一种检测牛igf-1基因的特异性引物、其荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法

xiaoxiao2020-6-24  6

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一种检测牛igf-1基因的特异性引物、其荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明为一种检测牛IGF-1基因的特异性引物、其荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用,提供一种牛IGF-1基因的荧光定量PCR检测试剂盒,试剂盒包括PCR反应液、TaqDNA聚合酶混合物、SYBRGreen染料和引物;所述引物序列为:上游引物序列为5’-AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’;下游引物序列为:5’-AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。本发明还提供上述试剂盒的检测方法和应用以及检测牛IGF-1基因的特异性引物。本发明实现了方便快捷的检测牛IGF-1基因mRNA表达水平的目的。本发明在检测基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。本发明的方法能够有效扩增来源于奶牛、黄牛和牦牛三个牛种的IGF-1基因,从而检测IGF-1基因的mRNA表达量。
【专利说明】—种检测牛IGF-1基因的特异性引物、其荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用

【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】,具体涉及一种检测牛IGF-1基因的特异性引物和牛IGF-1基因荧光定量PCR检测试剂盒。

【背景技术】
[0002]聚合酶链式反应(Polymerase Chain React1n, PCR)是DNA体外操作技术中最常用的技术。PCR技术将模板DNA、特异性引物、dNTPs底物、耐热DNA聚合酶、镁离子等放在同一个缓冲反应体系中,进行反复高温变性、低温退火、中温链延伸的热循环,实现靶DNA片段在反应液中呈2n倍扩增(其中η为热循环次数)。
[0003]荧光定量PCR技术是在变通PCR反应的基础上,结合实时荧光检测技术和计算机分析技术。荧光定量PCR在变通PCR反应体系中加入特定的荧光标记物质,通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的扩增情况,并获得每个样本的荧光定量变化曲线,进而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数);同时,在相同的反应体系和反应条件下检测2-10个倍数稀释的已知数量的靶标DNA,获得其Ct值,以起始模板数的对数为横坐标,以Ct值为纵坐标制备标准曲线,据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
[0004]虽然Northern blot技术可检测基因的mRNA表达水平,但整个实验过程操作比较复杂。Northern blot实验中一个主要的问题是存在RNA的降解,所以Northern Blot中所有的实验用品都需要经过除去RNA酶的过程,如高温烘烤、DEPC处理等。另外,NorthernBlot中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫外灯等等对人体都有一定的伤害。基因芯片实验虽然降低了实验人员的工作量,并可以在一次实验中同时检测几千个基因表达量变化,但是其灵敏度较低。
[0005]而SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。与双链DNA结合后,其荧光大大增强。该性质用于扩增产物的检测非常理想。SYBR Green的最大吸收波长约为497 nm,发射波长最大约为520 nm。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
[0006]SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点,由于它与所有的双链DNA相结合,不必因为模板不同而特别定制,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低。此外,由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合,因此SRYB Green的灵敏度很高。但是,由于SYRBGreen与所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果。
[0007]类膜岛素一号增长因子(Insulin-Like Growth Factor-1, IGF-1)是调节动物生长发育的一个重要分泌因子。IGF-1在胚胎和出生后的发育过程中都表现出重要的调节作用,它可以通过调节细胞的增殖、分化和凋亡来影响各种组织的动态平衡以及组织功能。因此,在牛的饲养过程中和科学研究中,可以定量检测组织中IGF-1的表达量,达到监测牛的发育状况的目的。


