检测miR-129-2甲基化的试剂在制备检测乳腺癌试剂盒中的应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  5

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检测miR-129-2甲基化的试剂在制备检测乳腺癌试剂盒中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子诊断领域,提供了检测miR-129-2甲基化的试剂在制备检测乳腺癌试剂盒中的应用。具体的说,本发明提供了序列为SEQ?ID?NO:1-4的引物在制备检测乳腺癌试剂盒中的应用。此外,本发明还提供了使用Touchdown-PCR非诊断检测miR-129-2甲基化的方法。
【专利说明】检测miR-129-2甲基化的试剂在制备检测乳腺癌试剂盒中的应用

【技术领域】
[0001]本发明属于分子诊断【技术领域】,具体的说,使用引物检测微小RNA miR-129-2的甲基化以诊断乳腺癌。

【背景技术】
[0002]微小RNA(microRNA)是一类高度保守的非编码小RNA分子,其通过在后转录水平对目标信使RNA(mRNA)的降解或抑制,达到调苄基因表达的目的。在人体中,微小RNAmiR-129被转录为miR-129-l和miR-129-2,分别位于染色体7q32和Ilpll上,已经有文献报道了 miR-129-2在多种癌症中表达下调,预测其具有肿瘤抑制作用。
[0003]甲基化是一种基因的表观遗传学修饰方式。在哺乳动物中几乎所有DNA甲基化发生在CpG 二核苷酸序列的5 ^胞嘧啶上。CpG岛区域的甲基化与基因转录抑制有关。基因启动子甲基化被认为是一种调节肿瘤细胞中原癌基因活性的表观遗传学修饰机制。已经有研究显示DNA甲基化在微小RNA的调控中有重要作用,如,研究发现在子宫内膜癌中miR-129-2的启动子区呈高甲基化状态,当使用药物去除miR-129-2启动子甲基化时,S0X4表达下调,肿瘤细胞增长受到抑制(Huang Yff, Liu JC, Deatherage, et al.EpigeneticRepress1n of microRNA-129_2Leads to Overexpress1n of S0X40ncogene inEndometrial Cancer)。
[0004]目前,对于miR-129-2甲基化与癌症关系的研究主要集中在子宫内膜癌、胃癌、膀胱癌、结直肠癌方面,尚没有对乳腺癌组织中miR-129-2甲基化的研究结果发表。


【发明内容】

[0005]针对上述问题, 申请人:使用一对甲基化和一对非甲基化引物以甲基化特异性引物PCR(MSP)检测了乳腺癌细胞株和正常样本中的miR-129-2甲基化情况,发现多个乳腺癌细胞株中普遍存在miR-129-2甲基化,而正常样本中并没有miR-129-2甲基化,由此提供了检测miR-129-2甲基化以诊断乳腺癌的方法。此外,针对普通PCR特异性不足的问题, 申请人:提供了使用touch-down PCR方法非诊断检测miR-129-2甲基化的方法,以用于癌症发生分子机制的实验室研究。
[0006]一方面,本发明提供了检测微小RNA甲基化的试剂在制备检测癌症试剂盒中的应用。
[0007]在进一步的方面,该应用中的微小RNA为miR-129-2,癌症为乳腺癌。
[0008]在进一步的方面,该应用中检测微小RNA甲基化的试剂为一组检测微小RNA甲基化的引物,引物序列为SEQ ID NO: 1-40
[0009]另一方面,本发明提供了非诊断检测miR-129-2甲基化程度的方法,其中使用甲基化和非甲基化引物对样品DNA进行PCR扩增(MSP),根据扩增结果来判断miR-129-2甲基化程度。非诊断检测方法可以是用于科研用途的方法,例如可以非诊断的检测来自各保藏机构的细胞株样本,或者医疗机构所收集的研究用细胞/血液样本,这些样本的样本主体已经去世/治愈/去向不明,所以显然检测其miR-129-2甲基化程度并不是为了检测样本主体的健康状态而是为了科研。
[0010]在进一步的方面,该方法中甲基化和非甲基化引物的序列为SEQ ID NO:1_4,PCR方法为touch-down PCR方法。
[0011]20 μ I反应体系:
[0012]I μ I重亚硫酸盐处理的DNA、250 μΜ正向引物和反向引物、0.75 μ MdNTPs>3.75mM MgC12、0.625units AmpliTaq GoldDNA 聚合酶(Roche MolecularSystems, Inc., Branchburg, NJ)
[0013]循环参数:
[0014]

【权利要求】
1.检测微小RNA甲基化的试剂在制备检测癌症试剂盒中的应用。
2.权利要求1所述的应用,其中的微小RNA为miR-129-2,癌症为乳腺癌。
3.权利要求2所述的应用,其中检测微小RNA甲基化的试剂为一组检测微小RNA甲基化的引物,引物序列为SEQ ID NO:1-40
4.检测miR-129-2甲基化程度的非诊断方法,其中使用甲基化和非甲基化引物对样品DNA进行PCR扩增(MSP),根据扩增结果来判断m iR-129-2甲基化程度。
5.权利要求4所述的方法,其中甲基化和非甲基化引物的序列为SEQID NO: 1-4, PCR方法为touch-down PCR方法。
6.权利要求5所述的方法,其中touch-downPCR方法具体为: .20 μ I反应体系: I μ I重亚硫酸盐处理的DNA、250 μΜ正向引物和反向引物、0.75 μ M dNTPs、.3.75mM MgCl2、0.625 单位 AmpliTaq Gold DNA 聚合酶(Roche MolecularSystems, Inc., Branchburg, NJ) 循环参数: 预变性95°C 1minl个循环 TD 程序 95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 54°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 95°C 30s, 51°C 30s, 72°C 30s 2 个循环 主程序 95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s 15 个循环 最后延伸72°C 1minl个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK104164485SQ201410253132
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年6月9日 优先权日:2014年6月9日
【发明者】汤郡, 肖莹莹, 李晓霞 申请人:济南金域医学检验中心有限公司, 广州金域医学检验中心有限公司

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