3 4反向引物,从5’末端向3’末端的方向依次具有与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、与外显子4的反义链的序列互补的序列、及与外显子3的反义链的5’末端部分的序列互补的序列(图11)。
PCR反应在94°C下使其变性2分钟后,进行30个循环的下述反应:外显子I在94°C下15秒、55°C下30秒、68°C下30秒,外显子2在94°C下15秒、55°C下30秒、68°C下30秒、外显子3 *4在94°C下15秒、55°C下30秒、68°C下6分钟。聚合酶使用KOD-Plus (东洋纺)。(2)利用同源重组的表达载体的制作通过电泳确认外显子1、外显子2及外显子3 *4被扩增后(图12),表示目标条带的PCR产物、限制性酶处理过的载体、以及编码作为标签的His及HA标签的序列导入芽殖酵母。使用市售的PRS425作为载体,使用SalI及SacI作为限制性酶。通过酵母内的重组酶引起同源重组,制作包含外显子1、外显子2及外显子3 *4的表达载体(图13)。利用同源重组,并入有由外显子I 4构成的序列(序列号47)的表达载体使用Leu作为标记进行选择。另外,使用GRC法,也一并并入npgA及matB。

(3)目标蛋白质在酵母中的表达利用与实施例1同样的方法,确认了目标蛋白质在酵母中的表达。基于连接外显子I 4的序列的PKS的分子量为239kDa,标签肽的分子量为8kDa,预测在分子量247kDa检测出条带,结果实际上在其附近确认到条带(图14)。2.利用体内合成系统的CHGG_00542的酶功能分析、以及合成产物的分离及构造
确定将由上述1.得到的酵母培养液离,回收上清液后,用与上清液等量的乙酸乙酯提取目标化合物,使其干燥。从IL的培养液中得到约0.0lg的固体。使所得的固体溶解在甲醇中,用LC/MS分析,用HPLC分离得到。测定条件与6-MSA的情况(实施例2的2.)相同。将LC/MS的光谱与HPLC的光谱一同示于图15中。由于分离得到2种化合物,所以将一方作为化合物I (CHGG_542-1)、另一方作为化合物2 (CHGG_542_2)使。将分离得到的这些化合物干燥后,分别溶解于氘代丙酮(acetone (6D)),进行NMR谱分析。从1HNMR谱(图16)的分析结果明确了分离的化合物I (CHGG_542_1)是化学结构已经确定的化合物,化合物2(CHGG_542-2)为新化合物。由上述结果可以确认,被转化的酵母产生化合物1(CHGG_542_1)及化合物2(CHGG_542-2)。即,确认了导入了按照本发明的方法制作的表达载体的转化体实际上能够生产新化合物。[产业上的可利用性]根据本发明,能够从基因序列中除去内含子,仅使外显子连接,因此,可以说能够人为地进行剪接。使用本发明时,能够使未知的生物合成基因组表达,因此,有可能能够创制目前为止没有确定分离结构的该基因群编码的蛋白质、及该蛋白质合成的有用的生物活性物质。因此,根据本发明,能够提供新的药品、农药、或它们的先导化合物。
权利要求
1.一种制作表达载体的方法,所述方法将真核生物具有的、包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的外显子序列连接,制作包含该连接成的序列的表达载体,所述方法包括以下工序: 工序(a):利用PCR,从提取自真核生物的基因组,将外显子序列作为多个片段扩增, 这里,PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列,反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列,通过使用这些引物,在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或与载体的限制性酶处理末端部分同源的序列,及 工序(b):将通过工序(a)得到的片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母,由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。
2.一种制作表达载体的方法,所述表达载体包含真核生物具有的、包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列的全长cDNA序列,所述方法包括以下工序: 工序(a):从提取自真核生物的mRNA合成cDNA片段,利用PCR扩增该cDNA片段, 这里,PCR中使用的正向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的有义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的有义链的3’末端部分的序列 互补的序列、及与扩增的片段的有义链的5’末端部分的序列互补的序列,反向引物从5’末端向3’末端的方向依次具有:与使扩增的片段连接所得的片段的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、或与载体的限制性酶处理末端部分的反义链的3’末端部分的序列互补的序列、及与扩增的片段的反义链的5’末端部分的序列互补的序列,通过使用这些引物,在扩增的片段的末端添加与连接在该片段上的片段的末端部分同源的序列或载体的限制性酶处理末端部分同源的序列,及 工序(b):将通过工序(a)得到的cDNA片段和经限制性酶处理过的载体同时转化至芽殖酵母或分裂酵母,由此利用同源重组得到片段和片段、及片段和载体连接成的表达载体。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中,真核生物为霉菌。
4.如权利要求3所述的方法,其中,霉菌为青霉属(Penicilium属)、毛壳属(Chaetomium 属)、或曲霉属(Aspergillus 属)。
5.如权利要求1 4中任一项所述的方法,其中,基因或推定为基因的基因组序列为4 20kbo
6.如权利要求1 5中任一项所述的方法,其中,基因或推定为基因的基因组序列为编码聚酮合酶或非核糖体肽合成酶的序列。
7.如权利要求1 6中任一项所述的方法,其中,被连接的序列为包含序列号15 21、29及47中的任一个表不的碱基序列的多核苷酸。
8.一种转化体,导入有通过权利要求1 7所述的方法制作的表达载体。
9.一种蛋白质,由权利要求8所述的转化体产生。
10.一种得到化合物的方法,所述方法使用通过权利要求1 7所述的方法制作的表达载体,得到由包含内含子的基因或推定为基因的基因组序列编码的蛋白质产生的化合物。
11.如权利要求10所述的方法,包 括下述工序:培养导入了表达载体的转化体,从培养液或转化体中提取化合物。
全文摘要
本发明涉及一种表达载体的制作方法,所述方法从真核生物具有的包含内含子的基因中除去该基因所包含的内含子,仅将外显子序列连接,从而制作包含该连接的序列的表达载体。详细而言,涉及以下方法利用PCR从包含内含子的霉菌的巨大基因中将外显子序列作为一个或多个片段扩增,利用缺口修复克隆法将该片段及经限制性酶处理的载体连接,从而制作包含连接的外显子序列的表达载体的方法;合成巨大基因的cDNA片段并连接,制作包含全长cDNA序列的表达载体的方法;导入了利用该方法制作的表达载体的转化体;由该转化体产生的蛋白质;以及得到使用该表达载体由该蛋白质产生的化合物的方法。
文档编号C12N1/21GK103119161SQ201180041800
公开日2013年5月22日 申请日期2011年8月11日 优先权日2010年8月13日
发明者渡边贤二, 守屋央朗 申请人:静冈县公立大学法人, 国立大学法人冈山大学

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