【发明内容】

[0008]本发明提供了一种类胰岛素一号增长因子(Insulin-Like Growth Factor-1,IGF-1)基因的荧光定量PCR检测试剂盒。通过大量的实验研究,我们优化出了一套能够有效检测不同牛种(包括奶牛、黄牛和牦牛)IGF-1基因表达量的引物和PCR反应的条件,并组装成IGF-1基因表达检测荧光定量聚合酶链式反应试剂盒,以满足生命科学、医学和畜牧兽医研究者的检测需要。为此,本发明还提供检测牛IGF-1基因的特异性引物、检测方法和试剂盒的应用。
[0009]为了实现上述发明目的,本发明提供的技术方案如下:
一种检测牛IGF-1基因的特异性引物,其核苷酸序列为:
上游引物序列为 5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’ ;
下游引物序列为:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
[0010]本发明的第二个目的是提供一种牛IGF-1基因的荧光定量PCR检测试剂盒,所述试剂盒包括PCR反应液、Taq DNA聚合酶混合物、SYBR Green染料和引物;所述引物序列为:
上游引物序列为 5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’ ;
下游引物序列为:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
[0011]优选地,所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[0012]本发明的第三个目的是提供牛IGF-1基因的定量检测方法,是以待测cDNA为模板,利用权利要求1所述的引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR,记录Ct值,并以IGF-1标准基因作为阳性对照绘制标准曲线,据此标准曲线和Ct值进行定量测定。
[0013]优选地,所述实时荧光定量PCR的反应条件是:95 °C预变性30秒;95 °C 5秒,56°C 20秒,捕捉突光信号,循环40次。
[0014]本发明的第四个目的是提供上述试剂盒在定量检测牛IGF-1基因中的应用。
[0015]优选地,所述牛为奶牛、黄牛和牦牛。
[0016]与现有最好技术相比,本发明的优点在于:
1.本发明实现了方便快捷的检测IGF-1基因mRNA表达水平的目的。
[0017]2.本发明在检测基因mRNA表达水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。
[0018]3.由于引物在奶牛、黄牛、牦牛中完全同源,所以本发明的方法能够有效扩增来源于这些物种的IGF-1基因,从而检测IGF-1基因的表达量。

【专利附图】

【附图说明】
[0019]附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为IGF-1基因转录水平的荧光检测结果图,A:扩增曲线。横坐标为PCR循环次数,纵坐标为相对荧光量值(Relative Fluorescence Units, RFU), B:熔解曲线,横坐标为温度,纵坐标为单位温度下相对荧光值的变化量。

【具体实施方式】
[0020]以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0021]本发明的IGF-1基因的荧光定量PCR检测试剂盒由以下组分组成:
2XSYBR GREEN MIX5mL ;
引物混合液500μ?;
超纯水5mL ;
阳性对照:标准IGF-1基因模板500 μ L0
[0022]其中,2ΧSYBR GREEN MIX 由以下组分组成:Taq DNA 聚合酶 0.1 U/μ L、dNTPs 底物0.4 mmol/L、Mg2+ 5.0 mmol/LUOO mmol/L KC1、20 mmol/L Tris.HCl PH8.3、0.02 % 明胶和 20 ng/mL SYBR Green 染料。
[0023]引物混合液:上游引物8 μ mol/L、下游引物8 μ mol/L,上游引物序列为5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’,下游引物序列为:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
[0024]标准IGF-1基因模板:浓度为0.8 μ mol/L, IGF-1基因模板序列为5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAATTATTTAAGTGCTGCTTTTGTGATTTCTTGAAGCAGGTGAAGATGCCCATCACATCCTCCTCGCATCT-3,。
[0025]超纯水:纯度超过18.25 ΜΩ.CM。
[0026]应用本发明的荧光定量PCR检测试剂盒定量检测牛IGF-1基因的步骤如下:
(1)取2XSYBRGREEN MIX 1000 μ L、引物混合液100 μ L、超纯水800 μ L充分混匀,配制1900 μ L的FQ-PCR反应预混液;
(2)充分混匀以上各种液体,将预混液按19μ L/管分装成100小管,加至荧光定量专用PCR反应管或者反应板中;
(3)配制以10E+8/ML、10E+7/ML、10E+6/ML、10E+5/ML、10E+4/ML 等系列稀释度的标准IGF-1基因模板5管,每管10 μ L ;
(4)在每个装有19μ L FQ-PCR反应预混液的反应管中分别加入I μ L待测cDNA、超纯水(阴性对照)或标准IGF-1基因模板,震荡混匀,瞬时离心后上机到荧光定量PCR仪(B1-RadCFX96TM)中,95°C预变性30秒;95°C 5秒,56°C 20秒,捕捉荧光信号,循环40次;由于扩增的片段较短,退火和延伸合并为一步,即56°C,20秒;升高至95 °C,升温过程中捕捉荧光信号,根据该荧光信号制作溶解曲线。PCR扩增曲线参见图1,图1表明IGF-1基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线,熔解曲线表明该荧光定量具有高度的检测专一性。因此,本发明可以准确的测定IGF-1的表达水平,并具有高度的特异性,效果很理想,与设计的预期完全一致。
[0027]其中,待测cDNA是通过以下步骤制备得到的:
a、RNA提取过程:采集牛种(黄牛、奶牛或牦牛)的组织,将10mg组织在液氮中磨碎,力口入ImL TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理;将匀浆样品在室温(15_30°C )放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离;加入0.2mL氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟;4°C 1000Xg离心15分钟(样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层);把水相转移到新管中;加入0.5mL异丙醇沉淀水相中的RNA,室温放置10分钟;4°C 1000Xg离心10分钟,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀;移去上清,使用ImL 75%乙醇洗涤RNA沉淀;4°C7000 X g离心5分钟,弃上清;室温放置干燥RNA沉淀;加入25-200 μ I无RNase的水用枪头吸打几次,58°C放置10分钟使RNA溶解,此时得到牛种的RNA溶液。
[0028]b、反转录过程,也就是获得cDNA的过程:在PCR管中加入50 μ mol/L oligo dT溶液 1.5 μ L, 10 mmol/L dNTP 混合液 I μ L,牦牛总 RNA 2.5 μ L, RNase free dH20 5 μ L,混匀,65°C放置5min,迅速转移至冰上冷却;在上述PCR管中继续加入5 XPrime ScriptTM缓冲液 4 μ L,40 U/μ I RNA 酶抑制剂 0.5 μ L,200 U/μ L Prime Script? 反转录酶 I μ L,RNase free dH20 4.5 μ L,混匀,30°C 10min,42°C 60min,70°C 15min 条件下反应,此时获得牛种的cDNA。
[0029](5)PCR反应结束后,读取各个反应的Ct值用以定量分析:以起始模板数的对数为横坐标,以阳性对照的Ct值为纵坐标制备标准曲线,据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始模板数进行定量测定。同时用3%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳,溴乙锭染色,凝胶成像系统下观察,灰度扫描分析记录各PCR反应的结果。以确定扩增产物的大小,从而进一步确定扩增的是否是目的基因。
[0030]由于引物在奶牛、黄牛、牦牛中完全同源,所以本发明的方法能够有效扩增来源于这些物种的IGF-1基因,从而检测IGF-1基因的表达量。
[0031]最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种检测牛IGF-1基因的特异性引物,其核苷酸序列为: 上游引物序列为 5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’ ; 下游引物序列为:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
2.—种牛IGF-1基因的荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括PCR反应液、Taq DNA聚合酶混合物、SYBR Green染料和引物;所述引物序列为: 上游引物序列为 5’ -AGCAGTCTTCCAACCCAA-3’ ; 下游引物序列为:5’ - AGATGCGAGGAGGATGTG-3’。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
4.一种牛IGF-1基因的定量检测方法,是以待测cDNA为模板,利用权利要求1所述的引物和SYBR Green染料进行实时荧光定量PCR,记录Ct值,并以IGF-1标准基因作为阳性对照绘制标准曲线,据此标准曲线和Ct值进行定量测定。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于:所述实时荧光定量PCR的反应条件是:95°C预变性30秒;95°C 5秒,56 °C 20秒,捕捉荧光信号,循环40次。
6.权利要求2或3所述的试剂盒在定量检测牛IGF-1基因中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述牛为奶牛、黄牛和牦牛。
【文档编号】C12N15/11GK104313124SQ201410253252
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】裴杰, 郭宪, 包鹏甲, 梁春年, 褚敏, 朱新书, 丁学智, 冯瑞林, 阎萍 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所

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